WO2022270482A1

WO2022270482A1 - 糖鎖固定化ポリマー粒子及びその製造方法

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Publication number: WO2022270482A1
Application number: PCT/JP2022/024625
Authority: WO
Inventors: 紀子山内; 芳男小林; 実稚永塚; 慎尾形
Original assignee: 国立大学法人茨城大学; 国立大学法人福島大学
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2022-12-29
Also published as: JPWO2022270482A1

Abstract

本発明は、疎水化糖鎖ポリペプチドをポリマー粒子の最表面に強固に固定化するとともに、表面上の糖鎖密度を高くすることにより、糖鎖を介して吸着するタンパク質やウイルスの特異吸着性能を大幅に向上できる糖鎖固定化ポリマー粒子及びその製造方法を提供する。糖鎖固定化ポリマー粒子１は、ポリマー粒子５と、１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持ち、ポリマー粒子５の異なる複数の位置でポリマー粒子５の表面から内部に向けてそれぞれ個別に埋め込まれる複数の疎水基３を介してポリマー粒子５と非共有結合的に固定される疎水化糖鎖ポリペプチド４とを有し、平均粒径が５０ｎｍ～１μｍであって、疎水性の重合性モノマーの重合反応の途中から疎水化糖鎖ポリペプチド４と共存した状態でソープフリー乳化重合を行うことにより製造される。

Description

糖鎖固定化ポリマー粒子及びその製造方法

　本発明は、糖鎖固定化ポリマー粒子及びその製造方法に係り、特に、疎水化糖鎖ポリペプチドをポリマー粒子に、より強固に、且つ、密な状態で固定化することにより、糖鎖を介してタンパク質やウイルスが吸着するときの特異吸着性の大幅な向上を図ることができる糖鎖固定化ポリマー粒子及びその製造方法に関する。

　糖鎖がタンパク質やウイルスと特異的相互作用することは既に知られており、タンパク質やウイルス等のバイオセンサーとして、又はそれらとの親和性を利用した分離及び精製を行うための多能性の手段として使用されている。しかしながら、単一の糖鎖分子は、タンパク質やウイルスとの結合親和性が非常に弱いため、タンパク質やウイルスに対する特異的相互作用が十分でなく、所望の特異吸着性を発現することができない。そのため、微粒子を担体（キャリア）として使用し、該担体の表面上に多くの糖鎖分子を固定化することが行われている。

　ここで、微粒子としてはポリマー粒子（磁性粒子が含まれる場合もある）、又はガラス若しくは二酸化チタン等の金属酸化物複合体等の無機粒子が使用されるが、糖鎖の固定化方法を含め、製造が容易であること、特異吸着性等の機能付与が広範囲に行うことが出来ること等から、糖鎖固定化ポリマー粒子が検討されている。

　糖鎖固定化ポリマー粒子の例としては、例えば、ビニル系モノマーの重合体である高分子微粒子に２糖以上のオリゴ糖が固定された高分子微粒子（特許文献１）、高分子としてポリペプチド主鎖を有する糖鎖高分子（特許文献２）、及びタンパク質の分離材として使用され、被覆層を有する多孔質ポリマー粒子（特許文献３）等が提案されている。

　本発明者等も、平均粒径が１μｍ以下で、且つ、粒径分布の狭いナノレベルの糖鎖固定化ポリマー粒子として、疎水基を有する糖鎖を、ソープフリー乳化重合法によって製造されるポリメチルメタクリレート微粒子に前記疎水基を介して非共有結合的に固定化させたポリマー粒子を提案した（非特許文献１）。

　他方、糖鎖固定化ポリマー粒子ではないものの、糖鎖に代えて、疎水性セグメントを有するマレイミド化合物を非共有結合的に固定化したナノレベルのポリマー粒子が特許文献４には提案されている。

特開２００２－１４５８９６号公報特開平９－２２７６００号公報国際出願第２０１７／１５５１０５号特表２００９－５０８９３６号公報

Ｎ．Ｙａｍａｕｃｈｉ，　ｅｔ．　ａｌ．,「Ｏｎｅ－ｐｏｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｇａｒ－ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｅｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｂｙ　ｓｏａｐ－ｆｒｅｅ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ａ　５８０,１２３７５４,２０１９年,ｐｐ．１－７

　タンパク質やウイルスに対して特異的に吸着する糖鎖固定化ポリマー粒子の粒径は、吸着するタンパク質やウイルスの大きさの点から、平均粒径が１μｍ以下、好ましくは数十～数百ｎｍの範囲であることが望ましい。加えて、粒度分布が狭く、ほぼ均一な粒径を有するポリマー粒子が、すべての粒子間で均質的にほぼ同じ特性を発現でき、特異吸着性のばらつきを小さくできることから望ましい。

　また、糖鎖固定化ポリマー粒子の一個に着目すると、高度で、かつ、安定的な特異吸着性を得るためには、ポリマー粒子表面上の糖鎖がポリマー粒子に強固に、且つ、糖鎖が表面上に密の状態で高濃度に固定化されることが必要である。

　さらに、糖鎖固定化ポリマー粒子の製造工程を、糖鎖固定化の工程を含めて効率化及び簡略化することができれば、コスト低減によって利用を広げることができる。

　しかしながら、上記特許文献１～４及び非特許文献１に開示されるポリマー粒子は、上述の技術課題のすべてを同時に満たすことが困難であった。すなわち、特許文献１及び２に記載の発明は、該ポリマー粒子と糖鎖とが共有結合によって強固に固定化されているものの、糖鎖固定化ポリマー粒子そのものが糖鎖成分を側鎖に有する共重合体又はポリペプチドから構成されており、糖鎖成分がポリマー粒子の内部にまで埋め込まれるため、ポリマー粒子表面上に糖鎖成分を高濃度で配列することが難しいという課題がある。

　また、特許文献１～３に開示されるポリマー粒子は、該ポリマー粒子と糖鎖との間で共有結合を形成するために行われる合成反応において高度な専門的技術を要するため、製造工程の管理が難しい。特に、特許文献３に記載の分離材の製造方法は、多孔性ポリマー粒子の表面に第１と第２のグラフト鎖を有する被覆層を形成する方法を採用するため、合成反応の精緻なコントロールを行う必要があり、特許文献１及び２に記載される方法に比べてポリマー粒子の製造工程がより複雑となっていた。

　一方、特許文献４には、マレイミド化合物とポリマーとを含む油層を水槽に分散させることにより球形ポリマー状のナノメートル（１００－５００ｎｍ）粒子を形成する方法が記載されている。しかしながら、特許文献４に記載の球形ポリマー粒子は、疎水性セグメントを有するマレイミド化合物が疎水相互作用によってポリマー粒子に表面吸着しているものであり、前記疎水性セグメントがポリマー粒子の内部に埋め込まれた形態を有するものではなかった。また、特許文献４に記載された形成方法では、ポリマー粒子の粒度分布がやや広くなる傾向にあった。そのため、本発明の目的に対して特許文献４に記載のポリマー粒子及びその製造方法をそのまま適用することができなかった。

　以上の点から、特許文献１～４に比べてより簡便にポリマー粒子を作製し、且つ、糖鎖成分をより強固に固定化する方法として、非特許文献１に開示されるように、疎水基を有する糖鎖成分をソープフリー乳化重合法によりポリマー粒子に非共有結合的に固定化したナノレベルのポリマー粒子及びその製造方法が提案された。ここで、ポリマー粒子への非共有結合的な固定化は、疎水基がポリマー粒子の内部に埋め込まれる形態によって行われる。

　しかしながら、非特許文献１に記載された疎水基を有する糖鎖成分は、１分子中に疎水基の疎水性セグメントと糖鎖の親水性セグメントをそれぞれ１つだけ含む低分子量化合物である。そのため、糖鎖成分のポリマー粒子に対する固定力が必ずしも十分であるとは言えず、固定力の一層の改善を行うことが必要であった。また、ソープフリー乳化重合において添加される前記低分子量化合物のすべてを表面吸着させることが困難であるため、ポリマー粒子表面上における糖鎖成分の高密度化についても技術上の制約があった。したがって、非特許文献１に記載の方法に代えて、糖鎖成分のより強固な固定化を図るとともに、糖鎖成分をポリマー粒子表面上に高密度で固定化することができれば、タンパク質やウイルスに対する特異吸着性を大幅に高めることができることが期待できる。そのため、そのような性状と特性を有するポリマー粒子及びその製造方法が強く望まれていた。

　本発明は、上記した従来の問題点に鑑みてなされたものであって、疎水性セグメントを有する糖鎖ポリペプチドをポリマー粒子の最表面に強固に固定化するとともに、ポリマー粒子最表面上の糖鎖を密に導入することにより、糖鎖を介して吸着するタンパク質やウイルスの特異吸着性の大幅な向上を図ることができる糖鎖固定化ポリマー粒子及びその製造方法を提供する。

　本発明は、疎水性セグメントである疎水基と糖鎖をそれぞれ１つ有する従来の疎水化糖鎖ポリペプチドに代えて、１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に有するポリペプチドを用いて、疎水性の重合性モノマーを重合反応の途中からポリペプチドと共存した状態でソープフリー乳化重合を行うことにより上記の課題を解決できることを見出して本発明に到った。

　すなわち、本発明の構成は以下の通りである。
［１］本発明は、ポリマー粒子と、１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持ち、前記ポリマー粒子の異なる複数の位置で前記ポリマー粒子の表面から内部に向けてそれぞれ個別に埋め込まれる前記複数の疎水基を介して前記ポリマー粒子と非共有結合的に固定される疎水化糖鎖ポリペプチドと、を有する糖鎖固定化ポリマー粒子を提供する。
［２］本発明は、前記糖鎖固定化ポリマー粒子の平均粒径が５０ｎｍ～１μｍであることを特徴とする前記［１］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子を提供する。
［３］本発明は、前記疎水化糖鎖ポリペプチドの固定化が、前記ポリマー粒子の複数個に跨がないで行われることを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子を提供する。
［４］本発明は、前記疎水化糖鎖ポリペプチドが、下記（１）式又は下記（２）式で表されるアミノ酸残基を持つポリペプチドを主鎖とし、前記主鎖にアミド結合を介して単糖又はオリゴ糖の構造を含有する配糖体を結合してなる側鎖、及び前記主鎖にアミド結合を介して疎水基を結合してなる側鎖、をそれぞれ複数で有することを特徴とする前記［１］～［３］のいずれかに記載の糖鎖固定化ポリマー粒子を提供する。

［５］本発明は、前記疎水化糖鎖ポリペプチドが、下記（３）式で表されるポリペプチドであることを特徴とする前記［４］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子を提供する。

　ここで、Ｒ_１は水素、アルキル基又は一価の陽イオン金属で、Ｒ_２は単糖配糖体又はオリゴ糖配糖体で、Ｒ_３が疎水基であり、ａは０又は１以上の整数で、ｂ及びｃはそれぞれ独立に２以上の整数である。
［６］本発明は、前記ｂ及びｃがそれぞれ独立に５００～３０００であり、前記ａ、ｂ及びｃの（ａ＋ｂ＋ｃ）に対する比率が、それぞれ０．０５～０．９、０．０５～０．５及び０．０５～０．６であることを特徴とする前記［５］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子を提供する。
［７］本発明は、前記ポリマー粒子が、スチレンとその誘導体及び（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の疎水性モノマーの重合体を有する粒子であり、前記Ｒ_１がナトリウム又はカリウムの陽イオン金属であり、前記Ｒ_２が下記（４）式又は下記（５）式で表される単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する配糖体であり、前記Ｒ_３が炭素数３～１５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることを特徴とする前記［５］又は［６］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。

　ここで、Ｙ_１及びＹ_２は、それぞれ独立にスペーサー基として３～１５のメチレン基が共有結合した構造を有する有機基であり、ｍ及びｎは、それぞれ独立に０～２の整数であり、Ｚは単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する糖鎖である。
［８］本発明は、前記糖鎖固定化ポリマー粒子が、前記ポリマー粒子の表面に吸着される親水性のポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体を有することを特徴とする前記［１］～［７］のいずれかに記載の糖鎖固定化ポリマー粒子を提供する。
［９］本発明は、前記ポリマー粒子が、前記ポリマー粒子との疎水相互作用又は静電相互作用によって非共有結合的に前記ポリマー粒子に固定された蛍光色素を有することを特徴とする前記［１］～［８］のいずれかに記載の糖鎖固定化ポリマー粒子を提供する。
［１０］本発明は、重合性モノマーを分散した水系溶媒を有する重合槽内に水溶性のラジカル重合開始剤を添加して重合を開始する工程と、重合反応の途中で、１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つ疎水化糖鎖ポリペプチドを添加し、該疎水化糖鎖ポリペプチドを前記重合槽内に共存させた状態で前記重合反応を継続する工程と、を有する糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。
［１１］本発明は、前記疎水化糖鎖ポリペプチドの添加が、前記重合槽内で前記重合性モノマーの重合が進み、ポリマー粒子の核形成に続き、前記ポリマー粒子の安定的な成長がみられるときから、前記重合性モノマーが消失する前までであって、且つ、前記重合性モノマーの重合反応による転化率が０質量％を超え９５質量％以下のときに行われることを特徴とする前記［１０］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。
［１２］本発明は、前記疎水化糖鎖ポリペプチドの添加が、前記重合槽内に含まれる前記重合性モノマーの重合反応による転化率が重合開始のときに対して３～５０質量％となるときの重合反応時間に行われることを特徴とする前記［１０］又は［１１］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。
［１３］本発明は、前記疎水化糖鎖ポリペプチドが、下記（１）式又は下記（２）式で表されるアミノ酸残基を持つポリペプチドを主鎖とし、前記主鎖にアミド結合を介して単糖又はオリゴ糖の構造を含有する配糖体を結合してなる側鎖、及び前記主鎖にアミド結合を介して疎水基を結合してなる側鎖、をそれぞれ複数で有することを特徴とする前記［１０］～［１２］のいずれかに記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。

［１４］本発明は、前記疎水化糖鎖ポリペプチドが、下記（３）式で表されるポリペプチドであることを特徴とする前記［１３］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。

　Ｒ₁は水素、アルキル基又は一価の陽イオン金属で、Ｒ₂は単糖配糖体又はオリゴ糖配糖体で、Ｒ₃が疎水基であり、ａは０又は１以上の整数で、ｂ及びｃはそれぞれ独立に２以上の整数である。
［１５］本発明は、前記ｂ及びｃが、独立に５００～３０００の整数であり、前記ａ、ｂ及びｃの（ａ＋ｂ＋ｃ）に対する比率が、それぞれ０．０５～０．９、０．０５～０．５及び０．０５～０．６であることを特徴とする前記［１４］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。
［１６］本発明は、前記ポリマー粒子が、スチレンとその誘導体及び（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の疎水性モノマーの重合体を有する粒子であり、前記Ｒ_１がナトリウム又はカリウムの陽イオン金属であり、前記Ｒ_２が下記（４）式又は下記（５）式で表される単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する配糖体であり、前記Ｒ_３が炭素数３～１５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることを特徴とする前記［１４］又は［１５］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。

