CN111841079B - 一种富集n-糖肽或n-糖链的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富集N‑糖肽或N‑糖链的方法,所述方法为将细菌纤维素进行预处理,将蛋白质溶液进行变性和酶消化处理后,然后将预处理后的细菌纤维素加入到处理后的蛋白质溶液中,进行富集。本发明鉴定出IgG标准蛋白和人血清样品中的36和159种N‑糖链和31和523条完整的N‑糖肽,整个富集过程非常容易操作,而且速度超快(只需10min),具有高达94%的高特异性。富集不受盐的影响,可以使样品在酶消化后直接富集,而不经历脱盐过程。
Description
技术领域
本发明涉及糖肽富集技术领域,特别是涉及一种富集N-糖肽或N-糖链的方法。
背景技术
糖基化长期以来被认为是生物体中最常见和最重要的蛋白质修饰过程之一,并对许多生物过程有很大影响。蛋白质上的糖链具有多种功能属性,从提供细胞的结构组成到调节其物理和化学性质。异常蛋白质糖基化与多种疾病直接相关,如癌症、神经退行性疾病、免疫相关疾病等。由于蛋白质糖基化的重要性,在糖蛋白质组学和糖组学领域开发新方法和开展相关研究已经引起人们极大兴趣。
目前,已经发展了很多有效的基于质谱(MS)的蛋白质糖基化分析方法。此外,由于糖肽和糖链固有的低丰度和电离效率,在MS分析之前的有效富集对于糖肽和糖链分析都是不可或缺的。目前,已经开发了多种糖肽/糖链富集方法。例如,酰肼化学法广泛用于糖肽富集。然而,由于这种方法是不可逆富集的,这种方法无法保留完整糖肽和获得糖链。基于凝集素的方法通常用于通过识别特定的糖型来富集糖蛋白/糖肽。但是,因为每种类型的凝集素只能识别特定的糖链结构,这种方法不能普遍识别所有类型的糖基化产物。硼酸法已用于糖肽和糖链的富集。此外,硼酸富集特异性相对较低。亲水性相互作用液相色谱(HILIC)是广泛用于糖蛋白质组学中复杂糖基化样本的分离,但它仍然难以捕获O-连接的糖链和中性N-连接的糖链。最近开发的一些值得注意的方法,如基于苯并硼氧基的方法和同位素靶向糖蛋白质组学(IsoTaG),显示了突出的富集能力。然而,这些方法是专为完整糖肽的富集和鉴定而设计的,不适用于糖链的富集和分析。此外,一些方法,例如使用多孔石墨化碳(PGC)的方法,通常用于糖链纯化,但不适用于糖肽富集。最近报道的固相提取含氮连接的糖链和糖肽(NGAG)在糖链和糖肽富集方面显示出良好的性能。但是,操作步骤复杂,技术要求高,而且耗时,在大规模糖蛋白质组和糖质分析中,在进行MS分析之前,必须有一种有效、易于操作和快速的方法来富集糖肽和糖链。基于现有技术中富集糖肽和糖链的方法均存在一些缺陷,亟需提供一种可以对糖链和糖肽进行超快高效富集的、易于操作的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种对糖链或糖肽进行超快高效富集的、易于操作的方法,以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种N-糖肽或N-糖链富集材料,所述富集材料为细菌纤维素。
本发明还提供细菌纤维素在富集N-糖肽或N-糖链中的应用。
本发明还提供细菌纤维素在制备用于富集N-糖肽或N-糖链的柱填料中的应用。
本发明还提供细菌纤维素作为富集N-糖肽或N-糖链的柱填料的应用。
本发明还提供一种富集N-糖肽或N-糖链的方法,包括以下步骤:
(1)细菌纤维素的预处理:将细菌纤维素切成1cm×1cm的块,得到细菌纤维素块,用蒸馏水洗涤,然后,将细菌纤维素块冷冻干燥,并储存在4℃备用;
(2)蛋白质溶液的变性和酶消化:
a、蛋白质在浓度为2μg/μL的50mM碳酸氢铵缓冲液中稀释,并在100℃水浴中变性5min,得到变性蛋白质;
b、在37℃用10mM二硫苏糖醇(DTT)还原变性蛋白质1h;
c、在步骤b中得到的物质中加入碘乙酰胺(IAA),在37℃用25mM烷基化反应0.5h;
