KR101433973B1 - 당쇄 포착물질 및 그 용도 - Google Patents

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신이치로 니시무라
야스로 시노하라
요시아키 미우라
준이치 후루카와
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스미토모 베이클리트 컴퍼니 리미티드
국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
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Abstract

본 발명은 히드라지드기를 포함하는 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체를 상기 물질 A의 히드라지드기와 상기 당쇄 및/또는 당의 유도체의 환원 말단의 사이의 히드라존 형성에 의해서 결합하는 것을 특징으로 하는 시료 조제방법을 제공하여, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포함하는 생체 시료로부터 분석 시료용 당쇄 및/또는 당의 유도체를 간단한 조작으로 분리 정제하는 것을 가능하게 한다.

Description

당쇄 포착물질 및 그 용도{SUGAR CHAIN-CAPTURING SUBSTANCE AND USE THEREOF}
본 발명은 소정의 당쇄 포착물질을 사용한 시료 조제방법 및 그 방법에 의해 얻을 수 있는 분석 시료에 관한 것이다. 본 발명은 당쇄 포착물질의 제조방법 및 그에 이용하는 화합물 및 이 화합물을 중합하여 이루어지는 중합체에 관한 것이다. 또, 본 발명은 당쇄 포착물질의 용도, 예를 들면 사용방법, 당쇄 마이크로어레이 및 이 당쇄 마이크로어레이의 용도, 당쇄 어피니티 비드(affinity beads) 및 이 당쇄 어피니티 비드의 용도에 관한 것이다.
생체 고분자란 당쇄, 당단백, 당펩티드, 펩티드, 올리고펩티드, 단백, 핵산, 지질 등의 총칭이다.
또, 이들 생체 고분자는 의학, 세포 공학, 장기 공학 등의 바이오 테크놀로지 분야에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있어 이들 물질에 의한 생체 반응의 제어 기구를 밝히는 것은 바이오 테크놀로지 분야의 발전으로 이어지게 된다.
이 중에서도, 당쇄는 매우 다양성이 풍부하며, 천연에 존재하는 생물이 가지는 여러가지 기능에 관여하는 물질이다. 당쇄는 생체내에서 단백질이나 지방질 등에 결합한 복합 당질로서 존재하는 경우가 많으며, 생체내의 중요한 구성 성분의 하나이다. 생체내의 당쇄는 세포간 정보 전달, 단백질의 기능이나 상호작용의 조정 등에 깊이 관련되어 있는 것이 밝혀지고 있다.
또한 당쇄란 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산 등의 단당 및 이들의 유도체가 글리코시드 결합에 의해서 쇄상(鎖狀)으로 결합한 분자의 총칭이다.
예를 들면, 당쇄를 가지는 생체 고분자로는 세포의 안정화에 기여하는 식물세포의 세포벽의 프로테오글리칸, 세포의 분화, 증식, 접착, 이동 등에 영향을 주는 당지질 및 세포간 상호작용이나 세포 인식에 관여하고 있는 당단백질 등을 들 수 있다. 이들의 생체 고분자에 포함되는 당쇄가 이 생체 고분자와 서로 기능을 대행, 보조, 증폭, 조절, 혹은 저해하면서 고도로 정밀한 생체 반응을 제어하는 기구가 점차로 밝혀지고 있다. 또한 이와 같은 당쇄와 세포의 분화 증식, 세포 접착, 면역 및 세포의 암화(癌化)와의 관계가 명확하게 되면, 이 당쇄 공학과 의학, 세포 공학, 혹은 장기 공학을 밀접하게 관련시켜 새로운 전개를 도모하는 것을 기대할 수 있다.
특허 문헌 1에는 이와 같은 당쇄와 특이적으로 반응할 수 있는 물질이 기재되어 있고 이들 물질을 이용하여 당쇄를 분리 등 하는 방법이 아울러 기재되어 있다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제2004/058687호 팜플렛
그런데, 특허 문헌 1에는 당쇄 포착물질에 포착된 당쇄를 이 당쇄 포착물질로부터 유리하기(절단하기) 위해, 트리플루오로아세트산이나 산성 수지 등을 이용한 산 처리를 이용하는 예가 기재되어 있다. 이와 같은 가혹한 조건에 당쇄를 노출하는 것은 생체 시료로부터 꺼낸 당쇄의 말단에 결합하고, 또한 산성 조건에서 이탈하기 쉬운 성질을 가지는 시알산 잔기의 이탈 등 당쇄의 변성을 일으킬 우려가 있어, 보다 온화한 조건에서 당쇄 절단을 실시하는 것이 바람직하였다. 또한 당쇄에 결합하는 시알산의 유무 및 결합 장소는 질환과 관련된 것이 많아, 시알산이 완전한 상태로 당쇄를 분석하는 것이 바람직하고, 분석 전의 전처리 단계에서 시알산의 일부라도 탈리해 버리게 되면 정확한 당쇄 정보를 얻을 수 없게 되는 것이다.
따라서, 본 발명은 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포함하는 생체 시료로부터 분석 시료용 당쇄 및/또는 당의 유도체를 간단한 조작으로 분리 정제하는 것을 가능하게 하는 시료 조제방법 및 이 방법에 의해 얻을 수 있는 분석 시료를 제공한다. 또, 본 발명은 상기 시료 조제방법에서 이용되는 당쇄 포착물질의 제조방법 및 이 제조방법에서 이용할 수 있는 모노머, 이 모노머를 중합하여 얻어지는 폴리머를 제공한다. 또, 본 발명은 상기 시료 조제방법의 용도를 제공한다.
본 발명은
(1) 히드라지드기를 포함하는 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체를 상기 물질 A의 히드라지드기와 상기 당쇄 및/또는 당의 유도체의 환원 말단의 사이의 히드라존 형성에 의해서 결합하는 것을 특징으로 하는 시료 조제방법.
(2) 물질 A가 크로모포어 또는 플루오로포어를 포함하는 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 (1)항 기재의 시료 조제방법.
(3) 물질 A가 하기로부터 선택되는 물질 또는 그 염인 (1)항 기재의 시료 조제방법.
(물질 A): 5-디메틸아미노나프탈렌-1-설포닐 히드라진(단실히드라진); 2-히드라지노피리딘; 9-플루오로메틸 카바제이트(Fmoc 히드라진); 벤질히드라진; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, 히드라지드; 2-(6,8-디플루오로-7-히드록시-4-메틸쿠마린)아세토히드라지드; 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복시산, 히드라지드(DCCH), 페닐히드라진; 1-나프탈렌아세트히드라지드; 2-히드라지노벤조산; 비오틴 히드라지드; 페닐아세틱 히드라지드
(4) 물질 A가 아르기닌 잔기, 트립토판 잔기, 페닐알라닌 잔기, 티로신 잔기, 시스테인 잔기 및 이들 유도체 중 적어도 하나로 이루어진 부분을 포함하는 (1)항 기재의 시료 조제방법.
(5) 물질 A가 하기 (식 1)의 구조를 가지는 화합물인 (4)항 기재의 시료 조제방법.
(식 1)
Figure 112009010718235-pct00001
(R은 -CH3 또는 -CD3를 나타낸다)
(6) 물질 A가 하기 (식 2)의 구조를 가지는 (1)항 기재의 시료 조제방법.
(식 2)
Figure 112009010718235-pct00002
(R은 H, -COCH3, -COCD3 중 어느 하나를 나타낸다)
(7) 물질 A가 (식 3)으로 표시되는 (1)항 기재의 시료 조제방법.
(식 3)
Figure 112009010718235-pct00003
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(8) 물질 A가 하기 (식 4)로 표시되는 가교형 폴리머 구조를 가지는 (7)항 기재의 시료 조제방법.
(식 4)
Figure 112009010718235-pct00004
(R1, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
(9) 물질 A가 하기 (식 5)로 표시되는 가교형 폴리머 구조를 가지는 (7)항 기재의 시료 조제방법.
(식 5)
Figure 112009010718235-pct00005
(m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
(10) 물질 A가 평균 입경 0.1㎛ 이상 500㎛ 이하의 폴리머 입자인 (7)항~(9)항 중 어느 한 항 기재의 시료 조제방법.
(11) 물질 A가 건조 중량 1mg 당 100nmol 이상의 히드라지드기를 가지는 폴리머 입자인 (7)항~(10)항 중 어느 한 항 기재의 시료 조제방법.
(12) 물질 A가 건조 중량 1mg당 0.5μmol 이상의 히드라지드기를 가지는 폴리머 입자인 (7)항~(10)항 중 어느 한 항 기재의 시료 조제방법.
(13) 물질 A가 pH 3~8에서 안정한, (7)항~(12)항 중 어느 한 항 기재의 시료 조제방법.
(14) 물질 A가 적어도 1 MPa 이하의 압력하에서 안정한, (7)항~(12)항 중 어느 한 항 기재의 시료 조제방법.
(15) (7)항에 있어서, 상기 식 (3) 중의 담체가 고상 기판 또는 고상 기판의 표면에 직접 결합하는 물질인 것을 특징으로 하는 시료 조제방법.
(16) (1)항~(15)항 중 어느 한 항 기재의 시료 조제방법에 의해 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체를 결합시키는 당쇄 포착 단계와,
상기 당쇄 포착 단계에서 포착된 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체의 복합체에 아미노옥시기 또는 히드라지드기를 포함하는 물질 B를 작용시키고, 상기 복합체와 상기 물질 B의 사이에서 생기는 히드라존-옥심 교환 반응 또는 히드라존-히드라존 교환 반응에 의해 상기 당쇄 및/또는 당의 유도체를 상기 물질 A로부터 절리하면서 상기 물질 B에 결합시키는 당쇄 유리 단계를 포함하는 시료 조제방법.
(17) 물질 B가 크로모포어 또는 플루오로포어를 포함하는 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 (16)항 기재의 시료 조제방법.
(18) 물질 B가 하기 히드라지드기를 포함하는 물질 또는 아미노옥시기를 포함하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질 또는 염인 (16)항 기재의 시료 조제방법.
(히드라지드기를 포함하는 물질) 5-디메틸아미노나프탈렌-1-설포닐 히드라진(단실히드라진); 2-히드라지노피리딘; 9-플루오로메틸 카바제이트(Fmoc 히드라진); 벤질히드라진; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, 히드라지드; 2-(6,8-디플루오로-7-히드록시-4-메틸쿠마린)아세토히드라지드; 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복시산, 히드라지드(DCCH), 페닐히드라진; 1-나프탈렌아세트히드라지드; 2-히드라지노벤조산; 페닐아세틱 히드라지드;
(아미노옥시기를 포함하는 물질) O-벤질히드록실아민; O-페닐히드록실아민; O-(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤질)히드록실아민; O-(4-니트로벤질)히드록실아민; 2-아미노옥시피리딘; 2-아미노옥시메틸피리딘; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 메틸 에스테르; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 에틸 에스테르; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 n-부틸 에스테르.
(19) 물질 B가 아르기닌 잔기, 트립토판 잔기, 페닐알라닌 잔기, 티로신 잔기, 시스테인 잔기 및 이들 유도체 중 적어도 하나로 이루어진 부분을 포함하는 (16)항 기재의 시료 조제방법.
(20) 물질 B가 하기 (식 7)로 표시되는 구조를 가지는 (16)항 기재의 시료 조제방법.
(식 7)
Figure 112009010718235-pct00006
(구조식 중, R은 -CH3, -CD3를 나타낸다)
(21) 물질 B가 고상 담체인 (16)항 기재의 시료 조제방법.
(22) 물질 B가 아미노옥시기를 포함하는 고상 담체인 (21)항 기재의 시료 조제방법.
(23) 물질 B가 하기 (식 12)로 표시되는 (22)항 기재의 시료 조제방법.
(식 12)
Figure 112009010718235-pct00007
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(24) 물질 B가 하기 (식 8)로 표시되는 구조를 가지는 폴리머 입자인 (23)항 기재의 시료 조제방법.
(식 8)
Figure 112009010718235-pct00008
(Rl, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
(25) 물질 B가 하기 (식 9)로 표시되는 구조를 가지는 폴리머 입자인 (23)항 기재의 시료 조제방법.
(식 9)
Figure 112009010718235-pct00009
(m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
(26) (21)항에 있어서, 상기 고상 담체가 고상 기판 또는 고상 기판의 표면에 직접 결합하는 물질인 것을 특징으로 하는 시료 조제방법.
(27) (16)항~(25)항 중 어느 한 항 기재의 제조방법에 있어서, 상기 당쇄 유리 단계 후에 히드라존-옥심 교환 또는 히드라존-히드라존 교환 반응을 적어도 1회 이상 실시하는 것을 특징으로 하는 시료 조제방법.
(28) 당쇄 및/또는 당의 유도체를 결합시킨, 하기 (식 3), (식 4) 또는 (식 5)로 표시되는 구조를 가지는 물질 A를 산성 조건에서 처리함으로써 히드라존 결합을 해리시켜, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 유리시키는 것을 특징으로 하는 시료 조제방법.
(식 3)
Figure 112009010718235-pct00010
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(식 4)
Figure 112009010718235-pct00011
(R1, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
(식 5)
Figure 112009010718235-pct00012
(m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
(29) 산성 조건에서의 처리가 0.01~10 부피%의 트리플루오로아세트산 용액에 의한 처리인 (28)항 기재의 시료 조제방법.
(30) 산성 조건에서의 처리가 0.01~1 부피%의 트리플루오로아세트산 용액에 의한 처리이며, 25~80℃에서 5~60 분간 행해지는 (29) 항 기재의 시료 조제방법.
(31) (1)항~(30)항 중 어느 한 항 기재의 시료 조제방법에 의해 조제된 분석시료.
