CN109762035A - 一种携带功能基团o-糖链的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种携带功能基团O‑糖链的制备方法，以全乙酰基保护的半乳糖胺为供体，以无水1,2‑二氯乙烷为溶剂，以三氟甲烷磺酸铜为催化剂，混合后加入受体，反应温度为110‑135℃，反应时间为6‑10h，得O‑糖链的前体类似物，经硅胶柱层析提纯，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚，展开剂为二氯甲烷和甲醇，提纯后再经细胞吸收，被细胞中酶利用，加工反应合成携带功能基团O‑糖链。该制备方法克服了传统化学法释放糖蛋白O‑糖链的缺陷，且还使糖链带上紫外基团，提高检测灵敏度，降低糖链极性，使糖链在色谱柱上保留，无需进行柱前衍生，便于糖链分离，既能用于糖链的微量分析又能用于糖链的制备，且得到的携带功能基团的O‑糖链还可用于后续糖芯片构建及功能分析。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种携带功能基团O-糖链的制备方法。
背景技术
O-糖链具有重要的生物学功能，如稳定蛋白质结构，参与细胞生长分化、细胞信号传递、介导病原菌感染等。但是，对于O-连接糖链，首先，O-糖基化没有保守的特征修饰序列用来预测糖基化位点；其次，已知O-连接糖链有8个核心结构，其结构变化与N-连接糖链相比更为复杂，合成无模板指导，且表达量低。最后，至今为止还未发现能将O-连接糖链整体从肽链上释放下来的通用内切酶，因此目前大多数研究人员都利用化学方法将O-连接糖链从肽段上释放下来，常用的化学法是碱性条件下的β-消除反应和肼解法。
肼解法可以用于释放N-连接糖链和O-连接糖链，但是因为该方法的反应条件比较剧烈，反应条件严苛，容易引起爆炸且肼是一种剧毒物质。因此，肼解法没有得到广泛应用。而β-消除反应是指糖蛋白在碱性环境下不稳定易发生β-消除造成糖肽键断裂从而使O-连接糖链从相应的糖蛋白上解离下来。但是非还原条件下糖链的半缩醛结构易发生peeling反应。为了阻止peeling反应，加入过量的还原剂将糖链的半缩醛结构还原为比较稳定的糖醇结构以保护糖链的还原性末端。因此，后续大多已发表的文献中均采用β-消除的方法进行O-连接糖链的释放，而且随着研究的不断发展其方法也在不断的改进和完善。
Rasilo等用硼烷氨络合物(NH3·BH3)代替了NaBH4，终止反应时不会产生大量的盐。Goetz等用28％的氨水溶解的硼烷氨络合物代替了NaOH和NaBH4，并对释放的糖链进行了甲基化修饰，虽然大大的提高了糖链的收率，但由于实验时间过长以及未能将糖链与肽段进行分离，还是造成了糖链的大量损失。非还原性释放及同时标记PMP：此方法由wang等2011年首先提出，基本原理是利用碱性环境对糖链进行解离，以及在碱性环境中对释放的糖链标记，以避免发生降解反应。它的最大优点是把释放和标记糖链结合了起来，简化了分析的步骤，避免了释放糖链过程中的副反应。但该法的样品需求量比较大，并且对酸性糖链的释放效率比较低。
由于O-糖链自身特性的原因，相对于N-糖链，O-糖链的研究还一直处于基础研究，对于O-糖链的功能研究甚少，因此，发展一种有效制备O-糖链的方法，同时实现对糖芯片构建以及后续功能分析具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种携带功能基团O-糖链的制备方法，该制备方法克服了传统化学法的缺陷、步骤简单、成本低廉，将其用于糖链的分析制备以及后续糖芯片构建等功能分析。
本发明提供的制备方法是基于寡糖代谢工程，先合成O-糖链的前体类似物，也就是O-糖基转移酶的抑制剂，再以细胞作为O-糖链合成的加工反应器，合成携带功能基团的O-糖链，该底物通过质谱以及核磁对其进行结构表征，糖链通过质谱对其进行分析。具体通过以下技术方案实现：
一种携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：制备O-糖链的前体类似物：以全乙酰基保护的半乳糖胺为供体，以无水1,2-二氯乙烷为溶剂，以三氟甲烷磺酸铜为催化剂，混合后加入受体，反应温度为110-135℃，反应时间为6-10h，得O-糖链的前体类似物；
步骤二：制备携带功能基团O-糖链：O-糖链的前体类似物经细胞吸收，被细胞中酶利用，加工反应合成携带功能基团O-糖链，释放到培养基中；
步骤三：从培养基中纯化携带功能基团O-糖链：利用C18柱纯化，先活化平衡、后上样、经水洗除杂，最后洗脱接样，得到携带功能基团O-糖链样品。
进一步地，上述O-糖链的前体类似物经硅胶柱层析提纯，提纯后再用于制备携带功能基团O-糖链，其中，洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚(v/v)＝4：1，展开剂：二氯甲烷：甲醇(v/v)＝15：1。