　ここで、Ｙ_１及びＹ_２は、それぞれ独立にスペーサー基として３～１５のメチレン基が共有結合した構造を有する有機基であり、ｍ及びｎは、それぞれ独立に０～２の整数であり、Ｚは単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する糖鎖である。
［１７］本発明は、前記［１０］～［１６］のいずれかに記載の製造方法が、前記糖鎖固定化ポリマー粒子の重合反応の途中又は重合反応を終了した後、ポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体の親水性ポリマーを前記糖鎖固定化ポリマー粒子の表面に吸着させる工程を有することを特徴とする糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。
［１８］本発明は、前記親水性ポリマーを前記ポリマー粒子の表面に吸着させる工程が、前記糖鎖固定化ポリマー粒子の重合反応の途中又は重合反応を終了した後、前記糖鎖固定化ポリマー粒子が含まれる前記重合槽に、前記親水性ポリマーを添加する工程、及び前記重合槽とは別に、水系媒体が含まれる反応槽に前記糖鎖固定化ポリマー粒子を移動させた後、前記糖鎖固定化ポリマー粒子が含まれる前記反応槽に前記親水性ポリマーを添加する工程、のいずれかの工程を含むことを特徴とする前記［１７］に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。
［１９］本発明は、前記重合を開始する工程の前に、前記重合性モノマーとの共存又は非共存の状態で蛍光色素を前記重合槽内に添加するか、又は前記重合を開始してから前記重合性モノマーの重合反応による転化率が９５質量％以下であるときのいずれかの重合時間において、前記疎水化糖鎖ポリペプチドの共存若しくは非共存の状態で前記蛍光色素を前記重合槽内に添加することによって、前記ポリマー粒子に前記蛍光色素が固定された糖鎖固定化ポリマー粒子を製造することを特徴とする前記［１０］～［１８］のいずれかに記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法を提供する。

　本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は、疎水化糖鎖ポリペプチドが有する２以上の疎水基がそれぞれポリマー粒子の独立した箇所の内部に埋め込まれる。そのため、ポリマー粒子と、アンカー部位として機能する疎水基の部分との接触面積が大きくなり、糖鎖がポリマー粒子から外れにくくなる。それにより、糖鎖がポリマー粒子の表面上に強固に固定化される。さらに、疎水化糖鎖ポリペプチドが有する２以上の多数の糖鎖がポリマー粒子の最表面上で分子状に配列して密に導入されるため、糖鎖を介して吸着するタンパク質やウイルスの特異吸着性の大幅な向上を図ることができる。

　また、本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は、タンパク質やウイルスの種類に応じて、疎水化糖鎖ポリペプチドの糖鎖の種類や数を変えることにより所望の特異吸着性を有するポリマー粒子として使用することができるため、バイオセンサー、分離剤及び精製剤としての適用性が広く、かつ、汎用性も高い。さらに、本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は、蛍光色素を内包することにより、タンパク質又はウイルスの高精度検知手段としてだけでなく、生体物質イメージング用の蛍光プローブ又は細胞イメージング用の蛍光ラベルとして利用することができる。例えば、水溶液中又は生体組織中において、前記蛍光色素が内包される糖鎖固定化ポリマー粒子の蛍光スペクトルを蛍光分光法等によって測定し、得られる蛍光スペクトルの吸収ピーク及び強度等を分析及び解析することによってタンパク質やウイルスが特異吸着する前後の前記糖鎖固定化ポリマー粒子の分散状態及び挙動だけでなく、特異吸着後のタンパク質やウイルスの挙動も合わせて把握することができるため有用性が非常に高い。

本発明の糖鎖固定化ポリマーの製造方法は、疎水性の重合性モノマーを重合反応の途中からポリペプチドと共存した状態でソープフリー乳化重合を行うことにより、ポリマー粒子の凝集を避けることができるだけでなく、平均粒径が５０ｎｍ～１μｍの範囲に含まれるナノレベルの微粒子を、所望の平均粒径で、且つ、小さな粒径分布を有する態様で効率的に製造することができる。そのため、粒径及び粒径分布が精緻にコントロールされた糖鎖固定化ポリマーの量産性に優れる。

本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子の例について断面模式図及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察されたＳＥＭ写真像を示す図である従来技術による糖鎖固定化ポリマー粒子の例を示す断面模式図である。本発明による糖鎖固定化ポリマー粒子の重合方法及び従来のソープフリー乳化重合方法のそれぞれの重合プロセスを示す模式図である。本発明で使用する疎水化糖鎖配糖体の前駆体を製造するときの製造例を模式的に示す図である。低分子量の糖鎖から高分子量のオリゴ糖鎖を合成するときの合成例を模式的に示す図である。本発明の実施形態による疎水化糖鎖ポリペプチドの製造方法の例を模式的に示す図である。本発明及び従来の糖鎖固定化ポリマー粒子の表面に親水性ポリマーが吸着した様態を模式的に示す断面図である。本発明の実施例及び比較例において糖鎖固定化ポリマー粒子を製造するときの重合プロセスを示す図である。本発明の実施例１による糖鎖固定化ポリマー粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したときのＳＥＭ写真像を示す図である。比較例１及び参考例１、２の糖鎖固定化ポリマー粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したときのＳＥＭ写真像を示す図である。本発明の実施例４及び比較例２の糖鎖固定化ポリマー粒子に対して特異的に吸着したタンパク質吸着量の測定結果を示す図である。ポリエチレングリコールが表面吸着した本発明の実施例５による糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子及び比較例３、４のＰＭＭＡ粒子に対して特異的に吸着したタンパク質（ＷＧＡ）吸着量の測定結果を示す図である。本発明の実施例６によるシアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子を製造するときの重合プロセスを示す図である。本発明の実施例６のシアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子及び糖鎖無添加ＰＭＭＡ粒子に吸着したタンパク質（ＳＳＡ）吸着量の測定結果を示す図である。

　図１に、本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子の例を模式的に示す。図１において、（ａ）は本発明の糖鎖固定化ポリマー粒子の模式断面図であり、（ｂ）は本発明の糖鎖固定化ポリマー粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したＳＥＭ写真像を示す図である。

　図１（ａ）に示すように、糖鎖固定化ポリマー粒子１の表面には、１分子中に複数の糖鎖２及び複数の疎水基３を持つ疎水化糖鎖ポリペプチド４がポリマー粒子５に固定化される。疎水化糖鎖ポリペプチド４の固定化は、ポリマー粒子５の異なる複数の位置でポリマー粒子５の表面から内部に向けてそれぞれ個別に埋め込まれる複数の疎水基３を介して非共有結合的に行われる。ここで、複数の疎水基３は、ポリマー粒子５と共有結合をしておらず、ポリマー粒子５に対して埋込による投錨（アンカー）効果を得るために疎水化糖鎖ポリペプチド４の側鎖に導入される部位である。疎水基３による投錨効果は疎水化糖鎖ポリペプチド４において１分子中の複数個所で得られるため、ポリマー粒子との接触面積の増大に伴って固定化を強固にすることができる。さらに、疎水化糖鎖ポリペプチド４の固定化はポリマー粒子５の１個だけで行われ、２以上の複数個に跨がないようにすることが好ましい。後述するように、疎水化糖鎖ポペプチド４がポリマー粒子５の複数個に跨って固定される場合はポリマー粒子同士の凝集が起こりやすくなるため、疎水基３のポリマー粒子５の各１個への埋込が不十分となる。それにより、非共有結合的な固定化強度が低下する結果となる。さらに、数十ｎｍ未満の微細粒子も合成されるようになるため、後述するように、粒度分布の広がりによってタンパク質及びウイルスの検出感度に影響する吸着特性の低下及び水系溶媒からの粒子回収効率の低下といった副次的な問題も起きる。

　図１（ａ）は、ポリマー粒子５の断面において疎水化糖鎖ポリペプチド４の３分子がポリマー粒子５に固定化される様態を模式的に示すものであるが、固定化される疎水化糖鎖ポリペプチド４の固定量は、後述の重合反応において重合槽に供給される重合性モノマー及び疎水化糖鎖ポリペプチド４の量に応じて調整される。また、疎水化糖鎖ポリペプチド４は、糖鎖２及び疎水基３のセグメントを数多く側鎖に持つものを合成し、それを使用してもよい。それにより、ポリマー粒子５の最表面上で分子状に配列して保持することにより糖鎖２を密に導入し、糖鎖２を介して吸着するタンパク質やウイルスの特異吸着性の大幅な向上を図ることができる。さらに、糖鎖２の種類又は糖鎖２を有する糖鎖配糖体の数を、タンパク質やウイルスの種類に応じてそれぞれ選択することにより、それらの選択的な特異吸着性を同時に高めることができる。本発明においては、糖のグリコキシド結合により様々な原子団と結合した化合物である配糖体の中から、単糖及びオリゴ糖として２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する配糖体を側鎖に導入したペプチドを使用する。これらの配糖体の導入によって特異吸着性の向上を図ることが、原料の入手及び製造の容易さ等の点から実用的である。このように、本発明における「糖鎖」とは、単糖が複数個繋がった分子鎖だけでなく、単糖単独の分子鎖も含めて総称されるものである。

　図１（ｂ）には、本発明の実施形態によって得られる糖鎖固定化ポリマー粒子１の例について走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したＳＥＭ写真像を示す。図１（ｂ）に示す例は、粒径が２００ｎｍ未満で、かつ、粒度分布が狭く、高い粒径均一性を有しており、加えて、凝集がみられない単分散の糖鎖固定化ポリマー粒子であることが分かる。

　本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子１の平均粒径は、凝集しない一次粒子の形で５０ｎｍ～１μｍである。さらに、平均粒径が５０ｎｍ～５００ｎｍの範囲に含まれるものが好ましい。タンパク質及びウイルスは、粒子径を球形と仮定したときに平均粒径がそれぞれ数ｎｍ～数十ｎｍ及び１０～数百ｎｍの範囲にある。そのため、糖鎖固定化ポリマー粒子は、平均粒径が５０ｎｍ～１μｍ、好ましくは５０ｎｍ～５００ｎｍの範囲で吸着特性を十分に発現することができる。

　平均粒径が１μｍを超えると、単位質量あたりの粒子の総表面積が小さくなるため、タンパク質及びウイルスの吸着量が少なくなり、検出感度の低下が顕著になる。特に、糖鎖固定化ポリマー粒子が凝集した凝集（二次）粒子は、糖鎖固定化ポリマー粒子に固定化される疎水化糖鎖ポリペプチドが凝集粒子間に跨ることに起因して起こりやすく、それによって平均粒径が１μｍを超え、不定形の大きな粒子になる。その場合、ポリマー粒子５に対する複数の疎水基３の埋込が不十分となり、埋込による投錨効果が十分に得られないため、固定化の強度低下や固定化強度のばらつきがみられる。したがって、本発明においては糖鎖固定化ポリマー粒子１の凝集を避ける必要がある。また、平均粒径が５０ｎｍ未満であると、タンパク質及びウイルスを吸着した後に、水系溶媒からの粒子回収が難しくなるだけでなく、検出感度の大幅な低下がみられる。

　本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子１は、粒径分布が狭く、高い粒径均一性を有することが実用的である。粒径分布を分散度（変動係数）ＣＶ＝（粒径の標準偏差）／（平均粒子径）×１００（％）で定義するとき、前記ＣＶを２０％以下、好ましくは１０％以下となるように粒度分布を狭くすることにより、タンパク質及びウイルスに対する吸着特性を高めることができる。前記ＣＶが２０％を超えると、タンパク質及びウイルスの吸着の際に粒子間での吸着量のバラツキが大きくなるため、吸着特性の低下が顕著になる。

　糖鎖固定化ポリマー粒子１の平均粒径は、図１（ｂ）に示すように、ＳＥＭ写真像から任意に選択した１００～２００個程度の粒子について粒子径を実測し、それらの平均値として求めることができる。また、実測した粒子径を横軸にプロットし、それぞれの粒子径を有する粒子の累積数を縦軸にプロットすることにより粒度分布曲線を作成し、その粒度分布曲線から粒径の標準偏差を求め、平均粒子径で除算することにより粒径の分散度ＣＶを求めることができる。また、糖鎖固定化ポリマー粒子の平均粒径及び分散度は、前記の方法に限定されず、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置によって測定した粒度分布曲線を用いて求めてもよい。

　図２に、従来技術による糖鎖固定化ポリマー粒子の例を模式的に示す。図２に示す糖鎖固定化ポリマー粒子６は、非特許文献１に開示された従来技術によって得られたものである。図２に示す糖鎖固定化ポリマー粒子６は、糖鎖７と疎水基８とを一分子中にそれぞれ１つだけ含む疎水化糖鎖ポリペプチド９が、ポリマー粒子１０に非共有結合的に固定化されるが、疎水化糖鎖ポリペプチド９の固定化が１つの疎水基８の埋込によって行われる。加えて、糖鎖固定化ポリマー粒子６の製造の際に疎水化糖鎖ポリペプチド９の仕込み量の制約及び弱い表面吸着性の点で、糖鎖の固定化密度を高くすることには限界がある。

　それに対して、本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子１は、図１（ａ）に示すように、糖鎖２と疎水基３とを側鎖に２以上の複数で含む疎水化糖鎖ポリペプチド４をポリマー粒子５に物理吸着させる際に、複数の疎水基３をポリマー粒子５の内部に埋込むことにより、疎水基３とポリマー粒子５との接触面積が広くなるためアンカー効果の増大を図ることができる。それにより、疎水化糖鎖ポリペプチド４の固定化強度を大幅に向上できるだけでなく、ポリマー粒子５の表面上に配列する糖鎖の密度も向上させることができる。

　さらに、本発明は、疎水化糖鎖ポリペプチド４を使用するだけでなく、複数の疎水基３をポリマー粒子５の内部に埋込むための方法についても検討を行うことにより、なされたものである。ポリマー粒子５の表面上に配列する糖鎖の密度を高めるための方法の一つとして、ソープフリー乳化重合で疎水性のポリマー粒子５を形成した後、１分子中に複数の糖鎖２及び複数の疎水基３を持つ疎水化糖鎖ポリペプチド４を添加することにより、ポリマー粒子５の表面上に疎水基３を物理吸着させる方法を採用することができる。この方法は複数の疎水基３をポリマー粒子の内部に埋め込む操作を必要としないことから簡便な方法であるが、後述の比較例４で説明するように、タンパク質やウイルスに対する特異吸着性能及び疎水化糖鎖ポリペプチド４の固定化強度が十分に得られず、本発明の目的を達成することができなかった。

　本発明の糖鎖固定化ポリマー粒子１は、ポリマー粒子の重合方法として用いられる乳化重合法、懸濁重合法、分散重合法、シード重合法等の中から、単分散ポリマー粒子の合成方法として知られているソープフリー乳化重合法によって製造される。ソープフリー乳化重合法は、界面活性剤を使用しないでクリーンな粒子表面を持つ粒子を合成するときに一般的に使用されるが、本発明では、新たな成分として疎水化糖鎖ポリペプチド４を使用する点だけでなく、さらに、ソープフリー乳化重合のときに添加する疎水化糖鎖ポリペプチド４の添加方法が従来の重合プロセスと異なる点に特徴を有する。

本発明においてソープフリー乳化重合法として実際に採用する重合プロセスを、従来から一般的に採用される重合プロセスと対比して図３を用いて説明する。図３（a）は、本発明による糖鎖固定化ポリマー粒子１の製造方法で採用する重合プロセスを模式的に示す図である。また、図３（ｂ）は、従来から一般的に採用されているソープフリー乳化重合プロセスを示す図であり、非特許文献１において粒径分布を狭くできる重合プロセスとして採用されたものである。