d、在步骤c得到的物质中加入酶,酶与蛋白质的比例为1:50(w/w),并37℃下孵育过夜,然后在100℃煮5min终止酶解反应,得到消化的肽;
e、消化的肽,真空离心,冷冻干燥,得到冻干肽,储存在-20℃备用;
f、为了从肽中获得糖链混合物,将冻干肽溶解在50mM碳酸氢铵溶液(ABC)中,得到重溶肽段,并按照1:1(mg:μL)重溶肽段:肽N-糖苷酶F的比例加入肽N-糖苷酶F,释放糖链,在37℃下过夜反应释放糖链,,酶解产物经真空离心干燥,储存在-20℃备用。
(3)富集N-糖肽或N-糖链:将所述细菌纤维素块加入到含酶解产物的缓冲液中,摇床孵育10min,弃去溶液,用洗涤缓冲液洗涤细菌纤维素块,在室温下,用100μg洗脱液洗脱捕获的N-糖肽或N-糖链,洗脱时间为5min,得到N-糖肽或N-糖链。
作为本发明的进一步改进,蛋白质的预处理步骤d中加入的酶为胰蛋白酶(用于N-糖肽富集)或胰蛋白酶后再加肽N-糖苷酶F(用于N-糖链富集)。
作为本发明的进一步改进,当富集N-糖肽时,乙腈:水:甲酸=80:19:1(体积比),洗涤缓冲液为乙腈:水:甲酸=80:19:1(体积比),洗脱液为体积分数为0.1%的甲酸;当富集N-糖链时乙腈:水:甲酸=80:19:0.1(体积比),洗涤缓冲液为乙腈:水:甲酸=80:19:0.1(体积比),洗脱液为体积分数为0.1%的三氟乙酸。
本发明还提供一种用于富集N-糖肽或N-糖链的试剂盒,所述试剂盒包括细菌纤维素。
本发明公开了以下技术效果:
细菌纤维素(BC)是由微生物产生的结构性碳水化合物,细菌纤维素具有纳米尺寸的聚合物纤维。基于纤维素的亲水材料由于其优异的优点,如易获得性、大比表面积、高亲水性和生物相容性,在生物样品处理中日益流行。作为一种纤维素,细菌纤维素有其自身的优点,如高溶解能力、高拉伸强度和生物降解性。
超快高效地富集糖肽/糖链对于基于质谱(MS)的糖蛋白质组和糖组分析的效率和产量来说至关重要,特别是对于大规模样品分析。本发明提出了一种对完整糖肽和糖链进行超快高效富集的方法,并将其应用于人类血清样品。该方法采用天然亲水材料细菌纤维素(bacterial cellulose,BC),并对富集进行了充分优化。该方法具有以下优点:(1)富集材料具有天然亲水性,并且具有成本低、生物相容、可生物降解和容易获得的优点;(2)整个富集过程非常简单和快速。完整的糖肽/糖链只需10min就可以从混合物中轻松纯化出来;(3)该方法对糖链和糖肽富集的特异性均超过94%;(4)该方法的高特异性保证了完整糖肽和糖链有效分离富集。利用该方法,本发明从人免疫球蛋白G(IgG)中共鉴定出36种N-糖链和31条N-糖肽。细菌纤维素的糖链和糖肽吸收容量分别高达333μg/mg和250μg/mg(IgG/BC)。糖链和糖肽富集的选择性分别达到1:100(IgG/BSA,摩尔比)和1:200(DP7/BSA,摩尔比)。此外,使用该方法在人血清中共鉴定了159种N-糖链和523条N-糖肽。
本发明提供了一种用细菌纤维素对糖链或糖肽进行超快高效富集的、高特异性、易于操作的方法。充分优化了富集方法,并将其应用于人免疫球蛋白G(IgG)标准蛋白品和人血清样品中糖链和糖肽的全局分析。此外,细菌纤维素富集不受盐的影响,这允许样品在酶消化后直接富集,而不经历脱盐过程。本发明的富集方法具有高生物相容性、良好的亲水性、良好的选择性、低检测限(LODs)和优异的重现性。本发明提出的用细菌纤维素进行富集的方法对于糖链和糖肽的富集都具有重要意义,并且在大规模糖组学和糖蛋白质组学分析中显示出巨大的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为麦芽糖基葡萄糖(DP7)糖链富集优化的MALDI质谱分析,填充和清洗缓冲液如下:(A)5%ACN+0.1%TFA,(B)20%ACN+0.1%TFA,(C)40%ACN+0.1%TFA,(D)60%ACN+0.1%TFA,(E)80%ACN+0.1%TFA,(F)80%ACN+0.5%TFA,(G)80%ACN+1%FA,(H)80%ACN+0.1%FA,(I)80%ACN+0.5%FA,和(J)80%ACN+1%FA,[DP7+H]+和[DP7+Na]+的信号标有*;
