CN113383003A - 由糖蛋白制备糖链的方法、试剂盒和装置 - Google Patents

Abstract

由糖蛋白制备糖链的方法、以及用于由糖蛋白制备糖链的试剂盒和装置，所述方法包括：(I)使包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离溶液接触糖蛋白，使糖链自糖蛋白游离，得到包含糖链的含糖链样品的工序；(II)使含糖链样品接触纯化剂，使前述糖链吸附至纯化剂的工序，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链；(III)使糖链自纯化剂溶出的工序。

Description

由糖蛋白制备糖链的方法、试剂盒和装置

技术领域

本发明涉及由糖蛋白制备糖链的方法、试剂盒和装置。

背景技术

构成生物体的蛋白质大多受到糖链修饰，以键合有糖链的糖蛋白的形式存在。蛋白质通过该糖链修饰来调节高阶结构形成、细胞间信号传导、分子识别等功能、以及体内动态等。已知该糖蛋白的糖链的结构和分布会干预蛋白质的功能表达，随着多种疾病的发病、加剧，糖链结构会发生变化，存在糖蛋白的糖链可用作疾病生物标记物的可能性。此外启示出：在生物药品中，糖链不仅影响该药品的活性，还对抗原性、动态造成影响。

因此，可期待糖蛋白的结构分析在伴有糖链结构变化的各种疾病的发病机理的阐明、疾病治疗和诊断技术的开发等生命科学、医疗、新药等各种技术领域中发挥重要的作用，糖链结构分析的重要性日益提高。

因此，寻求构建可迅速、简便且高精度地分析糖链结构的技术。糖链的分析一般通过高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振法、毛细管电泳法(CE法)、质谱分析法或它们的组合来进行。然而，为了通过上述方法来分析糖链，首先，必须使糖链自糖蛋白游离，并仅提纯(回收)所游离的糖链。

糖蛋白根据糖链与蛋白质的键合方式而分成N键合型糖链和O键合型糖链，以往，糖链自糖蛋白的游离通过与各个糖链相符的方法来进行。

例如，为了使N键合型糖链游离，可使用PNGaseF、糖肽酶A等酶使糖链游离。然而，使用酶使糖链游离时，预先将蛋白质用二硫苏糖醇等还原试剂处理后，通过使用碘代乙酰胺等烷基化剂进行处理而使其改性，进而，用胰蛋白酶等蛋白酶将其分解成肽后，使其与糖链游离酶反应而使糖链游离，因此，还包括前处理在内需要长时间。进而，由于PNGaseF、糖肽酶A非常昂贵，且进行多检体的分析，因此产生相当大的成本负担。

此外，还有不使用酶地而通过肼分解法等的化学反应使糖链游离的方法。例如，根据肼分解法，使充分干燥的糖蛋白溶解于无水肼，并在100℃下进行10小时以上的加热处理，主要用作使N键合型糖链游离的方法。需要在反应后减压馏去无水肼，进而使用碳酸氢钠和乙酸酐来进行乙酰化。其是因键合于糖链的N乙酰基、N羟乙酰基也分解并转化成氨基，因而肼通过乙酰化来恢复原状的操作。然而，肼分解法需要完全的无水条件，反应体系内即便是少量只要混入水就会导致显著的收率降低。因此，需要预先将试样充分减压干燥后再反应。进而，反应时间为10小时以上，若反应后还包括肼的馏去、再乙酰化，则至全部工序结束为止至少需要2天以上。进而，肼也是具有致癌性的毒物，且还是易爆炸性的化合物，因此，其处理需要多加注意。此外，通过乙酰化，在原本键合有N羟乙酰基等其它酰基的情况下，也全部作为N乙酰基体进行分析，因此，还存在无法进行N羟乙酰基神经氨酸的分析的问题。尤其是，在生物医药、糖链疾病标记物中，作为一种唾液酸的N羟乙酰基神经氨酸的有无有时会成为问题。

针对O键合型糖链的游离，尚未发现具有实用性的酶，因此，专门利用基于化学反应的游离。作为用于发生游离的化学反应，广泛使用在强碱水溶液中使糖链发生β脱离的方法。然而，游离出的糖链在碱的存在下立即被分解，因此，通常使用通过在硼氢化钠的共存下进行反应而将游离出的糖链立即还原成醛糖醇的方法。

由于用于赋予荧光标记的糖链侧的官能团即醛基被还原而变为醇，因此，游离出的醛糖醇无法赋予荧光标记。因此，一般将醛糖醇的全部羟基进行甲基化(完全甲基化)后，再利用质谱分析仪进行分析。

作为在保留醛基的状态下使O键合型糖链化学游离的其它方法，已知前述的肼分解法。在反应后，进行肼的馏去、再乙酰化，赋予荧光标记后，使用HPLC等进行分析。

另一方面，在使O键合型糖链游离的情况下，无论是肼分解法还是碱β脱离法，均必定伴有键合在糖链的还原末端的N乙酰基氨基半乳糖的3位上的糖发生脱离的副反应(剥离反应)。即便为了抑制该副反应而利用弱碱来进行β脱离法，也会存在如下问题：不仅无法避免剥离，游离效率也会显著降低。此外，反应时间也耗费16小时以上。

此外，在为了抑制剥离而使硼氢化钠共存的方法中，由于无法对还原末端赋予标记试剂，因此，无法利用HPLC等高灵敏度地进行分析。

本发明人等作为使用安全且廉价的药品，且不使用特别的系统而在短时间的处理时间内使N键合型糖链和O键合型糖链自蛋白质游离的方法，构建了如下方法：在羟胺的存在下，在水溶液中使用碱性催化剂使糖链自糖蛋白游离(专利文献1)。

此外，以往，自糖蛋白游离的糖链的纯化通过下述方法等来进行：例如，利用亲水性相互作用的方法；通过利用苯基硼酸等来形成共价键的方法；利用与凝集素的相互作用的方法；利用与钛(例如氧化钛(TiO₂))、锆、银等的螯合相互作用的方法等(例如参照非专利文献1等)。

此处，利用亲水性相互作用的方法是利用糖链的理化性质的方法，其利用在琼脂糖凝胶的羟基与糖链之间形成的氢键，通过琼脂糖凝胶珠选择性地吸附并回收糖链(例如参照非专利文献1和2等)。然而，由于琼脂糖凝胶与糖链的相互作用弱，因此，分子量小的O键合型糖链受到样品中包含的蛋白质、肽片段等夹杂物的影响，对琼脂糖凝胶珠的保持变弱。因此，存在导致糖链的浓缩效率、重现性降低的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2008/062167号公报

非专利文献

非专利文献1：Chen-Chun Chen et al., “Interaction modes and approachesto glycopeptide and glycoprotein enrichment”, Analyst, 2014, vol. 139, p.688-704

非专利文献2：Michiko Tajiri et al., “Differential analysis of site-specific glycans on plasma and cellular fibronectins: Application of ahydrophilic affinity method for glycopeptide enrichment”, Glycobiology, 2005,vol. 15, no.12, p.1332-1340。

发明内容

发明所要解决的课题

因而，本发明提供既能够抑制糖链的分解，又能够通过简便的操作在短时间内由糖蛋白制备糖链的糖链制备技术。尤其是，其目的在于，提供能够以高收率回收包括分子量小的O键合型糖链在内的糖链的糖链制备技术。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：通过使包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离溶液接触糖蛋白，使糖链自糖蛋白游离，接着，使其接触包含具有内铵盐结构的化合物的纯化剂，从而能够以高收率回收包括分子量小的O键合型糖链在内的糖链。此外发现：该反应能够通过简便的操作在短时间内进行，且还能够抑制糖链的分解(剥离)。

即，本发明提供由糖蛋白制备糖链的方法、试剂盒和装置，详细而言，包括以下的技术方案。

〔1〕由糖蛋白制备糖链的方法，其包括：

(I)使包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离溶液接触前述糖蛋白，使糖链自前述糖蛋白游离，得到包含糖链的含糖链样品的工序；

(II)使前述含糖链样品接触纯化剂，使前述糖链吸附于前述纯化剂的工序，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链；

(III)使前述糖链自前述纯化剂溶出的工序。

〔2〕根据上述〔1〕的方法，其还包括：(IV)使糖链标记溶液中的糖链标记试剂与糖链反应的糖链标记工序。

〔3〕根据上述〔2〕的方法，其还包括：(V)与包含还原试剂的还原溶液反应的还原工序。

〔4〕根据上述〔3〕的方法，其中，前述还原溶液中的前述还原试剂的浓度为1.0mmol/L以上且250mmol/L以下。

〔5〕根据上述〔1〕~〔4〕的方法，其中，前述糖链游离溶液中的羟胺类为2%以上且70%以下。

〔6〕根据上述〔1〕~〔5〕的方法，其中，前述羟胺化合物为选自羟胺、羟胺的盐、O取代羟胺和O取代羟胺的盐中的至少一种。

〔7〕根据上述〔1〕~〔6〕的方法，其中，前述碱性试剂为选自碱金属的氢氧化物、碱金属的弱酸盐、碱土金属的氢氧化物、溶解于氨水溶液的碱土金属的盐和有机碱中的至少一种。

〔8〕根据上述〔7〕的方法，其中，前述碱金属的氢氧化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，前述碱金属的弱酸盐为碳酸氢钠或碳酸钠，前述碱土金属的氢氧化物为氢氧化钙、氢氧化钡或氢氧化锶，前述碱土金属的盐为乙酸钙、氯化钙、乙酸钡或乙酸镁，前述有机碱为1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍或鲸蜡基三甲基氢氧化铵。