　ソープフリー乳化重合は、例えば、スチレン又はメチルメタクリレート等の疎水性の重合性モノマーを重合槽内１１の水系溶媒１２に分散し重合性モノマーの油滴１３を形成した状態でリン酸二水素カリウムや過硫酸塩（例えば、過硫酸カリウム）等の水溶性のラジカル重合開始剤を添加し、重合雰囲気（例えば窒素やアルゴンの雰囲気）、温度及び時間等を所定の条件で選択し、ラジカル重合を行ってポリマー粒子を合成する方法である。図３（a）に示すように、本発明の製造方法は、重合の進行とともにポリマー粒子が形成される途中、すなわち重合反応の途中で、疎水化糖鎖ポリペプチド４を添加して行う点に特徴を有する。ここで、重合反応途中のポリマー粒子１４とは、後述するように、重合性モノマーで前記ポリマー粒子が膨潤している状態を意味する。

図３（a）に示す重合プロセスでは、図３（ｂ）に示す従来の重合プロセスで見られたポリマー粒子の凝集、さらに数十ｎｍ以下の微細粒子が合成されやすいという技術課題を解決することができる。図３（ｂ）に示す従来の重合プロセスは、疎水性の重合性モノマーが含まれる重合槽１１にラジカル重合開始剤が添加される前（重合開始前）に疎水化糖鎖ポリペプチド４が投入添加された後、重合を進めてポリマー粒子が形成される。しかしながら、この重合プロセスでは、分子量が大きな疎水化糖鎖ポリペプチド４の使用によって、疎水化糖鎖ポリペプチド４が重合反応途中で形成される微小ポリマー１４の表面に物理吸着し、微小ポリマー粒子間を互いに橋掛けするように働く。そのため、重合が進行するに伴い、複数のポリマー粒子間で凝集が起こり、凝集した糖鎖固定化ポリマー粒子１５がみられるという問題が生じた。また、粒子凝集は重合反応を行う環境を不均一にする傾向があるため、数十ｎｍ未満の微細粒子が合成されやすい。それにより糖鎖固定化ポリマー粒子の粒度分布が広くなるといった点も考慮する必要がある。

それに対して、図３（ａ）に示す本発明の重合プロセスでは、重合途中において重合性モノマーで膨潤しているポリマー粒子１４が、サイズ的に疎水化糖鎖ポリペプチド４の複数が表面吸着できる程度まで大きくなった段階で、疎水化糖鎖ポリペプチド４のポリマー粒子１４への表面吸着が行われる。その挙動により、ポリマー粒子間で疎水化糖鎖ポリペプチド４の物理吸着による橋掛け現象がみられず、重合が進行する過程においてポリマー粒子５の凝集が防止される。その際、疎水化糖鎖ポリペプチド４が有する複数の疎水基３は疎水相互作用によって膨潤したポリマー粒子の内部に侵入した形態で埋め込まれ、ポリマー粒子５に対する大きなアンカー効果が得られる。加えて、重合反応が各粒子間においてほぼ同じ条件で進むため、ポリマー粒子５の粒度分布を狭くできるという利点がある。

図３（ｂ）に示す糖鎖固定化ポリマー粒子１５の凝集及び微細粒子の作製という技術課題は、本発明独自の疎水化糖鎖ポリペプチドを使用するときに初めて認識されるものである。この技術課題に基づいて、１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つ疎水化糖鎖ポリペプチド４を使用するときには、さらに製造方法について重合プロセスの最適化を行うことにより、本発明独自の性状と物性を有する糖鎖固定化ポリマー粒子１が得られることを見出して本発明がなされた。

以上のように、本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子１は、疎水性モノマーの重合体であるポリマー粒子５を担体として、該ポリマー粒子５の表面に、複数の糖鎖２及び複数の疎水基３を有する疎水化糖鎖ポリペプチド４が表面固定化された構造を有する。さらに、疎水化糖鎖ポリペプチド４は、複数の疎水基３がポリマー粒子５の内部に埋め込まれており、複数の疎水基３の疎水相互作用によってポリマー粒子５に非共有結合的に固定化される。本発明の実施形態で使用するポリマー粒子５及び疎水化糖鎖ポリペプチド４について以下に説明する。

＜ポリマー粒子＞
　本発明の実施形態において、ポリマー粒子は疎水性モノマーの重合体であり、疎水性モノマーとしては、スチレンとその誘導体、ビニルエステル、及び（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選ばれる１種以上のモノマー、より好ましくは、ソープフリー乳化重合の容易性と適用実績の点から、スチレンとその誘導体、及び（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選ばれる１種以上のモノマーである。これらの疎水性モノマーは、本発明の製造方法として後述するソープフリー乳化重合において一般的に使用されるモノマーである。

　疎水性モノマーとして用いられるスチレン及びその誘導体としては、スチレン、α－メチルスチレン、メチルスチレン、ブチルスチレン、ｔ－ブチルスチレン、ジメチルスチレン、ジビニルベンゼン等が挙げられ、これらを１種又は２種以上用いることができる。上記の中でも、ポリマーエマルションの製造におけるソープフリー乳化重合の容易性、入手性及び経済性の観点から、スチレンが好ましい。

　疎水性モノマーとして用いられるビニルエステルとしては、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、ヘキサン酸ビニル、オクタン酸ビニル、デカン酸ビニル、ラウリン酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等の、アルキル基又はアルケニル基を有するビニルエステルが挙げられ、これらを１種又は２種以上用いることができる。上記の中でも、ポリマーエマルションの製造におけるソープフリー乳化重合の容易性、入手性及び経済性の観点から、酢酸ビニルが好ましい。

　疎水性アクリル系モノマーとして用いられる（メタ）アクリル酸エステルとしては、ポリマーエマルションの製造におけるソープフリー乳化重合の容易性、入手性及び経済性の観点から、（メタ）アクリル酸アルキルエステルが好ましく、そのホモポリマーの２０℃の水への溶解量が１質量％以下であるものが挙げられる。（メタ）アクリル酸アルキルエステルのアルキルの炭素数は、好ましくは１以上２４以下、より好ましくは１以上１２以下、更に好ましくは１以上８以下、より更に好ましくは１以上６以下である。なお本明細書において「（メタ）アクリル酸」とは、メタクリル酸又はアクリル酸を意味する。

　メタクリル酸エステルの具体例としては、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ－プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｓｅｃ－ブチル、メタクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル、メタクリル酸ｎ－ヘキシル、メタクリル酸２－エチルヘキシル、メタクリル酸イソオクチル、メタクリル酸ｎ－デシル、メタクリル酸イソデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ベンジル、及びメタクリル酸イソボルニル等が挙げられる。

　これらのうち、ポリマーエマルションの製造におけるソープフリー乳化重合の容易性、入手性及び経済性の観点から、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ－プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｓｅｃ－ブチル、メタクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル、メタクリル酸ｎ－ヘキシル、メタクリル酸２－エチルヘキシル、メタクリル酸イソオクチル、メタクリル酸ｎ－デシル、メタクリル酸イソデシル、及びメタクリル酸ラウリルからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ－プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｓｅｃ－ブチル、メタクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル、メタクリル酸ｎ－ヘキシル、メタクリル酸２－エチルヘキシル、及びメタクリル酸イソオクチルからなる群から選ばれる１種以上がより好ましく、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ－プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｓｅｃ－ブチル、メタクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル、及びメタクリル酸ｎ－ヘキシルからなる群から選ばれる１種以上が更に好ましく、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ－プロピル、メタクリル酸イソプロピル、及びメタクリル酸ｎ－ブチルからなる群から選ばれる１種以上がより更に好ましく、メタクリル酸メチルがより更に好ましい。

　アクリル酸エステルの具体例としては、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ－プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ｓｅｃ－ブチル、アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル、アクリル酸ｎ－ヘキシル、アクリル酸２－エチルヘキシル、アクリル酸イソオクチル、アクリル酸ｎ－デシル、アクリル酸イソデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸ベンジル、及びアクリル酸イソボルニル等が挙げられる。

　これらのうち、ポリマーエマルションの製造におけるソープフリー乳化重合の容易性、入手性及び経済性の観点から、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ－プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ｓｅｃ－ブチル、アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル、アクリル酸ｎ－ヘキシル、アクリル酸２－エチルヘキシル、アクリル酸イソオクチル、アクリル酸ｎ－デシル、アクリル酸イソデシル、及びアクリル酸ラウリルからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ－プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ｓｅｃ－ブチル、アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル、アクリル酸ｎ－ヘキシル、及びアクリル酸イソオクチルからなる群から選ばれる１種以上がより好ましく、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ－プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ｓｅｃ－ブチル、アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル、及びアクリル酸ｎ－ヘキシルからなる群から選ばれる１種以上が更に好ましく、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ－プロピル、アクリル酸イソプロピル、及びアクリル酸ｎ－ブチルからなる群から選ばれる１種以上がより更に好ましく、アクリル酸ｎ－ブチルがより更に好ましい。

＜１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つ疎水化糖鎖ポリペプチド＞
　本発明の実施形態においては、ポリマー粒子に固定化される疎水化糖鎖ポリペプチドとして、１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つ疎水化糖鎖ポリペプチドが用いられる。この疎水化糖鎖ポリペプチドは、下記（１）式又は下記（２）式で表されるアミノ酸残基を持つポリペプチドを主鎖とし、前記主鎖にアミド結合を介して単糖又はオリゴ糖の構造を含有する配糖体を結合してなる側鎖、及び前記主鎖にアミド結合を介して疎水基を結合してなる側鎖、をそれぞれ複数で有するものである。

　上記（１）式で表されるアミノ酸残基は、アミノ酸の一種であるグルタミン酸からなるポリペプチドを構成するγグルタミン酸残基である。γグルタミン酸残基を主鎖に有するポリγグルタミン酸（γ―ＰＧＡ）は納豆菌等を培養することにより得られるバイオポリマーである。ポリγグルタミン酸（γ―ＰＧＡ）は、バイオポリマーを利用するだけでなく、人工合成によって得ることができる。また、上記（２）式で表されるアミノ酸残基は、アスパラギン酸からなるポリペプチドを構成するアスパラギン酸残基である。アスパラギン酸残基を主鎖に有するポリアスパラギン酸は、自然界には存在しないため人工合成によって得られる。

　１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つ疎水化糖鎖ポリペプチドとしては、合成の容易性、原料の入手性及び経済性の観点から下記（３）式で表されるポリペプチドを用いることが好ましい。

　ここで、Ｒ_１は水素、アルキル基又は一価の陽イオン金属で、Ｒ_２は単糖配糖体又はオリゴ糖配糖体で、Ｒ_３が疎水基であり、ａは０又は１以上の整数で、ｂ及びｃはそれぞれ独立に２以上の整数である。

　上記（３）式に表されるように、ポリグルタミン酸残基を主鎖に有するポリペプチドは、バイオポリマーでもあるポリγグルタミン酸を原料として用いて公知の方法に従って合成できるため、ポリγグルタミン酸の入手の容易さ及びコスト低減の観点から、本発明において好適である。

　また、ポリγグルタミン酸を原料として用いる場合、上記Ｒ_１は水素、アルキル基又は一価の陽イオン金属で、それぞれ－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＸ（ここで、Ｘはアルキル基である。）又は－ＣＯＯ^－Ｍ^＋（ここで、Ｍは一価の陽イオン金属である。）で表される置換基である。本発明においてポリγグルタミン酸を原料として用いる場合は、上記式（３）で表されるポリペプチドの合成を水溶媒中で容易に行うため、ポリγグルタミン酸の水溶性化合物として市販されているポリγグルタミン酸ソーダ又はポリγグルタミン酸カリウムが容易に入手できることから、上記Ｒ_１は、前記－ＣＯＯ^－Ｎａ^＋、又は－ＣＯＯ^－Ｋ^＋を形成するナトリウム又はカリウムの陽イオン金属であることが好ましい。

　上記（３）式で表されるポリペプチドにおいて、疎水化糖鎖ポリペプチドの合成の容易性、ソープフリー乳化重合時における水系溶媒中での分散性、ポリマー粒子の固定性、及びポリマー粒子表面上に配列される糖鎖の高密度化の観点から、上記式（３）中のｂ及びｃは、独立に５００～３０００であることが好ましく、さらに、１０００～２５００がより好ましい。また、上記（３）式で表されるポリペプチド中において、前記ａ、ｂ及びｃは、（ａ＋ｂ＋ｃ）に対して、それぞれ０．０５～０．９、０．０５～０．５及び０．０５～０．６の比率で含まれることが好ましい。それによりポリペプチドの合成を一般的に採用される条件で容易に行うことができる。前記ａ、ｂ及びｃが前記の範囲から外れた比率で含まれるポリペプチドを合成する場合は、脱水縮合反応をさらに進める必要があるため、反応形態や反応条件等を最適化することが困難である。また、ポリペプチド中に含まれる糖鎖配糖体及び疎水基の含有比率に大きな偏りが生まれるため、本願発明の効果が十分に得られない。

　上記（３）式で表されるポリペプチドにおいて、Ｒ_２は単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する配糖体であり、さらに、特異吸着性の向上の観点から、前記Ｒ_２が下記（４）式又は下記（５）式で表される配糖体であることが好ましい。

　ここで、Ｙ_１及びＹ_２は、それぞれ独立にスペーサー基として３～１５のメチレン基が共有結合した構造を有する有機基、すなわち、鎖長が－（ＣＨ_２）_３－から－（ＣＨ_２）_１５－までのいずれかの基であり、ｍ及びｎは、それぞれ独立に０～２の整数であり、Ｚは単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を有する糖鎖である。

　単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する糖鎖としては、例えば、下記表１～表４に記載される糖鎖構造（Ｚ－）を有するものが挙げられる。下記表１～表４に挙げた糖鎖構造例は、本発明者等によって既に合成された化合物である（例えば、Bioorganic & Medical Chemistry, 15, 1383-1393 (2007)、Bioconjugate Chemistry, vol. 20, No. 3, 538-549 (2009)、Bioorganic & Medical Chemistry, 18, 621-629 (2007)、Journal of Applied Glycoscience, 61, 1-7 (2014)、Journal of Biotechnology, 209,50-57(2015)、Bioscience Biotechnology and Biochemistry 81, 1520-1528 (2017)を参照）。

　なお、上記表１～表４に示す糖鎖の中で、Ｎｏ．５、６、２７、２８及び２９の５種類については、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の受容体となる可能性がある糖鎖である。したがって、それらの糖鎖が含まれる本発明の糖鎖固定化ポリマー粒子は、新型コロナウイルスのバイオセンサーとして適用できることが期待される。また、Ｎｏ．５と６、１５、及び１９は、それぞれＪＣウイルス、デングウイルス、及びパラインフルエンザに対して特異吸着性を示すことが知られている。また、Ｎｏ．３と５、７、９、１１、１３、１９及び２７は、それぞれトリ型インフルエンザウイルスに対して、Ｎｏ．４と６、８、１０、１２、１４、２０及び２７は、それぞれヒト型インフルエンザウイルスに対して、Ｎｏ．２２及び２４は、それぞれウマ型インフルエンザウイルスに対して特異吸着性を示すことが知られている。