图2为MALDI谱图的IgG糖肽富集优化,填充和清洗缓冲液如下:(A)65%ACN+0.1%FA,(B)70%ACN+0.1%FA,(C)75%ACN+0.1%FA,(D)80%ACN+0.1%FA,(E)65%ACN+0.5%FA,(F)70%ACN+0.5%FA,(G)75%ACN+0.5%FA,(H)80%ACN+0.5%FA,(I)65%ACN+1%FA,(J)70%ACN+1%FA,(K)75%ACN+1%FA,(L)80%ACN+1%FA,(M)65%ACN+0.1%TFA,(N)70%ACN+0.1%TFA,(O)75%ACN+0.1%TFA,(P)80%ACN+0.1%TFA,(Q)65%ACN+0.5%TFA,(R)70%ACN+0.5%TFA,(S)75%ACN+0.5%TFA,(T)80%ACN+0.5%TFA,(U)65%ACN+1%TFA,(V)70%ACN+1%TFA,(W)75%ACN+1%TFA,和(X)80%ACN+1%TFA,IgG糖肽信号用*标记;
图3中图A和图B为细菌纤维素的SEM表征图,图C为干的和湿的细菌纤维素片的照片,图D为细菌纤维素的氮吸附等温线,图E为细菌纤维素的孔径分布,图F为细菌纤维素的红外质谱分析;
图4为细菌纤维素对IgG酶解物和DP7的富集表现,其中图A为BC富集前IgG酶解物MALDI谱图,图B为BC富集后IgG酶解物MALDI谱图,图C为三次分析中3种最丰富的IgG糖链及其RSDs的相对丰度,图D为不同量的细菌纤维素富集富集10μg的IgG酶解物得到的糖链谱图展示,图E-G为富集不同浓度IgG酶解物的糖链MALDI-TOF-MS分析,其中(E)6.7pmol/μL、(F)3.3pmol/μL和(G)667fmol/μL MALDI-TOF-MS,图H-J为不同摩尔比例DP7和BSA混合后富集质谱分析,其中1:1(H)、1:10(I)和1:100(J),糖链用*标记;
图5为用IgG胰蛋白酶消化物富集细菌纤维素糖肽的性能,A为富集前的MALDI-TOF质谱,B为细菌纤维素富集后的质谱,C为三次分析中6种最丰富的IgG糖肽及其RSDs的相对丰度,D为5种最丰富的糖肽的MALDI质谱分析信号强度由100μg的被不同量的细菌纤维素消化的IgG富集,E为667fmol/μL,F为67fmol/μL,和G为6.7fmol/μL富集的IgG消化物的MALDI-TOF MS质谱,H-J为不同摩尔比富集后IgG和BSA混合物的MALDI-TOF-MS质谱,其中H摩尔比为1:10、I摩尔比1:100和J摩尔比1:200的MALDI-TOF-MS质谱,糖肽用*标记;
图6为使用细菌纤维素对从人血清中富集的糖肽进行的LC-MS/MS分析,其中A为已鉴定的糖蛋白、糖基化位点、完整糖肽和糖链的数量;B为从糖基化位点到n+2位点的氨基酸序列分析;C为在LC-MS/MS谱中鉴定的前5种糖链及其位置;D为已鉴定的糖链和糖基化位点相关分析,糖链和位点的颜色代表了在LC-MS/MS中鉴定到的谱图数。糖链分为5组(低聚甘露糖、不含岩藻糖/唾液酸的复合物/杂交物、岩藻糖基化、唾液酸化以及岩藻糖基化和唾液酸化)。糖基化位点分为3组(仅寡聚甘露糖、仅复合物/杂合体、以及寡聚甘露糖和复合物/杂合体),右边的条形图显示了与某一特定糖苷键相连的糖链的数量。底部的条形图显示了含有特定糖链的糖基的数量;E为与某个位点相连的糖链的数量(顶部)和位于某个蛋白质上的糖基的数量(底部)的统计结果;F为已鉴定糖肽的串联质谱展示;
