CN103675085A - 一种检测人血清中免疫球蛋白n糖链结构的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法，包括以下步骤：人血清中免疫球蛋白的纯化，免疫球蛋白上N糖链的释放，释放后的N糖链的纯化，以及通过质谱技术进行糖链结构信息的解析。本发明对糖链进行了纯化分离，具有更高的准确性，能够真实的再现疾病导致的细小变化，使N糖链的检测可以成为疾病诊断的实用工具。经过可行性验证，本发明的每个步骤都是可行的，准确的，对于N糖链的分析至关重要。

Description

一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法

技术领域

本发明涉及一种糖链分析方法，具体涉及一种分析人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法，属于生物技术领域。

背景技术

蛋白糖基化修饰是特异糖链在细胞内质网中添加到蛋白质上形成寡糖链的过程,具有酶定向和位点特异性。根据与糖链连接方式不同,蛋白质主要有N-连接和O-连接两种糖基化形式:前者是糖链与蛋白Asn-XXX-Ser/Thr序列子(XXX为除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn残基上的-NH2相连;后者则是糖链与蛋白Ser/Thr残基上的-OH相连。N-连接和O-连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面,也可以分泌型蛋白的形式存在。

免疫球蛋白是可溶性血清糖蛋白,可为高等脊椎动物提供针对已暴露抗原的长期保护。人类免疫球蛋白根据重链性质的不同分为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD5种。连接在免疫球蛋白上的寡糖分子量很大(每个约2kD),在不受其所在区域的限制时柔韧性很大。免疫球蛋白中的聚糖具有多种功能:(1)在维持抗体结构和与血清外源凝集素结合反应中扮演重要角色;(2)维持免疫球蛋白的溶解度、热稳定性和分子构象;(3)促进亚细胞间的运输、分泌和清除;(4)通过Fc和Fc受体间的有效结合保证免疫球蛋白的功能。

多年来,人们已对多种蛋白的糖基化修饰进行了广泛深入的研究,并清楚地认识到蛋白糖基化修饰在很多疾病的发生发展中扮演着重要角色。糖链结构信息包括糖链的单糖组成、异头碳构型、糖苷键的连接位置和糖残基的序列分析等内容。糖蛋白糖链的结构分析包括糖蛋白的提取分离、糖链释放和糖链结构鉴定等多个步骤，糖蛋白糖链结构分析因糖链复杂的不均一性和含量甚微备受挑战。质谱可以对各种糖链进行结构分析,是解决糖链结构的有效手段。本方法通过MSn技术可从样品中选择母离子进行逐级轰击分析,不受其他物质干扰,所获得的糖链结构信息更加详尽,功能强大。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法，提高检测的特异性、灵敏度和准确率。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链的方法，包括：人血清中免疫球蛋白的纯化，免疫球蛋白上N糖链的释放，释放后的N糖链的纯化，纯化后N糖链的标记，以及通过质谱MSn技术进行糖链结构信息的解析。

所述的人血清中免疫球蛋白的纯化步骤具体为：

（1）饱和硫酸铵溶液配制：称取硫酸铵800g，加入1L蒸馏水，加热不停搅拌，待完全溶解，冷却到室温，加氨水调节PH到7.2-7.4，保存于25℃以上的温度中备用；

（2）将人血清1500r/min离心10min，取上清液1mL，然后加入2mLPBS进行稀释，然后逐滴加入3mL饱和硫酸铵溶液，直至溶液变成白色浑浊液，4℃静置3h，使蛋白充分沉淀，然后在超速离心机上以5000r/min的速度离心，收集白色沉淀，即为免疫球蛋白粗蛋白，加入1mLPBS溶液溶解；

（3）准备一根长20cm的SPE柱，底部用尼龙膜封底，用前先用超纯水洗净，然后用PBS润洗，加入已经用水浸泡过夜的SephadexG25悬浊液，直至高度达到10-15cm，用5倍柱体积量的PBS润洗柱子，确保柱内的杂质被冲洗干净，将溶解的粗蛋白上样，待液面完全浸入柱内之后加入PBS洗脱，并用1.5mL规格的EP管收集蛋白，每管收集0.8mL，得到总免疫球蛋白，整个流程在4℃的冷库中进行。

所述的免疫球蛋白上N糖链的释放步骤具体为：

量取500微克IgG抗体于离心管中，加入10x5微升变性剂，45微升HPLCwater，混匀，在金属浴上加热100℃10min，冷却至室温加入5微升10xG7缓冲液，5微升10%NP-40缓冲液，加入1微升PNGaseF酶在37℃下过夜。

所述的释放后的N糖链的纯化步骤具体为：

(1)准备Spe-pakC18预装柱：用2ml乙腈润洗柱子，加入9ml平衡液（添加体积比0.1%三氟乙酸的2%乙腈水溶液）平衡C18柱子，彻底干燥酶处理以后的样品，然后以1ml平衡液溶解样品，并注入到柱子中去，额外加3ml上述平衡液对样品洗脱，然后收集得到4ml；