　上記（３）式で表されるポリペプチドはポリマー粒子に固定化されるとき、糖鎖を前記ポリマー粒子の表面から離れた高い位置に配列することにより、タンパク質やウイルスへの感受性を高め、それらに対する特異吸着性を向上させることができる。そのとき、上記（４）式又は上記（５）式で表される糖鎖配糖体は、Ｙ_１及びＹ_２の有機基が糖鎖の配列位置を高めるためのスペーサー基として機能する。この機能は、結合するメチレン基の数が３～１５において最も効果的に発現し、ポリマー粒子の表面上における糖鎖の高密度配列と合わせて、タンパク質やウイルスに対する特異吸着性を大幅に向上することができる。Ｙ_１及びＹ_２に含まれるメチレン基の数が２以下ではこの効果が得られず、また、１５を超えると疎水化糖鎖ポリペプチドの合成や取扱いが難しくなる。スペーサー基を長くしたい場合には、上記（４）式又は上記（５）式に示すｍ又はｎの数を１又は２に設定してもよい。しかしながら、前記ｍ又はｎが３以上でスペーサー基を長くし過ぎると、逆に、前記ポリマー粒子の表面から離れた高い位置に存在する糖鎖の運動性が増大し、自由に動けるようになるため、前記ポリマー粒子への糖鎖固定化によって特異吸着性を向上させるという技術的意義が無くなる。そのため、本発明においては、前記ｍ又はｎは０又は１が好ましい。なお、Ｙ_１及びＹ_２に含まれるメチレン基は、少なくともどちらかの水素がメチル基又はエチル基などの鎖長の短いアルキル基で置換されたものを本発明の実施形態において使用してもよい。

　一方、前記特許文献２には、主鎖がメチレン基の２個と結合した疎水基を介してポリペプチド主鎖をアミド結合する開示される糖鎖高分子が開示されている。しかしながら、鎖長が短い疎水基（－ＣＨ_２ＣＨ_２－）はスペーサー基として機能するには不十分であり、本願発明と同じ効果を得ることが困難であった。それに対して、本発明はスペーサー基の長さを最適化した糖鎖配糖体の合成方法を採用することにより、この技術課題を解決することができる。

　上記（３）式で表される疎水化糖鎖ポリペプチドの前駆体の例として、Ｒ_２が上記（４）式で表される配糖体の製造例を図４に模式的に示す（例えば、Bioconjugate Chem, Vol. 20, No.3, pp538-549を参照）。図４に示すように、Ｚ－ＯＨで表される糖鎖化合物（I）と、トリフルオロアセトアミドが末端に結合した長鎖アルコール（ＩＩ）との酵素的縮合反応によって化合物（ＩＩＩ）が合成される。図４には、化合物（ＩＩ）の例として、トリフルオロアセトアミドペンタノールを示しているが、本発明においてはこの化合物に限定されない。加水分解反応は、触媒としてセルラーゼ from Trichoderma reesei 等の加水分解酵素が使用される。化合物（ＩＩＩ）よりも長鎖の糖鎖配糖体を合成する場合は、化合物（ＩＩＩ）と、アルカリ溶液中でトリフルオロアセトアミドが末端に結合した長鎖カルボン酸との脱水縮合による脱アシル化反応とを行い、化合物（ＩＶ）が合成される。ここで、脱水縮合反応には、カルボジイミド系等の脱水縮合剤が使用される。さらに、同様の脱アシル化反応を繰り返すことにより長鎖の化合物（Ｖ）が合成される。化合物（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）は、上記式（４）において、それぞれｍ＝０、１及び２に相当する化合物である。

　本発明の実施形態においては、Ｚ－ＯＨで表される糖鎖化合物は、糖鎖（Ｚ－）として単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有するが、前記糖鎖化合物の合成は図５に示す合成方法に従って行ってもよい。図５は、低分子の糖鎖から、より鎖長の長い高分子量のオリゴ糖鎖を合成するときの合成例を示す図である。図５に示すように、図４に示す化合物（ＩＶ）の例として、Ｚ_１－が表１に示すＮｏ．１又はＮｏ．２の化学構造を有する２糖グリコシド［化合物（ＶＩ）］を用いて、Ｚ₁－ＯＨの付加反応によって４糖グリコシド［化合物（ＶＩＩ）］、さらに付加反応を進めて６糖グリコシド［化合物（ＶＩＩ）］がそれぞれ合成される。詳細は、前記の文献（Bioconjugate Chem, Vol. 20, No.3, pp. 539-549）に開示されているが、Ｚ₁－ＯＨとして２糖グリコシドに代えて、１糖グリコシドを使用することにより、奇数の糖を有する任意のグリコシドを選択して合成してもよい。

　また、疎水化糖鎖ポリペプチドの前駆体としてＲ_２が上記（５）式で表される配糖体の合成方法（不図示）は、例えば、Ｚ－ＮＨ_２で表される糖鎖化合物と、トリフルオロアセトアミドが末端に結合した長鎖カルボン酸との脱水縮合反応によって合成される。脱水縮合反応の触媒としては、カルボジイミド系等の脱水縮合剤が使用される。このようにして合成された化合物は、図４の中段以降に示す脱水縮合反応と基本的に同じ方法に従って、アルカリ溶液中でトリフルオロアセトアミドが末端に結合した長鎖カルボン酸との脱水縮合による脱アシル化反応とを行い、さらに、同様の脱アシル化反応を繰り返すことにより、Ｒ_２が上記（５）式で表される配糖体である疎水化糖鎖ポリペプチドの前駆体として、ｎ＝１又は２である長鎖の化合物が合成される。ここで、上記（５）式に示すｎは、上記（４）式で示すｍと同じように０～２の整数である。また、Ｚ－ＮＨ_２で表される化合物に含まれるＺ－の糖鎖構造も、基本的に上記表１～表４に示すものと同じものである。

　上記式（３）で表されるポリペプチドのＲ_３は、前記Ｒ_３が炭素数３～１５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であれば、ポリマー粒子の異なる複数位置の内部で疎水相互作用が十分に得られ、非共有結合的に糖鎖の固定化を強固に行うことができる。前記アルキル基の炭素数が２以下ではポリマー粒子に対する疎水相互作用が期待できず、また、炭素数が１５を超えると、ポリペプチド主鎖がポリマー粒子の表面から高い位置に浮き上がる状態で固定化されるため、固定化の強度が大幅に減少する。本発明の実施形態においては、炭素数３～１５のアルキル基として直鎖状及び分岐鎖状のどちらも使用できるが、ポリマー粒子の内部への浸透性の点から、置換基による立体障害を考慮しないでもよい直鎖状のアルキル基が好ましい。

＜蛍光色素を内包するポリマー粒子＞
　本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は蛍光色素を内包してもよい。前記糖鎖固定化ポリマー粒子をタンパク質やウイルス等のバイオセンサー、又はタンパク質やウイルス等の分離及び精製の手段として用いるとき、それらの機能及び作用の低下を抑制又は防止するために、前記蛍光色素が前記糖鎖固定化ポリマー粒子から外部へ移動して脱離しないように前記ポリマー粒子に固定させる必要がある。そのため、本発明の実施形態においては、前記蛍光色素と前記糖鎖固定化ポリマー粒子との疎水相互作用又は静電相互作用によって非共有結合的に前記ポリマー粒子への固定化を図る。

　前記蛍光色素は、前記糖鎖固定化ポリマー粒子への固定化を図るため、重合反応中に重合性モノマーと共有結合するような官能基、例えば二重結合等の官能基を有していてもよい。しかしながら、前記重合性モノマーとの共有結合の形成は前記蛍光色素の移動を束縛する要因の一つになることがある。そこで、前記糖鎖固定化ポリマー粒子内部への移動を促進させ、浸透をより深く行わせるためには、前記重合性モノマーとの反応によって共有結合の形成を行う蛍光色素よりも、前記重合性モノマーと親和性が高く、前記糖鎖固定化ポリマー粒子との疎水相互作用又は静電相互作用によって非共有結合的に固定することができる構造を有する有機蛍光色素を用いるのが好適である。本発明の実施形態で使用する有機蛍光色素としては、例えば、クマリン６［３－（２－ベンゾチアゾリル）－７－（ジエチルアミノ）クマリン］、クマリン７［３－（２－ベンズイミダゾリル）－７－（ジエチルアミノ）クマリン］等のクマリン系色素やローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３等のローダミン系色素が挙げられる。クマリン系の蛍光色素は、水との溶解性が低く、エタノール等のアルコールやメタクリル酸メチル等の重合性モノマーには溶解性が高い。そのため、クマリン系の蛍光色素を重合槽へ添加する際には、蛍光色素を分散させた水溶液、蛍光色素を溶解したアルコールと水との混合溶液、及びアルコール溶液のいずれかの形態で、又は重合性モノマーに溶解させて使用する。また、ローダミン系色素の場合は、水溶液として、又は親和性の高い重合性モノマーに溶解させて使用する。

　蛍光色素を内包する糖鎖固定化ポリマー粒子は、前記蛍光色素を蛍光プローブ又は蛍光ラベルとして利用できるため、水溶液中又は生体組織中における糖鎖固定化ポリマー粒子の分散状態及び存在位置等を蛍光スペクトルによって検知できるだけでなく、特異吸着する前後の糖鎖固定化ポリマー粒子の挙動を把握することができる。さらに、糖鎖固定化ポリマー粒子に特異吸着したタンパク質やウイルスの挙動や特異吸着機構等の解明及び解析にも役立てることができる。

＜疎水化糖鎖ポリペプチドの合成方法＞
　本発明の実施形態による疎水化糖鎖ポリペプチドの合成方法について図６を用いて説明する。図６に示すように、糖鎖配糖体の例として図４に示す化合物（ＩＶ）又は（Ｖ）を用いて、アルカリ溶液中で化合物（ＩＸ）を合成した後、ポリグルタミン酸又はその誘導体［化合物（Ｘ）］との脱水縮合反応を行うことにより、アミド結合を介して上記式（４）で表される置換基が化合物（Ｘ）の側鎖に導入された化合物（ＸＩ）が合成される（ステップ１）。引き続き、化合物（Ｘ）を、炭素数３～１５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を有するアルキルアミンと脱水縮合反応を行うことにより、アミド結合を介して上記式（３）で表される置換基Ｒ_３が化合物（Ｘ）の側鎖に導入された疎水化糖鎖ポリペプチド［化合物（ＸＩＩ）］が合成される（ステップ２）。図６には、前記アルキルアミンの例として、１）１－アミノデカンを例示している。図６に示すように、脱水縮合反応は一般的に脱水縮合剤を添加して行われるが、脱水縮合剤としては、例えば、ホスホニウム系縮合剤が使用され、必要に応じて添加剤として活性エステル等が併用される。本発明の実施形態において、化合物（ＩＶ）と（Ｖ）、及び前記アルキルアミンとしては、図６に示す例に限定されず、本発明で特定される範囲に含まれる各化合物の群から選択して使用される。また、上記（５）式で表される置換基Ｒ_２を有する疎水化糖鎖ポリペプチドの場合にも基本的に同じような操作に従って合成が行われる。図６の最下段には、上記（５）式で表される置換基Ｒ_２を有する疎水化糖鎖ポリペプチドの例（ＸＩＩＩ）を合わせて示している。

　図６に示す化合物（ＸＩＩ）又は化合物（ＸＩＩＩ）には、上記式（３）に示されるａ、ｂ及びｃの繰り返し数が記載されていないが、前記ステップ１及び２における脱水縮合反応の条件（温度、時間）を調整することにより、ａを１以上の整数とするとともに、ｂ及びｃをそれぞれ独立に２以上、さらに好ましくは５００～３０００に調製した疎水化ポリペプチドが合成される。同様に、前記ａ、ｂ及びｃが、（ａ＋ｂ＋ｃ）に対して、それぞれ０．０５～０．９、０．０５～０．５及び０．０５～０．６の比率で含まれように脱水縮合反応の調整を行う。

＜糖鎖吸着性能の向上＞
　本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は、疎水化糖鎖ポリペプチドが吸着されていない表面にタンパク質やウイルスが非特異的に吸着する場合がある。その状態を防止し、糖鎖による吸着性能の向上を図るため、疎水化糖鎖ポリペプチドが表面吸着されていない表面のブロッキングを行ってもよい。その方法として、糖鎖固定化ポリマー粒子の表面に親水性のポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体を表面吸着させてもよい。図７に、親水性のポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体の添加による糖鎖吸着性の向上の効果を模式的に示す。

　図７の（ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施形態で得られる糖鎖固定化ポリマー粒子１、及び前記非特許文献１に記載された従来の糖鎖固定化ポリマー粒子６において、ポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体の親水性ポリマー１６が表面吸着された状態の模式断面図をそれぞれ示す図である。図７（ａ）に示す糖鎖固定化ポリマー粒子１は、上記Ｙ_１及びＹ_２の有機基が糖鎖の配列位置を高めるためのスペーサー基として機能するため、疎水化糖鎖ポリペプチド４の糖鎖部位がポリマー粒子の表面から離れた位置に保持される。その疎水化糖鎖ポリペプチド４が表面吸着されていない箇所に、親水性ポリマー１６が表面吸着されることにより、その箇所においてタンパク質又はウイルスの非特異的な吸着がブロッキングされる。

　それに対して、図７（ｂ）に示す従来の糖鎖固定化ポリマー粒子６は、従来技術による疎水化糖鎖ポリペプチド９の糖鎖部位がポリマー粒子１０の表面上に保持されるため、前記糖鎖部位７が親水性ポリマー１６に埋もれた形態を有する。その場合は、タンパク質又はウイルスの非特異的な吸着をブロッキングする効果が薄れ、ポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体等の親水性ポリマー１６を表面吸着させても、糖鎖吸着性能の向上を図ることができない。

　親水性のポリアルキレングリコールとしては、例えば、重量平均分子量３０，０００未満、好ましくは１０，０００未満のポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングルコール等が挙げられる。また、親水性のポリアルキレングリコール系誘導体としては、重量平均分子量３０，０００未満、好ましくは１０，０００未満のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンヘキシルグリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブチルエーテル等のエーテル類が挙げられる。本発明の実施形態においては、糖鎖固定化ポリマー粒子の表面への吸着のしやすさ及び材料入手の容易さの点から、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングルコールが好適である。

＜糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法＞
　本発明の実施形態による糖鎖固体化ポリマー粒子は、基本的にソープフリー乳化重合法によって製造されるが、特に、図３（ａ）に示すように、重合反応の途中で、１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つポリペプチドを添加することに特徴を有する。以下、「１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つポリペプチド」は、上記と同じように「疎水化糖鎖ポリペプチド」と略す。

　ソープフリー乳化重合法による一般的なポリマー形成機構は、以下の通りである。重合性モノマー分子の大部分は水系溶媒中にモノマー油滴として存在するが、ごく少量のモノマー分子が水系溶媒中に溶解している。あらかじめ添加された水溶性のラジカル重合開始剤と水系溶媒中に溶解している重合性モノマー分子によって重合が開始し、水系溶媒中に溶解できなくなったポリマーが粒子核として析出する。その後、モノマー油滴から供給されるモノマーあるいはオリゴマーラジカルを取り込みながら重合が進行する。前記水系溶媒としては、主に水を使用するが、エタノールやプロパノール等の低級アルコール等の水混和性溶媒を溶媒全体の３０質量％以下で使用してもよい。重合を開始してから重合初期～中期の段階では形成過程のポリマー粒子中には未反応の重合性モノマーが含まれるため膨潤した形態で重合が進行する。モノマー油滴が消滅した後は、ポリマー粒子中に含まれる重合性モノマーの重合が進行し、最終的に、ある所望の一定の粒径を有した球状のポリマー粒子が形成される。なお、水溶性のラジカル重合開始剤は、最初に添加するだけでなく、重合を進めるため、必要に応じて重合反応の途中で添加してもよい。