图7为使用细菌纤维素BC从血清中富集的糖链的LC-MS/MS分析,其中(A)4种重复中已鉴定的糖链的文氏图;(B)已鉴定的糖链的糖链类型分布;(C)糖链[Hex]4[HexNAc]5[Fuc]1[NeuAc]1的串联质谱。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明细菌纤维素从上海奈雅生物技术有限公司购买。从默克(德国达姆施塔特)购买了LC-MS级的ZIC-HILIC色谱柱和乙腈(ACN)。肽N-糖苷酶F(PNGaseF,无甘油,500U/μL)从新英格兰生物获得(MA,U.S.A.)。蒸馏水通过默g密理博-Q系统净化(MA,U.S.A.)。测序级胰蛋白酶从中国北京华利世科学公司购买。甲酸(FA,98%)是从赛默飞世尔科技公司(沃尔瑟姆,MA)获得的。复旦大学上海中山医院提供了一份人类血清样本。人血清IgG、牛血清白蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、三氟乙酸(TFA)、麦芽七糖(DP7,95%)、和所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
如图3所示,用扫描电镜观察了细菌纤维素的孔结构和形貌(SEM;ZEISS德国GeminiSEM 500)。孔径分布和氮吸附/解吸等温线用氮吸附系统检测(微孔学,AsAp2010,GA,U.S.A.)。傅里叶变换红外(FT-IR)质谱分析由热尼科莱380质谱分析仪进行,样品为KBr颗粒形式(尼科莱6700,威斯康星州美国)。5800飞行时间/飞行时间(TOF/TOF)分析仪购自AB Sciex(MA,U.S.A.)。一台Orbitrap FusionTMTribridTM质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)与一个EASY纳米液相色谱系统相连。
采用纤维七糖(DP7)和牛血清蛋白(BSA)的混合物(1:1,w/w)用于优化糖链富集。含有不同比例的5%至80%(V%)的ACN和0.1%至1%(V%)的TFA/FA的溶液进行了富集(见图1)。如图1所示,DP7质谱分析的强度(MH+=1175)增加,并且随着ACN的比例从5%增加到80%,BSA肽的干扰减少。另一方面,当ACN的比例为80%时,极性溶剂的比例(TFA/FA)对糖链富集没有太大影响,这表明有机溶剂的比例是糖链富集的主要因素。因此,选择80%ACN和0.1%TFA的组合作为糖链富集中的填充和洗涤缓冲液。
采用来自人IgG标准蛋白的胰蛋白酶消化混合物来优化糖肽富集条件。将含有不同比例的65%至80%的ACN和0.1%至1%的TFA/FA的溶液进行置换组合和评估(图2)。一般来说,含FA的溶液比含TFA的溶液表现更好,因为后者不能消除m/z值低的非番茄肽。考虑到较高浓度的极性溶剂比低浓度的极性溶剂具有更高的洗涤能力,并且糖肽质谱分析的强度随着ACN比例的增加而增加,最终采用80%ACN和1%FA的溶液作为糖肽富集的孵育和洗涤步骤。
实施例1N-糖肽的富集
将细菌纤维素切成1cm×1cm的块,得到细菌纤维素块,用蒸馏水洗涤3次,然后,将细菌纤维素块冷冻干燥,并储存在4℃以备进一步使用。
蛋白质在浓度为2μg/μL的50mM碳酸氢铵(ABC)缓冲液中稀释,并在100℃水浴中变性5min。然后,在37℃用10mM DTT还原蛋白质1h,接着在37℃用25mM IAA烷基化反应0.5h。然后将胰蛋白酶以1:50(w/w)的酶:蛋白比加入溶液中,并在37℃下孵育过夜,然后在100℃煮5min终止酶解反应。消化的肽通过真空离心干燥,并储存在-20℃以备后用。
为了从肽中获得糖链混合物,将最后一步中的冻干肽溶解在50mM ABC中,并按照1:1(mg:μL)重溶肽段:肽N-糖苷酶F的比例加入肽N-糖苷酶F,释放糖链,在37℃下进行消化过夜,得到酶解产物肽/糖链混合物。酶解产物通过真空离心干燥,并储存在-20℃以备后用。