(32) 하기 (식 3)으로 표시된 물질 A의 제조방법으로서,
중합성 기를 포함하는 카르복시산 에스테르 모노머를 포함하는 원료를 가교제 존재하에서 중합시켜 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 얻은 후 상기 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 10 부피% 이상의 농도의 히드라진 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 물질 A의 제조방법.
(식 3)
Figure 112009010718235-pct00013
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(33) 상기 카르복시산 에스테르 모노머가 카르복시산 메틸 에스테르인 (32)항 기재의 물질 A의 제조방법.
(34) 하기 (식 10)로 표시되는 구조를 가지는 모노머.
(식 10)
Figure 112009010718235-pct00014
(Rl은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R2는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(35) (34)항 기재의 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체.
(36) 하기 (식 11)로 표시되는 구조를 가지는 모노머.
(식 11)
Figure 112009010718235-pct00015
(37) (36)항 기재의 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체.
(38) 하기 (식 13)으로 표시되는 구조를 가지는 모노머.
(식 13)
Figure 112009010718235-pct00016
(R2는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄, R6은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, [P]는 보호기를 나타낸다)
(39) (38)항 기재의 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체.
(40) (39)항 기재의 중합체에 있어서, 상기 (식 13)의 보호기 [P]를 산 처리에 의해 탈보호하여 얻어지는 중합체.
(41) 하기 (식 14)로 표시되는 구조를 가지는 모노머.
(식 14)
Figure 112009010718235-pct00017
(42) (41)항 기재의 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체.
(43) (42)항 기재의 중합체의 t-부톡시카르보닐기를 산 처리에 의해 탈보호하여 얻어지는 중합체.
(44) 하기 (식 4)로 나타내는 물질 A의 제조방법으로서,
하기 (식 10)의 구조를 가지는 모노머를 가교제 존재하에서 중합하여 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 얻은 후 상기 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 10 부피% 이상의 농도의 히드라진 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 물질 A의 제조방법.
(식 4)
Figure 112009010718235-pct00018
(Rl, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
(식 10)
Figure 112009010718235-pct00019
(Rl은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R2는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(45) 하기 (식 5)로 나타내는 물질 A의 제조방법으로서,
하기 (식 11)의 구조를 가지는 모노머를 가교제 존재하에서 중합하여 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 얻은 후 상기 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 10 부피% 이상의 농도의 히드라진 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 물질 A의 제조방법.
(식 5)
Figure 112009010718235-pct00020
(m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
(식 11)
Figure 112009010718235-pct00021
(46) 혼합물 자체 또는 혼합물로부터의 특정의 획분을 단리정제하여 얻어진 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화한 고상 담체를 이 당쇄 및/또는 당의 유도체에 대해서 결합성 또는 친화성을 가지는 물질을 포집하기 위한 담지체로서 이용하는 사용방법.
(47) 하기 (식 3) 또는 (식 12)로 표시되는 구조를 가지는 물질 B로 이루어진 고상 담체로 구성되는 고상 기판의 표면에 하기 (공정 1)~(공정 4)에 의해서 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화하는 당쇄 마이크로어레이의 제조방법.
(공정 1) 당쇄 및/또는 당의 유도체와 가용성의 히드라지드기 함유 화합물을 결합시켜, 소정의 분리 수단에 의해서 당쇄 및/또는 당의 유도체를 정제 및/또는 단리하는 공정.
(공정 2) 공정 1에서 얻어진 화합물의 용액을 상기 고상 기판상에 정렬적으로 점착하는 공정.
(공정 3) 점착 후의 고상 기판을 소정의 조건에서 인큐베이트함으로써 당쇄-물질 A의 결합을 고상 기판-당쇄의 결합으로 교환하는 반응을 진행시켜, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고상 기판에 고정화하는 공정.
(공정 4) 고상 기판상의 미반응물을 세정 제거하는 공정.
(식 3)
Figure 112009010718235-pct00022
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(식 12)
Figure 112009010718235-pct00023
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(48) (47)항 기재의 방법에 의해 제조되는 당쇄 마이크로어레이.
(49) (48)항 기재의 당쇄 마이크로어레이의 표면에 검체를 포함하는 용액을 접촉시켜, 소정의 조건에서 인큐베이트 및 세정 조작을 실시한 후에 고상 기판상의 점착 부위의 당쇄 및/또는 당의 유도체에 포집된 당 결합성 물질을 검출함으로써 고정화된 당쇄 및/또는 당의 유도체와 특이적으로 결합 또는 흡착하는 당 결합성 물질을 탐색하는 시스템.
(50) (48)항 기재의 당쇄 마이크로어레이의 표면에 검체를 포함하는 용액을 접촉시키고, 고상 기판상의 점착 부위의 당쇄 및/또는 당의 유도체에 상기 검체 중의 당 결합성 단백질을 포집시키고, 포집한 양을 소정의 정량화 수단으로 정량화하는 결합성 단백질의 인식 특이성(recognition specificity)을 평가하는 시스템.
(51) 하기 (식 3) 또는 (식 12)로 표시되는 구조를 가지는 물질 B로 이루어진 고상 담체로 구성되는 폴리머의 표면에 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화하는 당쇄 어피니티 비드의 제조방법.
(식 3)
Figure 112009010718235-pct00024
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(식 12)
Figure 112009010718235-pct00025
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(52) (51)항 기재의 당쇄 어피니티 비드의 제조방법에 있어서, 상기 폴리머 입자의 표면에 하기 (공정 1)~(공정 3)에 의해서 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화하는 것을 특징으로 하는 당쇄 어피니티 비드의 제조방법.
(공정 1) 당쇄 및/또는 당의 유도체와 가용성의 히드라지드기 함유 화합물을 결합시켜, 소정의 분리 수단에 의해서 당쇄 및/또는 당의 유도체를 정제 및/또는 단리하는 공정.
(공정 2) 공정 1에서 얻어진 화합물을 상기 폴리머 입자와 접촉시켜, 소정의 조건에서 인큐베이트함으로써 당쇄-히드라지드기 함유 화합물의 결합을 당쇄-폴리머 입자의 결합으로 교환시켜, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 폴리머 입자에 고정화하는 공정.
(공정 3) 폴리머 입자상의 미반응물을 세정 제거하는 공정.
(53) (51)항 또는 (52)항 기재의 방법에 의해 제조되는 당쇄 어피니티 비드.
(54) (53)항 기재의 당쇄 어피니티 비드에 검체를 포함하는 용액을 접촉시켜, 소정의 조건에서 인큐베이트 및 세정 조작을 실시한 후에 포착된 당 결합성 물질을 단리하는 시스템을 제공한다.
본 발명에 의하면, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포함하는 생체 시료로부터 분석 시료용 당쇄 및/또는 당의 유도체를 간단한 조작으로 분리 정제하는 것을 가능하게 한다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해 설명한다.
하나의 관점으로부터, 본 발명은 히드라지드기를 포함하는 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체를 상기 물질 A의 히드라지드기와 상기 당쇄 및/또는 당의 유도체의 환원 말단의 사이의 히드라존 형성에 의해서 결합하는 것을 특징으로 하는 시료 조제방법을 제공한다.
이 시료 조제방법에서 이용되는 히드라지드기를 포함하는 물질 A로는 단부에 히드라지드기(-NHNH-)를 포함하고 있으면 특별히 한정되는 일은 없다. 이 히드라지드기가 수용액 등의 용액 중에서 당쇄에 의해 형성되는 환상의 헤미아세탈형과 비환상의 알데히드형과의 평형에 있어서, 알데히드기와 반응하여 특이적이고 또한 안정적인 결합을 형성하여 당쇄를 포착할 수 있게 된다. 여기서, 당쇄 포착 반응이란 이하에 나타내는 반응을 말한다.
Figure 112009010718235-pct00026
여기서, 물질 A는 저분자 화합물, 고상 담체 중 어느 형태를 취해도 된다.
저분자 화합물로서 이용하는 경우에는 물질 A는 아르기닌 잔기, 트립토판 잔기, 페닐알라닌 잔기, 티로신 잔기, 시스테인 잔기 및 이들 유도체 중 적어도 하나로 이루어진 부분을 포함하는 것이 이하의 관점으로부터 바람직하다.
즉, 아르기닌(R) 잔기를 포함하는 경우, MALDI-TOF-MS 측정시에 이온화가 촉진되어 검출 감도가 향상하는 것이 알려져 있다. 또, 트립토판(W)은 형광성 아미노산이며, 또한 소수성인 것으로부터, 역상 HPLC에서의 분리성 향상과 형광 검출 감도 향상을 도모할 수 있다. 또한 페닐알라닌(F) 및 티로신(Y)을 이용했을 경우에는 UV 흡수에 의한 검출에 적합하다.
또, 시스테인을 이용했을 경우에는 측쇄의 티올기를 이용하고, S-S 결합에 의해 ―SH기를 포함하는 다른 물질과 결합시킬 수 있다. 예를 들면, -SH기를 포함하는 고상 담체에 고정화하는 것이 가능해진다. 또 다른 예로서는, ICAT법(Isotope-Coded Affinity Tags)을 이용할 수 있다.
이와 같은 물질 A의 일례로는 하기 (식 1)의 구조를 가지는 화합물을 들 수 있다.
(식 1)
Figure 112009010718235-pct00027
(R은 -CH3 또는 -CD3를 나타낸다)
(식 1)의 화합물은 이하의 도식 1에 따라서 제조할 수 있다.
(도식 1)
Figure 112009010718235-pct00028
도식 1에 있어서, 화합물(b)는 트립토판 부분의 아미노기가 페닐기 등에 의해 보호된 화합물(a)의 Pd/C 존재하에서의 수소화에 의한 탈보호에 의해 얻을 수 있다. 여기서, 트립토판 부분은 페닐알라닌, 티로신, 시스테인 등에 의해 치환할 수도 있다.
이어서, 화합물(b)의 트립토판 측의 아미노기를 수용성 카르복시디이미드(WSC), 디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에서, 디메틸포름아미드(DMF)의 용매 중에서 아세트산(AcOH)를 작용시키고, 아세틸화하여 화합물(c)를 얻는다.
또한 화합물(c)에 메탄올(MeOH) 용매 중에서 히드라진을 작용시키고, 아르기닌측의 C 말단의 메톡시기를 히드라지드기로 치환하고, 목적하는 (식 1)의 화합물로서 화합물(d)를 얻는다.
화합물(d)에 중수소(D)를 도입하는 경우에는 도식 1에 있어서, 화합물(b)에 수용성 카르복시디이미드(WSC), 디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에서, 디메틸포름아미드(DMF) 용매 중에서 중수소 아세트산(CD3COOH)으로 아세틸화하고, 트립토판 측의 아미노기를 중수화 아세틸기로 아세틸화한 화합물을 얻는다. 또한 이 화합물에 메탄올(MeOH) 용매 중에서 히드라진을 작용시키고, 아르기닌 측의 C말단의 메톡시기를 히드라지드기로 치환하고, 목적하는 (식 1)의 화합물로서 화합물(e)룰 얻는다.
또, 물질 A의 다른 일례로는 하기 (식 2)의 구조를 가지는 화합물을 들 수 있다.
(식 2)
Figure 112009010718235-pct00029
(R은 H, -COCH3,-COCD3 중 어느 하나를 나타낸다)
(식 2)의 화합물은 이하의 도식 2에 따라서 제조할 수 있다.
(도식 2)
Figure 112009010718235-pct00030
도식 2에 있어서, 우선 시스테인의 2량체(화합물(t))에 2-아미노벤조산(화합물(u))을 작용시켜 화합물(v)를 얻는다.
이 화합물(v)에 무수 아세트산을 작용시키고, 2-아미노벤조일기의 아미노기를 아세틸화시켜 화합물(q)를 얻을 수 있다. 이 때, 무수 아세트산인 화합물(o)를 이용함으로써 경수소화 화합물(q-1)을 얻을 수 있고, 또한 중수소화 무수 아세트산인 화합물(p)을 이용함으로써 중수소화 화합물(q-2)을 얻을 수 있다.
이어서, 화합물(q-1) 또는 (q-2)와 히드라진을 반응시켜 화합물(r)을 얻을 수 있다. 또한 화합물(r)에 있어서 R이 아세틸기 (-COCH3)일 때는 경수소화물(r-1)을 얻을 수 있고 R이 중수소화 아세틸기(-COCD3)일 때는 중수소화물(r-2)을 얻을 수 있다.
또한 화합물(r)에 DTT 등의 환원제를 이용하여 환원하고, 디설파이드 결합을 절단하여, 아미노기가 아세틸화된 2-아미노벤조일기와 시스테인을 가지는 (식 2)의 히드라지드기 함유 화합물을 얻을 수 있다. 또한 화합물(r)에 있어서 R이 아세틸기(-COCH3)일 때는 경수소화물(s-1)을 얻을 수 있고 R이 중수소화 아세틸기(-COCO3)일 때는 중수소화물(s-2)을 얻을 수 있다.
이상과 같이 물질 A에 아르기닌 잔기, 트립토판 잔기, 페닐알라닌 잔기, 티로신 잔기, 시스테인 잔기 및 이들의 유도체를 도입함으로써 포착된 당쇄에 질량 분석의 고감도화나 형광ㆍUV 표지화 등의 기능을 부여하는 것이 가능해진다.