〔9〕根据上述〔1〕~〔8〕所述的方法，其中，前述纯化剂包含前述具有内铵盐结构的化合物作为有效成分。

〔10〕根据上述〔9〕的方法，其中，前述纯化剂是主链上键合有具有前述内铵盐结构的侧链的聚合物被固定于不溶性支撑体而成的糖链浓缩载体。

根据上述构成，通过使用安全且廉价的药品，能够抑制糖链的分解(剥离)且在短时间的处理时间内使糖链自糖蛋白游离。进而，通过使用亲水度得以有效提高的纯化剂，能够使游离出的糖链、包括分子量小的O键合型糖链在内特异性地吸附至该纯化剂。由此，能够有效地从糖蛋白中回收糖链。因此，根据上述构成，能够通过简便的操作在短时间内以高收率由糖蛋白制备糖链。

此外，根据上述〔2〕的构成，能够利用标记试剂对游离出的糖链进行标记。进而，根据上述〔3〕的构成，能够利用还原试剂将糖链与标记试剂的复合体还原，由此，能够使糖链与标记试剂的复合体稳定化，能够提高标记效率。尤其是，通过将还原试剂设为上述〔4〕的构成的浓度范围，能够进一步提高糖链的标记效率。

〔11〕用于由糖蛋白制备糖链的试剂盒，其包含：

(a)羟胺化合物、

(b)碱性试剂、

(c)纯化剂，其包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链。

〔12〕根据上述〔11〕的试剂盒，其还包含(d)糖链标记试剂。

〔13〕根据上述〔11〕或〔12〕的试剂盒，其中，前述羟胺化合物为选自羟胺、羟胺的盐、O取代羟胺和O取代羟胺的盐中的至少一种。

〔14〕根据根据权利要求〔11〕~〔13〕中任一项的试剂盒，其中，前述碱性试剂为选自碱金属的氢氧化物、碱金属的弱酸盐、碱土金属的氢氧化物、溶解于氨水溶液的碱土金属的盐和有机碱中的至少一种。

〔15〕根据上述〔14〕的试剂盒，其中，前述碱金属的氢氧化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，前述碱金属的弱酸盐为碳酸氢钠或碳酸钠，前述碱土金属的氢氧化物为氢氧化钙、氢氧化钡或氢氧化锶，前述碱土金属的盐为乙酸钙、氯化钙、乙酸钡或乙酸镁，前述有机碱为1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍或鲸蜡基三甲基氢氧化铵。

根据上述构成，通过将对于由糖蛋白制备糖链而言必须的试剂类制成试剂盒，能够更简便且短时间地进行糖链的制备。

〔16〕用于由糖蛋白制备糖链的装置，其具备：

第一容器保持部，其保持用于容纳包含前述糖蛋白的含糖蛋白样品的第一容器；试剂导入部，其向前述第一容器中导入试剂；以及第二容器保持部，其保持包含纯化剂的第二容器，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链，

前述试剂导入部包括：向前述第一容器中导入包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离试剂的糖链游离试剂导入部。

〔17〕根据上述〔16〕的装置，其中，前述试剂导入部还包括：导入糖链标记试剂的糖链标记试剂导入部。

〔18〕根据上述〔16〕或〔17〕的装置，其具备：对前述第二容器的容纳物进行固液分离的固液分离部。

根据上述构成，通过将对于由糖蛋白制备糖链而言必须的试剂和构件类制成装置，从而能够更简便且短时间地进行糖链的制备。

附图说明

图1是示意性地示出本实施方式所述的糖链制备纯化剂的一例的图。

图2是表示对糖链标记时的还原试剂浓度与收率的关系进行验证的实施例2的结果的图(低浓度侧)。

图3是表示对糖链标记时的还原试剂浓度与收率的关系进行验证的实施例2的结果的图(高浓度侧)。

图4是通过与比较例4和比较例5的对比来表示对糖链的制备进行验证的实施例3的结果的HPLC分析谱图。

图5是通过与比较例4和比较例5的对比来表示对糖链的制备进行验证的实施例3的结果的图。

具体实施方式

以下，针对本发明的实施方式进行详细说明。但本发明不限定于后述实施方式。

[由糖蛋白制备糖链的方法]

本实施方式所述的由糖蛋白制备糖链的方法包括：

(I)使包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离溶液接触前述糖蛋白，使糖链自前述糖蛋白游离，得到包含糖链的含糖链样品的工序；

(II)使前述含糖链样品接触纯化剂，使前述糖链吸附至前述纯化剂的工序，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链；

(III)使前述糖链自前述纯化剂溶出的工序，由此，能够由糖蛋白制备糖链。

本说明书中，“糖蛋白”是指：在蛋白质的氨基酸序列中至少键合有一个以上的O键合型糖链或N键合型糖链的蛋白质。在由糖蛋白制备糖链的方法中成为对象的糖蛋白没有特别限定，可以为天然来源，也可以为合成的糖蛋白。

此外，“糖链”包含O键合型糖链和N键合型糖链，O键合型糖链和N键合型糖链中的任意糖链均可作为由糖蛋白进行制备的对象。O键合型糖链是在蛋白质的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的氨基酸残基中借助各氨基酸侧链所含的-OH基键合有糖链的结构。此外，O键合型糖链根据芯的结构而分类为1~8种。此外，N键合型糖链是指与蛋白质的天冬酰胺残基的侧链的酰胺基的氮原子键合的糖链。N键合型糖链包含以甘露糖为基点而形成了分枝的糖链，例如，有2条支链、3条支链、4条支链等。此外，N键合型糖链可根据其结构而分类为基本型、高甘露糖型、混合型、复合型等。

〔工序(I)/含糖链样品获取工序〕

工序(I)是使包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离溶液接触糖蛋白，使糖链自糖蛋白游离，得到包含糖链的含糖链样品的工序。

“糖链游离溶液”只要最终呈现糖蛋白、羟胺类和碱性试剂相接触的状态即可，与糖蛋白的接触、混合的顺序随意。例如，可以首先向糖蛋白中添加羟胺类，其后添加碱性试剂。或者，也可以首先向糖蛋白中添加碱性试剂，其后添加羟胺类。或者，还可以首先将羟胺类与碱性试剂混合，并向其中添加糖蛋白。需要说明的是，在O键合型糖链的情况下，为了抑制糖链的分解(剥离)，优选先添加羟胺类。

此处，作为本实施方式中可使用的“羟胺类”，可列举出羟胺、羟胺的盐、O取代羟胺、O取代羟胺的盐。具体而言，不限定于以下，但可列举出例如选自羟胺盐酸盐、羟胺水溶液、羟胺硫酸盐、羟胺磷酸盐、O甲基羟胺盐酸盐、O乙基羟胺盐酸盐、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟胺、硝基苄基羟胺盐酸盐、O-叔丁基二甲基甲硅烷基羟胺、O-三甲基甲硅烷基羟胺中的至少一种化合物。需要说明的是，可以组合使用上述化合物中的两种以上。在优选实施方式中，“羟胺类”为羟胺水溶液。

“羟胺类”的最终浓度例如可以设为2%(w/w)以上且70%(w/w)以下、例如可以设为2%(w/w)以上且50%(w/w)以下的浓度范围。然而，不限定于上述浓度范围，只要是本领域技术人员，则可根据作为对象的糖蛋白的种类、其它成分(胺类、碱性试剂、其它添加剂)、接触条件(时间、温度等)等来适当调整。

尤其是，在使O键合型糖链游离的情况下，“羟胺类”的最终浓度优选尽可能高。因此，在使O键合型糖链游离的情况下，“羟胺类”的最终浓度例如可以为5%(w/w)以上且70%(w/w)以下、例如可以为10%(w/w)以上且60%(w/w)以下的浓度范围。

需要说明的是，在使N键合型糖链游离的情况下，“羟胺类”的最终浓度可以设为2%(w/w)以上且50%(w/w)以下，可优选设为2%(w/w)以上且20%(w/w)以下。

使用羟胺作为“羟胺类”时，若羟胺的浓度超过2%(w/w)且为50%(w/w)以下，则存在能够获得充分的糖链回收量且羟胺也稳定的倾向。

此外，作为本实施方式中可使用的“碱性试剂”，可列举出选自碱金属的氢氧化物、碱金属的弱酸盐、碱土金属的氢氧化物、溶解于氨水的碱土金属的盐、以及有机碱中的至少一种化合物。

作为碱金属的氢氧化物，不限定于以下，但可列举出例如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾。

此外，作为碱金属的弱酸盐，不限定于以下，但可列举出例如碳酸氢钠、碳酸钠。

此外，作为碱土金属的氢氧化物，不限定于以下，但可列举出例如氢氧化钙、氢氧化钡、氢氧化锶。

此外，作为溶解于氨水的碱土金属的盐，不限定于以下，但可列举出例如乙酸钙、氯化钙、乙酸钡、乙酸镁。

这些之中，特别优选为氢氧化锂。

此外，作为有机碱，不限定于以下，但可列举出例如DBU：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)、TBD：1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸烷-5-烯(1,5,7-Triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene)、MTBD：7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(7-Methyl-1,5,7-triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene)、TMG：1,1,3,3-四甲基胍(1,1,3,3-Tetramethylguanidine)、t-BuTMG：2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍(2-叔Butyl-1,1,3,3-tetramethylguanidine)、DBN：1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(1,5-diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene)、CTAH：鲸蜡基三甲基氢氧化铵(cetyltrimethylammonium hydroxide)等。需要说明的是，可以组合使用前述化合物中的两种以上。在优选实施方式中，“有机碱”为有机强碱(pKa为12以上)，具体而言，可列举出DBU、TMG、TBD、MTBD、CTAH。通过将这些DBU、TMG、TBD、MTBD、CTAH用作“有机碱”，在能够通过基于有机溶剂的清洗来去除反应后的碱这一点上是优选的。