将一块细菌纤维素加入到含有1μg肽/糖链混合物的200μL填充缓冲液中,缓冲液CAN:H2O:FA=80:19:1。将混合物与细菌纤维素在摇床上孵育10min。然后,弃去溶液,用洗涤缓冲液CAN:H2O:FA=80:19:1洗涤BC 6次。在室温下,用100μg洗脱液0.1%FA将捕获的N-糖肽洗脱5min,得到N-糖肽。得到的洗脱液中含有糖肽,获得的溶液通过MALDI-TOF-MS或LC-MS-MS直接进行分析。
实施例2N-糖链的富集
将细菌纤维素切成1cm×1cm的块,得到细菌纤维素块,用蒸馏水洗涤3次,然后,将细菌纤维素块冷冻干燥,并储存在4℃以备进一步使用。
蛋白质在浓度为2μg/μL的50mM碳酸氢铵(ABC)缓冲液中稀释,并在100℃水浴中变性5min。然后,在37℃用10mM DTT还原蛋白质1h,接着在37℃用25mM IAA烷基化反应0.5h。然后将胰蛋白酶以1:50(w/w)的酶:蛋白比加入溶液中,并在37℃下孵育过夜,然后在100℃煮5min终止酶解反应。消化的肽通过真空离心干燥,并储存在-20℃以备后用。
为了从肽中获得糖链混合物,将最后一步中的冻干肽溶解在50mM ABC中,并以1:1(μL/mg)的酶:蛋白比加入糖链肽。在37℃下进行消化过夜,得到酶解产物肽/糖链混合物。酶解产物通过真空离心干燥,并储存在-20℃以备后用。
将一块细菌纤维素加入到含有1μg肽/糖链混合物的200μL填充缓冲液中,缓冲液CAN:H2O:TFA=80:19:0.1。将混合物与细菌纤维素在摇床上孵育10min。然后,弃去溶液,用洗涤缓冲液CAN:H2O:FA=80:19:0.1洗涤BC 6次。在室温下,用100μg洗脱液0.1%TFA将捕获的N-糖链洗脱5min,得到N-糖链。最后,获得的溶液通过MALDI-TOF-MS或LC-MS/MS。
实施例3表征细菌纤维素
细菌纤维素由具有β-1,4-糖苷键的糖链组成,并且具有互连的3D多孔网络结构。用SEM观察了细菌纤维素的形貌。如图3A和3B所示,细菌纤维素具有纳米级纤维结构。互连的3D多孔网络结构提供了高比表面积、强柔性和高拉伸强度。细菌纤维素具有显著的吸水能力。细菌纤维素干燥后形成固体薄片,而溶液吸收后膨胀类似凝胶(图3C)。通过吸水前后的质量变化来评价显著的水容量。细菌纤维素在水中能吸收80倍于自身重量的水分。
氮气吸附-解吸等温线进一步证明了细菌纤维素的多孔结构(图3D)。代表第四类等温线的磁滞回线表明细菌纤维素具有中等孔径。用N2吸附-解吸法计算的产品表面积高达29m2/g,证实了细菌纤维素具有高表面积。平均孔径为6.1687纳米,由Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型计算(图3E)。该孔径可有效富集糖肽并排除蛋白质。
细菌纤维素的化学组成和结构通过FT-IR质谱分析进行测试(图3F)。3368cm-1处的峰可归因于O-H键的拉伸振动,表明羟基的存在,其在亲水性富集中起重要作用。丰富的羟基允许细菌纤维素和糖肽或糖链之间的亲水性相互作用。此外,1036cm-1处的峰值可归因于C-O键的拉伸振动。
本发明从多个层面研究了细菌纤维素膜N-糖链富集性能。首先,从IgG标准蛋白中释放的N-糖链用于评估该方法的吸附能力。由于它们的低丰度和低解离效率,在没有纯化的情况下,很难通过MS检测糖链。在糖链/肽混合物中不能直接检测到糖链(图4A)。通过细菌纤维素富集后,可以通过MALDI-MS以相对高的强度和高的S/N比容易地检测到N-糖链(图4B,表1)。此外,采用相同的富集步骤,纯化的N-糖链通过PGC-LC-MS/MS。共鉴定出36个N-糖链(表2),显示了细菌纤维素富集N-糖链的良好能力。
表1人免疫球蛋白中的n-聚糖
序号 | 质荷比(m/z) | 聚糖组成 |
1 | 1485.5562 | [Hex]3[HexNAc]4[Fuc]1 |