또, (식 2)에 나타낸 것처럼 2-아미노벤조일기 등의 크로모포어 또는 플루오로포어를 분자 중에 포함하고 있어도 되며, 이와 같은 기로는 2-아미노벤조일기 이외에는 벤질기, 나프틸기, 안트라세닐기, 피리딜기 등으로 대표되는 방향족 잔기, 단실(Dansyl)기, Fmoc기를 포함하는 치환기 등을 들 수 있다. 이와 같은 치환기는 형광성을 부여하기 위한 표지 화합물이며, 당쇄의 HPLC 분석에 일반적으로 사용되고 있다. 따라서, 이 치환기를 도입한 물질 A에 의해 포착한 당쇄 및/또는 당의 유도체를 표지화 샘플로 할 수 있다. 이 표지화 샘플을 이용함으로써 물질 A에 의해 포착된 당쇄 및/또는 당의 유도체를 역상 컬럼을 이용한 HPLC로 고분해능, 고감도로 분석하는 것이 가능하게 된다.
또, (식 1), (식 2)에서 설명한 것처럼 중수소화된 치환기, 예를 들면 중수소화 아세틸기 등을 포함하고 있어도 된다. 이와 같은 중수소화된 관능기를 포함하는 것은 질량 분석에 의한 검출 감도를 향상시켜 정성 및 정량이 가능하게 된다.
예를 들면, (식 1), (식 2)의 물질 A를 이용하여 중수소화된 샘플 및 경수소화된 샘플을 조합하여 이용함으로써 예를 들면 미지의 당쇄 함유 샘플(예를 들면, 혈청을 처리한 것)에 포함되는 당쇄의 질량 분석에 의한 정성 및 정량 분석이 가능하게 된다.
이것에 의해 예를 들면 조성도 농도도 기존의 샘플을 중수소 표지화하며, 미지의 샘플을 경수소 표지화하고, 양 샘플을 혼합하고 나서 질량 분석을 실시했을 경우, 중수소화 샘플의 각 피크는 경수소화 샘플의 대응하는 각 피크보다 도입한 중수소의 수만큼 고분자량 쪽으로 시프트하여 관측된다. 따라서, 각 피크의 위치(m/z 값) 및 강도를 해석하여, 미지의 샘플의 각 피크가 나타내는 당쇄의 종류와 그 샘플 중의 농도를 알 수 있다. 이와 같은 해석은 기존 샘플을 경수소화하고, 미지의 샘플을 중소화하는 것에 의해서도 가능하다.
또, 이 해석에 있어서, 정상인으로부터 채취한 샘플을 중수소화하고, 질병 환자에서 채취한 샘플을 경수소화함으로써 혹은 정상인 샘플을 경수소화하고, 질병 환자 샘플을 중수소화함으로써 양자의 샘플 중에 포함되는 당쇄의 종류, 양에서의 차이를 해석하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 이와 같은 분석 시료는 당의 대사가 관여하는 생체 반응에 근거하는 질병의 진단, 이와 같은 생체 반응을 제어하는 것에 의한 치료 등의 용도에 매우 적합하게 사용된다.
물질 A에 대해서 (식 1) 및 (식 2)의 구조를 가지는 화합물에 대해 설명했으나, 물질 A는 하기로부터 선택되는 물질 또는 그 염이어도 된다.
(물질 A): 5-디메틸아미노나프탈렌-1-설포닐 히드라진(단실히드라진); 2-히드라지노피리딘; 9-플루오레닐메틸 카바제이트(Fmoc 히드라진); 벤질히드라진; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, 히드라지드; 2-(6,8-디플루오로-7-히드록시-4-메틸쿠마린)아세토히드라지드; 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복시산, 히드라지드(DCCH), 페닐히드라진; 1-나프탈렌아세트히드라지드; 2-히드라지노벤조산; 비오틴 히드라지드; 페닐아세틱 히드라지드
또, 이들의 화합물에 포착된 당쇄를 고정도(high resolution)이고 또한 고감도(high sensitivity)로 검출한다고 하는 관점으로부터, 크로모포어 또는 플루오로포어를 포함하는 부위를 도입해도 되고, 또, 중수소를 도입해도 된다.
여기서, 당쇄 포착 반응, 즉 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체의 반응은 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포함하는 시료에 물질 A를 도입하고, pH가 4~8인 조건에서, 또, 반응 온도가 40~90℃, 바람직하게는 25~90℃, 보다 바람직하게는 40~90℃인 조건에서의 반응계에서, 10분간~24시간, 바람직하게는 10분간~8시간, 보다 바람직하게는 10분간~2시간 실시된다.
또, 고상 담체로서 이용하는 경우에는 물질 A는 하기 (식 3)으로 표시된다.
(식 3)
Figure 112009010718235-pct00031
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
식 3에 있어서, 담체는 무기 물질 또는 유기 고분자 물질로 이루어진 폴리머 매트릭스이며, 입자, 고상 기판, 또는 고상 기판의 표면에 직접 결합하는 물질의 형태로서 이용된다.
여기서, 담체로서 이용할 수 있는 무기 물질로는 입자상의 것을 이용할 수 있고, 예를 들면 실리카 입자, 알루미나 입자, 유리 입자, 금속 입자 등을 들 수 있다.
또, 유기 고분자 물질로는 아가로오스, 세파로오스로 대표되는 다당류 겔, 비닐 화합물의 중합체인 폴리머를 입자상으로 한 것, 고상 기판의 표면에 고정화한 것을 들 수 있다. 또, 이들 물질을 이용하여 고상 기판의 표면을 구성해도 된다.
또, 입자로 했을 때의 형상은 구인 것이 바람직하고, 평균 입경 0.1㎛ 이상 500㎛ 이하의 폴리머 입자이다. 이와 같은 범위의 입경을 가지는 담체의 입자는 원심분리, 필터 등에 의한 회수가 용이하고, 또한 충분한 표면적을 가지고 있기 때문에 당쇄와의 반응 효율도 높다고 생각된다. 입경이 상기의 범위보다 큰폭으로 큰 경우, 표면적이 작아지기 때문에 당쇄와의 반응 효율이 낮아지는 일이 있다. 또, 입경이 상기의 범위보다 큰폭으로 작은 경우, 특히 필터에 의한 입자의 회수가 어려워지는 일이 있다. 또한 입자를 컬럼에 충전하여 이용하는 경우, 입경이 지나치게 작으면 액이 통과할 때의 압력 손실이 커져 버리는 일이 있다.
또, 고상 기판으로는 마이크로플레이트, 평판 모양의 기판을 들 수 있고 이와 같이 함으로써 물질 A를 당쇄 마이크로어레이용 기판에 적용하고, 분석 시료를 조제하는 것이 가능하게 된다.
R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타내고, 예를 들면 하기의 것을 들 수 있다. 하기 식 중, a, b, d는 1에서 5의 정수를 나타내고, c는 1에서 10의 정수를 나타낸다.
Figure 112009010718235-pct00032
여기서, 당쇄 포착 반응은 상술과 같은 입자상의 물질 A를 컬럼 등에 충전하여 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포함하는 시료를 통과시켜도 되고(연속식), 이 입자를 시료 중에 투입해 실시해도 된다(회분식). 또, 입자가 미리 충전된 반응 용기 내에 시료를 연속적으로 투입해서 교반하여 실시해도 된다(반회분식).
또, 상기 (식 3)으로 표시되는 물질 A는 중합성 기를 포함하는 카르복시산 에스테르 모노머를 포함하는 원료를 가교제 존재하에서 중합시켜 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 얻은 후 상기 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 10 부피% 이상의 농도의 히드라진 용액으로 처리함으로써 얻을 수 있다. 따라서, 다른 관점에서는 본 발명은 이와 같은 (식 3)으로 표시되는 물질 A의 제조방법을 제공한다.
여기서, 카르복시산 에스테르 모노머로는 카르복시산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 카르복시산메틸 에스테르를 들 수 있다.
또, 가교제로는 다관능의 화합물로서 카르복시산 에스테르 모노머와 공중합을 실시하는 화합물을 매우 적합하게 이용할 수 있고, 예를 들면 (1) 폴리올의 디 또는 트리(메타)아크릴산 에스테르류, 예를 들면 폴리올이 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 트리메틸올프로판, 글리세린, 폴리옥시에틸렌글리콜, 폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리글리세린 등인 것, (2) 상기 (1)에 있어서, 불포화산이 (메타)아크릴산 이외의 것, 예를 들면 말레산, 푸말산 등인 것, (3) 비스아크릴아미드류, 예를 들면 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 등, (4) 폴리에폭시드와 (메타)아크릴산을 반응시켜 얻을 수 있는 디 또는 트리(메타)아크릴산 에스테르류, (5) 폴리이소시아네이트와 (메타)아크릴산히드록시 에스테르를 반응시켜 얻을 수 있는 디(메타)아크릴산카르바밀 에스테르류, 예를 들면 폴리이소시아네이트가 톨릴렌 디이소시아네이트, 헥사메틸렌디이소시아네이트 등인 것, (6) 다가 알릴 화합물, 예를 들면 알릴화 전분, 알릴화 셀룰로오스, 디알릴프탈레이트, 테트라알릴옥시에탄, 펜타에리스리톨 트리알릴 에테르, 트리메틸올 프로판 트리알릴에테르, 디에틸렌 글리콜 디알릴 에테르, 트리알릴 트리멜리테이트 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 본 발명에서는 에틸렌 글리콜 디(메타)아크릴레이트, 프로필렌 글리콜 디(메타)아크릴레이트, N,N'-메틸렌 비스(메타)아크릴아미드 등이 바람직하다.
즉, (식 3)으로 표시되는 물질 A는 하기 구조를 취하는 것을 이용할 수 있다.
-(히드라지드기 함유 화합물 성분)m-(가교제 성분)n-
이와 같은 구조를 가지는 물질 A로는 하기 (식 4)로 표시되는 가교형 폴리머 구조를 가지는 것을 들 수 있다.
(식 4)
Figure 112009010718235-pct00033
(R1, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
Rl은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타내고, 예를 들면 상기 R와 같은 것을 들 수 있다.
R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타내고, 예를 들면 하기의 것을 들 수 있다. 하기 식 중, e, f는 1에서 5의 정수를 나타내고, g는 1에서 10의 정수를 나타낸다.
Figure 112009010718235-pct00034
R3, R4, R5는 각각 같아도 달라도 되고, H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타내고, 예를 들면 하기의 것을 들 수 있다. 하기 식 중, h는 1에서 4의 정수를 나타낸다.
Figure 112009010718235-pct00035
여기서, 히드라지드기 함유 화합물 성분의 전구체인 카르복시산 에스테르 모노머로는 하기 (식 10)으로 표시되는 카르복시산 메틸 에스테르 모노머를 매우 적합하게 이용할 수 있다. 또, 가교제 성분으로는 상기의 가교제를 이용할 수 있다.
(식 10)
Figure 112009010718235-pct00036
(Rl은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R2는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다)
Rl 및 R2의 구체적인 예는 전술한 (식 4)에서 예로 들었던 것과 같은 것이다.
즉, (식 4)로 표시되는 물질 A는 (식 10)의 구조를 가지는 모노머를 가교제 존재하에서 중합하여 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 얻은 후 상기 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 10 부피% 이상의 농도의 히드라진 용액으로 처리함으로써 얻을 수 있다.
추가적인 관점에서는 본 발명은 (식 10)으로 표시되는 모노머, 이 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체 및 상술한 것처럼 이 (식 10)를 이용하여 (식 4)의 물질 A를 얻는 제조방법을 제공한다.
또, 이 제조방법에서는 카르복시산 에스테르 모노머를 출발 물질로 하여, 이 모노머를 가교제의 존재하에서 중합시켜 폴리머 입자를 얻은 후에 히드라진 용액으로 처리하여 (식 4)의 물질 A를 얻고 있지만, 예를 들면 하기 (식 13)의 히드라지드기 함유 모노머를 출발 물질로 하고, 이 모노머를 전술한 것과 같은 가교제의 존재하에서 중합시킨 후에 탈보호하는 것에 의해서도 (식 4)의 물질 A를 얻을 수 있다.
(식 13)
Figure 112009010718235-pct00037
(R2는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄, R6은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, [P]는 보호기를 나타낸다)
여기서, R2의 구체적인 예는 전술한 (식 4)에서 예로 들었던 것과 같은 것이다.
또, R6는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타내고, 예를 들면 하기의 것을 들 수 있다. 하기 식 중, i, j는 1에서 5의 정수를 나타낸다.
Figure 112009010718235-pct00038
또, (식 13) 중에서의 보호기 [P]는 Boc, Fmoc, Tmoc 등을 들 수 있다.
또, 보호기 [P]를 탈보호하는 방법으로는 통상의 산 처리를 들 수 있다.
추가적인 관점에서는 본 발명은 (식 13)으로 표시되는 모노머, 이 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체 및 상술한 것처럼 이 (식 13)을 이용하여 (식 4)의 물질 A를 얻는 제조방법을 제공한다.
또, 이와 같은 (식 4) 중, 특히 바람직한 물질 A로는 하기 (식 5)로 표시되는 가교형 폴리머 구조를 가지는 것을 들 수 있다.
(식 5)
Figure 112009010718235-pct00039
(m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
여기서, 히드라지드기 함유 화합물 성분의 전구체인 카르복시산 에스테르 모노머로는, 하기 (식 11)로 표시되는 카르복시산 메틸 에스테르 모노머를 매우 적합하게 이용할 수 있다. 또, 가교제 성분으로는 에틸렌 글리콜 디(메타)아크릴레이트를 이용할 수 있다.
(식 11)
Figure 112009010718235-pct00040
즉, (식 5)로 표시되는 물질 A는 (식 11)의 구조를 갖는 모노머를 가교제 존재하에서 중합하여 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 얻은 후 상기 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 10 부피% 이상의 농도의 히드라진 용액으로 처리함으로써 얻을 수 있다.