“碱性试剂”的最终浓度可以设为例如2mM以上且10M以下的浓度范围。然而，不限定于上述浓度范围，只要是本领域技术人员，则可根据作为对象的糖蛋白的种类、反应液中的其它成分(羟胺类、其它添加剂)、反应条件(时间、温度等)等来适当调整。需要说明的是，例如，使用氢氧化锂作为“碱性试剂”时，可以设为6mM以上且8M以下。通过使碱性试剂的浓度为上述下限值以上，能够使反应时间为短时间，通过设为上述上限值以下，能够抑制所残留的碱性试剂对下一工序的影响。

羟胺类与碱性试剂的摩尔比优选设为1:2以上且300:1以下，更优选设为1:1以上且100:1以下。通过将羟胺类与碱性试剂的摩尔比设为上述范围，能够抑制游离出的糖链的分解(剥离)反应，且能够提高糖链的收率。

只要能够从成为对象的蛋白质中游离出糖链，使糖蛋白与糖链游离溶液接触的温度、时间等条件没有特别限定，本领域技术人员可根据成为对象的糖蛋白、羟胺类、碱性试剂的种类、浓度等条件来适当设定。需要说明的是，温度可以设为例如室温以上且80℃以下。需要说明的是，通过降低反应温度，能够抑制糖链分解(剥离)率。尤其是，N羟乙酰基等在高温下反应时容易被分解，因此，以具有未知糖链的糖蛋白作为对象时，优选设为50℃以下，可以设为例如37℃左右。此外，时间也可根据条件而设为约5分钟~16小时。

可以向糖链游离溶液中进一步添加胺类。作为胺类，不限定于以下，但可列举出例如选自氨水、甲胺水溶液、二甲胺水溶液、乙胺、二乙胺、乙醇胺、乙二胺、丁胺、吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸中的至少一种化合物。此外，需要说明的是，也可以组合使用前述化合物中的两种以上。胺类优选为氨水、吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸。通过将氨水、吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸等用作胺类，从而在抑制剥离、异构化、酰胺分解的方面是优选的。尤其是，使用与氨相比pKa低的吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸等时，在能够抑制使N键合型糖链游离时的副反应、即异构化的方面是优选的。

胺类的最终浓度可以设为例如40mM以上且15M以下的浓度范围。然而，不限定于上述浓度范围，如果是本领域技术人员，则可以根据作为对象的糖蛋白的种类、反应液中的其它成分(羟胺类、碱性试剂、其它添加剂)、反应条件(时间、温度等)等来适当调整。需要说明的是，例如，使用氨水作为胺类时，反应液中的氨的最终浓度可以设为2%(w/w)以上且25%(w/w)以下，可优选设为10%(w/w)以上且20%(w/w)以下。更优选为20%(w/w)。

此处，如上所述，尤其是使O键合型糖链游离时，羟胺类的最终浓度优选尽可能高。然而，糖蛋白与反应液的混合液包含高浓度的羟胺类时，有时使糖链游离后的混合液中残留未反应的羟胺类。未反应的羟胺类在标记糖链并分析时会阻碍标记反应，因此优选去除。

因而，可以还包括去除未反应的羟胺类的追加工序。因此，可以还包括：向含糖链样品中添加酮、醛或酸酐，将残留在含糖链样品中的羟胺类转化成酮肟、醛肟或酰胺的工序。

通过使酮与羟胺类反应而能够转化成酮肟。此外，通过使醛与羟胺类反应而能够转化成醛肟。此外，通过使酸酐与羟胺类反应而能够转化成酰胺。

作为酮，可以使用丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮、4-羟基丁酮等。此外，作为醛，可以使用水杨醛、苯甲醛、4-羟基苯甲醛等。此外，作为酸酐，可以使用乙酸酐、琥珀酸酐等。

〔工序(II)/糖链吸附工序〕

工序(II)是使工序(I)的含糖链样品获取工序中得到的含糖链样品接触纯化剂，从而使前述糖链吸附至前述纯化剂的工序，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链。纯化剂能够高效地吸附长度为单糖以上的糖链。

本实施方式中使用的“纯化剂”也可称为包含具有内铵盐结构的化合物作为有效成分且用于提纯长度为单糖以上的糖链的纯化剂。换言之，“纯化剂”只要包含具有内铵盐结构的化合物即可，可以是与不具有内铵盐结构的化合物的混合物的状态。

上述“内铵盐结构”可以为下述式(1)所示的结构。

-A-L-Z (1)

[式(1)中，Z表示选自仲氨基、叔氨基、季铵基和亚氨基中的阳离子性基团，L表示碳原子数1~10的亚烷基，A表示选自磷酸基、羧基、膦酸基、次膦酸基、磺酸基、亚磺酸基、次磺酸基、羟基、硫醇基和硼酸基中的阴离子性基团。]

上述具有内铵盐结构的化合物可以为甜菜碱，也可以是主链上键合有具有内铵盐结构的侧链的聚合物。

“主链”是指在聚合物结构中最长的碳链，将从主链分枝出的结构称为“侧链”。

此外，糖链包括单糖。因此，长度为单糖以上的糖链包括长度为单糖、二糖、三糖、四糖以上的糖链。长度为单糖以上的糖链的分子量可以为例如150以上且3000以下左右。

“纯化剂”可以固定于不溶性支撑体而形成糖链浓缩用载体。“提纯”也可以称为“浓缩”，此外，有时将“糖链浓缩用载体”简称为“载体”。例如，“纯化剂”可以是聚合物被固定于不溶性支撑体，该聚合物在主链上键合有具有内铵盐结构的侧链。通过具有内铵盐结构而使亲水度非常高，通过亲水性相互作用而能够牢固地保持亲水度高的糖链。

“糖链浓缩用载体”中，聚合物被固定于不溶性支撑体，优选聚合物覆盖不溶性支撑体表面的全部或一部分而形成聚合物层。此处，覆盖是指在不溶性支撑体的表面附着有聚合物。图1示意性地示出“糖链浓缩用载体”的一例。图1的“糖链浓缩用载体”在不溶性支撑体表面形成有具有内铵盐结构的聚合物层。

“聚合物层”可以在主链上键合有具有内铵盐结构的侧链的聚合物的基础上，还包含不具有内铵盐结构的聚合物。因此，“糖链浓缩用载体”只要在该载体的表面存在内铵盐结构即可，可以提纯长度为单糖以上的糖链。

“不溶性支撑体”是不溶于水和在糖链的制备过程中使用的有机溶剂的基材，只要能够使主链上键合有具有内铵盐结构的侧链的聚合物固定化，就没有特别限定，可以使用公知的基材。不溶性支撑体的材质可以是无机物质和有机物质中的任一者，也可以是并用它们的复合物质。作为无机物质，可列举出二氧化硅等硅化合物；硅酸盐玻璃等玻璃；氧化铁(铁素体、磁铁矿等)、氧化铝、氧化钛、氧化锆等氧化物；铁、铜、金、银、铂、钴、铝、钯、铱、铑等金属及其合金；石墨等碳材料等。它们可以单独使用1种，也可以组合使用两种以上。作为有机物质，可列举出交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子；交联琼脂糖凝胶、结晶性纤维素、交联纤维素、交联直链淀粉、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类等。它们可以单独使用1种，也可以组合使用两种以上。此外，在主链上键合有具有内铵盐结构的侧链的聚合物自身可以形成不溶性支撑体。

作为不溶性支撑体，优选使用无机物质，特别优选为硅化合物、其中优选为二氧化硅。一般来说，可形成不溶性支撑体的有机物质的比重为1左右，其与含糖链样品的比重差小，因此固液分离变得复杂的情况多。通过使用无机物质，将例如糖链浓缩用载体应用于糖链的浓缩时等，能够容易且简便地进行固液分离，能够将吸附至该载体的糖链与游离的蛋白质、肽片段、脂质、盐等夹杂物有效地分离。由此，能够有助于浓缩效率的提高。此外，无机物质能够对载体赋予适度的强度。

不溶性支撑体可以具有多孔体、中空体等的空隙。例如，作为多孔体，可列举出整体柱类型的二氧化硅等。整体柱类型的二氧化硅是具有微米尺寸的三维网格状细孔(大孔)且在形成三维网格状结构的二氧化硅骨架上具有纳米尺寸的细孔(中孔)的二氧化硅多孔结构体。可独立地控制至：微孔的孔径例如为1μm以上且100μm以下、优选为1μm以上且50μm以下，中孔的孔径例如为1nm以上且100nm以下、优选为1nm以上且70nm以下等的范围。通过使用具有这种空隙的不溶性支撑体，糖链浓缩用载体的比表面积变大，能够增加可固定于不溶性支撑体表面的纯化剂量。由此，将实施方式的载体用于糖链的浓缩时，与糖链的接触效率提高，能够有效地吸附糖链，可有助于浓缩效率的提高。此外，也可以用于调整后述不溶性支撑体的比重。

纯化剂为聚合物时，该聚合物可以为聚合性单体的聚合物。聚合性单体只要是可通过聚合反应而形成聚合物的单体，就没有特别限定，优选为具有(甲基)丙烯酰基的(甲基)丙烯酸类化合物，包括例如(甲基)丙烯酸酯及其衍生物等。进而，可列举出具有乙烯基、烯丙基、α-烷氧基甲基丙烯酰基、马来酸残基、富马酸残基、衣康酸残基、巴豆酸残基、异巴豆酸残基和柠康酸残基等的化合物及其衍生物等，但不限定于它们。聚合性单体可以单独使用1种，或者，也可以组合使用2种以上。需要说明的是，“(甲基)丙烯酰基”表示“丙烯酰基”或“甲基丙烯酰基”，“(甲基)丙烯酸类”表示“丙烯酸类”或“甲基丙烯酸类”。