　ソープフリー乳化重合法は、界面活性剤を使用しないでクリーンな粒子表面を持つ粒子を合成するときに一般的に使用されるが、本発明では、上記で述べたように、重合途中で疎水化糖鎖ポリペプチドを添加する点で、従来のソープフリー乳化重合法とは重合プロセスが異なる。すなわち、本発明で採用するソープフリー乳化重合法は、図３（ａ）に示すように、重合性モノマーを分散した水系溶媒を有する重合槽内に水溶性重合開始剤を添加して重合を開始する工程と、重合反応の途中で、疎水化糖鎖ポリペプチドを添加し、該疎水化糖鎖ポリペプチドを前記重合槽内に共存させた状態で前記重合反応を継続する工程と、を有する。ここで、疎水化糖鎖ポリペプチドの添加量は、水系溶媒中に含まれる重合性モノマーの量に応じて調整され、生成ポリマー粒子の表面を十分覆える程度の濃度とすることが好ましい。

　本発明において規定される「重合の途中」とは、少なくとも、前記重合槽内で前記重合性モノマーの重合が開始し、ポリマー粒子の核形成に続き、ポリマー粒子の安定的な成長がみられるときから、前記重合性モノマーが消失する前までのときを意味する。

　本発明では、前記の「ポリマー粒子の安定的な成長がみられるときから、重合性モノマーが消失する前まで」を具体的に特定する物理量として、重合性モノマーの重合反応による転化率（以降、モノマー転化率と略す。）を用いて、その転化率の範囲を規定してもよい。「ポリマー粒子の安定的な成長がみられるときから、重合性モノマーが消失する前まで」とは、モノマー転化率が０質量％を超え９５質量％以下であるときの状態を包括的に意味する。すなわち、モノマー転化率が０質量％のときは疎水化糖鎖ポリペプチドの添加が重合開始前に行われる場合に相当する。他方、モノマー転化率が９５質量％を超えるときは、合成終了後の疎水性のポリマー粒子の表面上に疎水化糖鎖ポリペプチドを添加し、疎水基の埋込がなされていない状態で物理吸着させる場合に相当する。モノマーの消失は、理想的には転化率が１００質量％のときだが、現実的には９５質量％程度になることが知られており、この値を超える場合は疎水性のポリマー粒子の形成がほぼ終了した状態を意味する。前述したように、前者の場合はポリマー粒子の凝集がみられ、後者の場合では疎水化糖鎖ポリペプチドの固定化強度の向上が図れなかった。このように、モノマー転化率が０質量％の場合及び９５質量％を超える場合は本発明の目的を達成することができなかった。したがって、ソープフリー乳化重合プロセスにおいて、本願発明の効果を奏するために疎水化糖鎖ポリペプチドを添加する時期は、モノマー転化率が少なくとも０質量％を超え９５質量％以下の範囲である。

　本発明者等による実験検証によれば、例えば、重合性モノマーとしてスチレンを用いる場合、モノマーの転化率が重合開始のときに対して数質量％程度でポリマー粒子核が形成し始め、さらに、その転化率が４０質量％程度でモノマー油滴の消失が確認された。モノマー油滴が消失する場合はポリマー粒子の粘度が高くなり、疎水化糖鎖ポリペプチドが有する疎水基（上記Ｒ_３の置換基に含まれる疎水基）が埋込まれにくくなると考えられるため、モノマー油滴消失前が望ましい。

　上記モノマーの転化率は、重合の開始から終了までの間の途中で重合を所定の時間で停止し、重合槽の水系溶媒中に含まれるモノマーの含有量を重量又は赤外吸収等の分光手段で求めることができる。ポリマー粒子核の存在及びポリマー粒子の凝集は、水系溶媒中に含まれるポリマー粒子の形成状態、及び必要に応じてポリマー粒子径等を、光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡又は走査型電子顕微鏡を用いて観察及び計測することによって確認することができる。また、各重合反応時間で測定される重合性モノマーの転化率は、重合開始後から各重合反応時間までに成長するポリマー粒子の平均粒径との間で相関関係があるため、重合開始から各経過した時間においてポリマー粒子の平均粒径を求め、重合終了後に得られるポリマー粒子の平均粒径との対比を行うことにより、各重合反応時間における重合性モノマーの転化率を推定してもよい。

　これらの実験検証に基づいて、ポリマー粒子の凝集防止及び疎水化糖鎖ポリペプチドの固定化強度の点から、本発明においては、重合槽内に含まれる重合性モノマーの転化率が重合開始のときに対して、前記０質量％を超え９５質量％以下となるときの重合反応時間で疎水化糖鎖ポリペプチドの添加を行う。前記０質量％を超え、９５質量％以下モノマー転化率の範囲内で実用的に疎水化糖鎖ポリペプチドの添加を行う重合反応時間としては、重合槽内に含まれる重合性モノマーの転化率が重合開始のときに対して３～５０質量％となるときが好ましい。さらに、疎水化糖鎖ポリペプチドの添加は、重合性モノマーの転化率が１０～４０質量％となるときの重合反応時間で行うのが好ましい。重合性モノマーの転化率が３質量％未満では水系溶媒中で分散安定なポリマー粒子が形成されていないため、重合反応終了後に得られる糖鎖固定化ポリマー粒子には凝集がみられる。重合性モノマーの転化率が１０質量％以上であれば、ポリマー粒子の核形成に続き、ポリマー粒子の安定的な成長が確実にみられる。ここで、ポリマー粒子の安定的な成長とは、上述したように、水系溶媒中に含まれるポリマー粒子がその粒子径をほぼ均一に揃った形で成長することを意味する。また、重合性モノマーの転化率が５０％を超えると、ポリマー粒子の表面上に存在する疎水化糖鎖ポリペプチドによって粒子の凝集が促進される場合がある。重合性モノマーの転化率が４０質量％以下であれば、疎水化糖鎖ポリペプチドの疎水基のポリマー粒子内への埋込を確実に行うだけでなく、ポリマー粒子形成後において粒子凝集の進行を抑制することができる。

　「重合槽内に含まれる重合性モノマーの転化率が重合開始のときに対して３～５０質量％となるときの重合反応時間」は、使用する重合性モノマー及び重合条件によってやや異なるが、重合開始から１５分を超え、２時間未満であるときに、重合性モノマーの転化率が３～５０質量％になる重合反応時間に相当することが分かった。また、ポリマー粒子の核形成に続き、粒子の安定的な成長を図るためには、重合開始から３０分を超える時間で疎水化糖鎖ポリペプチドの添加を行うことが好ましい。このように、本発明の製造方法において、疎水化糖鎖ポリペプチドの添加は３０分を超え、２時間未満の重合時間のときに行うのが好適である。

　図３（ａ）に示す製造法で使用される重合性モノマー及び疎水化糖鎖ポリペプチドは、上記で説明したものと同じ疎水性モノマー及び「１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つポリペプチド」がそれぞれ用いられる。

　本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマーの製造方法は、糖鎖吸着性能の向上の観点から、疎水化糖鎖ポリペプチド４が表面吸着されていない表面のブロッキングを行うため、糖鎖固定化ポリマー粒子１の重合反応の途中又は重合反応を終了した後、ポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体等の親水性ポリマー１６を糖鎖固定化ポリマー粒子１の表面に吸着させる工程を有してもよい。これらのポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体としては、例えば、上記［糖鎖吸着性能の向上］の項目で挙げたものと同じ化合物が使用される。本発明においては、親水性ポリマー１６の添加は、重合反応の途中及び重合反応を終了した後のどちらで行ってもよく、糖鎖固定化ポリマー粒子１の合成反応の制御と管理の容易性及び糖鎖吸着性能等の点を考慮して選択される。

　親水性ポリマー１６の吸着工程は、糖鎖固定化ポリマー粒子１の重合反応の途中または重合反応を終了した後、次の２通りのいずれかで行われる。一つは、図３（ａ）において糖鎖固定化ポリマー粒子１が含まれる重合槽１１に、親水性ポリマー１６を添加する工程である。もう一つは、水系媒体が含まれる重合槽１１とは別に準備する反応槽に前記糖鎖固定化ポリマー粒子を移動させた後、糖鎖固定化ポリマー粒子１が含まれる前記反応槽に親水性ポリマー１６を添加する工程である。本発明においては、前者の工程で行うことにより、後者の工程に比べて、前記親水性ポリマーの添加工程の省力化と簡略化を図ることができる。

＜蛍光色素を内包する糖鎖固定化ポリマーの製造方法＞
　蛍光色素を内包する糖鎖固定化ポリマーの製造方法を以下に説明する。
　本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマーの合成においては重合反応の進行に伴って、まず、ポリマーの粒子核が形成され、その後、ポリマー粒子の成長ととともに未反応の重合性モノマーによって膨潤したポリマー粒子が形成され、最終的に重合がほぼ完結した時点で所望の粒径を有する球状のポリマー粒子が得られる。重合槽内に添加された蛍光色素は膨潤したポリマー粒子の内部へ移動及び浸透し、前記膨潤したポリマー粒子中に取り込まれる。前記重合性モノマーの重合がほぼ完結した後、前記蛍光色素は糖鎖固定化ポリマー粒子との疎水相互作用又は静電相互作用により非共有結合的に前記糖鎖固定化ポリマー粒子に固定される。この形態を得るためには、少なくとも前記糖鎖固定化ポリマー粒子の合成時の重合反応において未反応の重合性モノマーが重合反応槽に残存している間に前記蛍光色素を添加する必要がある。そのため、前記蛍光色素の重合反応槽への添加を、重合を開始する前、又は前記重合性モノマーの重合を開始してから重合反応の途中までの間に行う。重合を開始する前に色素を添加する場合、予め重合性モノマーに前記蛍光色素を溶解して、前記重合性モノマーと共に重合反応槽に添加してもよい。このように本発明の実施形態においては、重合を開始する前に、前記重合性モノマーの共存又は非共存の状態で前記蛍光色素を前記重合槽内に添加するか、又は重合を開始してから重合反応の途中のいずれかの重合反応時間において、前記疎水化糖鎖ポリペプチドの共存若しくは非共存の状態で前記蛍光色素を前記重合槽内に添加する。

　ここで、「前記重合性モノマーの共存又は非共存の状態」とは、前記重合性モノマーと共に、又は前記重合性モノマーが添加される前と後のどちらの時点においても、重合層内に前記蛍光色素を添加してよいことを意味する。同様に、「前記疎水化糖鎖ポリペプチドの共存若しくは非共存の状態」とは、前記疎水化糖鎖ポリペプチドが添加される前と後のどちらの時点においても重合槽内に前記蛍光色素を添加してよいことを意味する。すなわち、蛍光色素の添加は、重合槽内において前記重合性モノマー又は前記疎水化糖鎖ポリペプチドの有無に関わらず行うことができる。

　重合性モノマーの重合反応において、重合性モノマーの消失がほぼ完全にみられるときの前記重合モノマーの重合反応による転化率は、上述したように、９５質量％程度である。そのため、本発明で規定する前記重合反応の途中とは、前記重合性モノマーの転化率が９５質量％以下であるときのいずれかの重合反応時間を意味する。さらに、蛍光色素の移動及び浸透は、重合槽内に重合性モノマーだけが存在する状態、又は前記糖鎖固定化ポリマー粒子が重合性モノマーで膨潤した状態において格段に促進される。そのような状態は、重合槽内の水溶液中に重合性モノマー油滴が分散状態で存在するときに得られる。上記の＜疎水化糖鎖ポリペプチドの合成方法＞の項目で述べたように、重合性モノマーの油滴が確認されるのは、重合性モノマーの重合反応による転化率が、重合開始のときに対して５０質量％以下である。さらに転化率が４０質量％以下であれば、重合性モノマー油滴の存在が確実に確認される。したがって、蛍光色素の添加は、重合性モノマーの重合反応による転化率が９５質量％以下であるときの重合反応時間までに行うのが実用的であり、前記転化率が５０質量％以下、さらに４０質量％以下となるであるときの重合反応時間までに行うことが望ましい。

　以上のように、蛍光色素を重合反応槽への添加する時機を調整することにより、糖鎖固定化ポリマー粒子に対して蛍光色素の固定を図ることができるが、糖鎖固定化ポリマー粒子の製造において蛍光色素以外の他成分の添加方法及び重合条件等は変更する必要が無く、上記の＜糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法＞の項目で説明した製造方法に基本的に従って行う。

　糖鎖固定化ポリマー粒子に蛍光色素が確実に固定されたか否かの評価は、例えば、クマリンなどの疎水性の蛍光色素を用いた場合、次のようにして行う。すなわち、重合反応が終了した後に得られる糖鎖固定化ポリマー粒子を重合槽から取り出した後、エタノールに所定時間（例えば１０分間）浸漬し、前記糖鎖固定化ポリマー粒子の内部には固定されずに表面に付着又は吸着した蛍光色素だけをエタノールに溶解させる。エタノールは前記蛍光色素を溶解する一方で、前記糖鎖固定化ポリマー粒子を溶解しない溶媒である。ここで使用する浸漬用溶媒としては、前記糖鎖固定化ポリマー粒子を溶解しないが、前記蛍光色素に対してはエタノールと同等か、それ以上の溶解性を有するものであればエタノールに限定されない。その後、エタノールから前記糖鎖固定化ポリマー粒子を取り除き、前記ポリマー粒子を除去した後のエタノールについて蛍光スペクトルを測定する。例えば、蛍光色素がクマリン７の場合は５００～５１０ｎｍの波長域に蛍光スペクトル強度のピークを観測することができる。蛍光分光法による測定の結果、仮に、前記糖鎖固定化ポリマー粒子中に固定されずにエタノール中に抽出される蛍光色素の量が多い場合は、蛍光スペクトルにおいて蛍光色素に特有の波長で大きなピーク強度が観測される。

　以上の操作を、蛍光色素の添加時期を変えたときにそれぞれ製造される糖鎖固定化ポリマー粒子について行い、前記糖鎖固定化ポリマー粒子の浸漬処理及び除去を行った後の各エタノールについて蛍光スペクトルを測定する。事前検討の結果、重合を開始する前、及び重合を開始した直後に蛍光色素を添加する場合（Ａの場合）、重合を完結して得られる糖鎖固定化ポリマー粒子を除去した後のエタノールの蛍光スペクトルは、蛍光色素特有の波長で観測されるピーク強度が非常に小さかった。また、重合開始後の短い時間で蛍光色素を添加する場合（Ｂの場合）も、蛍光スペクトルにおいてＡの場合とほぼ同じ小さなピーク強度が観測された。それらに対して、重合反応の終点に近い時間で蛍光色素を添加する場合（Ｃの場合）は、Ａ及びＢの場合に比して大きな吸収強度を有する蛍光スペクトルが観測された。このＣの場合は、糖鎖固定化ポリマー粒子の内部に固定されずに表面に付着又は吸着した蛍光色素が多く存在することが確認された。ここで、重合性モノマーの重合反応による転化率を前記Ａ、Ｂ及びＣのそれぞれ場合で調べた。その結果、Ａ及びＢの場合は、前記転化率がそれぞれ０質量％及び約２５質量％程度であった。また、Ｃの場合は、前記転化率が９５質量％をやや超えていた。

　以上の事前検討の結果から、蛍光色素の添加時期は、糖鎖固定化ポリマー粒子を製造するときの重合反応時間、すなわち重合性モノマーの重合反応による転化率によって影響を受けることが分かった。したがって、蛍光色素の添加は、上述したように、前記重合性モノマーの重合反応による転化率が９５質量％以下であるときの重合反応時間までに行うのが実用的であり、前記転化率が５０質量％以下、さらに４０質量％以下である重合反応時間までに行うことが望ましい。それにより、糖鎖固定化ポリマーに対する蛍光色素の固定化を向上させることができる。