进一步地，上述受体的用量为供体用量的4倍当量。
进一步地，三氟甲烷磺酸铜的用量为供体用量的0.15倍当量。
进一步地，上述步骤一中反应温度为130℃，反应时间为6小时。
进一步地，上述受体为对硝基苯甲醇，对应的O-糖链的前体类似物为全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖，对应的携带功能基团O-糖链为对硝基苄基-O-糖链。
进一步地，上述受体为对乙炔基苯甲醇，对应的O-糖链的前体类似物为全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖，对应的携带功能基团O-糖链为对乙炔基苄基-O-糖链。
进一步地，上述步骤二中细胞密度达到80％的时候加样，培养3天，得到带功能基团的O-糖链。
进一步地，上述步骤三具体为：利用C18柱纯化，使用前先用2倍柱体积的乙腈活化，再加含0.1％TFA的50％乙腈洗柱10ml，然后水洗20ml平衡，最后上样，上样后水洗15ml除杂，然后再用3ml含0.05％TFA的10％乙腈洗脱接样，得到携带功能基团O-糖链样品。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的制备方法克服了传统化学法释放糖蛋白O-糖链的缺陷，且该方法还使糖链带上紫外基团，提高检测灵敏度，降低糖链极性，使糖链在色谱柱上保留，且无需进行柱前衍生，便于糖链分离，既能用于糖链的微量分析又能用于糖链的制备；此方法得到的携带功能基团的O-糖链还可以用于后续糖芯片构建及功能分析；且该制备方法操作步骤简单、成本低廉。本发明的制备方法适用于中性O-糖链、酸性O-糖链和岩藻糖修饰的O-糖链，不适用磷酸化，硫酸化的糖链。
附图说明
图1是一种携带功能基团O-糖链制备分离分析方法的模式图。
图2是全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的合成线路图。
图3是全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的合成线路图。
图4是全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的ESI-MS质谱图。
图5是全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的ESI-MS质谱图。
图6是全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的1H-NMR。
图7是全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的13C-NMR。
图8是全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的1H-NMR。
图9是全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的13C-NMR。
图10全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖经Hela细胞代谢得到的含对硝基苄基-O-糖链的质谱图。
图11全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖经Hela细胞代谢得到的含对乙炔基苄基-O-糖链的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所属领域的技术人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，例如，根据本发明反应条件做一些常规的修改，用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。
化合物的结构是通过核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)来确定的。1H-NMR和13C-NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。1H-NMR和13C-NMR的测定是用Bruker Avance IIIHD 600核磁共振谱仪，测定溶剂如无特别说明均为氘代氯仿(CDCl3)。用TMS(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰)，d(doublet，双峰)，t(triplet，三重峰)，m(multiplet，多重峰)，br(broadened，宽峰)，dd(doublet of doublets，双二重峰)，brs(broadened singlet，宽单峰)。偶合常数，用赫兹(Hz)表示。