固定于不溶性支撑体的聚合物的侧链是从由上述聚合性单体的聚合物构成的主链中分枝出的分子链，一部分或全部具有内铵盐结构。内铵盐结构是指：在同一分子内的分离而不相邻的位置具有阳离子部位和阴离子部位的结构。

阳离子部位是指带正电荷的原子团，是指所谓的阳离子性基团。作为阳离子性基团，可列举出例如伯氨基、仲氨基(-NHR)、叔氨基(-NR₂)、季铵基(-NR₃ ^＋)和亚氨基等，但不限定于它们。仲氨基、叔氨基、季铵基中的R为烷基或芳基，在1个基团具有多个R的情况下，可以各自不同或相同，可列举出例如甲基、乙基、丙基等，但不限定于它们。优选为季铵基，特别优选为三甲基铵基。此外，与氟化物离子、氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子、盐酸根离子、乙酸根离子、硫酸根离子、氢氟酸根离子和碳酸根离子等形成了盐的盐形态的基团也包括在阳离子性基团中。

阴离子部位是指带负电荷的原子团，是指所谓的阴离子性基团。作为阴离子性基团，可列举出例如磷酸基、膦酸基、次膦酸基、磺酸基、亚磺酸基、次磺酸基、羧基、羟基、硫醇基和硼酸基等，但不限定于它们。优选为磷酸基。此外，与钠离子、钾离子等碱金属离子以及钙离子等碱土金属离子等形成了盐的盐形态的基团也包括在阴离子性基团中。

“内铵盐结构”只要是具有上述阳离子部位和阴离子部位的结构，就没有特别限定，阳离子部位与阴离子部位的组合没有特别限定。优选阳离子部位为季铵基，阴离子部位为磷酸基。

固定于不溶性支撑体的聚合物只要在由聚合性单体的聚合物构成的主链上键合有具有内铵盐结构的侧链，就没有特别限定。因此，聚合物除了是具有内铵盐结构的聚合性单体的均聚物之外，也可以是具有阳离子部位的聚合性单体与具有阴离子部位的聚合性单体的共聚物。此外，可以是包含不具有电荷的聚合性单体的共聚物，通过包含这种聚合性单体，能够控制聚合物在水中的溶解性等。共聚物是指由2种以上的单体得到的聚合物，可以为交替共聚物、嵌段共聚物、无规共聚物和接枝共聚物等中的任一者。因此，内铵盐结构可以导入至聚合物的每个单体单元中，也可以隔着单体单元的每一定单元来导入，还可以随机地导入。

优选为聚合物侧链具有内铵盐结构的聚合性单体的均聚物。此时，具有内铵盐结构的聚合性单体中，阴离子部位和阳离子部位存在于同一分子链中。连接两者的连接基团只要具有2价以上的基团就没有特别限定，可以使用公知的连接基团。优选为亚烷基连接基团，作为亚烷基连接基团，可列举出例如具有1以上且10以下的碳原子数、优选具有2以上且5以下的碳原子数的亚烷基连接基团。

作为这种具有内铵盐结构的聚合性单体，可列举出例如具有磷酸胆碱基等磷酸内铵盐基的磷酸内铵盐系单体、具有羧酸内铵盐基的羧酸内铵盐系单体、具有磺酸内铵盐基的磺酸内铵盐系单体等，但不限定于它们。优选为磷酸内铵盐系单体，其中，为具有磷酸胆碱基的磷酸内铵盐系单体。

作为磷酸内铵盐系单体，优选为具有磷酸胆碱基的聚合性单体，可列举出例如2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、2-(甲基)丙烯酰氧基乙氧基乙基磷酸胆碱、6-(甲基)丙烯酰氧基己基磷酸胆碱、10-(甲基)丙烯酰氧基乙氧基壬基磷酸胆碱、2-(甲基)丙烯酰氧基丙基磷酸胆碱、2-(甲基)丙烯酰氧基丁基磷酸胆碱等。其中，从获取容易性出发，特别优选为2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱。进而，作为磷酸内铵盐系单体，也可列举出例如二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(2-膦酸根合乙基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(2-膦酸根合乙基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(3-膦酸根合丙基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(3-膦酸根合丙基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(4-膦酸根合丁基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(4-膦酸根合丁基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(膦酸根合甲基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(膦酸根合甲基)铵等。

作为羧酸内铵盐系单体，可列举出例如二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(2-羧酸根合乙基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(2-羧酸根合乙基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(3-羧酸根合丙基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(3-羧酸根合丙基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(4-羧酸根合丁基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(4-羧酸根合丁基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(羧酸根合甲基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(羧酸根合甲基)铵等。

作为磺酸内铵盐系单体，可列举出例如二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(2-磺酸根合乙基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(2-磺酸根合乙基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(3-磺酸根合丙基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(3-磺酸根合丙基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(4-磺酸根合丁基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(4-磺酸根合丁基)铵、二甲基(2-甲基丙烯酰氧基乙基)(磺酸根合甲基)铵、二甲基(2-丙烯酰氧基乙基)(磺酸根合甲基)铵等。

键合于前述不溶性支撑体的聚合物的重量相对于前述不溶性支撑体的单位表面积(m²)优选为0.5mg以上且1.5mg以下左右、特别优选为0.6mg以上且1.3mg以下、进一步优选为0.7mg以上且1.2mg以下。若每单位表面积的聚合物重量为上述范围，则合成聚合物时的处理性良好，此外，能够确保与糖链的良好接触效率，能够高效地吸附糖链。

“糖链浓缩用载体”优选比重为1.05以上且3.00以下左右的载体，特别优选为1.1以上且2.7以下、进一步优选为1.5以上且2.5以下。比重小于下限值时，沉降性降低，此外，若超过上限值，则分散性恶化，因此，在任意情况下，操作性均恶化。因此，若实施方式所述的载体的比重在上述范围内，则应用于糖链的浓缩时等，因沉降性良好而能够通过基于重力的自然沉降、离心分离等来容易且简便地进行固液分离，能够将吸附至载体的糖链与游离的蛋白质、肽片段等夹杂物有效地分离。此外，因分散性良好而与糖链的接触效率提高，能够高效地吸附糖链。因此，能够提供在操作性的方面优异的载体，且应用于糖链的浓缩时等，能够提供在与游离的蛋白质、肽片段等夹杂物的分离和糖链的吸附效率的方面也优异的载体。

“糖链浓缩用载体”的形状没有特别限定，可以为公知的任意形状。可列举出例如珠等球状；基板、多孔板等板状；片、膜、薄膜等膜状；纤维状等。载体也可以换称为固相。优选为容易处理的球状或类似于球状的形状。为球状时，平均粒径优选为0.5μm以上且100μm以下左右，特别优选为1μm以上且50μm以下或者1μm以上且10μm以下。特别优选为3μm以上且10μm以下。平均粒径小于下限值时，难以通过离心分离、过滤来回收载体，且将载体填充至柱等使用时，通液性变差，在通液时需要施加大的压力。另一方面，若平均粒径超过上限值，则载体与试样溶液的接触面积变少，糖链的吸附效率降低，浓缩效率降低。因此，若“糖链浓缩用载体”的平均粒径在上述范围内，则能够提供在操作性的方面优异的载体，且应用于糖链的浓缩时等，能够提供在与游离的肽片段等的分离和糖链的吸附效率的方面也优异的载体。平均粒径可利用例如粒度分布计等来测定。

“糖链浓缩载体”可以在填充至核酸纯化柱(spin column)等过滤杯、多孔板的各孔、过滤板的各孔、微管等容器中的状态下使用。

聚合物可通过将上述聚合性单体进行聚合来获得，聚合物的聚合方法没有特别限定，可根据聚合性单体的种类等来适当选择。优选为自由基聚合。

聚合物对不溶性支撑体的固定化可以使用物理吸附或化学键合中的任一者来进行。从稳定性的观点出发，优选为化学键合，能够抑制聚合物从不溶性支撑体中溶出。此外，可通过在不溶性支撑体表面使聚合性单体聚合而将聚合物固定于不溶性支撑体表面，也可以使预先聚合得到的聚合物固定于不溶性支撑体表面。

通过在不溶性支撑体表面使聚合性单体聚合而将聚合物固定至不溶性支撑体表面时，可通过例如向不溶性支撑体的表面导入聚合引发点，将导入有聚合引发点的不溶性支撑体浸渍于聚合性单体溶液，并添加聚合引发剂而使聚合物从聚合引发点开始生长。由此，能够借助化学键将聚合物固定于不溶性支撑体表面。作为聚合引发点，可以使用聚合性官能团、链转移基团、活性自由基聚合中的休眠种等。

作为聚合性官能团，可列举出乙烯基、烯丙基(2-丙烯基)、(甲基)丙烯酰基、环氧基、苯乙烯基等。作为链转移基团，可列举出巯基、氨基等，从反应性优异的观点出发，优选为巯基。

作为向不溶性支撑体表面导入聚合性官能团或链转移基团的方法，没有特别限定，优选使用具有聚合性官能团或链转移基团的硅烷偶联剂。

作为具有聚合性官能团的硅烷偶联剂，可列举出例如(3-甲基丙烯酰氧基丙基)二甲基甲氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)二乙基甲氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)二甲基乙氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)二乙基乙氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)甲基二甲氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)乙基二甲氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)乙基二乙氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)三乙氧基硅烷等，从反应性和获取性的观点出发，优选为(3-甲基丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、(3-甲基丙烯酰氧基丙基)三乙氧基硅烷。这些硅烷偶联剂可以单独使用或组合使用两种以上。