　以下、具体的な実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。

－疎水化糖鎖ポリペプチドの合成－
＜実施例１＞
　糖鎖として上記表１のＮｏ．２４に示す構造と、疎水基としてデカニル基（炭素数１０個と有するアルキル基）とを有する疎水化糖鎖ポリペプチドを、図６に示す方法に従って次のようにして合成した。

　まず、図６に示す化合物（ＸＩ）として、上記（４）式においてｍ＝０で、炭素数５個のメチレン基を有するスペーサー基が、ポリγグルタミン酸残基の側鎖にアミド結合された疎水化糖鎖ペプチドに相当する化合物の合成を行った（Bioconjugate Chemistry, vol. 20, No. 3, 538-549 (2009) に記載された合成方法を参照）。この合成においては、図６に示す化合物（Ｘ）として分子量９９０，０００のγポリグルタミン酸ソーダ（明治フードマテリアル（株）製））を用いて、Ｚ－の構造式として上記表１のＮｏ．２４に表される糖鎖を有し、かつ、スペーサー基としてｍ＝０で、炭素数５個のメチレン基を有する化合物（ＩＸ）との間で脱水縮合を行った。脱水縮合剤としては、１Ｈ－ベンゾトリアゾールー１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩（以下、ＢＯＰと略す）を用い、添加剤として１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、ＨＯＢｔと略す）を併用した。

　引き続き、下記（６）式に示す合成方法に従って、化合物（ＸＩ－１）の９．２ｍｇを、０．１モルのカーボネート／ビカーボネート緩衝液（ｐＨ＝１０）の１．６６ｍｌに溶解した後、脱水縮合剤としてＢＯＰの１４２ｍｇ（０．３２ミリモル）と、添加剤としてＨＯＢｔの１１．９ｍｇ（０．０９ミリモル）とを含むジメチルスルファキシド（ＤＭＳＯ）の３．３ｍｌを加え、２５℃で１５分間攪拌した。さらに、１－アミノデカンの１１．７μｌ（０．０６ミリモル）を添加し、同じ条件でさらに２４時間攪拌することにより、疎水基（デカニル基）をアミド結合によってポリγグルタミン酸残基の側鎖に導入した化合物（ＸＩＩ－１）が含まれる混合物を調製した。

　このようにして調製された混合物を、１０ミリモルのりん酸でｐＨ７．４に緩衝された食塩液で前もって平衡状態にされた使い捨ての脱塩用カラムＰｄ－１０上に装填した状態で３日間透析を行った。その後、濃縮して凍結乾燥して、目的とする疎水化糖鎖ポリペプチド［化合物（ＸＩＩ－１）］だけを抽出した。

　上記（６）式に示す化合物（ＸＩ－１）及び（ＸＩＩ－１）は、^１Ｈ又は^１３ＣのＮＭＲ（２チャンネル　５００ＭＨｚ　ブルカー　ＡＶIII）を用いて、下記ＮＭＲスペクトルのピーク解析によって同定を行い、目的の化合物が合成されたことを確認した。
・^１Ｈ－ＮＭＲ (Ｄ_２Ｏ，500.13 MHz at 318 K): δ4.55－4.13 (1H, α-methine, γ-PGA（ポリグルタミン酸）), 4.19 (s, 2H, HOCH₂CONH－″),4.08－3.57 (21H, from sugar, H-α), 3.35－3.05 (H-ε, H-j), 2.85 (dd,1H, J3″ax,3″eq 12.5, J3″eq,4″ 4.5 Hz, H-3″eq), 2.45 (2H, γ-methylene, γ-PGA), 2.38－1.98 (2H, β-methylene, γ-PGA), 2.09 (s, 3H,CH₃CONH－), 1.88 (t, 1H, J3″ax,3″eq 12.5, J3″ax,4″ 12.5 Hz, H－3″ax),1.55－1.00 (22H, H-β, H-γ, H-δ, H-b, H-c, H-d, H-e, H-f, H-g, H-h, Hi),0.90 (3H, H-a).
・^１３Ｃ－ＮＭＲ (Ｄ_２Ｏ，125.13 MHz at 318 K): δ 177－176(carbonyl carbon of amide groups), 175.7 (HOOC″－), 105.5 (C-1′),103.8 (C-1), 102.7 (C-2″), 81.6 (C-4), 78.3 (C-5′), 77.9 (C-3′), 77.5 (C-5), 75.4 (C-6″), 75.2 (C-3), 74.5 (C-8″), 72.9 (C-α), 72.2 (C-2′),71.0 and 70.8 (C-4″, C-7″), 70.2 (C-4′), 65.4 (C-9″), 63.7 (C-6′,HOCH₂CONH''－), 63.0 (C-6), 57.9 (C-2), 56.5 and 53.6 (α-methine,γ-PGA), 54.3 (C-5″), 42.5 (C-3″), 42.1 (C-ε, C-j), 34.5 (C-c), 34.1 (γ-methylene, γ-PGA), 32.3 and 32.0 (C-d, C-e, C-f, C-g, C-i), 31.0 (C-β,C-δ), 30.0 (β-methylene, γ-PGA), 29.7 (C-h), 25.2 (C-γ, C-b,CH₃CONH－), 16.4 (C-a)。

　また、上記（３）式に示す各繰り返しユニット数の全繰り返し数に対する比率（例えば、ａ／（ａ＋ｂ＋ｃ）等）についても、ＮＭＲスペクトルにおいて各ユニットに含まれる特徴的な置換基ピークから求めることができるため、それらの値とポリグルタミン酸ソーダの分子量から各ユニットの繰り返し数であるａ、ｂ及びｃを算出することができる。その結果、本実施例で得られた化合物（ＸＩＩ－１）は、ｐ＝ａ＋ｂ＋ｃ＝６５５７であり、ａ＝２２９５、ｂ＝１３７７、及びｃ＝２８８５であった。

＜実施例２＞
　下記（７）式に示すように、上記（５）式においてｎ＝０で、炭素数５個のメチレン基を有するスペーサー基がポリγグルタミン酸残基の側鎖にアミド結合され、且つ、糖鎖として上記表３のＮｏ．２５に示す構造を有するシアロ糖鎖と、疎水基としてデカニル基（炭素数１０個を有するアルキル基）とを有する疎水化糖鎖ポリペプチド（化合物ＸＩＩＩ－１）を合成した。化合物（ＸＩＩＩ－１）は、前記シアロ糖鎖がスペーサー基であるペンタニル基とアミド結合される点で、上記実施例１の化合物（ＸＩＩ－１）とは構造が異なる。合成は、Ｚ－ＯＨとトリフルオロアセトアミドが末端に結合した長鎖アルコールとの酵素内縮合反応（上記実施例１）に代えて、Ｚ－ＮＨ_２とトリフルオロアセトアミドが末端に結合した長鎖カルボン酸との脱水縮合反応を行った以外は、基本的に上記実施例１の方法に従って行った。本実施例で合成された化合物（ＸＩＩＩ－１）は、ｐ＝ａ＋ｂ＋ｃ＝６６６２で、ａ＝２９５１、ｂ＝１２５２、及びｃ＝２４５８であった。

－糖鎖固定化ポリマー粒子の合成－
＜実施例３＞
　上記実施例２において疎水化糖鎖ポリペプチドとして得られた化合物（ＸＩＩＩ－１）を用い、以下に説明する方法でメチルメタクリレート（ＭＭＡ）の重合体であるポリマー粒子に固定化を行うことにより、糖鎖固定化ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）粒子を合成した。糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子の合成方法の例を図８に示す。

　蓋を有する重合槽１７内に脱イオン水１８を供給し、攪拌しながら窒素ガスによるバブリングを２０分間行い、続いて重合槽１７内の脱イオン水１８の温度を７０℃に加熱した。加熱温度が一定になったことを確認してからＭＭＡモノマー（富士フイルム和光純薬工業（株）製）を重合槽内に加え、２０分攪拌を続けた後、ラジカル重合開始剤として過硫酸カリウム（ＫＰＳ、富士フイルム和光純薬工業（株）製）を溶解した脱イオン水を添加し、重合を開始した。本発明の実施形態においては、ラジカル重合開始剤が重合性モノマーに添加されたときを重合時間の開始点とする。

　重合を開始してから１時間後（図８において実線矢印の先に示す（Ａ）の時点）で、疎水化糖鎖ポリペプチドとして得られた化合物（ＸＩＩＩ－１）を添加した。化合物（ＸＩＩＩ－１）の添加量は、ＭＭＡモノマー重量に対して１０００分の１程度の重量となるように調整した。ここで、重合を開始してから１時間後では、前記脱イオン水に含まれるモノマーの転化率が約２５質量％であった。この転化率は、重合を開始してから１時間後に作製される糖鎖固定化ポリマー粒子の平均粒径と、重合終了後で得られるポリマー粒子の平均粒径とを対比することにより求めた。

　引き続き、重合を２時間続け、計３時間の重合時間で合成を行った。その後、糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子が含まれる懸濁液を脱イオン水で遠心分離する操作を３回行い、その後、２４時間の真空凍結乾燥を行うことによって糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子１９を得た。

　このようにして得られた糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子１９について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察したＳＥＭ写真像を図９に示す。また、図９に示すＳＥＭ写真像から任意に選択した２００個程度の粒子について粒子径を実測し、それらの平均値として求めた粒径及び分散度を求めた。その結果、本実施例の糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子は、平均粒径及び分散度がそれぞれ１７６ｎｍ及び８％であり、粒子間で凝集しておらず、ほぼ均一に揃った粒径を有することが確認された。

＜実施例４＞
　疎水化糖鎖ポリペプチドとして、下記（８）式で表される化合物（ＸＩＩＩ－２）を用いて、上記実施例３と同じ方法で糖鎖固定化ポリマー粒子の合成を行った。本実施例で使用する化合物（ＸＩＩＩ－２）は、上記（５）式においてｎ＝０で、炭素数５個のメチレン基を有するスペーサー基がポリγグルタミン酸残基の側鎖にアミド結合され、且つ、糖鎖として上記表２のＮｏ．１７に示す構造を有するキトビオース糖鎖と、疎水基としてデカニル基（炭素数１０個を有するアルキル基）とを有する疎水化糖鎖ポリペプチドである。本実施例で合成された化合物（ＸＩＩＩ－２）は、ｐ＝ａ＋ｂ＋ｃ＝６４８８であり、ａ＝３１９９、ｂ＝１４５３、及びｃ＝１８３６であった。

　本実施例４によって得られた糖鎖固定化ポリマー粒子は、平均粒径及び分散度がそれぞれ１８８ｎｍ及び１０％であり、粒子間で凝集しておらず、ほぼ均一に揃った粒径を有することが確認された。

＜比較例１＞
　上記実施例４と同じ疎水化糖鎖ペプチド、重合性モノマー及び重合開始剤を用いて、糖鎖固定化ポリマー粒子を製造した。本比較例１においては、疎水化糖鎖ポリペプチドとして化合物（ＸＩＩＩ－２）の添加を、図８において経過時間として点線矢印で示す（Ｂ）の時点で行うことを除いて、上記実施例２と同じ方法と条件でＭＭＡモノマーの重合を行った。ここで、図８に示す（Ｂ）の時点は、ラジカル重合開始剤（ＫＰＳ）を添加する前の「重合開始前」に相当する。

　＜参考例１＞
　上記実施例４と同じ疎水化糖鎖ペプチド、重合性モノマー及び重合開始剤を用いて、糖鎖固定化ポリマー粒子を製造した。本参考例１においては、疎水化糖鎖ポリペプチドとして上記の化合物（ＸＩＩＩ－２）の添加を、図８において経過時間として一点鎖線矢印で示す（Ｃ）の時点で行うことを除いて、上記実施例４と同じ方法と条件でＭＭＡモノマーの重合を行った。ここで、図８に示す（Ｃ）の時点は、重合開始後１５分を経過したときに相当する。図８に示す（Ｃ）の時点におけるモノマーの転化率は、ソープフリー乳化重合を行ったこれまでの実験結果から判断して３質量％未満と推察される。

　＜参考例２＞
　上記実施例４と同じ疎水化糖鎖ペプチド、重合性モノマー及び重合開始剤を用いて、糖鎖固定化ポリマー粒子を製造した。本参考例２においては、疎水化糖鎖ポリペプチドとして化合物（ＸＩＩＩ－２）の添加を、図８において経過時間として二点鎖線矢印で示す（Ｄ）の時点で行うことを除いて、上記実施例４と同じ方法と条件でＭＭＡモノマーの重合を行った。ここで、図８に示す（Ｄ）の時点は、重合開始後２時間を経緯したときに相当する。図８に示す（Ｃ）の時点におけるモノマーの転化率は、実施例３と同様な方法でポリマー粒子の平均粒径を対比することによって求めた結果、５０質量％をやや上回る値であった。

　比較例１及び参考例１～２で得られた糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察したＳＥＭ写真像のそれぞれを図１０に示す。図１０において、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれ比較例１、参考例１及び参考例２に相当する。図１０の（ａ）に示すように、重合開始前の添加においては、糖鎖固定化ポリマー粒子の多くが凝集しており、図３（ｂ）に示す形態を有することが分かる。それに対して、参考例１の重合開始後１５分の添加では粒子凝集が少なくなり、凝集しない単一の糖鎖固定化ポリマー粒子の数が増している。しかしながら、粒子凝集を完全に解消するまでに至っていないことが図１０（ｂ）から分かる。また、図１０（ｃ）に示すように、参考例２の重合開始後２時間の添加では多数のポリマー粒子が凝集した大粒径の塊が形成されるようになる。この場合は、重合槽２０内に含まれる重合性モノマーの転化率が重合開始のときに対して５０質量％を超えるため、モノマーの重合が進行する代わりに、疎水化糖鎖ポリペプチドの添加効果によって、やや大きな粒径を有するポリマー粒子同士の会合が起こったものと考えられる。

　以上のように、本発明の実施形態においてポリマー粒子がＰＭＭＡ粒子である場合は、疎水化糖鎖ポリペプチドの添加を、重合開始後１５分を超え、２時間未満の重合時間のときに行うことが好ましい。また、ポリマー粒子がポリスチレンの粒子である場合も、疎水化糖鎖ポリペプチドの添加時期がＰＭＭＡ粒子からやや変動するものの、重合開始後１５分を超え、２時間未満の重合時間の範囲であれば、粒子間で凝集がみられず、ほぼ均一に揃った粒径を有する糖鎖固定化ポリマー粒子が得られることが確認された。１５分を超え、２時間未満の重合反応時間は、モノマーの重合過程において、ポリマー粒子の核形成に続きポリマー粒子の安定的な成長がみられるときから、前記重合性モノマーの油滴が完全に消失する前までと考えることができる。この範囲は、重合槽内に含まれる重合性モノマーの転化率が重合開始のときに対して３～５０質量％となるときの範囲に相当する。

－タンパク質に対する特異吸着性能の検証方法－
　上記実施例４で得られた糖鎖固定化ポリマー粒子についてタンパク質の特異吸着性を以下のような方法で検討した。

　化合物（ＸＩＩＩ－２）が有するキトビオース糖鎖が特異吸着性を示すタンパク質として、分子量が４３，２００の小麦胚芽レクチン（Wheat germ agglutinin：ＷＧＡ、（株）J-ケミカル）を用いた。上記化合物（ＸＩＩＩ－２）の構造を有する疎水化糖鎖ポリペプチドが固定化されたポリマー粒子０．０１８８ｇを脱イオン水０．２５ｍＬに懸濁した後、該懸濁液と、０．２５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解したＷＧＡ０．２５ｍｇとをマイクロチューブ内で混合し、０℃で３０分間静置した。ここで、前記ＰＢＳとしては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びりん酸二水素カリウムを脱イオン水に溶解して調製したものを使用した。表面にＷＧＡが吸着した前記糖鎖固定化ポリマー粒子は、３０分間遠心分離（条件：４℃、１４０００回転／分）を行って懸濁液から分離した。その後、前記糖鎖固定化ポリマー粒子表面に吸着されなかったＷＧＡを含む上澄み液の吸光度（Ａ２８０）を、超微量分光光度計（Bio medical science社製、Nano-100）を使って測定した。吸光度とＷＧＡの濃度との関係についてあらかじめ作成した検量線を使い、前記糖鎖固定化ポリマー粒子に吸着したＷＧＡの濃度を計算で求めた。