柱层析一般使用青岛海洋化工300目～400目硅胶为载体。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用试剂、药品如无水1,2二氯乙烷(分析纯)、对硝基苯甲醇、氯化钠、亚硝酸钠、碳酸氢钠等，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或者可以采用或者按照本领域已知的方法来合成。
实施例中无特殊说明，无水反应均在氮气氛下进行；反应温度高于溶剂沸点时，在反应瓶上接冷凝管，以防止反应溶剂挥发。
氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氮气气球或钢釜。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC,silica gel UV254)反应所使用的展开剂的体系有：甲醇和二氯甲烷体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
实施例中所用细胞购于中国细胞库官网(ATCC)。
本发明中使用LTQ-XL型电喷雾电离质谱(ESI-MS)(美国Thermo Finnigan公司)，ESI-MS参数设置如下：进样量，2μL进样环控制；载样流动相为甲醇/水(50％/50％，v/v)；流速为50μL/min；工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQ Tune软件，样品均在正离子模式下检测。
该携带功能基团O-糖链制备分离分析方法的模式图如图1。
下面列举几个实施例以具体说明本发明的释放方法：
实施例1：
(1)将全乙酰基保护的半乳糖胺(60mg，0.154mmol)放入50mL的圆底烧瓶中，氮气保护下，溶于无水1,2-二氯乙烷(1.5mL)，加入无水硫酸钙除水(50mg)，室温搅拌10min。再向混合物体系中加入对硝基苯甲醇、无水三氟甲烷磺酸铜，此时α产物的产率最高)，加完后，反应体系在氮气保护下130℃冷凝回流反应6h。
对硝基苯甲醇的用量为全乙酰基保护的半乳糖胺的4倍当量，受体4倍当量的时候产率高，受体量再大，产率基本不变了，所以优选受体用量是供体用量的4倍当量。无水三氟甲烷磺酸铜的用量为全乙酰基保护的半乳糖胺的0.15倍当量，此时α产物的产率最高。反应温度可以为110-135℃，反应温度为130℃时，易于得到α产物，α构型的异构体是热力学上的产物，温度低时得到的基本都为β构型的产物，所以优选130℃。反应6-10小时后原料可以基本反应完。
薄层层析检测反应(展开剂：二氯甲烷：甲醇(v/v)＝15：1)。反应结束后，向圆底烧瓶中加入饱和碳酸氢钠水溶液使反应体系pH＝8，中和三氟甲烷磺酸铜催化剂，淬灭反应，然后离心，分出有机相，减压浓缩，所得浓缩物经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚(v/v)＝4：1)纯化，得到全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖为黄色糖浆(50.55mg，收率68％)，ESI-MS质谱图见图4，1H-NMR见图6，13C-NMR见图7，全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的合成线路图如图2。
产物结构确证：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.24(d,J＝8.6Hz,2H),7.49(d,J＝8.5Hz,2H),7.26(s,2H),5.61(d,J＝9.3Hz,1H),5.40(d,J＝2.3Hz,1H),5.21(dd,J＝11.4,3.2Hz,1H),5.08–4.91(m,1H),4.81(d,J＝12.8Hz,1H),4.62(d,J＝12.8Hz,2H),4.35–4.05(m,4H),2.24–1.90(m,11H),1.25(t,J＝7.1Hz,2H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ172.87,172.62,150.43,146.51,130.95,126.56,103.33,100.12,79.87,79.66,79.45,71.36,70.73,69.81,64.40,50.59,32.96,23.36,23.33,16.84.