作为具有链转移基团的硅烷偶联剂，可列举出例如(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)甲基二甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)二甲基甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷、(3-巯基丙基)甲基二乙氧基硅烷、(3-巯基丙基)二甲基乙氧基硅烷、(巯基甲基)三甲氧基硅烷、(巯基甲基)甲基二甲氧基硅烷、(巯基甲基)二甲基甲氧基硅烷、(巯基甲基)三乙氧基硅烷、(巯基甲基)甲基二乙氧基硅烷、(巯基甲基)二甲基乙氧基硅烷等，从获取性出发，优选为(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷。这些硅烷偶联剂可以单独使用或组合使用两种以上。

使用具有聚合性官能团或链转移基团的硅烷偶联剂向不溶性支撑体导入聚合性官能团或链转移基团可通过例如在硅烷偶联剂与不溶性支撑体表面的官能团之间形成共价键来进行。例如，使用三甲氧基硅烷类、三乙氧基硅烷类等烷氧基硅烷类作为硅烷偶联剂时，可通过利用水解生成的硅烷醇基与不溶性支撑体表面的羟基、氨基、羰基、硅烷醇基等发生脱水缩合而形成共价键来进行。

向不溶性支撑体表面导入聚合性官能团或链转移基团后，通过将不溶性支撑体与聚合性单体混合来进行聚合反应，从而在不溶性支撑体表面形成聚合物层。聚合反应没有限定，通过例如向溶解有聚合性单体和聚合引发剂的溶剂中投入不溶性支撑体，并在搅拌下、0℃以上且80℃以下的温度下加热1小时以上且30小时以下来进行。其后，不溶性支撑体在减压下过滤，并在清洗后进行干燥。

不溶性支撑体与聚合性单体和聚合引发剂的使用比例没有特别限定，通常，相对于不溶性支撑体1g，以聚合性单体为0.1mmol以上且10mmol以下、聚合引发剂为0.01mmol以上且10mmol以下的比例来使用。

作为溶剂，只要是溶解各个聚合性单体的溶剂即可，可列举出例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、正戊醇等醇类；苯、甲苯、四氢呋喃、二噁烷、二氯甲烷、氯仿、环己酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲乙酮、甲基丁基酮、乙二醇单乙基醚、乙二醇单甲基醚、乙二醇单丁基醚等。这些溶剂可单独使用或组合使用2种以上。

作为聚合引发剂，没有特别限定，可列举出例如2,2’-偶氮双异丁基腈(以下有时简写为“AIBN”)、1,1’-偶氮双(环己烷-1-甲腈)等偶氮化合物；过氧化苯甲酰、过氧化月桂基、过氧化叔丁基等有机过氧化物；过氧化氢-亚铁离子等氧化还原引发剂等。

另一方面，使预先聚合得到的聚合物固定于不溶性支撑体表面时，可列举出：使预先聚合得到的聚合物物理吸附至不溶性支撑体的方法或者使预先聚合得到的聚合物化学键合至不溶性支撑体的方法。优选的是：在聚合物的聚合时，向聚合物中以共聚物的形式组入容易吸附至不溶性支撑体的成分、具有能够与存在于不溶性支撑体表面的反应性官能团反应的官能团的成分。例如，作为能够与存在于不溶性支撑体表面的反应性官能团反应的官能团，例如，将硅烷偶联剂水解而得到的硅烷醇基等因具有高反应性而优选，能够与固体支撑体表面的羟基、氨基、羰基、硅烷醇基等发生脱水缩合而形成共价键。聚合性单体的聚合反应可按照上述来进行。

通过向不溶性支撑体表面涂布上述聚合物，能够使聚合物吸附或化学键合于不溶性支撑体表面。涂布方法可列举出制备聚合物的溶液并浸渍、喷雾等公知的方法。优选在涂布后在室温~加温下使其干燥。基于化学键合时，可以在与各自相符的反应条件下实施。由此，在不溶性支撑体表面形成聚合物层。

“糖链浓缩用载体”是向在作为不溶性支撑体的二氧化硅珠等的表面具有羟基的无机颗粒的表面导入巯基等链转移基团，从而合成包含内铵盐结构的聚合物层而成的。首先，使用具有链转移基团的硅烷偶联剂，向无机颗粒的表面导入链转移基团。此时，通过硅烷偶联剂的烷氧基等水解性基团的水解而生成的硅烷醇基与无机颗粒表面的羟基发生脱水缩合而形成共价键，由此导入链转移基团。接着，添加聚合引发剂，使导入有链转移基团的无机颗粒与至少一部分单体具有内铵盐结构的(甲基)丙烯酸类单体在适当的溶剂下发生自由基聚合。导入至无机颗粒中的链转移基团成为聚合引发点，无机颗粒表面被具有内铵盐结构的聚合物层覆盖而形成聚合物层。

使纯化剂与工序(I)的含糖链样品获取工序中得到的含糖链样品接触。此时，含糖链样品可以是通过公知的方法进行脱盐等处理而得的样品。纯化剂的亲水度得以提高，因此，可通过亲水性相互作用来特异性地吸附糖链，试样中大量存在的肽片段等不吸附于纯化剂，而是以游离状态残留。

纯化剂的糖链保持力与有机溶剂浓度成比例。因此，作为糖链被纯化剂吸附时的反应液的溶剂，可以使用有机溶剂或者有机溶剂与水的混合溶剂。溶剂可根据成为浓缩对象的糖链的种类等来适当选择。作为有机溶剂，只要是可溶解糖链的有机溶剂即可，没有特别限定，可列举出例如乙腈、四氢呋喃、丙酮、二噁烷、吡啶、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇和1-丁醇等。优选适合地使用1-丁醇、乙醇等有机溶剂。为了调节pH而可以使用各种缓冲液。此外，使用有机溶剂与水的混合溶剂时，有机溶剂与水的混合比率例如以体积比计为3:1以上且1000:1以下。

根据需要，可以对吸附有糖链的纯化剂进行清洗。通过清洗而能够去除吸附至纯化剂的糖链之外的夹杂物、例如蛋白质、肽片段、脂质、盐等。作为清洗液，可以使用例如上述溶剂。

〔工序(III)/糖链溶出工序〕

工序(III)是使糖链从通过上述工序(II)的糖链吸附工序而吸附有糖链的纯化剂中溶出的工序。

用于使所吸附的糖链从纯化剂中溶出的溶出液可以使用有机溶剂、或者有机溶剂与水的混合溶剂，可根据成为溶出对象的糖链、纯化剂的种类等来适当选择。作为有机溶剂，可以使用上述有机溶剂。此外，本工序中，通过使用亲水性得以提高的溶剂，能够高效地使糖链溶出。例如，可以仅使用水而不使用有机溶剂，也可以使用有机溶剂与水的混合溶剂。使用混合溶剂时，可列举出有机溶剂以体积比计相对于水为3倍以下，特别优选仅使用水而不使用有机溶剂。

工序(II)的糖链吸附工序和工序(III)的糖链溶出工序不限定于它们，可通过间歇法、核酸纯化柱法等来进行其中的一部分工序和全部工序。针对间歇法和核酸纯化柱法，详见下述，试剂类和反应条件等如上所述。

(间歇法)

基于间歇法时，使通过工序(I)的含糖链样品获取工序而得到的含糖链样品与本实施方式中使用的纯化剂在适当的容器(例如微管、离心管、微孔板等)中接触，使糖链吸附于该纯化剂(工序(II))。此时，纯化剂优选固定于不溶性支撑体。接着，对纯化剂-糖链复合体进行固液分离，去除包含蛋白质、肽片段、脂质、盐等夹杂物的液相部分，仅回收该复合体。固液分离可通过基于重力的自然沉降、离心分离等来进行，可通过抽吸等来去除液相部分。此外，通过使该载体的不溶性支撑体包含铁素体等磁性材料，也可以通过使用磁力使该复合体聚集来进行固液分离。此时无需进行离心分离等。此外，可以通过使其通液至过滤器的过滤来进行固液分离，此时，也可以在减压下或加压下进行。

接着，对吸附有糖链的纯化剂进行清洗。通过清洗，能够去除吸附于纯化剂的糖链之外的蛋白质、肽片段等夹杂物。清洗可通过将吸附有糖链的纯化剂在适当的容器中浸渍于清洗液，并反复更换清洗液来进行。例如，通过向适当的容器中投入吸附有糖链的纯化剂，反复进行添加清洗液并振荡或搅拌后，利用固液分离去除液相部分的操作，从而能够进行清洗。固液分离可如上所述地进行。

在清洗后，使糖链从吸附有糖链的纯化剂中溶出(工序(III))。糖链的溶出可通过将该纯化剂浸渍于溶出液来进行。例如，在充分去除清洗液后，向吸附有糖链的载体中添加适量溶出液，并振荡或搅拌。接着，通过固液分离来回收该载体，将溶出液收集至新的适当容器(例如收集管、收集板等)中。固液分离可如上述那样地进行。通过根据需要馏去溶出液而能够浓缩糖链。

(核酸纯化柱法)