추가적인 관점에서는 본 발명은 (식 11)로 표시되는 모노머, 이 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체 및 상술한 것처럼 이 (식 11)을 이용하여 (식 5)의 물질 A를 얻는 제조방법을 제공한다.
또, 이 제조방법에서는 (식 11)의 카르복시산 에스테르 모노머를 출발 물질로 하여, 이 모노머를 가교제의 존재하에서 중합시켜 폴리머 입자를 얻은 후에 히드라진 용액으로 처리하여 (식 5)의 물질 A를 얻고 있지만, 예를 들면 하기 (식 14)의 히드라지드기 함유 모노머를 출발 물질로 하고, 이 모노머를 전술한 것과 같은 가교제의 존재하에서 중합시킨 후에 탈보호하는 것에 의해서도 (식 5)의 물질 A를 얻을 수 있다.
(식 14)
Figure 112009010718235-pct00041
또, 보호기인 t-부톡시카르보닐(Boc)기를 탈보호하는 방법으로는 통상의 산 처리를 들 수 있다.
추가적인 관점에서는 본 발명은 (식 14)로 표시되는 모노머, 이 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체 및 상술한 것처럼 이 (식 14)를 이용하여 (식 5)의 물질 A를 얻는 제조방법을 제공한다.
또, (식 3), (식 4), (식 5)로 표시되는 물질 A는 건조 중량 1mg당 100nmol 이상, 바람직하게는 0.5μmol 이상의 히드라지드기를 가지는 폴리머 입자이고, pH 3~8에서 안정하며, 적어도 1 MPa 이하의 압력하에서 안정한 것이 입자의 형상을 유지하고, 또한 활성인 히드라지드기의 함유량이 실질적으로 변화하지 않는다고 하는 관점으로부터 바람직하다. 또, 가교제와 공중합한 입자이므로, 용매에 대한 용해성이 낮아지며, 또한 물리적 강도를 충분히 얻을 수 있다. 나아가서는 pH 3~8에서 절단되는 부위가 없다.
또다른 관점에서, 본 발명은 전술한 시료 조제방법에 의해 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체를 결합시키는 당쇄 포착 단계와, 당쇄 포착 단계에서 포착된 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체의 복합체에 아미노옥시기 또는 히드라지드기를 포함하는 물질 B를 작용시키고, 상기 복합체와 상기 물질 B의 사이에서 생기는 히드라존-옥심 교환 반응 또는 히드라존-히드라존 교환 반응에 의해 상기 당쇄 및/또는 당의 유도체를 상기 물질 A로부터 떼어내면서 상기 물질 B에 결합시키는 당쇄 유리 단계를 포함하는 시료 조제방법을 제공한다.
이 방법에 있어서, 당쇄 포착 단계에서는 전술한 것처럼 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체룰 상기 물질 A의 히드라지드기와 상기 당쇄 및/또는 당의 유도체의 환원 말단 사이의 히드라존 형성에 의해서 결합하여, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 물질 A에 포착시킨다.
이어서, 당쇄 유리 단계에서는 하기 (반응식 1)로 표시한 것처럼 히드라존-옥심 교환 반응 또는 히드라존-히드라존 교환 반응을 실시한다.
(반응식 1)
Figure 112009010718235-pct00042
여기서, 물질 A는 전술에서 설명한 것을 이용할 수 있다.
또, 물질 B는 저분자 화합물, 고상 담체 중 어느 형태를 취해도 된다.
저분자 화합물로서 이용하는 경우에는 물질 A와 같이, 아르기닌 잔기, 트립토판 잔기, 페닐알라닌 잔기, 티로신 잔기, 시스테인 잔기 및 이들 유도체 중 적어도 하나로 이루어진 부분을 포함하는 것이 전술한 것과 같은 관점으로부터 바람직
즉, 물질 B에 아르기닌 잔기 등을 포함하게 함으로써 당쇄 유리 단계를 거쳐 얻을 수 있는 물질 B와 당쇄 및/또는 당의 유도체의 복합체에 대해서 MALDI-TOF-MS 측정에서의 검출 감도의 향상, 역상 HPLC에서의 분리성 향상과 형광 검출 감도의 향상 등을 도모할 수 있다.
이와 같은 물질 B의 일례로는 상기 물질 A에서 예로 들었던 저분자 화합물 및 하기 (식 7)로 나타내는 구조를 가지는 화합물을 들 수 있다. 또, (식 7)에 있어서, 트립토판 부분은 페닐알라닌, 티로신, 시스테인 등에 의해 치환할 수도 있다.
(식 7)
Figure 112009010718235-pct00043
(구조식 중, R은 -CH3, -CD3를 나타낸다)
(식 7)의 화합물은 이하의 도식 3에 따라서 제조할 수 있다. 또한 R=CH3인 경우를 나타낸다.
(도식 3)
Figure 112009010718235-pct00044
도식 3에 있어서, 화합물(b) (WR-OMe)는 트립토판 부분의 아미노기가 페닐기 등에 의해 보호된 화합물의 탈보호에 의해 얻을 수 있다. 여기서, 트립토판 부분은 페닐알라닌, 티로신 등에 의해 치환할 수도 있다. 이어서, 화합물(b)와 Boc 보호된 히드록시아민(화합물(w))의 혼합 산 무수물법(mixed acid anhydride method) 등의 축합 반응에 의해 화합물(m)이 합성된다. 이 히드록시아민의 보호기는 화합물(w)과 같이 Boc으로 한정되는 일은 없으며, Fmoc, Troc 등이어도 된다. 이어서, 화합물(m)을 탈보호 처리함으로써 목적물인 (식 7)의 화합물로서 화합물(n)을 얻을 수 있다. 이 탈보호 처리로는 예를 들면 보호기가 Boc인 경우에는 트리플루오로아세트산(TFA)에 의한 처리를 들 수 있다.
이상과 같이 물질 B에 아르기닌 잔기, 트립토판 잔기, 페닐알라닌 잔기, 티로신 잔기, 시스테인 잔기 및 이들 유도체를 도입함으로써 포착된 당쇄를 고정도이고 또한 고감도로 검출할 수 있게 된다.
또, (식 7)로 표시한 것처럼 2-아미노벤조일기 등의 크로모포어 또는 플루오로포어를 분자 중에 포함하고 있어도 되고, 이와 같은 기로는 2-아미노벤조일기 이외에는 벤질기, 나프틸기, 안트라세닐기, 피리딜기 등으로 대표되는 방향족 잔기, 단실기, Fmoc기를 포함하는 치환기 등을 들 수 있다. 이와 같은 치환기는 형광성을 부여하기 위한 표지 화합물이며, 당쇄의 HPLC 분석에 일반적으로 사용되고 있다. 따라서, 이 치환기를 도입한 물질 A에 의해 포착한 당쇄 및/또는 당의 유도체를 표지화 샘플로 할 수 있다. 이 표지화 샘플을 이용함으로써 물질 A에 의해 포착된 당쇄 및/또는 당의 유도체를 역상 컬럼을 이용한 HPLC로 고분해능, 고감도로 분석하는 것이 가능하게 된다.
또, (식 7)에서 설명한 것처럼 중수소화된 치환기, 예를 들면 중수소화 메톡시 에스테르기 등을 포함하고 있어도 된다. 이와 같은 중수소화된 관능기를 포함하는 것은 질량 분석에 의한 검출 감도를 향상시키는 효과에 덧붙여, 예를 들면 표준 물질을 중라벨(heavy labeling), 샘플을 경라벨(light labeling)하여 혼합해 측정하는 등과 같이 질량수의 차이를 이용한 정량적 분석을 가능하게 한다.
이것에 의해 당쇄 유리 단계를 거쳐 얻을 수 있는 물질 B와 당쇄 및/당의 유도체의 복합체도, 전술한 것과 같은 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체의 복합체가 적합하게 사용되는 용도에 또한 적합하게 사용될 수 있다.
물질 B에 대해서 (식 7)의 구조를 가지는 화합물에 대해 설명했지만, 물질 B는 하기 히드라지드기를 포함하는 물질 또는 아미노옥시기를 포함하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질 또는 염이어도 된다.
(히드라지드기를 포함하는 물질) 5-디메틸아미노나프탈렌-1-설포닐 히드라진(단실히드라진); 2-히드라지노피리딘; 9-플루오레닐메틸 카바제이트(Fmoc 히드라진); 벤질히드라진; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, 히드라지드; 2-(6,8-디플루오로-7-히드록시-4-메틸쿠마린)아세토히드라지드; 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복시산, 히드라지드(DCCH), 페닐히드라진; 1-나프탈렌아세트히드라지드; 2-히드라지노벤조산; 페닐아세틱 히드라지드.
(아미노옥시기를 포함하는 물질) O-벤질히드록실아민; O-페닐히드록실아민; O-(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤질)히드록실아민; O-(4-니트로벤질)히드록실아민; 2-아미노옥시피리딘; 2-아미노옥시메틸피리딘; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 메틸 에스테르; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 에틸 에스테르; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 n-부틸 에스테르.
또, 이들의 화합물에 포착된 당쇄를 고정밀도이고 또한 고감도로 검출한다고 하는 관점으로부터, 크로모포어 또는 플루오로포어를 포함하는 부위를 도입해도 되고, 또, 중수소를 도입해도 된다.
여기서, 당쇄 유리 단계에서의 반응은 물질 A와 당쇄 및/또는 당의 유도체의 복합체를 포함하는 시료에 물질 B를 도입하고, pH 3~8, 바람직하게는 pH 4~6으로 조정하여, 온도 4~90℃, 바람직하게는 60~90℃에서, 15분~16시간, 바람직하게는 15분~5시간, 보다 바람직하게는 30분~3시간 가열함으로써 실시된다. 용매는 물 및 아세토니트릴, 메탄올 등으로 대표되는 휘발성 유기용매 중 어느 하나 또는 그들의 혼합 용매인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 물/아세토니트릴의 혼합 용매이며, 가장 바람직하게는 pH 조정제로서의 2% 아세트산을 포함하는 물/아세토니트릴(1:9)의 혼합 용매이다.
또, 고상 담체로서 이용하는 경우에는 물질 B는 전술한 물질 A에서 예로 들었던 물질 및 아미노옥시기를 포함하여, 예를 들면 하기 (식 12)로 나타내는 물질을 매우 적합하게 이용할 수 있다.
(식 12)
Figure 112009010718235-pct00045
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
식 12에 있어서, 담체는 (식 3)에서 설명된 담체와 같이, 무기 물질 또는 유기 고분자 물질로 이루어진 폴리머 매트릭스이며, 입자, 고상 기판, 또는 고상 기판의 표면에 직접 결합하는 물질의 형태로서 이용된다. 또, R의 구체적인 예로는 (식 3)에서의 설명에서 예로 들었던 것과 같은 것을 들 수 있다.
여기서, 당쇄 유리 단계에서의 교환 반응은 용기 등에 도입한 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포착시킨 입자상의 물질 A에 대해서 저분자 화합물의 물질 B의 용액을 첨가하여 실시해도 된다. 또, 상술과 같은 입자상의 물질 B를 용기 등에 도입하고, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포착시킨 저분자 화합물인 물질 A의 용액을 첨가하여 교환 반응을 실시해도 된다. 혹은 컬럼 등에 충전시킨 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포착시킨 입자상의 물질 A에 대해서 저분자 화합물인 물질 B의 용액을 통과시켜 실시해도 된다. 또, 상술과 같은 입자상의 물질 B를 컬럼 등에 충전하고, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포착시킨 저분자 화합물인 물질 A의 용액을 통과시켜 교환 반응을 실시해도 된다. 또, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포착시킨 저분자 화합물인 물질 A의 용액에 저분자 화합물인 물질 B를 도입하여 교환 반응을 실시해도 된다.
이 교환 반응에 의해 얻을 수 있는 물질 B와 당쇄 및/또는 당의 유도체의 복합체에 있어서, 물질 B 및 당쇄 및/또는 당의 유도체는 물질 B로서 히드라지드기를 가지는 물질을 이용했을 때는 히드라존 결합으로, 또한 물질 B로서 아미노옥시기를 가지는 물질을 이용했을 때는 옥심 결합으로 결합되게 된다.
(식 12)로 표시되는 물질 B로는 하기 (식 8)로 표시되는 구조를 가지는 폴리머 입자를 매우 적합하게 이용할 수 있다.
(식 8)
Figure 112009010718235-pct00046
(Rl, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다). 또, R1으로부터 R5의 구체적인 예로는 (식 4)에서의 설명에서 예로 들었던 것과 같은 것을 들 수 있다.
또한, 이와 같은 (식 8)로 표시한 폴리머 입자에 있어서, 하기 (식 9)로 표시되는 구조를 가지는 폴리머 입자를 매우 적합하게 사용할 수 있다.
(식 9)
Figure 112009010718235-pct00047
(m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
또, (식 12), (식 8), (식 9)로 표시되는 물질 B는 pH 3~8에서 안정하며, 적어도 1 MPa 이하의 압력하에서 안정한 것이 당쇄 포착 담체 용도 및 고상 기판 용도의 관점으로부터 바람직하다.
또, 상기 당쇄 유리 단계 후에 히드라존-옥심 교환 또는 히드라존-히드라존 교환 반응을 적어도 1회 이상 실시해도 된다. 이것에 의해 일단 유리시킨 당쇄 및/또는 당의 유도체에 대해서 예정된 분석방법에 적용할 수 있도록, 임의의 표지 화합물로 이루어진 물질 B를 추가로 작용시켜 표지화 샘플을 얻는 것이 가능하게 된다.
여기서는 당쇄 포착물질에 포착된 당쇄를 유리하여 표지화 샘플을 얻는 방법을 설명했지만, 하기 방법에 의하면 비표지 샘플을 얻을 수 있으며, 본 발명은 이와 같은 시료 조제방법도 제공한다.