ESI-MS:[M+Na]+505.08；C21H26N2O11[M+Na]+理论值m/z 505.33。
(2)在人宫颈癌细胞Hela细胞(细胞密度80％)培养过程中向培养基中添加全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖，它进入细胞后经细胞内酯酶的作用重新生成去乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖，可被细胞内的糖基转移酶利用生成还原端带有对硝基苄基的O-糖链，最后释放到培养基中，持续共培养3天为宜，然后通过对培养基中对硝基苄基-O-糖链进行质谱分析，对O-糖链结构进行初步确定，因其带上了发色基团，后续无需衍生就可实现分离制备，得到单个糖链，对具体结构的进行进一步解析，为后续功能分析奠定了基础。全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖经Hela细胞代谢得到的含对硝基苄基-O-糖链的质谱图见图10。
对硝基苄基的O-糖链的获得及分离纯化具体步骤：人宫颈癌细胞Hela的培养采用DMEM(HIGU GLUCOSE)培养基，培养基中含有10％(体积分数)胎牛血清和100U/ML青/链霉素，在37℃，5％CO2(体积分数)及95％空气饱和湿度的培养箱中进行细胞培养。当细胞密度为80％(细胞数为2×107)时，培养基血清含量换成8％进行培养，并向培养基中加入底物全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖(100μM)，培养3天，收集细胞培养液，过10kDa超滤膜(2500g，30min)分离，取下层溶液，过C18小柱进行纯化，纯化步骤如下：C18柱使用前先用2倍柱体积乙腈活化，再加50％乙腈(含0.1％TFA)洗柱10ml,然后水洗20ml平衡，最后上样，上样后水洗15ml除杂，然后再用3ml含0.05％TFA的10％乙腈洗脱接样，得到的糖链样品旋转蒸干后备用。
实施例2：
(1)将全乙酰基保护的半乳糖胺(60mg，0.154mmol)放入50mL的圆底烧瓶中，氮气保护下，溶于无水1,2-二氯乙烷(1.5mL)，加入无水硫酸钙(50mg)，室温搅拌10min。再向混合物体系中加入对乙炔基苯甲醇、无水三氟甲烷磺酸铜，加完后，反应体系在氮气保护下130℃冷凝回流反应6h。
对乙炔基苯甲醇的用量为全乙酰基保护的半乳糖胺的4倍当量，受体4倍当量的时候产率高，受体量再大，产率基本不变了，所以优选受体用量是供体用量的4倍当量。无水三氟甲烷磺酸铜的用量为全乙酰基保护的半乳糖胺的0.15倍当量，此时α产物的产率最高。反应温度可以为110-135℃，反应温度为130℃时，易于得到α产物，α构型的异构体是热力学上的产物，温度低时得到的基本都为β构型的产物，所以优选130℃。反应6-10小时后原料可以基本反应完。
薄层层析检测反应(展开剂：二氯甲烷：甲醇(v/v)＝15：1)。反应结束后，向圆底烧瓶中加入饱和碳酸氢钠水溶液使反应体系pH＝8，中和三氟甲烷磺酸铜催化剂，淬灭反应，然后离心，分出有机相，减压浓缩，所得浓缩物经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚(v/v)＝4：1)纯化，得到全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖为白色糖浆(49.78mg，收率70.1％)，得到的全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的ESI-MS质谱图见图5，1H-NMR见图8，13C-NMR见图9。全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖的合成路线图如图3。
产物结构确证：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.49–7.42(m,1H),7.27(d,J＝9.9Hz,4H),5.56(d,J＝9.6Hz,1H),5.38(d,J＝2.3Hz,1H),5.18(dd,J＝11.4,3.2Hz,1H),4.98(d,J＝3.6Hz,1H),4.75(d,J＝37.8Hz,1H),4.50(d,J＝12.0Hz,2H),4.25–4.10(m,4H),4.15–4.03(m,4H),3.10(s,1H),2.60(s,1H),2.24–1.87(m,13H),1.25(t,J＝7.1Hz,5H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ172.59,139.91,135.05,134.85,130.60,124.85,99.81,79.87,79.66,79.45,72.25,70.97,69.96,69.68,64.52,63.04,50.43,25.93,23.69,23.40,23.35,16.85.