基于核酸纯化柱法时，可以使用内置有过滤器等的容器、例如过滤杯等来进行。作为过滤杯，可以使用例如上部和下部具有开口部且下部的开口部被过滤器覆盖的过滤杯。使用过滤杯时，向填充有本实施方式所使用的纯化剂的过滤杯中投入通过工序(I)的含糖链样品获取工序而得到的含糖链样品，通过通液使该纯化剂与试样在反应液下发生接触。纯化剂优选固定于不溶性支撑体。通液可以基于重力的自然下落和离心分离来进行等，此外，也可以在减压下或加压下使其通液。在通液后，去除通过该纯化剂后的包含游离的蛋白质、肽片段、脂质、盐等的排出液。

接着，对吸附有糖链的纯化剂进行清洗。通过清洗而能够去除吸附至该纯化剂的糖链之外的夹杂物、例如蛋白质、肽片段、脂质、盐等。清洗可通过使清洗液通液至过滤杯内的该纯化剂来进行，可以从糖链的吸附开始连续地进行清洗。通液可如上所述地进行。

在清洗后，使糖链从吸附有糖链的纯化剂中溶出。糖链的溶出可通过使溶出液通液至过滤杯内的该纯化剂来进行，可以从糖链的吸附开始历经清洗操作来连续地进行。将通液至纯化剂后的溶出液收集至适当的容器(例如收集管、收集板等)中。通液可如上所述地进行。通过根据需要馏去溶出液而能够浓缩糖链。

〔工序(IV)/糖链标记工序〕

工序(IV)是使糖链标记溶液中的糖链标记试剂与糖链反应的糖链标记工序，由本实施方式的糖蛋白制备糖链的方法可根据需要而包括工序(IV)。

“糖链标记溶液”至少包含“糖链标记试剂”，可以包含水、缓冲液和/或有机溶剂等。糖链标记溶液可以具有紫外线吸收特性或荧光特性。通过具有前述特性，能够利用LC-MS等分析装置进行检测。

“糖链标记试剂”只要具有相对于糖链的反应性基团和应该对糖链赋予的修饰基团即可，没有特别限定。作为相对于糖链的反应性基团，可列举出烃氧基氨基、酰肼基、氨基、活性酯基等。修饰基团可根据糖链的分析方法由本领域技术人员适当选择。

例如，糖链标记试剂具有氨基作为对于糖链的反应性基团时，作为糖链标记试剂，可以使用包含具有紫外线吸收特性或荧光特性的氨基的化合物。在该具有氨基的化合物中，作为应该对糖链赋予的修饰基团，可列举出芳香族基团。在使用具有氨基和芳香族基团的标记化合物时，通过还原氨基化来进行修饰。芳香族基团具有紫外可见吸收特性或荧光特性，因此，从UV检测或荧光检测中的检测灵敏度提高的观点出发是优选的。

作为赋予这种芳香族基团的标记化合物，具体而言，可列举出8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate)、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸(8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulphonate)、7-氨基-1,3-萘二磺酸(7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid)、2-氨基-9(10H)-吖啶酮(2-amino-9(10H)-acridone)、5-氨基荧光素(5-aminofluorescein)、丹磺酰乙二胺(dansylethylenediamine)、2-氨基吡啶(2-aminopyridine)、7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarine)、2-氨基苯甲酰胺(2-aminobenzamide)、2-氨基苯甲酸(2-aminobenzoic acid)、3-氨基苯甲酸(3-aminobenzoic acid)、7-氨基-1-萘酚、3-(乙酰基氨基)-6-氨基吖啶(7-amino-1-naphthol,3-(acetylamino)-6-aminoacridine)、2-氨基-6-氰基乙基吡啶(2-amino-6-cyanoethylpyridine)、对氨基苯甲酸乙酯(ethyl p-aminobenzoate)、对氨基苯甲腈(p-aminobenzonitrile)和7-氨基萘-1,3-二磺酸(7-aminonaphthalene-1,3-disulfonicacid)。

其中，作为具有氨基的化合物，可以包含2-氨基苯甲酰胺(2-aminobenzamide)。2-氨基苯甲酰胺在即便反应规模大的情况下也比较难以受到夹杂物、例如蛋白质、肽片段、脂质、盐等的影响的方面出发有时优选。需要说明的是，在可维持作为标记化合物的功能的范围内，还优选使用上述化合物的衍生物。

糖链标记溶液包含缓冲液时，作为缓冲剂，可列举出碳酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、柠檬酸氢二铵、氨基甲酸铵等。缓冲液的pH没有特别限定，优选pH为5~10的缓冲液。

糖链标记溶液包含有机溶剂时，作为有机溶剂，可以包含选自非质子性极性有机溶剂、质子性极性有机溶剂和非质子性非极性有机溶剂中的一种以上。具体而言，作为有机溶剂，可列举出例如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等非质子性极性有机溶剂；有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等)和醇(甲醇、乙醇、丙醇等)等质子性极性有机溶剂；以及己烷等非质子性非极性有机溶剂。这些溶剂可单独使用1种，也可以组合使用两种以上。

从能够更优选地获得缩短糖链标记工序所需的时间这一效果的观点出发，作为有机溶剂，可以使用甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等有机酸。其中，从操作容易性的观点出发，作为有机酸，可以使用乙酸。

质子性极性有机溶剂的沸点较低时(例如沸点小于140℃时)，可以在质子性溶剂的基础上并用沸点比该质子性溶剂更高的溶剂。由此，能够延迟糖链标记工序中的上述沸点较低的质子性极性有机溶剂的挥发速度。其结果，能够在糖链标记工序中抑制未反应物的不期望的析出。由此，能够以良好的收量获得标记糖链。在糖链的规模小的情况、溶剂的量少的情况和/或反应时间变长的情况下，可以选择组合使用这种沸点高的溶剂(以下记作高沸点溶剂)的方式。

作为上述高沸点溶剂，可以是例如沸点为140~200℃的非质子性极性有机溶剂。作为具体的高沸点溶剂，可列举出二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等非质子性极性有机溶剂。

并用非质子性极性有机溶剂作为高沸点溶剂时，从提高作为标记化合物的2-氨基苯甲酰胺、还原试剂的溶解性/反应性的观点出发，其量优选体积%小于质子性极性有机溶剂，可以是质子性极性有机溶剂的4体积%以上且小于100体积%，也可以是4~70体积%。

“糖链标记工序”可以在上述工序(III)的糖链溶出工序之前，也可以在工序(III)之后。因此，糖链标记溶液中的糖链标记试剂与糖链的反应可以在上述纯化剂吸附有糖链的状态下进行，也可以在从上述纯化剂中溶出的溶出液的状态下进行。此外，在工序(III)中，换言之，可以边使糖链从吸附有糖链的纯化剂中溶出边标记糖链。进而，作为“用于使所吸附的糖链从前述纯化剂中溶出的溶出液”，可以使用糖链标记溶液。

糖链标记溶液中的糖链标记试剂与糖链的反应温度可以为例如4℃以上且80℃以下，也可以为例如25℃以上且70℃以下。反应温度为上述下限值以上时，从反应时间变短的方面出发是优选的，为上述上限值以下时，从抑制糖链因高温而部分分解的方面出发是优选的。此外，糖链标记工序中的反应时间可以为例如5分钟以上且600分钟以下，可以为例如30分钟以上且300分钟以下。反应时间为上述下限值以上时，从定量地标记的方面出发是优选的，为上述上限值以下时，从抑制糖链的部分分解的方面出发是优选的。

需要说明的是，通过工序(I)的含糖链样品获取工序而获取的游离糖链中，呈现醛型的一部分会形成糖链肟。以往，作为游离后的糖链的官能团的醛基被还原而转化成醛糖醇时，无法直接标记。此外，作为糖链的官能团的醛基被肼转化成腙时，为了赋予标记，需要通过再乙酰化操作而恢复至原本的游离糖链。

对此，根据工序(I)的含糖链样品获取工序，可获得以能够直接标记的糖链肟的形式游离的糖链。换言之，从糖蛋白中游离的糖链包含糖链肟，此外，糖链肟能够直接标记。因此，由工序(I)得到的游离糖链能够以葡基胺、糖链肟、在还原末端具有半缩醛性羟基的通常糖链的混合物的形式在溶液中获得，能够将它们一并进行标记。

〔工序(V)/还原工序〕

工序(V)是与包含还原试剂的还原溶液反应的还原工序，在本实施方式的由糖蛋白制备糖链的方法中包括工序(IV)的糖链标记工序时，可根据需要而包括工序(V)的还原工序。

例如，在基于还原氨基化的修饰中，通过使在糖链的还原末端形成的醛基与标记化合物的氨基发生反应，将所形成的席夫碱用还原试剂进行还原而向糖链的还原末端导入修饰基团，由此能够有效地标记。

“还原溶液”至少包含“还原试剂”，可以包含水、缓冲液和/或有机溶剂等。

作为“还原试剂”，可以包含例如选自由氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、甲胺硼烷、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷、甲基吡啶硼烷和吡啶硼烷中的一种以上。通过使用毒性低的甲基吡啶硼烷，能够实现安全性高的标记。

从安全性和反应性这两者的观点出发，优选使用甲基吡啶硼烷(2-甲基吡啶-硼烷)。从同样的观点出发，将甲基吡啶硼烷用作还原试剂时，作为上述工序(IV)的糖链标记工序中使用的糖链标记试剂，优选使用例如2-氨基苯甲酰胺。

“还原试剂”的最终浓度例如可以设为1.0mmol/L以上且250mmol/L以下、优选设为1.2mmol/L以上且239mmol/L以下的浓度范围。通过将还原试剂的浓度优化至该范围，糖链的标记效率会提高。

使还原溶液包含缓冲液和/或有机溶剂时，可以同样使用上述工序IV中使用的缓冲液和/或有机溶剂。需要说明的是，使用甲基吡啶硼烷作为还原试剂时，优选包含质子性极性有机溶剂作为溶剂。由此，能够以高浓度溶解甲基吡啶硼烷，因此，工序所需的时间得以缩短。作为溶剂，可以使用乙酸等质子性极性有机溶剂与二甲基亚砜等非质子性极性有机溶剂的混合溶剂。