이와 같은 시료 조제방법은 당쇄 및 또는 당의 유도체를 결합시킨, 상기 (식 3), 상기 (식 4) 또는 상기 (식 5)로 표시되는 구조를 가지는 물질 A를 산성 조건에서 처리함으로써 히드라존 결합을 해리시켜, 당쇄 및 또는 당의 유도체를 유리시키는 것을 특징으로 하고 있다.
이 때 산성 조건에서의 처리는 0.01~10 부피%의 트리플루오로아세트산 용액에 의한 처리이며, 바람직하게는 0.01~1 부피%의 트리플루오로아세트산 용액으로 25~80℃에서 5~60분간 실시된다.
이와 같이 하여 얻을 수 있는 당쇄 샘플로 이루어진 분석 시료는 표지화되어 있지 않은 것이며, 표지하지 않아도 되는 용도에 유용하다.
이와 같이 하여 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포함하는 생체 시료로부터 분석 시료용 당쇄 및/또는 당의 유도체를 간단한 조작으로 분리 정제하는 것이 가능하게 된다. 추가적인 관점으로부터, 본 발명은 이 분석 시료 방법에 의해 얻을 수 있는 분석 시료를 제공한다.
또한, 다른 관점으로부터, 본 발명은 물질 A를 이용하여 당쇄를 포착하는 단계를 포함하는 시료 조제방법의 용도를 제공한다. 즉, 본 발명은 혼합물 자체 또는 혼합물로부터의 특정의 획분을 단리정제하여 얻어진 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화한 고상 담체를 이 당쇄 및/또는 당의 유도체에 대해서 결합성 또는 친화성을 가지는 물질을 포집하기 위한 담지체로서 이용하는 사용방법을 제공한다.
이 사용방법에 있어서, 우선 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포함하는 시료는 혼합물 자체 또는 이 혼합물로부터의 특정의 획분을 단리정제하여 이용해도 된다. 또, 물질 A로서 고상 담체를 이용하여 이 고상 담체에 대해서 시료 용액을 통과시키고, 이 시료 중의 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고상 담체의 히드라지드기 혹은 아미노옥시기에 결합시켜 고정화한다.
이어서, 이 고상 담체에 대해서 진단 또는 검사를 실시하기 위한 검체로부터 채취한 시료(이하, 「검체 시료」라고 한다)를 작용시키고, 이 검체 시료에 포함되는 당쇄 및/또는 당의 유도체에 대해서 결합성 또는 친화성을 가지는 물질, 예를 들면 렉틴 등의 당 결합성 단백질을 포집시킨다. 이와 같이 하여, 검체 시료 중의 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화시킨 고상 담체를 검체 시료 중의 렉틴 등을 포집하는 담지체로서 사용할 수 있다.
또, 포집된 물질을 검출, 정량화함으로써 당쇄와 검체 세포의 분화 증식, 세포 접착, 면역 및 세포의 암화의 관계에 대해서 보다 고도의 해석을 실시할 수 있다.
또한, 다른 관점으로부터, 본 발명은 상기의 당쇄 포착 단계 및 당쇄 유리 단계로 이루어진 시료 조제방법의 용도를 제공한다.
하나의 관점으로부터, 본 발명은 당쇄 마이크로어레이의 제조방법을 제공한다. 즉, 이 당쇄 마이크로어레이의 제조방법은 하기 (식 3) 또는 (식 12)로 표시되는 구조를 가지는 물질 B로 이루어진 고상 담체로 구성되는 고상 기판의 표면에 하기 (공정 1)~(공정 4)에 의해서 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화하는 것이다.
(식 3)
Figure 112009010718235-pct00048
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(식 12)
Figure 112009010718235-pct00049
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
또한 이들 물질의 구체적인 예는 전술한대로이다.
(공정 1) 당쇄 및/또는 당의 유도체와 가용성의 히드라지드기 함유 화합물을 결합시켜, 소정의 분리 수단에 의해서 당쇄 및/또는 당의 유도체를 정제 및/또는 단리하는 공정.
(공정 2) 공정 1에서 얻어진 화합물의 용액을 상기 고상 기판상에 정렬적으로 점착하는 공정.
(공정 3) 점착 후의 고상 기판을 소정의 조건에서 인큐베이트함으로써 당쇄-물질 A의 결합을 고상 기판-당쇄의 결합으로 교환하는 반응을 진행시켜, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고상 기판에 고정화하는 공정.
(공정 4) 고상 기판상의 미반응물을 세정 제거하는 공정.
(공정 1)에 있어서는 전술한 당쇄 및/또는 당의 유도체와 물질 A를 반응시키고, 물질 A에 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포착시켜, 소정의 분리 수단, 예를 들면 크로마토그래피 등의 기술을 이용하여 당쇄 및/또는 당의 유도체를 정제 및/또는 단리한다. (공정 2)에 있어서는 (공정 1)에서 얻어진 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고상 기판에 정렬적으로 점착한다. (공정 3)에 있어서는 예를 들면 pH 5, 온도가 60~90℃, 반응 시간이 1~16시간인 조건에 의해 인큐베이트하고 전술한 (반응식 1)로 표시한 교환 반응을 실시하여, 결과적으로 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고상 기판에 고정화한다. (공정 4)에 있어서는 (공정 3)에서 미반응이었던 물질을 버퍼 등을 이용하여 통상의 방법에 의해 세정 제거한다.
추가적인 관점으로부터, 본 발명은 이와 같은 방법에 의해 얻어진 당쇄 마이크로어레이를 제공한다. 이 당쇄 마이크로어레이는 예를 들면 검체 시료 중에 포함되는 당쇄 및/또는 당의 유도체와 상호작용하는 물질의 포집을 실시하기 위한 담지체로서 사용할 수 있다. 이것에 의해 포집된 물질의 동정, 정량화 등을 실시하는 것이 가능하게 된다.
추가적인 관점으로부터, 본 발명은 상기 당쇄 마이크로어레이의 용도를 제공한다.
예를 들면, 이 당쇄 마이크로어레이의 표면에 검체를 포함하는 용액을 접촉시키고, 소정의 조건에서 인큐베이트 및 세정 조작을 실시한 후에 고상 기판상의 점착 부위의 당쇄 및/또는 당의 유도체에 포집된 당 결합성 물질을 검출함으로써 고정화된 당쇄 및/또는 당의 유도체와 특이적으로 결합 또는 흡착하는 당 결합성 물질을 탐색하는 시스템이 제공된다.
이 탐색 시스템에 있어서, 전술한 것과 같은 방법으로, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화시킨 고상 기판에 검체(시료)를 포함하는 용액을 도입관 등으로부터 도입하고, 검체 시료를 당쇄 및/또는 당의 유도체와 접촉시킨다.
또한, 검체 시료와 당쇄 및/또는 당의 유도체가 접촉한 상태로 인큐베이트를 실시한다. 이 때의 인큐베이트의 조건은 예를 들면 pH 4~10, 온도가 37℃, 반응 시간이 1~16시간이다.
인큐베이트 처리를 한 결과, 당쇄 및/또는 당의 유도체에 포집된 당 결합성 물질, 예를 들면 렉틴 등의 단백질을 검출한다. 이 때의 검출 방법 및 수단으로는 당 결합성 물질이 직접 형광 염색 가능하면, 염색 후에 형광 스캐너를 이용하여 형광을 측정함으로써 검출한다; 당 결합성 물질이 이미 알려져 있으며, 또한, 특정의 항체와 결합하는 경우에는 그 항체를 결합시킴으로써 검출하는 것 등을 들 수 있다. 또, 당 결합성 물질이 단백질인 경우에는 이들로 한정되는 일은 없으며, 그 외의 일반적인 단백 검출 방법이 적용 가능하다.
이와 같이 본 시스템에 의하면, 포집된 당 결합성 물질을 검출함으로써 고정화된 당쇄 및/또는 당의 유도체와 특이적으로 결합 또는 흡착하는 당 결합성 물질을 탐색하는 것이 가능하게 된다. 이것에 의해 당쇄와 검체 세포의 분화 증식, 세포 접착, 면역 및 세포의 암화의 관계에 대해서 보다 고도의 해석을 실시할 수 있다.
또, 예를 들면 전술한 당쇄 마이크로어레이의 용도로서 당쇄 마이크로어레이의 표면에 검체를 포함하는 용액을 접촉시켜, 고상 기판상의 점착 부위의 당쇄 및/또는 당의 유도체에 상기 검체 중의 당 결합성 단백질을 포집시키고, 포집한 양을 소정의 정량화 수단, 예를 들면 형광ㆍ발색 등의 수단으로 정량화하는, 결합성 단백질의 인식 특이성을 평가하는 시스템이 제공된다.
전술한 것처럼 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화시킨 고상 기판으로 이루어진 당쇄 마이크로어레이에 검체 시료 중의 당 결합성 단백질을 포집시키고, 이 포집량을 정량화한다.
본 시스템에 의하면, 이 결과에 근거하여 결합성 단백질의 인식 특이성을 평가할 수 있다.
또한, 또다른 관점에서, 본 발명은 상기의 당쇄 포착 단계 및 당쇄 유리 단계로 이루어진 시료 조제방법의 용도로서 당쇄 어피니티 비드의 제조방법을 제공한다.
즉, 이 당쇄 어피니티 비드의 제조방법은 하기 (식 3) 또는 (식 12)로 표시되는 구조를 가지는 물질 B로 이루어진 고상 담체로 구성되는 폴리머의 표면에 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화하는 것이다.
(식 3)
Figure 112009010718235-pct00050
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
(식 12)
Figure 112009010718235-pct00051
(담체는 폴리머 매트릭스, R은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄를 나타낸다)
또한 이들 물질의 구체적인 예는 전술한대로이다.
또한, 이 당쇄 어피니티 비드의 제조방법에 있어서, 상기 폴리머 입자의 표면에 하기 (공정 1)~(공정 3)에 의해서 당쇄 및/또는 당의 유도체를 고정화하는 순서로 해도 된다.
(공정 1) 당쇄 및/또는 당의 유도체와 가용성의 히드라지드기 함유 화합물을 결합시켜, 소정의 분리 수단에 의해서 당쇄 및/또는 당의 유도체를 정제 및/또는 단리하는 공정.
(공정 2) 공정 1에서 얻어진 화합물을 폴리머 입자와 접촉시켜, 소정의 조건에서 인큐베이트함으로써 당쇄-히드라지드기 함유 화합물의 결합을 당쇄-폴리머 입자의 결합으로 교환시켜, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 폴리머 입자에 고정화하는 공정.
(공정 3) 폴리머 입자상의 미반응물을 세정 제거하는 공정.
(공정 1)에 있어서는 전술한 당쇄 및/또는 당의 유도체와 물질 A를 반응시키고, 물질 A에 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포착시켜, 소정의 분리 수단, 예를 들면 크로마토그래피 등의 기술을 이용하여 당쇄 및/또는 당의 유도체를 정제 및/또는 단리한다. 또한 이 때의 당쇄 포착 반응 조건의 구체적인 예로는 pH 4~7, 반응 온도가 25~90℃, 반응 시간이 1~16시간, 구체적으로는 pH 5, 반응 시간이 80℃, 반응 시간이 1시간인 조건을 들 수 있다.
(공정 2)에 있어서는 (공정 1)에서 얻어진 당쇄 및/또는 당의 유도체를 폴리머 입자와 접촉시키고, 소정의 조건, 예를 들면 pH 4~7, 온도가 25~90℃, 반응 시간이 1~16시간, 구체적으로는 pH 5, 온도가 80℃, 반응 시간 1시간으로 인큐베이트하고, 전술한 (반응식 1)로 표시한 교환 반응을 실시하여, 결과적으로 당쇄 및/또는 당의 유도체를 폴리머 입자에 고정화한다. (공정 3)에 있어서는 (공정 2)에서 미반응이었던 물질을 버퍼 등을 이용하여 통상의 방법에 의해 세정 제거한다.
또한 당쇄 어피니티 비드를 당쇄 및/또는 당의 유도체를 미리 히드라지드기를 가지는 물질 A로 포착하여 두고, 물질 B로 교환 반응을 실시함으로써 제조하는 순서를 예로 들었지만, 이것으로 한정되는 것은 아니고, 당쇄 및/또는 당의 유도체를 포함하는 시료를 직접 물질 B로 이루어진 고상 담체로 제작한 폴리머 입자에 접촉시킴으로써 당쇄 어피니티 비드를 제조해도 된다.
추가적인 관점으로부터, 본 발명은 이와 같은 방법에 의해 얻을 수 있는 당쇄 어피니티 비드를 제공한다. 또, 본 발명은 이 당쇄 어피니티 비드의 용도로서 당 결합성 물질을 단리하는 시스템을 제공한다.
즉, 이 당 결합성 물질을 단리하는 시스템에서는 전술의 당쇄 어피니티 비드에 검체(시료)를 포함하는 용액을 접촉시키고, 소정의 조건에서 인큐베이트 및 세정 조작을 실시한 후에 포착된 당 결합성 물질이 단리된다.
이 시스템에 있어서, 우선 당쇄 어피니티 비드에 검체 시료를 포함하는 용액을 접촉시켜, 소정의 조건, 예를 들면 pH 4~10, 온도가 37℃, 반응 시간이 1~16 h, Ca2+ 및 Mg2+를 포함하는 완충액 중에서 인큐베이트함으로써 당쇄 어피니티 비드의 표면에 고정화된 당쇄 및/또는 당의 유도체에 당 결합성 물질이 포집된다. 또한, 버퍼 등을 이용하여 통상의 세정 처리에 의해 당 결합성 물질이 포집된 당쇄 어피니티 비드의 표면을 세정한다.
