JP2009216608A - 試料調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】糖鎖および／または糖の誘導体を含む生体試料より分析試料のための糖鎖および／または糖の誘導体、特にビオチン化糖鎖を、簡単な操作で調製する方法を提供すること。
【解決手段】 ヒドラジド基を有する物質Ａと糖鎖および／または糖の誘導体とを結合させる糖鎖捕捉段階と、前記糖鎖捕捉段階で捕捉された物質Ａと糖鎖および／または糖の誘導体との複合体に、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有するビオチン誘導体Ｂを作用させて、前記複合体と前記ビオチン誘導体Ｂの間で生じるヒドラゾン−オキシム交換反応またはヒドラゾン−ヒドラゾン交換反応により、前記糖鎖および／または糖の誘導体を前記物質Ａから切り離しつつ前記ビオチン誘導体Ｂに結合させる糖鎖遊離段階とを含む試料調製方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、所定の糖鎖捕捉物質を使った試料調製方法に関するもので、特にビオチン化糖鎖の調製方法に関する。

生体高分子とは、糖鎖、糖タンパク、糖ペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク、核酸、脂質などの総称である。
また、これら生体高分子は、医学、細胞工学、臓器工学などのバイオテクノロジー分野において重要な役割を担っており、これら物質による生体反応の制御機構を明らかにすることはバイオテクノロジー分野の発展に繋がることになる。
この中でも、糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達，タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
なお、糖鎖とは、グルコース，ガラクトース，マンノース，フコース，キシロース，Ｎ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの生体高分子に含まれる糖鎖が、この生体高分子と互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
ビオチンはアビジンに対して高い親和性を持つことが知られており、ビオチン-アビジン複合体を用いたシステムはＥＩＡ(エンザイムイムノアッセイ)などの免疫学的測定や組織染色の分野で広く利用されている。例えば抗体やタンパク質にビオチンラベル化後、酵素標識または蛍光標識されたアビジン、ストレプトアビジンなどを反応させ、酵素反応により生じた可視色素や標識された蛍光色素を検出するといった方法が行われている。糖鎖分子にビオチン分子を結合することにより、上述と同様に、糖鎖と生体物質の相互作用の測定などに利用できると期待されるが、ビオチン化糖鎖を効率よく調製する方法はなく、解決する手段が求められていた。
国際公開第２００８／０８１７０号パンフレット

本発明の目的は、糖鎖および／または糖の誘導体を含む生体試料より分析試料のための糖鎖および／または糖の誘導体、特にビオチン化糖鎖を、簡単な操作で調製する方法を提供することである。

本発明は、
（１）ヒドラジド基を有する物質Ａと糖鎖および／または糖の誘導体とを結合させる糖鎖捕捉段階と、
前記糖鎖捕捉段階で捕捉された物質Ａと糖鎖および／または糖の誘導体との複合体に、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有するビオチン誘導体Ｂを作用させて、前記複合体と前記ビオチン誘導体Ｂの間で生じるヒドラゾン−オキシム交換反応またはヒドラゾン−ヒドラゾン交換反応により、前記糖鎖および／または糖の誘導体を前記物質Ａから切り離しつつ前記ビオチン誘導体Ｂに結合させる糖鎖遊離段階と、
を含む試料調製方法、
（２）前記物質Ａが下記の（式１）で表される構造を有するポリマー粒子である（１）記載の試料調製方法、

（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
（３）前記物質Ａが下記の（式２）で表される構造を有するポリマー粒子である（１）記載の試料調製方法、

（Ｒ₁，Ｒ₂は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅はＨ，ＣＨ₃，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。）
（４）前記物質Ａが下記の（式３）で表される構造を有するポリマー粒子である（１）記載の試料調製方法、

（５）前記ビオチン誘導体Ｂが下記の（式４）で表されるビオチンヒドラジドである（１）〜（４）いずれか記載の試料調製方法、

（６）前記ビオチン誘導体Ｂが下記の（式５）で表されるアミノオキシビオチンである（１）〜（４）いずれか記載の試料調製方法、

である。

本発明によれば、糖鎖および／または糖の誘導体を含む生体試料より分析試料のための糖鎖および／または糖の誘導体、特にビオチン化糖鎖を、簡単な操作で調製することが可能になる。

以下、本発明の実施形態について説明する。
（測定に供する試料）
本発明において使用する糖鎖を含む試料は、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織などの生体試料を用いることができる。植物由来の試料を用いることもできる。また、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質を用いることができる。試料は脱脂、脱塩、タンパク質分画などの方法により前処理されていてもよい。