“还原工序”只要能够将使糖链与糖链标记试剂反应而得的产物还原即可，可以在任意阶段中进行。例如，也可以使糖链标记溶液中包含糖链还原试剂，并与工序(IV)的糖链标记工序同时进行。

[用于由糖蛋白制备糖链的试剂盒]

本实施方式所述的用于由糖蛋白制备糖链的试剂盒是对于实施在上述[用于由糖蛋白制备糖链的方法]一项中说明的本实施方式的用于由糖蛋白制备糖链的方法而言适合的试剂盒，其包含：

(a)羟胺化合物、

(b)碱性试剂、

(c)纯化剂，其包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链。

像这样，能够以试剂盒的形式提供对于由糖蛋白制备糖链而言必须的试剂类。进而，该试剂盒可以包含(d)糖链标记试剂，此外，可以包含(e)还原试剂。通过将对于由糖蛋白制备糖链而言必须的试剂类和信息等制成试剂盒，能够由糖蛋白更简便地进行糖链的制备。

“试剂盒”可以包含用于使用该试剂盒的规程等作为使用说明书。使用说明书可以书写或印刷至纸或其它介质，也可以记录至磁带、磁盘、光盘等电子介质。

进而，“试剂盒”可以包含对于实施该试剂盒而言必须的试剂类、容器类。可列举出例如用于清洗的清洗液、用于使糖链从吸附有糖链的纯化剂中溶出的溶出液等。该试剂盒所包含的试剂类可以以冻干粉末的形态来提供，此时，该试剂盒可以还包含用于在使用时进行稀释的稀释液。此外，可以包含过滤杯、多孔板、过滤板、微孔管等容器类，该试剂盒所含的试剂类可以在填充至这些容器中的状态下包含。针对各术语的定义和优选实施方式，如上述〔由糖蛋白制备糖链的方法〕一项中所述那样。

[用于由糖蛋白制备糖链的装置]

本实施方式所述的用于由糖蛋白制备糖链的装置是对于实施在上述[用于由糖蛋白制备糖链的方法]一项中说明的本实施方式的用于由糖蛋白制备糖链的方法而言适合的装置，其具备：

第一容器保持部，其保持用于容纳包含前述糖蛋白的含糖蛋白样品的第一容器；试剂导入部，其向前述第一容器中导入试剂；以及第二容器保持部，其保持包含纯化剂的第二容器，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链，

前述试剂导入部包括：向前述第一容器中导入包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离试剂的糖链游离试剂导入部。通过将对于由糖蛋白制备糖链而言必须的试剂类和构件类等制成装置，从而能够由糖蛋白更简便地进行糖链的制备。

需要说明的是，以下说明的装置的构成是用于由本实施方式所述的糖蛋白制备糖链的装置的一例，本发明的权利范围不限定于所述构成。此外，针对各术语的定义和优选实施方式，如上述〔由糖蛋白制备糖链的方法〕一项中所述那样。

“第一容器保持部”用于保持要容纳含糖蛋白样品的第一容器。第一容器保持部保持第一容器的方式没有特别限定，可列举出例如使第一容器的大部分嵌入至第一容器保持部的保持穴或保持孔来保持的方式。除此之外，还可列举出：使第一容器的嵌合凹部(嵌合凸部)嵌合于第一容器保持部的嵌合凸部(嵌合凹部)来保持的方式、用第一容器保持部的夹持部来夹持保持第一容器的方式等。

“第二容器保持部”用于保持包含纯化剂的第二容器，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链。第二容器保持部保持第二容器的方式没有特别限定，可以与第一容器保持部同样操作来保持。

“试剂导入部”用于向第一容器保持部所保持的第一容器的内部导入试剂。试剂导入部至少包括向第一容器中导入包含羟胺类和碱性试剂的糖链游离试剂的糖链游离试剂导入部。羟胺类和碱性试剂可以在糖链游离试剂导入部混合而制成糖链游离试剂，也可以预先以糖链游离试剂的形式混合后再导入至糖链游离试剂导入部中。

“试剂导入部”也可以向第二容器保持部所保持的第二容器的内部导入试剂，可以包括：例如，含糖链样品导入部，其用于从第一容器导入通过使糖链自糖蛋白游离而得到的含糖链样品；清洗液导入部，其用于导入清洗纯化剂的清洗液；以及溶出液导入部，其用于导入用于使所吸附的糖链溶出的溶出液。此外，可以包括向第一容器和/或第二容器的内部导入糖链标记试剂的糖链标记试剂导入部。它们可以作为与糖链游离试剂导入部分别独立的构成构件来构成，也可以作为同一个构成构件来构成。

试剂导入部导入试剂的方式没有特别限定，可列举出例如从贮留有应该送液的液体的送液源借助管状构件向第一容器的内部送液的方式。除此之外，可列举出将采取至管状构件中的液体注入至第一容器内部的方式等。

进而，也可以具备对第二容器的容纳物进行固液分离的“固液分离部”。“固液分离部”从第二容器的内部所含的容纳物中分离成固体和液体。此处，固体实质上为纯化剂和吸附至其的糖链。

具备固体分离部时，作为第二容器，可以使用具备能够固液分离的过滤器的容器(例如过滤杯、过滤板等)。进而，这种容器可以装配有回收容器(例如收集管、收集板等)来使用。进而，此时，第二容器保持部可以包括用于保持装配于第二容器的回收容器的回收容器保持部来构成。

作为固液分离部的具体分离形式，没有特别限定，可以为离心过滤、减压过滤、加压过滤中的任一者。固液分离部可作为与第二容器保持部相独立的构成构件来构成。此时，可以包括从第二容器保持部向固液分离部自动输送第二容器的容器输送部。容器输送部在第二容器的输送中可以以仅输送第二容器的方式构成，也可以以第二容器在装配有回收容器的状态下输送的方式构成。容器输送部可以包括如下构件来构成：以直接或间接(换言之，借助回收容器)地握持和敞开第二容器且移动的方式动作的臂；以及控制该臂的动作的臂控制部。

此外，可以包含温度调节部，包含温度调节部时，温度调节部只要至少具有加热器功能即可。温度调节部将第一容器和/或第二容器加温至至少对于糖链的游离、基于纯化剂的糖链的吸附和/或糖链自吸附有糖链的纯化剂的溶出而言所需的温度。

此外，可工作的构成部分(例如试剂导入部、臂、固液分离部、温度调节部)中的至少任一者、优选全部受到自动控制。由此，能够从糖蛋白更迅速地进行糖链的制备。

实施例

以下，通过实施例来具体说明本发明。其中，本发明不限定于这些实施例。

[实施例1]纯化剂的合成

作为纯化剂，合成了在主链上键合有具有内铵盐结构的侧链的聚合物被固定于不溶性支撑体的糖链浓缩载体。详细而言，例示出二氧化硅珠表面上包含源自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱的结构单元的聚合物(以下记作“MPC聚合物”)的合成来进行说明，但不表示对本发明的范围进行限定。

(纯化剂的合成)

向二氧化硅珠导入链转移基团

将具有链转移基团的硅烷偶联剂5g添加至pH为3.0的乙酸水溶液50mL与乙醇50mL的混合液中，在室温下搅拌1小时，由此将硅烷偶联剂水解后，投入作为不溶性支撑体的一例的无机颗粒即二氧化硅珠5g，在70℃下搅拌2小时后，通过抽滤从反应溶液中回收二氧化硅珠，在100℃下加热1小时。其后，用乙醇使其分散并充分振荡后，通过离心分离去除上清液，并使其干燥。

聚合物的合成

使成为聚合物的结构单元的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(以下记作“MPC单体”，日本油脂公司制)溶解于乙醇，制作0.8mol/L的单体溶液20mL。向其中以达到0.027mol/L的方式添加AIBN，搅拌至均匀为止。其后，投入导入有上述链转移基团的二氧化硅珠4g，在氩气气氛下以70℃使其反应6小时。接着，通过离心分离从反应溶液中回收二氧化硅珠，使其分散至乙醇中，充分振荡后，通过抽滤来回收二氧化硅珠，并使其干燥，由此得到包含源自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱的结构单元的聚合物被固定于二氧化硅珠而成的载体(以下简写为“载体”)。

(纯化剂的物性确认)

测定导入至载体表面的包含聚合物的层的重量

关于导入至上述得到的载体的表面的、包含聚合物的层的重量，使用TGA装置(Seiko Instruments公司制的TG/DTA6200)，在空气气氛中，以10℃/分钟从室温升温至500℃，进而在500℃维持1小时，此后测定重量减少率。由该值和另行通过BET法求出的每单位重量的颗粒的表面积算出导入至颗粒表面的包含聚合物的层的重量，结果为1.08mg/m²。

[实施例2]糖链标记时的还原试剂浓度与收率的关系

(反应条件1)

(1)糖链标记溶液的制备

(1-1)制备10%乙酸、45%甲醇、45%水的混合溶剂。

(1-2)使1M的2-氨基苯甲酰胺和作为还原试剂的甲基吡啶硼烷以浓度达到0.6、1.2、2.3、4.7、9、47和239mM的方式溶解于溶液(1-1)。

(2)O键合型糖链的游离

对牛胎球蛋白(Fetuin)蛋白质(20μg)添加50%羟胺水溶液与DBU的混合液(5:2(体积比)、15μL)并混合后，使用加热块在37℃下加热75分钟。

(3)O键合型糖链的回收

向上述(2)中制备的溶液(2)15μL中添加乙腈1000μL，充分混合后，添加至作为用于提纯糖链的纯化剂的、上述实施例1中合成的载体1mg中，并充分混合。添加至核酸纯化柱(Ultrafree-MC、Millipore Cat＃：UFC30HVNB)中，使用台式离心机进行离心，将载体与溶液进行分离。接着，添加乙腈400μL，通过离心来去除溶液。再次添加乙腈400μL，通过离心来去除溶液。