나아가 포집된 당 결합성 물질을 당쇄 어피니티 비드로부터 단리한다. 이 때 당쇄 어피니티 비드로부터 당 결합성 물질을 유리시키는 방법으로는 메탄올 등의 유기용매를 첨가하여 당과 당 결합성 물질을 분리하는 방법; 고농도(0.1~1M)의 합텐 당(hapten sugar) 용액을 첨가하여 당 결합성 물질을 분리하는, 즉 첨가한 고농도의 당 쪽으로 렉틴을 옮기는 방법 등을 들 수 있다.
이상과 같이 본 발명의 시료 조제방법은 여러가지 용도에 적용할 수 있다.
상술한 목적 및 그 외의 목적, 특징 및 이점은 이하에 기술한 바람직한 실시의 형태 및 그에 부수하는 이하의 도면에 의해서 더욱 명백해진다.
[도 1] 도 1은 당쇄와 2-히드라지노피리딘의 반응물의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다. 횡축에 분자량(m/z), 종축에 강도를 나타낸다. 또, 2668.421(=m/z)에서의 피크(a), 2978.005(=m/z)에서의 피크(b) 및 3263.785(=m/z)에서의 피크(c)에 있어서 예측되는 당쇄의 구조를 ●: 갈락토오스, ■: N-아세틸글루코사민, ○: 만노오스, ◆: 시알산으로 모식적으로 나타내었다;
[도 2] 도 2는 당쇄와 물질 A의 실시예의 반응물의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다. 횡축에 분자량(m/z), 종축에 강도를 나타낸다. 각 메인 피크에 있어서 예측되는 당쇄의 구조를 ●: 갈락토오스, ■: N-아세틸글루코사민, ○: 만노오스, ◆: 시알산, 삼각: 푸코오스로 모식적으로 나타내었다;
[도 3] 도 3은 본 실시예의 당쇄 유리 단계에서 교환 반응의 pH와 교환 효율의 관계를 나타내는 그래프이다. 횡축에 pH, 종축에 교환 효율을 나타낸다. 옥심으로부터 옥심으로의 교환을 ○으로 나타내고, 옥심으로부터 히드라존으로의 교환을 ●으로 나타내고, 히드라존으로부터 옥심으로의 교환을 □로 나타내고, 히드라존으로부터 히드라존으로의 교환을 ■로 나타내었다;
[도 4] 도 4는 도 3의 교환 반응에서 얻어진 반응물의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다. 횡축에 분자량(m/z), 종축에 강도를 나타낸다. 차트의 상단으로부터, 비드의 관능기가 히드라지드이고, 유리 시약이 아미노옥시 화합물(aoWR)인 경우, 비드의 관능기가 히드라지드이고, 유리 시약이 히드라지드 화합물(AcWRh)인 경우, 비드의 관능기가 아미노옥시이고, 유리 시약이 아미노옥시 화합물(aoWR)인 경우, 비드의 관능기가 아미노옥시이고, 유리 시약이 히드라지드 화합물(AcWRh)인 경우를 각각 나타내었다;
[도 5] 도 5는 실험예 7(B)의 (1)의 방법으로 회수한 당쇄의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다. 횡축에 분자량(m/z), 종축에 강도를 나타낸다. 차트의 상단이 대조군(혈청 당쇄 + 400μM의 내부 표준)이며, 중단이 플로우 스루(flow through) 샘플((비드와 미반응의 당쇄) + 400μM의 내부 표준)이며, 하단이 샘플(히드라지드기 함유 비드에 포착 후 옥심 교환으로 회수한 혈청 당쇄 + 400μM의 내부 표준)이며, 대조군의 정량 대상 당쇄의 강도를 100%로 했을 때에 플로우 스루 샘플이 12%(88%가 비드와 결합), 샘플이 56%이었다;
[도 6] 도 6은 실험예 7(B)의 (2)의 방법으로 회수한 당쇄의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다. 횡축에 분자량(m/z), 종축에 강도를 나타낸다. 차트의 상단으로부터, Affi-Gel Hz를 50㎕(건조 중량 16.5mg), 100㎕(건조 중량 33mg), 150㎕(건조 중량 49.5mg) 및 히드라지드기 함유 비드를 2.5mg 사용했을 때의 결과를 나타낸다;
[도 7] 도 7은 실시예 8(1)의 방법으로 회수한 당쇄의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다. 횡축에 분자량(m/z), 종축에 강도를 나타낸다. 차트의 상단으로부터, 반응 전, 비드와의 반응 후, 비드 미사용(음성 대조군)에서의 결과를 나타낸다;
[도 8] 도 8은 실시예 9(2)의 렉틴 포착성의 검증의 결과를 나타내는 그래프이다. 종축에는 450nm에서의 흡광도를 나타낸다. 렉틴 농도가 1㎍/㎖이고, 2.5μmol/g 단당 고정화(포화량)이다;
[도 9] 도 9는 실시예 10(2)의 렉틴 포착성의 검증 결과를 나타내는 그래프 이다. 횡축에 분자량(m/z), 종축에 강도를 나타낸다.
이하의 실험예에서, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실험예로 한정되는 일은 없다.
(실험예 1)
(A) 히드라지드기 함유 화합물의 조제
(저분자 히드라지드 화합물)
1. 하기 히드라지드 화합물은 시판품을 이용했다.
5-디메틸아미노나프탈렌-1-설포닐 히드라진(단실히드라진); 2-히드라지노피리딘; 9-플루오레닐메틸 카바제이트(Fmoc 히드라진); 벤질히드라진; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, 히드라지드(BODlPY (tm) FL hydrazide); 2-(6,8-디플루오로-7-히드록시-4-메틸쿠마린)아세토히드라지드(Marina Blue (tm) hydrazide); 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복시산, 히드라지드(DCCH), 페닐히드라진; 1-나프탈렌아세트히드라지드; 2-히드라지노벤조산
2. AcWRh(물질 A)의 합성
전술한 도식 1에 나타내는 경로로 AcWRh를 합성했다(또한 Ac는 아세틸기, W는 트립토판 잔기, R은 아르기닌 잔기, h는 히드라지드기를 나타낸다).
(1) WR-OMe(화합물(b))의 합성
Z-WR-OMe(a)(10mg, 20mmol) 및 10% Pd/C(10mg)에 메탄올(5㎖)을 첨가하고 수 소 가스 분위기하, 실온에서 2시간 교반했다. 반응 용액을 수계 멤브레인 필터로 여과함으로써 Pd/C를 제거하고, 여액을 감압 농축함으로써 목적물인 화합물(b)(WR-OMe)를 얻었다. MALDI-TOF-MS에 의한 해석에 의해 목적물인 [M+H]+ 이온을 m/z: 376에서 관측했다.
(2) AcWROMe(c)의 합성
WR-OMe(b)(53mg, 0.14mmol)를 DMF 1㎖에 용해하고, WSC(40mg, 0.20mmol), DMAP(5mg, 0.041mmol) 및 아세트산(200㎕)을 첨가하고 실온에서 3시간 교반하였다. 또한 WSC(50mg, 0.26mmol)를 추가하고 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=1:1)에 의해 정제함으로써 목적으로 하는 AcWROMe를 얻었다. 1H NMR(500MHz, CD30D)δ7.70-7.00(m, 5H, 인돌), 3.62(s, 3H, OMe), 1.93(s, 3H, Ac)
(3) AcWRh(d)의 합성
AcWROMe 10mg를 10% 히드라진/메탄올(5㎖)에 용해하고, 실온에서 12시간 반응 후 농축하는 것에 의해 AcWRh(d)를 조제했다. MALDI-TOF MS에 의한 해석에 의해 목적물인 [M+H]+ 이온을 m/z: 416.89에서 관측했다.
한편, 상기 순서에 따라서, 아세틸기가 중수소 치환된 d-AcWRh(e)를 조제했다. d-AcWROMe: 1H NMR(500MHz, CD30D)δ7.59-6.99(m, 5H, 인돌), 3.62(s, 3H, OMe), 1.93(s, 3H, Ac), d-AcWRh: MALDI-TOF-MS [M+H]+ m/z: 419.94
(히드라지드기 함유 폴리머 비드의 합성)
1. 메틸 에스테르 함유 모노머의 합성
이하의 도식 4에 나타내는 경로로 메틸 에스테르 함유 모노머를 합성했다
(도식 4)
Figure 112009010718235-pct00052
(1) 화합물(h)의 합성
무수 메타크릴산(MAH: 5g, 0.03mol)(f)를 100㎖의 클로로포름에 용해시킨 용액을, 25g의(에틸렌디옥시)비스(에틸아민)(EDBEA: 25g, 0.17mol)(g)을 100㎖의 클로로포름에 용해시킨 용액에 빙욕(氷浴)상에서 적하 투입했다. 거기에 질소를 봉입하고 하룻밤 동안 교반시켰다. 얻어진 반응 용액으로부터 용매를 증발시켜 얻은 잔류물을 실리카겔 컬럼(전개용매: 클로로포름 90 부피%/메탄올 10 부피%의 혼합 용매)에 가하여 소정의 분획을 분취하고, 이 분획으로부터 용매를 증발시켜 화합물(h)을 얻었다.
(2) 화합물(j)의 합성
5g의 화합물(h)(0.023mol)를 100㎖의 클로로포름에 용해시킨 용액에 1.5 당량의 숙신산 모노메틸(i) 및 1.5 당량의 수용성 카르보디이미드 화합물(WSC)인 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노 프로필)카르보디이미드를 첨가하여 마개로 단단히 막았다. 거기에 질소를 봉입하고 하룻밤 동안 교반시켰다. 얻어진 반응 용액으로부터 용매를 증발시켜 얻은 잔류물을 실리카겔 컬럼(전개 용매: 클로로포름 90 부피%/메탄올 10 부피%의 혼합 용매)에 가하여 소정의 분획을 분취하고, 이 분획으로부터 용매를 증발시켜 화합물(j)을 얻었다.
또, 얻어진 물질은 NMR, 매트릭스 지원 레이저 이온화-비행 시간형 질량분석기(MALDI-TOF-MS)에 의해 화합물(j)인 것을 확인했다.
2. 메틸 에스테르 함유 폴리머의 합성
이하의 도식 5에 나타내는 경로로 메틸 에스테르 함유 폴리머 입자를 합성했다.
(도식 5)
Figure 112009010718235-pct00053
3구 플라스크에 25㎖의 5% 폴리비닐알코올(PVA) 수용액을 장입(裝入)하고, 거기에 질소를 퍼지(purge) 했다. 1g의 화합물(j)(2.6mmol), 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(k)(EGDMA: (j)에 대해서 5mol%) 및 1㎖의 클로로포름으로 이루어진 혼합물을 상기 3구 플라스크에 도입하고, 60℃로 유지하면서 교반하고, 혼합물에 포함되는 모노머로서의 화합물(j) 및 EGDMA를 PVA 수용액 중에 분산시켰다. 이어서, 모노머에 대해서 3중량%인 중합 개시제로서의 아조비스이소부티로니트릴(AIBN)을 첨가하여 중합을 개시시켰다. 60℃에서 16시간 반응시킨 후 생성한 폴리머 입자를 원심분리에 의해 회수하여 메탄올과 물로 세정했다.
3. 히드라지드기의 도입
폴리머 입자 400mg을 용기에 취해, 히드라진 1 수화물 4㎖를 첨가하여 교반하고 실온에서 2시간 정치했다. 반응 후 히드라진 1 수화물을 제거하고, 메탄올로 세정한 후 1M 염산으로 린스했다. 그 후 추가로 순수로 세정했다.
4. 관능기량의 정량
폴리머 입자 1mg를 용기에 취해, N-아세틸-D-락토사민(LacNAc) 1μmol를 첨가하고 2% 아세트산을 포함하는 아세토니트릴 180㎕를 추가로 첨가했다. 이것을 80℃에서 45분간 가열함으로써 LacNAc와 비드상의 히드라지드기를 반응시켰다. 순수로 비드를 린스하여 미반응의 당쇄를 회수하고, 그것을 MALDI-TOF-MS 측정에 의해 정량(내부 표준법)하여 비드에 대한 LacNAc 결합량을 구했다. 비드 1mg 당 0.86μmol(860nmol)의 LacNAc가 결합하는 것을 알 수 있었다.
(시판 히드라지드기 함유 비드)
Bio-Rad사제 「아피겔-Hz」를 그대로 이용했다.
1. 관능기량 정량
아피겔-Hz의 분산액 50㎕(비드의 건조 중량으로서 16.5mg)를 용기에 취하고, LacNAc 1μmol를 첨가하고, 또한 2% 아세트산을 포함하는 아세토니트릴 180㎕를 첨가했다. 이것을 80℃에서 45분간 가열함으로써 LacNAc와 비드상의 히드라지드기를 반응시켰다. 순수로 비드를 린스하여 미반응의 당쇄를 회수하고, 그것을 MALDI- TOF-MS 측정에 의해 정량(내부 표준법)하여, 비드에 대한 LacNAc 결합량을 구했다. 비드 1mg(건조 중량) 당 약 8nmol의 LacNAc가 결합하는 것을 알 수 있었다.
(B) 아미노옥시기 함유 화합물의 합성
(아미노옥시기 함유 저분자 화합물 aoWR의 합성)
전술한 도식 3에 따라서 aoWR(화합물(n))을 합성했다(ao는 아미노옥시기를 나타낸다).