（糖鎖を含む試料の調製）
糖鎖遊離手段を用いて上記生体試料に含まれる糖タンパク質から糖鎖を遊離させる。糖鎖を遊離させる手段としては、N-グリコシダーゼあるいはO-グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。N型糖鎖の分析を行う場合は、N-グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。

次いで、糖鎖を含む溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて捕捉担体上に糖鎖を捕捉する。
糖鎖は生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖は水溶液などの状態で環状のヘミアセタール型と、非環状型のアルデヒド型とが平衡で存在する。タンパク質や核酸，脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基が含まれていない。このことから、アルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉することが可能である。

アルデヒド基と特異的に反応する官能基としては、たとえばオキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基、セミチオカルバジド基ならびにそれらの誘導体を好ましく、ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基がより好ましい。オキシルアミノ基とアルデヒド基との反応によって生じるオキシム結合およびヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理などによって容易に切断されるため、糖鎖を捕捉したのち、糖鎖を担体から簡単に切り離すことができる。一般的に，生理活性物質の捕捉・担持にはアミノ基が多用されているが、アミノ基とアルデヒド基の反応によって生じる結合（シッフ塩基）は結合力が弱いため、還元剤などを用いた二次処理が必要であることから、アミノ基は糖鎖の捕捉には好ましくない。

本発明においては、糖鎖を捕捉するための担体としてヒドラジド基を有する物質Ａを使用する。
物質Ａとしては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子は、少なくとも表面の一部にヒドラジド基を有した固体あるいはゲル粒子であることが好ましい。ポリマー粒子としては、式１、式２、又は式３で表される構造のものが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また，ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート（例えばMillipore社製 MultiScreen Solvinert Filter Plate）を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えばゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、糖鎖精製のスループットが大幅に向上される。

ポリマー粒子の形状は特に限定しないが，球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５〜１０００μｍであり、より好ましくは０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜２００μｍであり、最も好ましくは０．１〜１００μｍである。平均粒径が下限値未満では，ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際，通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下する。

糖鎖を特異的に捕捉するポリマー粒子によって糖鎖を捕捉する際の反応系のpHは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。pH調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は，好ましくは４〜９０℃，より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり，最も好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。

ポリマー粒子を用いた場合、担体表面には糖鎖以外の莢雑物が非特異的に吸着しているため、これらを洗浄除去する必要がある。洗浄液としては、水、緩衝液、界面活性剤を含む水または緩衝液、有機溶剤などを適宜組み合わせて用いることが好ましい。特に好ましい形態は、界面活性剤を含む水または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物がポリマー粒子表面から除去される。

次いで捕捉担体であるポリマー粒子に結合した糖鎖を再遊離し、精製され、かつ、ビオチン標識された糖鎖試料を得る。
ポリマー粒子に結合した糖鎖を別の化合物であるビオチン誘導体Ｂに置換する工程に関して説明する。糖鎖が結合しているポリマー粒子に対してアミノオキシ基またはヒドラジド基を有するビオチン誘導体Ｂを過剰量加えることで置換が成される。すなわち、糖鎖はポリマー粒子から切り離され、それと同時に糖鎖にビオチン誘導体Ｂが付加する（糖鎖は「ビオチン化」される）。過剰に加えるビオチン誘導体Ｂの量は、好ましくはポリマー粒子が有する糖鎖と特異的に反応する官能基量の１．５倍量以上、より好ましくは３倍量以上、さらに好ましくは５倍量以上であり、最も好ましくは１０倍量以上である。反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。反応系の温度は，好ましくは４〜９０℃，より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり，最も好ましくは４０〜８０℃である。

ビオチン誘導体Ｂとしては、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有する化合物である式４で表されるビオチンヒドラジド、又は式５で表されるアミノオキシビオチンを好適に用いることができ、反応効率の観点からアミノオキシビオチンがより好ましい。

以下の実験例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実験例に限定されるものではない。
（糖鎖試料の調製）
糖タンパク質としてフェツインまたはアシアロフェツインを試料として用いた。糖タンパク質１０ｍｇを容器に取り、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に溶解させた。１２０ｍＭジチオスレイトール溶液２５μＬを加えて６０℃で３０分インキュベートしたのち、１２３ｍＭヨードアセトアミド溶液５０μＬを加え、室温で１時間静置した。さらにトリプシン４００Ｕを加え、３７℃で１６時間静置した。９０℃で５分間処理してトリプシンを失活させたのち、N-glycosidase F(Roche社製)１０ｕｎｉｔを添加し、３７℃で１６時間インキュベートすることで糖鎖を遊離させた。