(4)O键合型糖链的标记

将以达到上述(1-2)的浓度的方式制备的甲基吡啶硼烷与2-氨基苯甲酰胺的混合液即溶液(1-2)50μL添加至载体后，回收溶液，与之前的溶液混合，在50℃下使其反应2.5小时，对糖链进行荧光标记。

(5)O键合型糖链的提纯

将上述(4)中得到的包含荧光标记糖链的溶液(4)通入净化柱(住友ベークライト公司、BS-45403附属品)，去除过量的试剂后，利用HPLC对荧光标记糖链进行分析。

(反应条件2)

在上述反应条件1中，将甲基吡啶硼烷以浓度达到47、93、239、374、561、748和935mM的方式溶解于溶液(1)，除此持外，同样发生反应。

(结果)

将反应条件1的结果示于图2的图，将反应条件2的结果示于图3的图。横轴表示甲基吡啶硼烷浓度[mM]，纵轴表示峰总表面积、即2-氨基苯甲酰胺的标记效率。

由图2和图3的结果可确认：在甲基吡啶硼烷为5mM以上且20mM以下的浓度范围内，标记效率最高，浓度高于239mM时，收率进一步降低。一般来说，还原试剂以200mM以上的浓度来使用，例如，通常作为该技术领域中通用的还原试剂的氰基硼氢化钠以1M(1000mM)浓度来使用。因此可理解为：本实施例中得到的结果与该技术领域中使用的还原试剂浓度相比浓度非常低。

[实施例3]糖链的制备/纯化剂

(1)O键合型糖链的游离

对牛胎球蛋白(Fetuin)蛋白质(20μg)添加50%羟胺水溶液与DBU的混合液(5:2(体积比)、15μL)并混合后，使用加热块在37℃下加热75分钟。

(2)O键合型糖链的回收

向上述(1)中制备的溶液(1)15μL中添加乙腈1000μL，充分混合后，添加至作为用于提纯糖链的载体的、上述实施例1中合成的载体1mg中，并充分混合。添加至核酸纯化柱(Ultrafree-MC、Millipore Cat＃：UFC30HVNB)中，使用台式离心机进行离心，将载体与溶液进行分离。接着，添加乙腈400μL，通过离心来去除溶液。再次添加乙腈400μL，通过离心来去除溶液。

(3)O键合型糖链的标记

将甲基吡啶硼烷与2-氨基苯甲酰胺的混合液50μL添加至进行了上述(2)的处理的载体后，回收溶液，与之前的溶液混合，在50℃下反应2.5小时，对糖链进行荧光标记。

(4)O键合型糖链的提纯

将上述(3)中得到的包含荧光标记糖链的溶液(3)通入净化柱(住友ベークライト公司、BS-45403附属品)中，去除过量的试剂后，利用HPLC对荧光标记糖链进行分析。

[比较例4]糖链的制备/净化柱

(1)O键合型糖链的游离

与实施例3的(1)同样操作，进行O键合型糖链的游离。

(2)O键合型糖链的回收

向上述(1)中制备的溶液15μL中添加乙腈1000μL，充分混合后，添加至本比较例所使用的用于提纯糖链的载体即净化柱(住友ベークライト公司、BS-45403附属品)中，使用台式离心机进行离心，去除溶液。接着，添加乙腈400μL，通过离心来去除溶液。再次添加乙腈400μL，通过离心来去除溶液。

(3)O键合型糖链的标记

将甲基吡啶硼烷与2-氨基苯甲酰胺的混合液50μL添加至净化柱后，回收溶液，与之前的溶液混合，在50℃下使其反应2.5小时，对糖链进行荧光标记。

(4)O键合型糖链的纯化

与实施例3的(4)同样操作，进行O键合型糖链的纯化。

[比较例5]糖链的制备/石墨碳柱

(1)O键合型糖链的游离

与实施例3的(1)同样操作，进行O键合型糖链的游离。

(2)O键合型糖链的回收

向石墨碳柱(シグマアルドリッチ、スペルクリンENVI-Carb C)中通入乙腈1mL。进而，通入水3mL。接着，将上述(1)中制备的溶液15μL与0.1%乙酸水180μL混合，通入至本比较例所使用的用于提纯糖链的载体即石墨碳柱中。通入水3mL来清洗石墨碳。装配0.22μm的过滤器后，通入乙酸铵 in 50%乙腈水溶液500μL来回收溶液。所回收的溶液使用离心蒸发仪进行干燥。

(3)O键合型糖链的标记

将甲基吡啶硼烷与2-氨基苯甲酰胺的混合液50μL添加至上述(2)中干燥的样品后，在50℃下反应2.5小时，对糖链进行荧光标记。

(4)O键合型糖链的纯化

与实施例3的(4)同样操作，进行O键合型糖链的纯化。

将实施例3、比较例4和比较例5的结果示于图4和图5的图。图4为HPLC分析结果的图。图5为将HPLC分析的结果归纳于柱状图而得的图，横轴表示提纯时使用的载体种类，纵轴表示峰总表面积、即基于2-氨基苯甲酰胺的标记效率。其结果，使用实施例2中合成的本发明的纯化剂时，能够有效地制备O键合型糖链(实施例3)。另一方面，使用净化柱时，与使用本发明的纯化剂的情况相比是约一半的收率 (比较例4)，使用石墨碳时几乎无法回收糖链(比较例5)。

产业上的可利用性

本发明提供用于由糖蛋白制备糖链的方法、试剂盒和装置。因此，本发明可以在需要由糖蛋白制备糖链、尤其是制备包括分子量小的O键合型糖链在内的糖链的技术领域、例如伴有糖链结构变化的各种疾病的发病机理、疾病治疗和诊断技术的开发等生命科学、医疗、新药等技术领域中利用。

Claims (18)

1.由糖蛋白制备糖链的方法，其包括：

(I)使包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离溶液接触所述糖蛋白，使糖链自所述糖蛋白游离，得到含糖链样品的工序；(II)使所述含糖链样品接触纯化剂，使所述糖链吸附至所述纯化剂的工序，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链；(III)使所述糖链自所述纯化剂溶出的工序。

2.根据权利要求1的方法，其还包括：(IV)使糖链标记溶液中的糖链标记试剂与糖链反应的糖链标记工序。

3.根据权利要求2的方法，其还包括：(V)与包含还原试剂的还原溶液反应的还原工序。

4.根据权利要求3的方法，其中，所述还原溶液中的所述还原试剂的浓度为1.0mmol/L以上且250mmol/L以下。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，所述糖链游离溶液中的羟胺类为2%以上且70%以下。

6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法，其中，所述羟胺化合物为选自羟胺、羟胺的盐、O取代羟胺和O取代羟胺的盐中的至少一种。

7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法，其中，所述碱性试剂为选自碱金属的氢氧化物、碱金属的弱酸盐、碱土金属的氢氧化物、溶解于氨水溶液的碱土金属的盐和有机碱中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述碱金属的氢氧化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱金属的弱酸盐为碳酸氢钠或碳酸钠，所述碱土金属的氢氧化物为氢氧化钙、氢氧化钡或氢氧化锶，所述碱土金属的盐为乙酸钙、氯化钙、乙酸钡或乙酸镁，所述有机碱为1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍或鲸蜡基三甲基氢氧化铵。

9.根据权利要求1~8中任一项所述的方法，其中，所述纯化剂包含所述具有内铵盐结构的化合物作为有效成分。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述纯化剂是主链上键合有具有所述内铵盐结构的侧链的聚合物被固定于不溶性支撑体而成的糖链浓缩载体。

11. 用于由糖蛋白制备糖链的试剂盒，其包含：

(a)羟胺化合物、

(b)碱性试剂、

(c)纯化剂，其包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其还包含(d)糖链标记试剂。

13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中，所述羟胺化合物为选自羟胺、羟胺的盐、O取代羟胺和O取代羟胺的盐中的至少一种。

14.根据权利要求11~13中任一项所述的试剂盒，其中，所述碱性试剂为选自碱金属的氢氧化物、碱金属的弱酸盐、碱土金属的氢氧化物、溶解于氨水溶液的碱土金属的盐和有机碱中的至少一种。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述碱金属的氢氧化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱金属的弱酸盐为碳酸氢钠或碳酸钠，所述碱土金属的氢氧化物为氢氧化钙、氢氧化钡或氢氧化锶，所述碱土金属的盐为乙酸钙、氯化钙、乙酸钡或乙酸镁，所述有机碱为1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍或鲸蜡基三甲基氢氧化铵。

16.用于由糖蛋白制备糖链的装置，其具备：

第一容器保持部，其保持用于容纳包含所述糖蛋白的含糖蛋白样品的第一容器；

试剂导入部，其向所述第一容器中导入试剂；以及

第二容器保持部，其保持包含纯化剂的第二容器，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链，

所述试剂导入部包括：向所述第一容器中导入包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离试剂的糖链游离试剂导入部。

17.根据权利要求16所述的装置，其中，所述试剂导入部还包括：导入糖链标记试剂的糖链标记试剂导入部。

18.根据权利要求16或17所述的装置，其具备：对所述第二容器的容纳物进行固液分离的固液分离部。

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