(1) Boc-NHOCH2CO-W-R-OMe(화합물(m))의 합성
Boc 아미노옥시아세트산(l)(2.5mmol)의 THF(6㎖) 용액을 -20℃로 냉각했다. 그 다음에 N-메틸모르폴린(3.0mmol)과 포름산 이소부틸(3.0mmol)을 첨가하여, 15분 교반시킴으로써 혼합 산무수물을 조제했다. 반응 용액을 0℃로 하고, 별도의 반응 용액에서 화합물(b)(WR-OMe(30mmol))를 물(3㎖)에 용해하고 탄산수소나트륨(30mmol)을 첨가함으로써 조제한 WR-OMe 용액을 혼합하여 1시간 교반시켰다. 반응 용액을 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 목적물인 화합물(m)(Boc-NHOCH2CO-W-R-OMe)를 얻었다. MALDI-TOF-MS에 의한 해석에 의하여, 목적물인 [M+H]+ 이온을 m/z: 547에서 관측했다.
(2) NH2OCH2CO-W-R-OMe(화합물(n))의 합성
화합물(m)에 트리플루오로아세트산(TFA)(2㎖)를 첨가하고 -20℃에서 2시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고 톨루엔을 첨가하고 공비(共沸)를 반복하여 TFA를 제거하여 목적물인 화합물(n)을 얻었다. MALDI-TOF-MS에 의한 해석에 의하여, 목적물인 [M+H]+ 이온을 m/z: 448에서 관측했다.
한편, 상기 순서에 따라서, 메틸기의 수소가 경수소인 것: aoWR(H) 및 중수소인 것: aoWR(D)를 조제했다.
(아미노옥시기 함유 폴리머 비드의 합성)
특허 문헌: 국제 공개 제2005/097844호 팜플렛 기재의 방법에 의해 아미노옥시기 함유 폴리머 입자를 제작했다.
(실험예 2) 당쇄시료의 조제
(1) 당단백질 당쇄의 조제
당단백질로서 페투인(fetuin) 또는 리보뉴클레아제 B를 시료로서 이용했다. 당단백질 10mg를 용기에 취하여, 50mM 중탄산암모늄 용액에 용해시켰다. 소량의 계면활성제를 첨가하여, 60℃에서 30분 인큐베이트한 후 N-글리코시다제 F(Roche사제) 10 유니트를 첨가하여, 37℃에서 16시간 인큐베이트함으로써 당쇄를 유리시켰다.
(2) 혈청 중에 포함되는 당단백질 당쇄의 조제
사람 혈청 5㎖를 용기에 취하여, 50mM 중탄산암모늄 용액에 용해시켰다. 소량의 계면활성제를 첨가하여, 60℃에서 30분 인큐베이트한 후 N-글리코시다제 F(Roche사제) 5 유니트를 첨가하여, 37℃에서 16시간 인큐베이트함으로써 당쇄를 유리시켰다.
(실험예 3) 저분자 히드라지드 화합물과 당쇄의 반응
(1) 시판 히드라지드 화합물과 당쇄의 반응
실험예 1(A)의 히드라지드 화합물을 10mM의 농도로 메탄올 또는 아세토니트릴에 용해하여 히드라지드 화합물 용액을 얻었다. 실험예 2(1)의 페투인 당쇄용액(500pmol 상당)에 히드라지드 화합물 용액 1㎕를 첨가하고 아세토니트릴 100㎕를 추가로 첨가하였다. 80℃에서 45분간 가열함으로써 당쇄와 히드라지드 화합물을 반응시켰다. 반응 후의 생성물을 MALDI-TOF-MS로 측정했다.
도 1에는 대표적으로 2-히드라지노피리딘을 이용했을 경우의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타내지만, 당쇄(도면 중, 구조를 모식도로 표시함)와 2-히드라지노피리딘이 결합한 분자량을 나타내는 위치에서 피크를 관측했다. 다른 화합물을 이용했을 경우에도 같은 결과를 얻었다.
(2) AcWRh와 당쇄의 반응
실험예 1(A)의 AcWRh를 10mM의 농도로 메탄올 또는 아세토니트릴에 용해하여 히드라지드 화합물 용액을 얻었다. 실험예 2(2)의 혈청 당쇄 용액(혈청 5㎕ 상당량)을 용기에 취하여, 히드라지드 화합물 용액 1㎕를 첨가하고 아세토니트릴 100㎕를 추가로 첨가했다. 80℃에서 45분간 가열함으로써 당쇄와 히드라지드 화합물(AcWRh)을 반응시켰다. 반응 후의 생성물을 MALDI-TOF-MS로 측정했다.
도 2에는 MALDI-TOF-MS 차트를 나타내지만, 당쇄(도면 중, 구조를 모식도로 표시함)와 AcWRh가 결합한 분자량을 나타내는 위치에서 피크를 관측했다.
(실험예 4) 히드라지드기 함유 폴리머 비드와 당쇄의 반응
실험예 1(A)의 히드라지드기 함유 폴리머 비드 2.5mg를 용기에 측정하여 취했다. 실험예 2(2)의 혈청 당쇄 용액(혈청 5㎕ 상당량)을 첨가하고, 추가로 2% 아세트산을 포함하는 아세토니트릴 180㎕를 첨가했다. 이것을 80℃에서 45분간 가열함으로써 당쇄와 비드상의 히드라지드기를 반응시켰다. 소량의 순수로 비드를 린스하여 미반응의 당쇄를 회수하고, 그것을 MALDI-TOF-MS 측정에 의해 정량했는데 80~90%의 당쇄가 비드에 결합한 것을 알 수 있었다. 그 후 비드를 0.5% 도데실황산나트륨(SDS) 수용액, 50% 메탄올, 4M 구아니딘 수용액 및 순수로 세정하고, 후술하는 당쇄 재유리 실험에 제공했다.
(실험예 5) 라벨화 당쇄의 조제
(1) AcWRh(d), AcWRh(e)와 당쇄의 결합
키토트리오스 수용액에 10 등량의 실험예 1(A)의 AcWRh(d) 또는 d-AcWRh(e)를 첨가하고 아세트산으로 pH 5로 조정했다. 90℃에서 1시간 가열함으로써 키토트리오스-AcWRh(d) 표지체 및 키토트리오스 d-AcWRh(e) 표지체를 얻었다.
(2) aoWR(H), aoWR(D)와 당쇄의 결합
키토트리오스 수용액에 10 등량의 실험예 1(B)의 aoWR(H) 또는 aoWR(D)를 첨가하고 아세트산으로 pH 5로 조정했다. 90℃에서 1시간 가열함으로써 키토트리오 스-aoWR 표지체를 얻었다.
(실험예 6) 액상에서의 관능기 교환 반응
이하의 교환 반응에서는 히드라지드기 함유 화합물로 라벨화한 당쇄를 아미노옥시기 함유 화합물(또는 히드라지드기 함유 화합물)과 반응킴으로써 히드라존-옥심 교환(또는 히드라존-히드라존 교환)에 의해 라벨 바꿔 붙이기를 실시했다. 비교로서 아미노옥시기 함유 화합물로 라벨화한 당쇄에 대해서도 라벨 바꿔 붙이기를 시도했다. 반응의 진행은 MALDI-TOF-MS에 의해 확인했다.
(A) 관능기 교환 반응
(1) 히드라존-히드라존 교환 반응
실험예 5(1)의 키토트리오스-AcWRh(d) 표지체의 용액에 10 등량의 실험예 1(A)의 d-AcWRh(e)를 첨가하고 아세트산으로 pH 5로 조정했다. 90℃에서 1시간 가열 반응 후 반응액의 일부를 꺼내, 내부 표준으로서 농도를 이미 알고 있는 실험예 5(2)의 키토트리오스-aoWR(H) 표지체와 혼합했다. 이것을 MALDI-TOF-MS로 분석하여 반응액 중에 포함되는 키토트리오스-AcWRh(d) 표지체와 이 반응으로 얻어진 키토트리오스 d-AcWRh(e) 표지체의 비율을 산출했다.
(2) 히드라존-옥심 교환 반응
실험예 5(1)의 키토트리오스-AcWRh(d) 표지체의 용액에 10 등량의 실험예 1(B)의 aoWR(H)를 첨가하고 아세트산으로 pH 5로 조정했다. 90℃에서 1시간 가열 반응 후 반응액의 일부를 꺼내, 내부 표준으로서 농도를 이미 알고 있는 실험예 5(2)의 키토트리오스-aoWR(D) 표지체와 혼합했다. 이것을 MALDI-TOF-MS로 분석하여 반응액 중에 포함되는 키토트리오스-AcWRh(d) 표지체와 이 반응으로 얻어진 키토트리오스-aoWR(H) 표지체의 비율을 산출했다.
(3) 옥심-히드라존 교환 반응
실험예 5(2)의 키토트리오스-aoWR(H) 표지체의 용액에 10 등량의 실험예 1(A)의 AcWRh(d)를 첨가하고 아세트산으로 pH 5로 조정했다. 90℃에서 1시간 가열 반응 후 반응액의 일부를 꺼내, 내부 표준으로서 농도를 이미 알고 있는 실험예 5(1)의 키토트리오스 d-AcWRh(e) 표지체와 혼합했다. 이것을 MALDI-TOF-MS로 분석하여, 반응액 중에 포함되는 키토트리오스-aoWR(H)와 이 반응으로 얻어진 키토트리오스-AcWRh(d)의 비율을 산출했다.
(4) 옥심-옥심 교환 반응
실험예 5(2)의 키토트리오스-aoWR(H) 표지체의 용액에 10 등량의 실험예 1(B)의 aoWR(D)를 첨가하고 아세트산으로 pH 5로 조정했다. 90℃에서 1시간 가열 반응 후 반응액의 일부를 꺼내, 내부 표준으로서 농도를 이미 알고 있는 실험예 5(1)의 키토트리오스-AcWRh(d) 표지체와 혼합했다. 이것을 MALDI-TOF-MS로 분석하여 반응액 중에 포함되는 키토트리오스-aoWR(H)와 이 반응으로 얻어진 키토트리오스-aoWR(D)의 비율을 산출했다.
(B) 관능기 교환 반응의 고찰
도 3은 상기 4 패턴의 교환 반응의 수율을 나타낸 그래프이다.
히드라존-히드라존 교환 반응 및 히드라존-옥심 교환의 효율은 옥심-히드라존 교환 및 옥심-옥심 교환과 비교해서 높은 것을 알 수 있었다. 즉, 히드라존 결합은 옥심 결합보다 교환 반응을 하기 쉽다고 말할 수 있다. 또한 히드라존-히드라존 교환보다 히드라존-옥심 교환이 효율적으로 진행한 것도 알 수 있었다.
(실험예 7) 고상으로부터 액상으로의 교환 반응
(A) 교환 반응 효율의 비교
실험예 6에서 액상에서의 교환 반응의 결과로부터 히드라존-옥심 교환이 가장 효율적으로 진행하는 것을 알 수 있었다. 따라서, 이하에 나타낸 것처럼 고상으로부터 액상으로의 교환 반응에 대해서도 마찬가지로 반응 효율을 비교했다.
실험예 4에서 혈청 당쇄를 포착시킨 히드라지드기 함유 비드 및 실험예 4와 같은 방법으로 혈청 당쇄를 포착시킨 아미노옥시기 함유 비드를 이용하여 비교했다. 각 당쇄 포착 비드에 20㎕의 aoWR(H) 용액(20mM), 또는 AcWRh(H) 용액(20mM)을 첨가하고 180㎕의 2% 아세트산/아세토니트릴 용액을 추가로 첨가하여 80℃에서 45분간 가열했다. 반응 후 상청액을 회수하여 MALDI-TOF-MS 측정을 실시했다.
도 4는 MALDI-TOF-MS 차트이다.
차트의 S/N 비로부터, 히드라지드기 함유 비드로 포착하여 아미노옥시 화합물로 유리했을 경우가 가장 효율이 좋은 것을 분명히 알 수 있었다. 이 결과는 실험예 6에서 액상에서의 반응 효율 비교 결과와 일치한다.
(B) 교환 반응에 의한 비드로부터의 당쇄 재유리
(1) 히드라지드기 함유 폴리머 비드로부터의 당쇄 재유리
실험예 4에 있어서 당쇄를 결합시킨 히드라지드기 함유 폴리머 비드에 20㎕의 aoWR(H) 용액(20mM) 및 180㎕의 2% 아세트산/아세토니트릴 용액을 첨가하고 80℃에서 45분간 가열했다. 반응 후 상청액을 회수하고, 내부 표준 물질(키토테트라오스)을 첨가하여 MALDI-TOF-MS 측정을 실시함으로써 당쇄 회수량을 산출했다.
(2) 시판 비드(아피겔-Hz)로부터의 당쇄 재유리
실험예 4와 같은 방법으로 혈청 당쇄를 포착시킨 아피겔-Hz에 대하여, 실험예 7(B)의 (1)과 같은 방법으로 당쇄를 재유리시켜 회수량을 산출했다.
도 5에는 실험예 7(B)의 (1)의 방법으로 회수한 당쇄의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다.
내부 표준 물질의 시그널량으로부터 환산한 결과, 사용한 당쇄중 56%의 양을 회수할 수 있었음을 알 수 있었다.
도 6에는 실험예 7(B)의 (2)의 방법으로 회수한 당쇄의 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다. 동시에 실험예 7(B)의 (1)에서 회수한 당쇄의 차트도 병기한다.
매스 스펙트럼의 S/N 비로부터, 시판 비드 사용의 경우의 당쇄 회수량이 적은 것이 분명히 밝혀졌다. 비드 사용량을 3배까지 늘렸을 경우에도, 시그널량에서 히드라지드기 함유 폴리머 비드에는 미치지 못하는 것이 밝혀졌다. 이것은 상술한대로, 시판 비드의 관능기량이 본 특허의 비드와 비교하여 적기(약 1/100) 때문이라고 추측된다.