（2）真空干燥上述样品，在冰浴下加入300微升新鲜配制的NaBH₄溶液，然后室温下静置过夜，冰浴下加入5滴乙酸终止反应，然后升温至室温，并加入3ml乙醇，将该样品真空浓缩干燥；

（3）去除硼酸盐：加入3ml乙酸：甲醇=1:100溶液，真空浓缩干燥后再加入3ml甲苯，将此过程重复3次；准备多孔石墨化碳预装柱：洗柱子，依次加入下列试剂3ml：a）1MNaOH；b）HPLC水；c）含有体积比0.1%三氟乙酸的80%的乙腈水溶液；d）含有体积比0.05%三氟乙酸的25%的乙腈溶液；e）25%乙腈溶液；f）水，用6-8ml水平衡柱子。切割下来的糖链用1ml水溶解后上样，然后加入8-10ml水洗脱柱子，去除杂质和盐分。然后加入3ml25%ACN溶液就可以洗脱下中性的糖链（如果洗脱的糖是酸性的，需要加3ml体积比0.1%三氟乙酸的25%乙腈水溶液）。真空干燥样品，加入甲醇溶解样品准备质谱分析。

所述的通过质谱技术进行糖链结构信息的解析步骤具体为：

纯化好的N糖链加入300μL甲醇溶解，注入到质谱仪并在正离子条件下检测；质谱仪的参数设定如下：

流速：0.50μL/min，温度：230℃，氦气流速：2arb，电压：3.50kV，注入时间：100.00ms，分辨率：m/z1.5，注入体积：2μL。

本发明的有益效果：

1.质谱相对于其他的仪器，具有更好的灵敏度，能全面的分析抗体N糖基化的变化，对于及时检测病人病变微小的差异，实现对疾病的早期诊断具有重要意义。

2.对糖链进行了纯化分离，具有更高的准确性，能够真实的再现疾病导致的细小变化，使N糖链的检测可以成为疾病诊断的实用工具。

3.经过可行性验证，本发明的每个步骤都是可行的，准确的，对于N糖链的分析至关重要。

附图说明

图1为一级质谱下N糖链（A）m/z800-1500范围内的N糖链（B）m/z1500-2000范围内的N糖链。

具体实施方法

一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链的方法，包括：人血清中免疫球蛋白的纯化，免疫球蛋白上N糖链的释放，释放后的N糖链的纯化，纯化后N糖链的标记，以及通过质谱MSn技术进行糖链结构信息的解析。

所述的人血清中免疫球蛋白的纯化步骤具体为：

（1）饱和硫酸铵溶液配制：称取硫酸钠（Na₂SO₄）208g，及亚硫酸钠（Na₂SO₃）70g，加入蒸馏水约900ml，并加入浓硫酸2ml，使蒸馏水酸化，不停搅拌，待完全溶解后将溶液移入1L容量瓶内，用蒸馏水稀释至1L刻度，保存于25℃以上的温度中备用；

（2）将人血清1500r/min离心10min，取上清液1mL，然后加入2mLPBS进行稀释，然后逐滴加入3mL饱和硫酸铵溶液，直至溶液变成白色浑浊液，4℃静置3h，使蛋白充分沉淀，然后在超速离心机上以5000r/min的速度离心，收集白色沉淀，即为免疫球蛋白粗蛋白，加入1mLPBS溶液溶解；

（3）准备一根长20cm的SPE柱，底部用尼龙膜封底，用前先用超纯水洗净，然后用PBS润洗，加入已经用水浸泡过夜的SephadexG25悬浊液，直至高度达到10-15cm，用5倍柱体积量的PBS润洗柱子，确保柱内的杂质被冲洗干净，将溶解的粗蛋白上样，待液面完全浸入柱内之后加入PBS洗脱，并用1.5mL规格的EP管收集蛋白，每管收集0.8mL，得到总免疫球蛋白，整个流程在4℃的冷库中进行。

所述的免疫球蛋白上N糖链的释放步骤具体为：

量取500微克IgG抗体于离心管中，加入10x5微升变性剂，45微升HPLCwater，混匀，在金属浴上加热100℃10min，冷却至室温加入5微升10xG7缓冲液，5微升10%NP-40缓冲液，加入1微升PNGaseF酶在37℃下过夜。

所述的释放后的N糖链的纯化步骤具体为：

(1)准备Spe-pakC18预装柱：用2ml乙腈润洗柱子，加入9ml平衡液（添加体积比0.1%三氟乙酸的2%乙腈水溶液）平衡C18柱子，彻底干燥酶处理以后的样品，然后以1ml平衡液溶解样品，并注入到柱子中去，额外加3ml上述平衡液对样品洗脱，然后收集得到4ml；

（2）真空干燥上述样品，在冰浴下加入300微升新鲜配制的NaBH₄溶液，然后室温下静置过夜，冰浴下加入5滴乙酸终止反应，然后升温至室温，并加入3ml乙醇，将该样品真空浓缩干燥；