2 | 1501.5316 | [Hex]4[HexNAc]4 |
3 | 1647.6046 | [Hex]4[HexNAc]4[Fuc]1 |
4 | 1663.6074 | [Hex]5[HexNAc]4 |
5 | 1688.6328 | [Hex]3[HexNAc]5[Fuc]1 |
6 | 1809.6615 | [Hex]5[HexNAc]4[Fuc]1 |
7 | 1825.6573 | [Hex]6[HexNAc]4 |
8 | 1850.7023 | [Hex]4[HexNAc]5[Fuc]1 |
9 | 2012.7806 | [Hex]5[HexNAc]5[Fuc]1 |
10 | 2157.9788 | [Hex]5[HexNAc]5[NeuAc]1 |
备注:Hex:己糖;HexNAc:N-乙酰氨基己糖;Fuc:岩藻糖;NeuAc:唾液酸
表2液相色谱-串联质谱法鉴定人IgG中的n-聚糖
备注:Hex:己糖;HexNAc:N-乙酰氨基己糖;Fuc:岩藻糖;NeuAc:唾液酸
然后,本发明对IgG酶解混合物的N-糖链富集,以进一步研究富集的重现性。选择通过MALDI-MS鉴定的前三个N-糖链的相对强度来计算三个平行实验之间的重现性(图4C)。在三个重复中,每种选择的糖链的强度没有显示出显著的差异,并且平均相对标准偏差(RSD)低于3.31%,这表明基于细菌纤维素的富集方法的高重现性。
此外,通过将不同量的细菌纤维素材料(0.10~0.60mg)与一定量的IgG糖链混合物(100μg)一起孵育来研究N-糖链的吸收能力。细菌纤维素富集糖链的能力高达333mg/g(IgG/BC)(图4D)。
富集方法的灵敏度和选择性
图4E-4G显示了通过MALDI-MS鉴定的具有不同初始IgG蛋白富集浓度(6.7pmol/μL、3.3pmol/μL和667fmol/μL)的糖链。结果显示,当初始IgG富集浓度降至667fmol/μL时,仍可检测到N-糖链。使用不同摩尔比的DP7和BSA评估细菌纤维素富集糖链的选择性(图4H-4J)。如图4J所示,即使当DP7和BSA的摩尔比高达1:100时,也可以识别出具有高S/N比的糖链信号([M+H]+=1175),这显示了糖链富集方法的高选择性。
通过使用人IgG胰蛋白酶消化物作为模型生物样品,本发明首先评估了细菌纤维素富集糖肽的效率。如图5A所示,糖肽的信号在富集前被高度丰富的非番茄肽抑制。从胰蛋白酶消化的IgG中只能直接检测到4种N-糖肽。此外,在细菌纤维素富集后,通过MALDI-MS分析鉴定出21个完整的N-糖肽,而非糖肽的干扰几乎完全消除(图5B,表3)。通过LC-MS/MS分析,共鉴定出31个完整的含5个糖基化位点的N-糖肽和21个糖链(表4)。以上结果说明细菌纤维素在N-糖肽富集方面具有优异的性能。
表3 MALDI-TOF测量人免疫球蛋白中的n-糖肽
序号 | 质荷比(m/z) | 肽段序列 | 聚糖组成 |
1 | 2398.6279 | EEQFNSTFR | [Hex]3[HexNAc]3[Fuc]1 |
2 | 2430.6611 | EEQYNSTFR | [Hex]3[HexNAc]4 |
3 | 2455.5842 | EEQFNSTFR | [Hex]3[HexNAc]4 |
4 | 2487.6582 | EEQYNSTYR | [Hex]3[HexNAc]4 |
5 | 2601.6729 | EEQFNSTFR | [Hex]3[HexNAc]4[Fuc]1 |
6 | 2617.6343 | EEQFNSTFR | [Hex]4[HexNAc]4 |
7 | 2633.6531 | EEQYNSTYR | [Hex]3[HexNAc]4[Fuc]1 |
8 | 2649.6377 | EEQYNSTYR | [Hex]4[HexNAc]4 |