　比較のため、上記化合物（ＸＩＩＩ－２）の構造を有する疎水化糖鎖ポリペプチドを添加せずに、ＭＭＡのソープフリー乳化重合を行ったポリマー粒子、すなわち、該疎水化糖鎖ポリペプチドの固定化処理がされていないＰＭＭＡ粒子を合成した。このようにして得られた糖鎖無添加ポリマー粒子についても、超微量分光光度計によって吸光度値を用いて前記と同じ方法で測定し、表面に吸着したＷＧＡの吸着量を計算で求めた。このようにして求めたＷＧＡの吸着量を、図１１（ａ）に示す。

　図１１（ａ）に示すように、本実施例の糖鎖固定化ポリマー粒子及び糖鎖無添加ポリマー粒子は、ＷＧＡ吸着量がそれぞれ生成粒子０．０１８８ｇ当たり７３μｇ及び２５μｇであった。したがって、本実施例の糖鎖固定化ポリマー粒子に含まれる糖鎖（キトビオース）と特異吸着するタンパク質（ＷＧＡ）の吸着量は、両者の差から４８μｇであることが分かる。このように、疎水化糖鎖ポリペプチドが固定化されたポリマー粒子は、タンパク質の特異吸着性の機能を有することが確認された。

＜比較例２＞
　タンパク質の特異吸着性能について上記実施例４との対比を行うため、前記非特許文献１に記載のものと同じ糖鎖固定化ポリマー粒子を合成した。この糖鎖固定化ポリマー粒子は、糖鎖として上記表３のＮｏ．２６に示す構造を有するグルコース（Ｇｌｃ）、及び疎水基としてオクチル基をそれぞれ有する疎水化糖鎖が、一つのオクチル基を介してＰＭＭＡのポリマー粒子に固定化されたものである。グルコース固定化ＰＭＭＡ粒子の合成は、下記（９）式で表される疎水化糖鎖の化合物ＸＩＶ－１（オクチルーβ－Ｄ－グルコピラノシド：Octyl-β-Ｄ-glucopyranoside）の添加時期を変更したことを除いて、基本的に図８に示す方法に従って行った。ここで、化合物ＸＩＶ－１の添加は、図８において経過時間として点線矢印で示す（Ｂ）の時点、すなわち、ラジカル重合開始剤（ＫＰＳ）を添加する前の重合開始前に行った。

　本比較例２によって得られた糖鎖固定化ポリマー粒子は、平均粒径及び分散度がそれぞれ２５８ｎｍ及び５％であり、粒子間で凝集しておらず、ほぼ均一に揃った粒径を有することが確認された。

　糖鎖固定化ポリマー粒子及びタンパク質として、それぞれ上記グルコース固定化ＰＭＭＡ粒子及び分子量が１０４，０００のコンカナバリン　Ａ（Concanavalin A：ＣｏｎＡ、（株）J-ケミカル）を用いる以外は、上記実施例４と基本的に同じ方法と解析方法に従ってタンパク質に対する特異吸着性能を検証した。このようにして求めたＣｏｎＡの吸着量を図１１（ｂ）に示す。

　　図１１（ｂ）に示すように、本比較例２の糖鎖固定化ポリマー粒子及び糖鎖無添加のポリマー粒子は、ＣｏｎＡの吸着量がそれぞれ生成粒子０．０１８８ｇ当たり３８μｇ及び２１μｇであった。したがって、本比較例２による糖鎖固定化ポリマー粒子に含まれる糖鎖（グルコース）と特異吸着するタンパク質（ＣｏｎＡ）の吸着量は、両者の差から１７μｇであることが分かる。このように、本比較例２の糖鎖固定化ポリマー粒子についても、ある程度のタンパク質の特異吸着性の機能を有することが確認されたが、その吸着量は、上記実施例４に比べて少ないものと推察される。

　本比較例２においては、生成された糖鎖固定化ポリマー粒子に含まれる糖及び吸着するタンパク質の種類が上記実施例４とは異なるため、両者の糖及び糖鎖固定化ポリマーに吸着したタンパク質の吸着量を、重量ではなくモルに換算することによって、タンパク質の特異吸着性能を比較した。その結果を下記表５に示す。

　上記表５から、実施例４は、タンパク質の特異吸着量及び糖の物質量（仕込み量）当たりのタンパク質の特異吸着量が、比較例２に対してそれぞれ約７倍及び１００倍であることが分かる。以上の結果から、本発明の実施例４による糖鎖固定化ポリマー粒子は、従来の比較例２によるものと比べて、タンパク質の特異吸着性に格段に優れることが推察された。

＜実施例５＞
　本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は、疎水化糖鎖ポリペプチドが吸着されていない表面にはタンパク質やウイルスが非特異的に吸着する場合がある。その状態を防止又は抑制し、糖鎖吸着性能の向上を図るため、本実施例において、疎水化糖鎖ポリペプチドが表面吸着されていない表面のブロッキングを親水性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で行うことを検討した。

　親水性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としては、重量平均分子量として４０００を有するものを用いた。疎水化糖鎖ポリペプチド（ＸＩＩＩ－２）の添加と同時にＰＥＧの０．１ｇを重合槽内に添加することを除いて、上記実施例４と同様の方法で糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子を合成した。その操作によって、糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子の表面にＰＥＧを吸着させた。

　このようにして得られた糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子についてタンパク質（ＷＧＡ）に対する特異吸着性能を検証した。さらに、疎水化糖鎖ポリペプチドがＰＭＭＡのポリマー粒子に強固に固定されていることを確認するため、本実施例５の糖鎖固定化ポリマー粒子を１か月間水中に保存し、保存後のＷＧＡ吸着量の変化を調べた。また、ＷＧＡの特異吸着性能及び疎水化糖鎖ポリペプチドの固定性について実施例５との対比を行うため、比較例３及び比較例４として、以下に述べる方法で糖鎖無添加ＰＭＭＡ粒子及び重合後に糖鎖を添加したＰＭＭＡ粒子をそれぞれ製造した。比較例３及び４についても、ＰＥＧを表面吸着させたＰＭＭＡ粒子を検証用試料として用いる点では、実施例５の場合と同様である。

＜比較例３＞
　ＭＭＡの重合過程で疎水化糖鎖ポリペプチドが添加されないことを除いて、上記実施例５と同様の方法で重合を開始してから１時間後にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の０．１ｇを添加し、表面にＰＥＧを吸着させた糖鎖無添加ＰＭＭＡ粒子を製造した。

＜比較例４＞
　疎水化糖鎖ポリペプチド（ＸＩＩＩ－２）の添加を、ＰＭＭＡの重合過程終了後に行い、疎水化糖鎖ポリペプチド（ＸＩＩＩ－２）の添加と同時にＰＥＧの０．１ｇの添加を行うことを除いて、上記実施例４と同様の方法で疎水化糖鎖ポリペプチド（ＸＩＩＩ－２）をＰＭＭＡ粒子に表面吸着させた。その操作によって、表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を吸着させた糖鎖を含むＰＭＭＡ粒子を製造した。前述したように、ＰＭＭＡの重合過程終了後は、ＭＭＡの重合反応による転化率が９５質量％を超える場合に相当する。そのため、ＰＭＭＡの重合過程終了後に疎水化糖鎖ポリペプチドを添加した本比較例４の場合、疎水化糖鎖ポリペプチドに含まれる疎水基がポリマー粒子の内部に埋め込まれることなく表面吸着される。

　上記の実施例５（疎水化糖鎖ポリペプチドを固定化したポリマー粒子）、比較例３（糖鎖無添加ポリマー粒子）及び比較例４（重合過程終了後に疎水化糖鎖ポリペプチドを表面吸着させたポリマー粒子）について、上記実施例４と同じ方法でタンパク質（ＷＧＡ）の吸着を行い、各粒子生成の直後に上記実施例４と基本的に同じ方法でＷＧＡに対する特異吸着性能を検証した。このようにして求めたＷＧＡの吸着量を図１２（ａ）に示す。また、それぞれの粒子を１か月間水中に保存した後に、各粒子生成の直後と同じ方法で求めたＷＧＡの吸着量を図１２（ｂ）に示す。

　図１２（ａ）に示すように、実施例５（糖鎖固定化ポリマー粒子）及び比較例３（疎水化糖鎖ポリペプチドが無添加のとき）の各ポリマー粒子は、生成直後のＷＧＡ吸着量がそれぞれ生成粒子０．０１８８ｇ当たり１２９μｇ及び２３μｇであった。したがって、本実施例５の糖鎖固定化ポリマー粒子に含まれる糖鎖（キトビオース）と特異吸着するタンパク質（ＷＧＡ）の吸着量は、両者の差から１０６μｇであることが分かる。ＷＧＡの特異吸着量をモルに換算すると、ＷＧＡの分子量が４３，２００ｇ／モルであることから、ＷＧＡの特異吸着量が２．４５×１０^－９モルとなる。さらに、検証に用いた糖鎖固定化ポリマー粒子の添加量が０．０１８８ｇであったので、生成ポリマー粒子（糖鎖固定化ポリマー粒子）１ｇ当たりではＷＧＡの特異吸着量が１．３×１０^－７モルとなる。他方、上記実施例４で説明したように、ＰＥＧが添加されなかった糖鎖固定化ポリマー粒子は、生成粒子（糖鎖固定化ポリマー粒子）１ｇ当たりでは５．９×１０^－８モルであった（上記表５を参照）。

　したがって、上記実施例４の糖鎖固定化ポリマー粒子にＰＥＧを表面吸着することによりタンパク質の特異吸着性能を約２．２倍に向上できることが確認された。このように、糖鎖固定化ポリマー粒子に親水性ポリマーを表面吸着させることにより、タンパク質やウイルスの非特異的な吸着を防止又は抑制することができる。

また、図１２(a)に示すように、比較例４（重合過程終了後に疎水化糖鎖ポリペプチドを表面吸着させたポリマー粒子）の生成直後は、ＷＧＡ吸着量が、生成粒子０．０１８ｇ当たり７９μｇであり、重合過程終了後に疎水化糖鎖ポリペプチドを表面吸着させたポリマー粒子に含まれる糖鎖（キトビオース）と特異吸着するタンパク質（ＷＧＡ）の吸着量は、疎水化糖鎖ポリペプチドが無添加のポリマー粒子の生成直後のＷＧＡ吸着量２３μｇとの差から５６μｇであることが分かる。実施例５と比較例４との間でＷＧＡ吸着量を対比すると、実施例５は比較例４に対してタンパク質の特異吸着性能を２倍近くまで向上できることが確認された。このように、タンパク質の特異吸着性能を向上させるためには、疎水化糖鎖ポリペプチドの添加をポリマー粒子の重合途中で行うことが効果的である。

図１２（ｂ）に示すように、水中で１か月間保存した後の実施例５の糖鎖固定化ポリマー粒子は、ＷＧＡ吸着量が生成粒子０．０１８ｇ当たり１１９μｇであり、疎水化糖鎖ポリペプチドが無添加のときのポリマー粒子のＷＧＡ吸着量２３μｇとの差から、実施例５の糖鎖固定化ポリマー粒子に含まれる糖鎖（キトビオース）と特異吸着するタンパク質（ＷＧＡ）の吸着量が９６μｇであった。粒子生成直後の１０６μｇと比較して、ＷＧＡ吸着量の減少率は約９．４％であることが分かる。一方、重合過程終了後に疎水化糖鎖ポリペプチドを表面吸着させた比較例４のポリマー粒子は、ＷＧＡ吸着量が生成粒子０．０１８ｇ当たり６９μｇであり、疎水化糖鎖ポリペプチドが無添加のときのポリマー粒子のＷＧＡ吸着量２３μｇとの差から、重合過程終了後に疎水化糖鎖ポリペプチドを表面吸着させたポリマー粒子に含まれる糖鎖（キトビオース）と特異吸着するタンパク質（ＷＧＡ）の吸着量が４６μｇであった。粒子生成直後の５６μｇと比較して、ＷＧＡの吸着量の減少率が約１７．９％であることが分かる。したがって、重合過程終了後に疎水化糖鎖ポリペプチドを表面吸着させた比較例４と比較して、実施例５の糖鎖固定化ポリマー粒子では、ＷＧＡ吸着量の減少率を約１／２に減少させることができることが確認できた。このように、重合過程で疎水化糖鎖ポリペプチドを添加して疎水化糖鎖ポリペプチドの疎水基をポリマー粒子の内部に埋め込むことにより、糖鎖をポリマー粒子に強固に固定化することができる。

＜実施例６＞
　発明の糖鎖固定ポリマー粒子に対するウイルスの特異吸着性の有無を確認するため、本実施例において、シアロ糖鎖を有する疎水化糖鎖ポリペプチドポリマー粒子を用いてヒトインフルエンザウイルスの特異吸着性を検証した。実際の検証実験においてはインフルエンザウイルスヘマグルチニンを使用する代わりに、そのモデルとして機能することが知られているＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン　Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ＳｉｅｂｏｌｄｉａｎａＬｅｃｔｉｎ）を使用した（例えば、Ｍ．Ｏgａｔａ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，　第１０巻，ｐｐ．１８９４－１９０３，２００９年を参照）。

－シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子の合成－
　シアロ糖鎖を有する疎水化糖鎖ポリペプチドとしては、上記実施例２で使用したものと同じ化合物（上記（７）式において（ＸＩＩＩ－１）で示す化合物）を用い、以下に説明する方法でメチルメタクリレート（ＭＭＡ）の重合体であるポリマー粒子に固定化を行うことにより、シアロ糖鎖固定化ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）粒子を合成した。シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子の合成方法を図１３に模式的に示す。

　蓋を有する重合槽１７に脱イオン水１８を供給し、攪拌しながら窒素ガスによるバブリングを２０分間行い、続いて重合槽内の脱イオン水の温度を７０℃に加熱した。加熱温度が一定になったことを確認してから蛍光色素としてローダミンＢ（ＲｈＢ）を分散させた水溶液及びＭＭＡモノマーをこの順で重合槽内に加え、５分間攪拌を続けた後、ラジカル重合開始剤として過硫酸カリウム（ＫＰＳ）を溶解した脱イオン水を添加し、重合を開始した。本発明の実施形態においては、ラジカル重合開始剤が重合性モノマーに添加されたときを重合時間の開始点とする。

　重合を開始してから１時間後に、疎水化糖鎖ポリペプチドとして得られた化合物（ＸＩＩＩ－１）及び親水化剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をこの順に所定量添加した。化合物（ＸＩＩＩ－１）の添加量は、ＭＭＡモノマー重量に対して１０００分の１程度の重量となるように調整した。ここで、重合を開始してから１時間後では、前記脱イオン水に含まれるモノマーの転化率が約２５質量％程度であった。この転化率は、重合を開始してから１時間後に作製されるシアロ糖鎖固定化ポリマー粒子２０の平均粒径と、重合終了後で得られるポリマー粒子の平均粒径とを対比することにより求めた。