（3）去除硼酸盐：加入3ml乙酸：甲醇=1:100溶液，真空浓缩干燥后再加入3ml甲苯，将此过程重复3次；准备多孔石墨化碳预装柱：洗柱子，依次加入下列试剂3ml：a）1MNaOH；b）HPLC水；c）含有体积比0.1%三氟乙酸的80%的乙腈水溶液；d）含有体积比0.05%三氟乙酸的25%的乙腈溶液；e）25%乙腈溶液；f）水，用6-8ml水平衡柱子。切割下来的糖链用1ml水溶解后上样，然后加入8-10ml水洗脱柱子，去除杂质和盐分。然后加入3ml25%ACN溶液就可以洗脱下中性的糖链（如果洗脱的糖是酸性的，需要加3ml体积比0.1%三氟乙酸的25%乙腈水溶液）。真空干燥样品，加入甲醇溶解样品准备质谱分析。

所述的通过质谱技术进行糖链结构信息的解析步骤具体为：

纯化好的N糖链加入300μL甲醇溶解，注入到质谱仪并在正离子条件下检测；质谱仪的参数设定如下：

流速：0.50μL/min，温度：230℃，氦气流速：2arb，电压：3.50kV，注入时间：100.00ms，分辨率：m/z1.5，注入体积：2μL。

Claims (5)

1.一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：人血清中免疫球蛋白的纯化，免疫球蛋白上N糖链的释放，释放后的N糖链的纯化，以及通过质谱技术进行糖链结构信息的解析。

2.根据权利要求1所述的一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法，其特征在于，所述的人血清中免疫球蛋白的纯化步骤具体为：

（1）饱和硫酸铵溶液配制：称取硫酸铵800g，加入1L蒸馏水，加热不停搅拌，待完全溶解，冷却到室温，加氨水调节PH到7.2-7.4，保存于25℃以上的温度中备用；

（2）将人血清1500r/min离心10min，取上清液1mL，然后加入2mLPBS进行稀释，然后逐滴加入3mL饱和硫酸铵溶液，直至溶液变成白色浑浊液，4℃静置3h，使蛋白充分沉淀，然后在超速离心机上以5000r/min的速度离心，收集白色沉淀，即为免疫球蛋白粗蛋白，加入1mLPBS溶液溶解；

（3）准备一根长20cm的SPE柱，底部用尼龙膜封底，用前先用超纯水洗净，然后用PBS润洗，加入已经用水浸泡过夜的SephadexG25悬浊液，直至高度达到10-15cm，用5倍柱体积量的PBS润洗柱子，确保柱内的杂质被冲洗干净，将溶解的粗蛋白上样，待液面完全浸入柱内之后加入PBS洗脱，并用1.5mL规格的EP管收集蛋白，每管收集0.8mL，得到总免疫球蛋白，整个流程在4℃的冷库中进行。

3.根据权利要求1所述的一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法，其特征在于，所述的免疫球蛋白上N糖链的释放步骤具体为：

量取500微克IgG抗体于离心管中，加入10x5微升变性剂，45微升HPLC水，混匀，在金属浴上加热100℃10min，冷却至室温加入5微升10xG7缓冲液，5微升10%NP-40缓冲液，加入1微升PNGaseF酶在37℃下过夜。

4.根据权利要求1所述的一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法，其特征在于，所述的释放后的N糖链的纯化步骤具体为：

(1)准备Spe-pakC18预装柱：用2ml乙腈润洗柱子，加入9ml平衡液（添加体积比0.1%三氟乙酸的2%乙腈水溶液）平衡C18柱子，彻底干燥酶处理以后的样品，然后以1ml平衡液溶解样品，并注入到柱子中去，额外加3ml上述平衡液对样品洗脱，然后收集得到4ml；

（2）真空干燥上述样品，在冰浴下加入300微升新鲜配制的NaBH₄溶液，然后室温下静置过夜，冰浴下加入5滴乙酸终止反应，然后升温至室温，并加入3ml乙醇，将该样品真空浓缩干燥；

（3）去除硼酸盐：加入3ml乙酸：甲醇=1:100溶液，真空浓缩干燥后再加入3ml甲苯，将此过程重复3次；准备多孔石墨化碳预装柱：洗柱子，依次加入下列试剂3ml：a）1MNaOH；b）HPLC水；c）含有体积比0.1%三氟乙酸的80%的乙腈水溶液；d）含有体积比0.05%三氟乙酸的25%的乙腈溶液；e）25%乙腈溶液；f）水，用6-8ml水平衡柱子。切割下来的糖链用1ml水溶解后上样，然后加入8-10ml水洗脱柱子，去除杂质和盐分。然后加入3ml25%ACN溶液就可以洗脱下中性的糖链（如果洗脱的糖是酸性的，需要加3ml体积比0.1%三氟乙酸的25%乙腈水溶液）。真空干燥样品，加入甲醇溶解样品准备质谱分析。

5.根据权利要求1所述的一种检测人血清中免疫球蛋白N糖链结构的方法，其特征在于，所述的通过质谱技术进行糖链结构信息的解析步骤具体为：

纯化好的N糖链加入300μL甲醇溶解，注入到质谱仪并在正离子条件下检测；质谱仪的参数设定如下：

流速：0.50μL/min，温度：230℃，氦气流速：2arb，电压：3.50kV，注入时间：100.00ms，分辨率：m/z1.5，注入体积：2μL。

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