9 | 2690.6914 | EEQYNSTYR | [Hex]3[HexNAc]5 |
10 | 2763.6978 | EEQFNSTFR | [Hex]4[HexNAc]4[Fuc]1 |
11 | 2777.7175 | EEQFNSTFR | [Hex]5[HexNAc]4 |
12 | 2779.6135 | EEQFNSTFR | [Hex]5[HexNAc]4 |
13 | 2795.6733 | EEQYNSTYR | [Hex]4[HexNAc]4[Fuc]1 |
14 | 2804.7422 | EEQFNSTFR | [Hex]3[HexNAc]5[Fuc]1 |
15 | 2811.6472 | EEQYNSTYR | [Hex]5[HexNAc]4 |
16 | 2836.6816 | EEQYNSTYR | [Hex]3[HexNAc]5[Fuc]1 |
17 | 2925.7083 | EEQFNSTFR | [Hex]5[HexNAc]4[Fuc]1 |
18 | 2957.6978 | EEQFNSTYR | [Hex]6[HexNAc]4 |
19 | 2965.7644 | EEQFNSTFR | [Hex]4[HexNAc]5[Fuc]1 |
20 | 2998.6987 | EEQYNSTYR | [Hex]4[HexNAc]5[Fuc]1 |
21 | 3160.7192 | EEQYNSTYR | [Hex]5[HexNAc]5[Fuc]1 |
备注:Hex:己糖;HexNAc:N-乙酰氨基己糖;Fuc:岩藻糖;NeuAc:唾液酸
表4液相色谱-串联质谱法鉴定人IgG中的n-糖肽
备注:Hex:己糖;HexNAc:N-乙酰氨基己糖;Fuc:岩藻糖;NeuAc:唾液酸;肽段序列中的J代表发生了糖基化氨基酸天冬酰胺(asparagine,N)
富集方法的重现性
通过MALDI-MS鉴定的前六个完整的N-糖肽的相对强度用于研究三个平行实验之间的重现性(图5C)。各糖肽的相对丰度无显著差异,平均RSD小于4.35%,具有良好的重现性。
此外,通过将不同量的细菌纤维素(0.10~0.60mg)与一定量的IgG胰蛋白酶消化物(100μg)孵育,考察了细菌纤维素对糖肽的吸附能力。如图5D所示,BC富集糖肽的能力高达250mg/g(IgG/BC),高于一些基于HILIC的方法,例如利用TpPa-1(178mg/g)和GO-Fe3O4/SiO2/AuNWs/L-Cys(150mg/g)的方法。
对N-糖肽富集的灵敏度和选择性的评价:不同初始蛋白浓度(667fmol/μL、67fmol/μL和6.7fmol/μL)的糖肽富集如图5E-5G所示。最低可检测蛋白浓度达到6.7fmol/μL,这表明N-糖肽富集法具有较高的灵敏度,并说明了其在低丰度糖肽样品富集中的应用前景。为了研究细菌纤维素对N-糖肽富集的选择性,将不同摩尔比的IgG和非糖基化蛋白BSA(1:100至1:200)混合并富集用于N-糖肽分析。图5H-5J显示的结果表明该富集方法具有高选择性和良好的抗干扰能力。
使用开发的BC法从人血清中提取糖链和完整糖肽
本发明进一步用细菌纤维素进行富集的方法应用于更复杂的生物样品,即10μL的混合人血清。用细菌纤维素能够超快高效地富集和鉴定N-糖链和完整的N-糖肽。
在N-糖链富集和分析中,通过对4个重复的人血清样品进行PGC-LC-MS/MS分析,共鉴定出159个独特的N-糖链(图7A,表5)。如图7B所示,复杂和杂合的糖链在人血清中占优势,而159种糖链中只有8种是低聚甘露糖型。