　引き続き、重合を２時間続け、計３時間の重合時間で合成を行った後、シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子が含まれる懸濁液を得た。以上の重合反応工程において重合槽内に添加した各成分の濃度（モル）は、シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子が含まれる懸濁液の総体積を５ｍLとして換算するとき、［シアロ糖鎖（ＸＩＩＩ－１）］＝５０ナノモル、［ＭＭＡ］＝０．８モル、［ＫＰＳ（ラジカル重合開始剤）］＝８ミリモル、［ローダミンＢ（蛍光色素）］＝ＭＭＡ１Ｌに対して０．５ミリモルであった。また、［ＰＥＧ（親水化剤）］の添加量は、前記懸濁液の総体積を５ｍＬに対して重量換算で２５ｍｇであった。前記シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子が含まれる懸濁液を脱イオン水で遠心分離する操作を３回行い、その後、２４時間の真空凍結乾燥を行うことによって、前記懸濁液からシアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子２０を得た。

　このようにして得られたシアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いてＳＥＭ像を観察し、ＳＥＭ像から任意に選択した２００個程度の粒子について粒子径を実測し、それらの平均値として求めた粒径及び分散度を求めた。ここで、シアロ糖鎖固定化PＭＭＡ粒子２０には、粒径２５０ｎｍ以上のメイン粒子とともに、１００ｎｍ程度の小粒子が多数含まれていた。シアロ糖鎖の有する負電荷が重合中におけるＰＭＭＡ粒子の安定性の向上に寄与したために、新たなＰＭＭＡ粒子核が発生したことが要因と考えられる。そこで、シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子２０を水に再分散後、２分間（１５０００回転/分）で遠心分離することで、小粒子を分離した。その結果、本実施例の糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子は、平均粒径及び分散度がそれぞれ２７０ｎｍ及び４％であり、粒子間で凝集しておらず、ほぼ均一に揃った粒径を有することが確認された。また、本実施例によって得られるシアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子は、図１３に示す方法に従ってＲｈＢ（蛍光色素）をポリマー粒子に内包させたものであるが、ＲｈＢを蛍光分光測定において蛍光プローブ又は蛍光ラベルとして利用することにより、タンパク質やウイルスの特異吸着の前後におけるシアロ糖鎖固定化ポリマー粒子の存在を容易に確認及び検証できる。

－ウイルスに対する特異吸着性能の検証－
　糖鎖固定化ポリマー粒子及びタンパク質として、それぞれシアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子及びヒトインフルエンザウイルスのタンパク質（ヘマグルチニン）のモデル物質であるＳＳＡ（ニホンニワトコレクチンＳａｍｂｕｃｕｓＳｉｅｂｏｌｄｉａｎａＬｅｃｔｉｎ）を用いる以外は、上記実施例４で得られた糖鎖固定化ポリマー粒子を用いてタンパク質に対する特異吸着性能を検証したときと基本的に同じ方法と解析方法に従ってウイルスタンパク質の吸着量を求めた。すなわち、シアロ疎水化糖鎖ポリペプチドが固定化されたポリマー粒子０．０２５ｇを脱イオン水０．１０ｍＬに懸濁した後、該懸濁液と、０．１０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝６．５）に溶解したＳＳＡ０．１０ｍｇとをマイクロチューブ内で混合し、４℃で１時間静置した。ここで、前記ＰＢＳとしては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びりん酸二水素カリウムを脱イオン水に溶解して調製したものを使用した。表面にＳＳＡが吸着した前記シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子は、９０分間遠心分離（条件：４℃、１５０００回転／分）を行って懸濁液から分離した。その後、前記シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子に吸着されなかったＳＳＡを含む上澄み液の吸光度（Ａ２８０）を、超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.社製、Nano Drop ONE^Ｃ）を使って測定した。吸光度とＳＳＡの濃度との関係についてあらかじめ作成した検量線を使い、前記糖鎖固定化ポリマー粒子に吸着したＳＳＡの濃度を計算で求めた。

　また、比較例として、疎水化糖鎖ポリペプチドである化合物（ＸＩＩＩ－１）を添加しないことを除けば、シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子の場合と同じ方法と条件で合成した糖鎖無添加ＰＭＭＡ粒子についても上記と同様の解析方法でＳＳＡの吸着量を求めた。シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子（Sia(α-2,6)+C10／ＰＥＧ／ＲｈＢ／ＰＭＭＡ粒子）及び糖鎖無添加ＰＭＭＡ粒子（ＰＥＧ／ＲｈＢ／ＰＭＭＡ粒子）について、それぞれ粒子１ｍｇ当たりのＳＳＡ吸着量の測定結果を図１４に示す。

　図１４に示すように、本実施例６のシアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子（Sia(α-2,6)+C10／ＰＥＧ／ＲｈＢ／ＰＭＭＡ粒子）は、ＳＳＡ吸着量が粒子１ｍｇ当たり５、５５μｇであり、ＳＳＡ吸着量の標準偏差が０．２７μｇであった。それに対して、比較例として合成した糖鎖無添加ＰＭＭＡ粒子（ＰＥＧ／ＲｈＢ／ＰＭＭＡ粒子）は、ＳＳＡ吸着量が粒子１ｍｇ当たり０．７５μｇであり、ＳＳＡ吸着量の標準偏差が０．５０μｇであった。両者の粒子の間でＳＳＡの吸着量を対比すると、シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子は糖鎖無添加ＰＭＭＡ粒子に対してＳＳＡの特異吸着性能を約７、４倍まで向上できることが分かる。ヒトインフルエンザウイルスのタンパク質（ヘマグルチニン）のモデル物質であるＳＳＡの特異吸着性能を考慮すると、本実施例によるシアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子は、表面にシアロ糖鎖を固定して配列することによりヒトインフルエンザウイルスに対して高い特異吸着性を有することが確認された。

　以上のように、本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は、疎水化糖鎖ポリペプチドが有する２以上の疎水基がそれぞれポリマー粒子の独立した箇所の内部に埋め込まれる。そのため、ポリマー粒子と、アンカー部位として機能する疎水基の部分との接触面積が大きくなり、糖鎖がポリマー粒子から外れにくくなり強固に固定化されるだけでなく、疎水化糖鎖ポリペプチドが有する２以上の多数の糖鎖がポリマー粒子の最表面上で分子状に配列して密に導入するため、糖鎖を介して吸着するタンパク質やウイルスの特異吸着性の大幅な向上を図ることができる。

　また、本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は、タンパク質やウイルスの種類に応じて、疎水化糖鎖ポリペプチドの糖鎖の種類や数を変えることにより所望の特異吸着性を有するポリマー粒子として使用することができる。さらに、本発明の実施形態による糖鎖固定化ポリマー粒子は、蛍光色素を内包することにより、タンパク質又はウイルスの高精度検知手段としてだけでなく、生体物質イメージング用の蛍光プローブ又は細胞イメージング用の蛍光ラベルとして利用することができるため有用性が非常に高い。

　本発明の糖鎖固定化ポリマーの製造方法は、疎水性の重合性モノマーを重合反応の途中からポリペプチドと共存した状態でソープフリー乳化重合を行うことにより、ポリマー粒子の凝集を避けられるだけでなく、平均粒径がナノレベルの微粒子を、所望の平均粒径で、且つ、小さな粒径分布を有する態様で効率的に製造することができる。そのため、粒径及び粒径分布が精緻にコントロールされた糖鎖固定化ポリマーの量産性に優れる。

　本発明の糖鎖固定化ポリマーは、タンパク質やウイルス等のバイオセンサーとして、又はそれらとの親和性を利用した分離及び精製を行うための多能性の手段として利用することができる。

　１・・・糖鎖固定化ポリマー粒子
　２，７・・・糖鎖
　３，８・・・疎水基
　４・・・疎水化糖鎖ポリペプチド
　５・・・ポリマー粒子
　６・・・従来技術による糖鎖固定化ポリマー粒子
　９・・・従来技術による疎水化糖鎖ポリペプチド
１０・・・従来技術によるポリマー粒子
１１，１７・・・重合槽
１２，１８・・・水系溶媒
１３・・・モノマー油滴
１４・・・重合反応途中のポリマー粒子
１５・・・凝集した糖鎖固定化ポリマー粒子
１６・・・親水性ポリマー
１９・・・糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子
２０・・・シアロ糖鎖固定化ＰＭＭＡ粒子

Claims

　ポリマー粒子と、
　１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持ち、前記ポリマー粒子の異なる複数の位置で前記ポリマー粒子の表面から内部に向けてそれぞれ個別に埋め込まれる前記複数の疎水基を介して前記ポリマー粒子と非共有結合的に固定される疎水化糖鎖ポリペプチドと、を有する糖鎖固定化ポリマー粒子。
　前記糖鎖固定化ポリマー粒子の平均粒径が５０ｎｍ～１μｍであることを特徴とする請求項１に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。
　前記疎水化糖鎖ポリペプチドの固定化が、前記ポリマー粒子の複数個に跨がないで行われることを特徴とする請求項１又は２に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。
　前記疎水化糖鎖ポリペプチドが、下記（１）式又は下記（２）式で表されるアミノ酸残基を持つポリペプチドを主鎖とし、前記主鎖にアミド結合を介して単糖又はオリゴ糖の構造を含有する配糖体を結合してなる側鎖、及び前記主鎖にアミド結合を介して疎水基を結合してなる側鎖、をそれぞれ複数で有することを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。
　前記疎水化糖鎖ポリペプチドが、下記（３）式で表されるポリペプチドであることを特徴とする請求項４に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。

　ここで、Ｒ_１は水素、アルキル基又は一価の陽イオン金属で、Ｒ_２は単糖配糖体又はオリゴ糖配糖体で、Ｒ_３が疎水基であり、ａは０又は１以上の整数で、ｂ及びｃはそれぞれ独立に２以上の整数である。
　前記ｂ及びｃはそれぞれ独立に５００～３０００の整数であり、前記ａ、ｂ及びｃの（ａ＋ｂ＋ｃ）に対する比率が、それぞれ０．０５～０．９、０．０５～０．５及び０．０５～０．６であることを特徴とする請求項５に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。
　前記ポリマー粒子が、スチレンスチレンとその誘導体及び（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の疎水性モノマーの重合体を有する粒子であり、前記Ｒ_１がナトリウム又はカリウムの陽イオン金属であり、前記Ｒ_２が下記（４）式又は下記（５）式で表される単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する配糖体であり、前記Ｒ_３が炭素数３～１５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることを特徴とする請求項５又は６に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。

　ここで、Ｙ_１及びＹ_２は、それぞれ独立にスペーサー基として３～１５のメチレン基が共有結合した構造を有する有機基であり、ｍ及びｎは、それぞれ独立に０～２の整数であり、Ｚは単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する糖鎖である。
　前記糖鎖固定化ポリマー粒子は、前記糖鎖固定化ポリマー粒子の表面に吸着される親水性のポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体を有することを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。
　前記ポリマー粒子は、前ポリマー粒子との疎水相互作用又は静電相互作用によって非共有結合的に前記ポリマー粒子に固定された蛍光色素を有することを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子。
　重合性モノマーを分散した水系溶媒を有する重合槽内に水溶性のラジカル重合開始剤を添加して重合を開始する工程と、
　重合反応の途中で、１分子中に複数の糖鎖及び複数の疎水基を側鎖に持つ疎水化糖鎖ポリペプチドを添加し、該疎水化糖鎖ポリペプチドを前記重合槽内に共存させた状態で前記重合反応を継続する工程と、を有する糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。
　前記疎水化糖鎖ポリペプチドの添加は、前記重合槽内で前記重合性モノマーの重合が進み、ポリマー粒子の核形成に続き、前記ポリマー粒子の安定的な成長がみられるときから、前記重合性モノマーが消失する前までであって、且つ、前記重合性モノマーの重合反応による転化率が０質量％を超え９５質量％以下のときに行われることを特徴とする請求項１０に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。
　前記疎水化糖鎖ポリペプチドの添加は、前記重合槽内に含まれる前記重合性モノマーの重合反応による転化率が、重合開始のときに対して３～５０質量％となるときの重合反応時間に行われることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。
　前記疎水化糖鎖ポリペプチドが、下記（１）式又は下記（２）式で表されるアミノ酸残基を持つポリペプチドを主鎖とし、前記主鎖にアミド結合を介して単糖又はオリゴ糖の構造を含有する配糖体を結合してなる側鎖及び前記主鎖にアミド結合を介して疎水基を結合してなる側鎖、をそれぞれ複数で有することを特徴とする請求項１０～１２のいずれか一項に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。
　前記疎水化糖鎖ポリペプチドが、下記（３）式で表されるポリペプチドであることを特徴とする請求項１３に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。

　ここで、Ｒ_１は水素、アルキル基又は一価の陽イオン金属で、Ｒ_２は単糖配糖体又はオリゴ糖配糖体で、Ｒ_３が疎水基であり、ａは０又は１以上の整数で、ｂ及びｃはそれぞれ独立に２以上の整数である。
　前記ｂ及びｃはそれぞれ独立に５００～３０００の整数であり、前記ａ、ｂ及びｃの（ａ＋ｂ＋ｃ）に対する比率が、それぞれ０．０５～０．９、０．０５～０．５及び０．０５～０．６であることを特徴とする請求項１４に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。
　前記ポリマー粒子が、スチレンとその誘導体及び（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の疎水性モノマーの重合体を有する粒子であり、前記Ｒ_１がナトリウム又はカリウムの陽イオン金属であり、前記Ｒ_２が下記（４）式又は下記（５）式で表される単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる少なくともいずれかの糖の構造を含有する配糖体であり、前記Ｒ_３が炭素数３～１５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。

　ここで、Ｙ_１及びＹ_２は、それぞれ独立にスペーサー基として３～１５のメチレン基が共有結合した構造を有する有機基であり、ｍ及びｎは、それぞれ独立に０～２の整数であり、Ｚは単糖及び２～７糖からなる群から選ばれる糖の少なくともいずれかの糖の構造を含有する糖鎖である。
　請求項１０～１６のいずれか一項に記載の製造方法は、前記糖鎖固定化ポリマー粒子の重合反応の途中又は重合反応を終了した後、ポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール系誘導体の親水性ポリマーを前記糖鎖固定化ポリマー粒子の表面に吸着させる工程を有することを特徴とする糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。
　前記親水性ポリマーを前記ポリマー粒子の表面に吸着させる工程は、
　前記糖鎖固定化ポリマー粒子の重合反応の途中又は重合反応を終了した後、
　前記前記糖鎖固定化ポリマー粒子が含まれる前記重合槽に、前記親水性ポリマーを添加する工程、及び
　重合槽とは別に、水系媒体が含まれる反応槽に前記糖鎖固定化ポリマー粒子を移動させた後、前記糖鎖固定化ポリマー粒子が含まれる前記反応槽に前記親水性ポリマーを添加する工程、
のいずれかの工程を含むことを特徴とする請求項１７に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。
　前記重合を開始する工程の前に、前記重合性モノマーと共存又は非共存の状態で蛍光色素を前記重合槽内に添加するか、又は、前記重合を開始してから前記重合性モノマーの重合反応による転化率が９５質量％以下であるときのいずれかの重合時間において、前記疎水化糖鎖ポリペプチドの共存若しくは非共存の状態で前記蛍光色素を前記重合槽内に添加することによって、
　前記ポリマー粒子に前記蛍光色素が固定された糖鎖固定化ポリマー粒子を製造することを特徴とする請求項１０～１８のいずれか一項に記載の糖鎖固定化ポリマー粒子の製造方法。