(실험예 8) 액상으로부터 고상으로의 교환 반응
이하에 나타낸 것처럼 히드라지드 화합물로 표지화(히드라존 결합)한 당쇄를 아미노옥시기 함유 폴리머 비드와 접촉시킴으로써 액상으로부터 고상으로의 히드라존-옥심 교환 반응을 실시했다. 이 방법은 예를 들면 형광성 히드라지드 화합물로 당쇄를 라벨화한 후 HPLC 등으로 당쇄를 단리하고, 그것을 비드와 반응시킴으로써, 단리한 당쇄를 비드에 고정화한다고 하는 응용이 가능하다. 즉, 당쇄 혼합물(예를 들어 당단백으로부터 회수한 당쇄)로부터 임의의 당쇄를 골라내어, 그것을 비드 표면에 제시하는 방법으로서 이용할 수 있다. 또, 응용예에 있어서, 비드 대신에 고상 기판도 이용할 수 있다.
(1) 히드라진 화합물(AcWRh(d))과 당쇄의 결합
실험예 1(A)의 AcWRh(d)를 10mM의 농도로 메탄올에 용해했다. 당단백질인 페투인으로부터 유리한 당쇄 10pmol 상당을 용기에 취하여, 히드라지드 화합물 용액 1㎕를 첨가하고 2% 아세트산을 포함하는 아세토니트릴 100㎕를 추가로 첨가했다. 80℃에서 45분간 가열함으로써 당쇄와 AcWRh(d)를 반응시켰다.
(2) 히드라진 화합물(d-AcWRh(e))와 당쇄의 결합
실험예 8(1)과 같은 방법으로 당쇄와 d-AcWRh(e)를 반응시켰다.
(3) 교환 반응
5mg의 아미노옥시기 함유 폴리머 비드를 용기에 취하여, AcWRh(d)와 결합한 당쇄를 투입했다. 아세트산 완충액으로 pH 4로 조정하여, 80℃에서 1시간 반응시 켰다. 반응 후 상청액을 회수하고, 내부 표준으로서 농도를 이미 알고 있는 d-AcWRh(e) 표지화 당쇄를 첨가하고 MALDI-TOF-MS 측정을 실시함으로써 당쇄(대표적으로 NA3: Asialo, galactosylated triantennary glycan에 주목)의 양을 구했다. 음성대조군으로서 아미노옥시기 함유 폴리머 비드를 포함하지 않는 계를 마찬가지로 처리했다.
도 7에는 MALDI-TOF-MS 차트를 나타낸다.
아미노옥시기 함유 폴리머 비드와 반응시킨 계에서는 약 20%의 양의 당쇄밖에 관측되지 않았다. 한편, 음성대조군에서는 당쇄량은 거의 변화하지 않았다. 이것으로부터, 약 80% 양의 당쇄가 아미노옥시기 함유 폴리머 비드상에 결합한 것을 알 수 있었다.
(실험예 9) 단당 고정화 비드
(1) 단당 고정화 비드의 조제
실험예 1(B)의 아미노옥시기 함유 폴리머 비드 10mg를 용기에 취하여, 갈락토오스(Gal), 혹은 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 10μmol 첨가했다. 2% 아세트산을 포함하는 아세토니트릴을 200㎕ 첨가하여, 80℃에서 1시간 가열함으로써 당을 비드에 고정화했다. 그 후 비드를 0.5% SDS 용액, 메탄올, 순수로 차례차례 세정함으로써 협잡물(foreign matters)을 제거했다.
(2) 렉틴 포착성의 검증
3 종류의 HRP(horse radish peroxidase) 표지화 렉틴: HRP-Concanavalin A(ConA), HRP-Wheat germ agglutinin(WGA), HRP-Ricinus communis agglutinin(RCA120)(렉틴은 모두 생화학공업(주)제)을 1㎍/㎕의 농도로 각각 결합 완충용액(50mM Tris/HCl, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, 10mM MgCl2, pH 7.6)에 용해했다. 실험예 9(1)에서 단당을 고정화한 비드 1mg를 용기에 취하여, 이것에 임의의 렉틴 용액을 100㎕ 첨가하고 37℃에서 16시간 온화하게 교반했다. 그 후 비드를 0.05%의 Tween-20을 포함하는 결합 완충용액 및 결합 완충용액에서 각 1시간 세정했다. 비드상에 결합한 HRP 표지화 렉틴을 페록시다제 발색 키트(스미토모베이크라이트제)로 발색시켜, 용액의 450nm의 흡광도를 측정함으로써 렉틴의 결합량을 추정하였다.
도 8에 나타내는 바와 같이 GlcNAc를 고정화한 비드에는 WGA가 많이 결합하고, Gal을 고정화한 비드에는 RCA120가 많이 결합한 것을 알 수 있다. WGA는 GlcNAc를, RCA120은 Gal을 주로 인식하는 것이 알려져 있으며, 본 발명의 방법을 적용하여 단당을 고정화한 비드는 대응하는 렉틴을 올바르게 인식ㆍ포착 가능하다고 하는 것이 나타났다.
(실험예 10) 올리고당 고정화 비드
(1) 올리고당 고정화 비드의 조제
실험예 1(B)의 아미노옥시기 함유 폴리머 비드 10mg를 용기에 취하여, 실험예 2(1)의 페투인 당쇄 혹은 리보뉴클레아제 B 당쇄 용액을 당쇄량으로 환산하여 1 μmol 상당 첨가했다. 2% 아세트산을 포함하는 아세토니트릴을 200㎕ 첨가하여 80℃에서 1시간 가열함으로써 당쇄를 비드에 고정화했다. 그 후 비드를 0.5% SDS 용액, 메탄올, 순수로 차례대로 세정함으로써 협잡물을 제거했다.
(2) 렉틴 포착성의 검증(Concanavalin A(Con A)의 포착)
실험예 10(1)에서 리보뉴클레아제 B 당쇄를 고정화 완료한 비드 1mg를 용기에 취했다. 이것에 Con A 용액(10㎍/㎖)을 1㎕ 및 결합 완충용액 100㎕ 첨가하고 37℃에서 16시간 온화하게 교반시킴으로써 Con A와 비드상의 당쇄를 결합시켰다. 그 후 비드를 0.05%의 Tween-20을 포함하는 결합 완충용액 및 결합 완충용액으로 각 1시간 세정했다. 세정액을 제거하고, 합텐으로서 0.5M의 메틸-α-만노피라노시드를 20㎕ 첨가하고 37℃에서 2시간 교반시킴으로써 비드상의 당쇄에 결합한 Con A를 유리시켰다. 상청액을 회수하고, 트립신 용액(Promega사제 sequence grade trypsin)을 첨가하고 37℃에서 16시간 정치하여 유리한 Con A를 펩티드 단편화했다. 일부를 취해 MALDI-TOF-MS 측정을 실시하여, 이하와 같이 데이터를 이미 알고 있는 Con A의 아미노산 배열과 비교했다.
(1) Con A의 아미노산 배열(이미 알고 있음)로부터 트립신 절단 위치를 추정하여, 펩티드 단편의 질량수를 예측했다. 또, 측정한 매스 스펙트럼 데이터와 비교하여 일치하는 것을 확인했다. 이 때, 펩티드 단편의 질량수의 예측에는 「PeptideMass(웹상에 공개되고 있는 툴)」를 이용했다.
(2) 얻어진 스펙트럼 중 대표적인 것에 대해 MS/MS 해석을 실시하여, 「MASCOT MS/MS Ion Search(펩티드 단편의 MS/MS 데이터로부터 원래의 단백을 추정하 는 툴)」를 이용하여 해석했는데 정확하게 Con A 유래인 것을 확인했다.
도 9에 나타내는 바와 같이 Con A 유래의 펩티드와 질량수가 일치하는 피크를 다수 검출했다. 리보뉴클레아제 B에 포함되는 주된 당쇄는 고 만노오스형 당쇄(만노오스 잔기를 많이 포함함)이며, Con A는 만노오스를 인식하여 결합하는 성질이 있다. 이러한 사실들로부터, 비드에 고정화한 당쇄에 의해서 Con A를 인식ㆍ포착할 수 있는 것으로 나타났다.

Claims (54)

  1. 하기 (식 4)로 표시되는 가교형 폴리머 구조를 갖고 또한 히드라지드기를 포함하는 물질 A와 당쇄 및 당의 유도체 중 적어도 하나를 상기 물질 A의 히드라지드기와 상기 당쇄 및 당의 유도체 중 적어도 하나의 환원 말단 사이의 히드라존 형성에 의해서 결합하는 것을 특징으로 하는 시료 조제방법.
    (식 4)
    Figure 112013118380111-pct00088
    (Rl, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 물질 A가 하기 (식 5)로 표시되는 가교형 폴리머 구조를 가지는 시료 조제방법.
    (식 5)
    Figure 112009015091076-pct00089
    (m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 물질 A가 평균 입경 0.1㎛ 이상 500㎛ 이하의 폴리머 입자인 시료 조제방법.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 물질 A가 건조 중량 1mg당 100nmol 이상의 히드라지드기를 가지는 폴리머 입자인 시료 조제방법.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 물질 A가 pH 3~8에서 안정한 시료 조제방법.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서
    상기 물질 A가 적어도 1 MPa 이하의 압력하에서 안정한 시료 조제방법.
  7. 청구항 1 또는 청구항 2 기재의 시료 조제방법에 의해 물질 A와 당쇄 및 당의 유도체 중 적어도 하나를 결합시키는 당쇄 포착 단계와,
    상기 당쇄 포착 단계에서 포착된 물질 A와 당쇄 및 당의 유도체 중 적어도 하나의 복합체에 아미노옥시기 또는 히드라지드기를 포함하는 물질 B를 작용시키고, 상기 복합체와 상기 물질 B의 사이에서 생기는 히드라존-옥심 교환 반응 또는 히드라존-히드라존 교환 반응에 의하여, 상기 당쇄 및 당의 유도체 중 적어도 하나를 상기 물질 A로부터 절리하면서 상기 물질 B에 결합시키는 당쇄 유리 단계를 포함하는 시료 조제방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 물질 B가 크로모포어 또는 플루오로포어를 포함하는 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 조제방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 물질 B가 하기 히드라지드기를 포함하는 물질 또는 아미노옥시기를 포함하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질 또는 염인 시료 조제방법.
    (히드라지드기를 포함하는 물질) 5-디메틸아미노나프탈렌-1-설포닐 히드라진(단실히드라진); 2-히드라지노피리딘; 9-플루오레닐메틸 카바제이트(Fmoc 히드라진); 벤질히드라진; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, 히드라지드; 2-(6,8-디플루오로-7-히드록시-4-메틸쿠마린)아세토히드라지드; 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복시산, 히드라지드(DCCH), 페닐히드라진; 1-나프탈렌아세트히드라지드; 2-히드라지노벤조산; 페닐아세틱 히드라지드;
    (아미노옥시기를 포함하는 물질) O-벤질히드록실아민; O-페닐히드록실아민; O-(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤질)히드록실아민; O-(4-니트로벤질)히드록실아민; 2-아미노옥시피리딘; 2-아미노옥시메틸피리딘; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 메틸 에스테르; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 에틸 에스테르; 4-[(아미노옥시아세틸)아미노]벤조산 n-부틸 에스테르.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 물질 B가 아르기닌 잔기, 트립토판 잔기, 페닐알라닌 잔기, 티로신 잔기, 시스테인 잔기 및 이들 유도체 중 적어도 하나로 이루어진 부분을 포함하는 시료 조제방법.
  11. 청구항 7에 있어서,
    상기 물질 B가 하기 (식 7)로 표시되는 구조를 가지는 시료 조제방법.
    (식 7)
    Figure 112009015091076-pct00090
    (구조식 중, R은 -CH3, -CD3를 나타낸다)
  12. 당쇄 및 당의 유도체 중 적어도 하나를 결합시킨, 하기 (식 4) 또는 (식 5)로 표시되는 구조를 가지는 물질 A를 산성 조건에서 처리함으로써 히드라존 결합을 해리시켜 당쇄 및 당의 유도체 중 적어도 하나를 유리시키는 것을 특징으로 하는 시료 조제방법.
    (식 4)
    Figure 112013118380111-pct00091
    (Rl, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
    (식 5)
    Figure 112013118380111-pct00092
    (m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
  13. 청구항 1 또는 청구항 2 기재의 시료 조제방법에 의해 조제된 분석 시료.
  14. 하기 (식 4)로 표시되는 물질 A의 제조방법으로서,
    하기 (식 10)의 구조를 가지는 모노머를 가교제 존재하에서 중합하여 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 얻은 후 상기 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 10 부피% 이상의 농도의 히드라진 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 물질 A의 제조방법.
    (식 4)
    Figure 112009015091076-pct00093
    (Rl, R2는 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R3, R4, R5는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다. m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
    (식 10)
    Figure 112009015091076-pct00094
    (Rl은 -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH- 로 중단되어도 되는 탄소수 1~20의 탄화수소쇄, R2는 H, CH3 또는 탄소수 2~5의 탄화수소쇄를 나타낸다)
  15. 하기 (식 5)로 표시되는 물질 A의 제조방법으로서,
    하기 (식 11)의 구조를 가지는 모노머를 가교제 존재하에서 중합하여 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 얻은 후 상기 카르복시산 에스테르 함유 폴리머 입자를 10 부피% 이상의 농도의 히드라진 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 물질 A의 제조방법.
    (식 5)
    Figure 112009015091076-pct00095
    (m, n은 모노머 유니트 수를 나타낸다)
    (식 11)
    Figure 112009015091076-pct00096
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