在完整的N-糖肽富集和分析中,本发明使用pGlyco2.0对质谱数据进行搜索,并设置1%错误发现率(FDR),一共鉴定到523条完整N-糖肽来自77种糖蛋白,包括了79种糖链和132个N-糖基化位点(图6A)。在523条完整的N-糖肽中,221条糖肽(40%)含有N-X-S基序,307条糖肽(59%)含有N-X-T基序,只有5条糖肽含有N-C基序(图6B)。血清中5种最丰富的糖链都是复合/杂合糖链。如图6C所示,2种糖链,[Hex]5[HexNAc]4[NueAc]2和[Hex]5[HexNAc]4[NueAc]1,在超过三分之二的糖基化位点和糖蛋白中被鉴定到,显示出极高丰度。在图6F中展示了一条糖肽的质谱图。图6D显示了已鉴定的糖链和糖基化位点的相关性分析。分析显示,大多数糖基化位点含有复合/杂合型糖链(97%),大约1/3的糖链同时被唾液酸化和岩藻糖化。此外,寡聚甘露糖在人血清中很少见。只有11个糖基化位点(3%)被寡聚甘露糖糖链修饰,6种糖链被鉴定为寡聚甘露糖(8%)。右侧的条形图显示糖基化位点含有的的糖链种类数量。拥有最多糖链种类(36种糖链组成)的糖基化位点属于人免疫球蛋白A(IgA)蛋白。糖链的巨大多样性反映了它们在免疫反应中的多功能性。图6E显示大约四分之三的糖基化位点具有一种以上的糖链,和43%的糖蛋白具有一个以上的糖基化位点,这反映了人血清中糖基化的异质性。
表5液相色谱-串联质谱法鉴定人血清中的n-聚糖
备注:Hex:己糖;HexNAc:N-乙酰氨基己糖;Fuc:岩藻糖;NeuAc:唾液酸
总之,本发明用细菌纤维素进行富集的方法操作简单,速度极快,并且在N-糖肽和N-糖链的富集和鉴定方面显示出优异的性能。整个富集过程可在10min内完成;此外,细菌纤维素富集不受盐的影响,允许样品在酶消化后直接富集,而无需经过脱盐步骤,这大大提高了MS质谱的糖蛋白质组和糖组分析的效率和产量。该富集方法具有高生物相容性、良好的亲水性、良好的选择性、低检测限(LODs)和优异的重现性。此外,该方法在大规模糖蛋白质组和糖组分析中显示出巨大的潜力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种富集N-糖链的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)蛋白质溶液的变性和酶消化:
a、蛋白质在浓度为2μg/μL的50mM碳酸氢铵缓冲液中稀释,并在100℃水浴中变性5min,得到变性蛋白质;
b、在37℃用10mM二硫苏糖醇还原变性蛋白质1h;
c、在步骤b中得到的物质中加入碘乙酰胺,在37℃用25mM 烷基化反应0.5h;
d、在步骤c得到的物质中加入酶,酶与蛋白质的比例为1:50(w/w),并37℃下孵育过夜,然后在100℃煮5min终止酶解反应,得到消化的肽;
e、消化的肽真空离心,冷冻干燥,得到冻干肽,储存在−20℃备用;
f、将冻干肽溶解在50mM碳酸氢铵溶液中,得到重溶肽段,加入肽N-糖苷酶F,重溶肽段与肽N-糖苷酶F的比例为1:1(mg:μL),在37℃下过夜反应释放糖链,酶解产物经真空离心干燥,储存在-20℃备用;
(2)富集N-糖链:将细菌纤维素块加入到含酶解产物的缓冲液中,摇床孵育10min,弃去溶液,用洗涤缓冲液洗涤细菌纤维素块,在室温下,用100μg洗脱液洗脱捕获的N-糖链,洗脱时间为5min,得到N-糖链。
2.根据权利要求1所述的富集N-糖链的方法,其特征在于,蛋白质的预处理步骤d中加入的酶为胰蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的富集N-糖链的方法,其特征在于,富集N-糖链时,缓冲液为乙腈、水和甲酸,体积比为80:19:0.1,洗涤缓冲液为乙腈、水和甲酸,体积比为80:19:0.1,洗脱液为体积分数为0.1%的三氟乙酸。
4.根据权利要求1所述的富集N-糖链的方法,其特征在于,所述细菌纤维素块经过预处理,具体步骤为:将细菌纤维素切成1cm×1cm的块,得到细菌纤维素块,用蒸馏水洗涤,然后,将细菌纤维素块冷冻干燥,并储存在4℃备用。
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