ESI-MS:[M+Na]+484.08；C23H27NO9[M+Na]+理论值m/z 484.81。
(2)在人宫颈癌细胞Hela细胞(细胞密度80％)培养的过程中向培养基中添加全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖，它进入细胞后经细胞内酯酶的作用重新生成去乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖，可被细胞内的糖基转移酶利用生成还原端带有对乙炔基苄基的O-糖链，最后释放到培养基中，持续共培养3天为宜，然后通过对培养基中对乙炔基苄基-O-糖链进行质谱分析，对O-糖链结构进行初步确定，后续无需衍生就可实现分离制备，得到单个糖链，对具体结构的进行进一步解析，并且可连接在带有叠氮基的活性固相载体上，构建糖芯片，对O-糖链活性、功能的研究提供研究基础。全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖经Hela细胞代谢得到的含对乙炔基苄基-O-糖链的质谱图如图11。
对乙炔基苄基的O-糖链的获得及分离纯化具体步骤：人宫颈癌细胞Hela的培养采用DMEM(HIGU GLUCOSE)培养基，培养基中含有10％(体积分数)胎牛血清和100U/ML青/链霉素，在37℃，5％CO2(体积分数)及95％空气饱和湿度的培养箱中进行细胞培养。当细胞密度为80％(细胞数为2×107)时，培养基血清含量换成8％进行培养，并向培养基中加入底物全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖(100μM)，培养3天，收集细胞培养液，过10kDa超滤膜(2500g，30min)分离，取下层溶液，过C18小柱进行纯化，纯化步骤如下：C18柱使用前先用2倍柱体积乙腈活化，再加50％乙腈(含0.1％TFA)洗柱10ml,然后水洗20ml平衡，最后上样，上样后水洗15ml除杂，然后再用3ml含0.05％TFA的10％乙腈洗脱接样，得到的糖链样品旋转蒸干后备用。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：制备O-糖链的前体类似物：以全乙酰基保护的半乳糖胺为供体，以无水1,2-二氯乙烷为溶剂，以三氟甲烷磺酸铜为催化剂，混合后加入受体，反应温度为110-135℃，反应时间为6-10h，得O-糖链的前体类似物；
步骤二：制备携带功能基团O-糖链：O-糖链的前体类似物经细胞吸收，被细胞中酶利用，加工反应合成携带功能基团O-糖链，释放到培养基中；
步骤三：从培养基中纯化携带功能基团O-糖链：利用C18柱纯化，先活化平衡、后上样、经水洗除杂，最后洗脱接样，得到携带功能基团O-糖链样品。
2.如权利要求1所述的携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于：所述O-糖链的前体类似物经硅胶柱层析提纯，提纯后再用于制备携带功能基团O-糖链，其中，洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚(v/v)＝4：1，展开剂：二氯甲烷：甲醇(v/v)＝15：1。
3.如权利要求1所述的携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于：所述受体的用量为供体用量的4倍当量。
4.如权利要求1所述的携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于：三氟甲烷磺酸铜的用量为供体用量的0.15倍当量。
5.如权利要求1所述的携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于：所述步骤一中反应温度为130℃，反应时间为6小时。
6.如权利要求1所述的携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于：所述受体为对硝基苯甲醇，对应的O-糖链的前体类似物为全乙酰化的对硝基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖，对应的携带功能基团O-糖链为对硝基苄基-O-糖链。
7.如权利要求1所述的携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于：所述受体为对乙炔基苯甲醇，对应的O-糖链的前体类似物为全乙酰化的对乙炔基苄基-α-N-乙酰氨基半乳糖，对应的携带功能基团O-糖链为对乙炔基苄基-O-糖链。
8.如权利要求1所述的携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于：所述步骤二中细胞密度达到80％的时候加样，培养3天，得到带功能基团的O-糖链。
9.如权利要求1所述的携带功能基团O-糖链的制备方法，其特征在于：所述步骤三具体为：利用C18柱纯化，使用前先用2倍柱体积的乙腈活化，再加含0.1％TFA的50％乙腈洗柱10ml，然后水洗20ml平衡，最后上样，上样后水洗15ml除杂，然后再用3ml含0.05％TFA的10％乙腈洗脱接样，得到携带功能基团O-糖链样品。
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2019
- 2019-02-26 CN CN201910142856.5A patent/CN109762035A/zh active Pending
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