（ポリマー粒子への糖鎖担持）
得られた遊離糖鎖溶液２０μL（糖タンパク質１００μｇ相当）を、（式３）の構造を有するヒドラジド基含有ポリマー粒子（住友ベークライト株式会社製、BS-X4104S）５ｍｇに添加し、２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μＬを加えたのち、８０℃で１時間反応させ、乾固させた。２Ｍグアニジン塩酸塩溶液、水、メタノール、１％トリエチルアミン溶液にてポリマー粒子を洗浄後、１０％無水酢酸／メタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、１０ｍＭ塩酸水溶液、水、１，４‐ジオキサンにてポリマー粒子を洗浄した。１００ｍM の１−メチル−３−p−トリルトリアゼン（MTT）（東京化成 No.M０６４１）を２０μL加え、６０℃で１時間反応させ、シアル酸残基のカルボン酸をメチルエステル化した。反応後、メタノール、水、ジオキサンにてポリマー粒子を洗浄した。

（ポリマー粒子からの糖鎖再遊離／ビオチン化）
（式５）で表されるアミノオキシビオチン（Biotinum社製、aminooxy-biotin trifluoroacetate salt）を少量のＤＭＳＯに溶解し、これを純水で希釈することにより２０ｍＭ溶液を調製した。上記で調製した糖鎖担持ポリマー粒子に、アミノオキシビオチン溶液を２０μL、２％酢酸を含むアセトニトリルを１８０μＬを加えたのち、８０℃で１時間反応させ、乾固させた。純水５０μＬを加えてポリマー粒子をリンスし、上清を回収した。

（質量分析による評価）
得られた溶液をマトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型質量分析器（MALDI-TOF-MS）（Bruker社製 'autoflex III'）により分析した。溶液をマトリックス溶液（2,5-ジヒドロキシ安息香酸の10mg/mL水溶液）で１０倍希釈したのち、１μＬを試料台にスポット、乾燥・結晶化させたのち測定した。測定はポジティブイオン検出モード、リフレクトロンモードにて行い、シグナルはナトリウムイオン付加体（[M+Na]+）で検出された。

図１にはアシアロフェツイン由来の糖鎖を上記処理にてビオチン化したもののMALDI-TOF MSチャートを示す。質量対電荷比（m/z）2046, 2249, 2411に顕著なピークが観測された。これらの値からアミノオキシビオチンの分子量を差し引いた値を、GlycoMod Toolを用いて検索した結果、それぞれ表１に示す組成の糖鎖であることが示された。
表中の略称は下記の通りである。
Hex:ヘキソース、HexNAc:N-アセチルヘキソサミン、NeuAc:N-アセチルノイラミン酸、Man:マンノース、GlcNAc:N-アセチルグルコサミン

図２にはフェツイン由来の糖鎖を上記処理にてビオチン化したもののMALDI-TOF MSチャートを示す。質量対電荷比（m/z）2659, 3024, 3320, 3635に顕著なピークが観測された。これらの値からアミノオキシビオチンの分子量を差し引き、さらに、シアル酸メチルエステル化操作により付加されているメチル基の分子量を差し引いた数値を、GlycoMod Toolを用いて検索した結果、それぞれ表２に示す組成の糖鎖であることが示された。

以上の結果より、ヒドラジド基含有ポリマー粒子と、アミノオキシビオチンを組み合わせて用いることにより、簡単な操作で精製されたビオチン化糖鎖の調製が可能であることが示された。

アシアロフェツイン由来の糖鎖をビオチン化したもののMALDI-TOF-MSチャートを示す。 フェツイン由来の糖鎖をビオチン化したもののMALDI-TOF-MSチャートを示す。

Claims (6)

1. ヒドラジド基を有する物質Ａと糖鎖および／または糖の誘導体とを結合させる糖鎖捕捉段階と、
   前記糖鎖捕捉段階で捕捉された物質Ａと糖鎖および／または糖の誘導体との複合体に、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有するビオチン誘導体Ｂを作用させて、前記複合体と前記ビオチン誘導体Ｂの間で生じるヒドラゾン−オキシム交換反応またはヒドラゾン−ヒドラゾン交換反応により、前記糖鎖および／または糖の誘導体を前記物質Ａから切り離しつつ前記ビオチン誘導体Ｂに結合させる糖鎖遊離段階と、
   を含む試料調製方法。
2. 前記物質Ａが下記の（式１）で表される構造を有するポリマー粒子である請求項１記載の試料調製方法。
   

   

   （担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
3. 前記物質Ａが下記の（式２）で表される構造を有するポリマー粒子である請求項１記載の試料調製方法。
   

   

   （Ｒ₁，Ｒ₂は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅はＨ，ＣＨ₃，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。）
4. 前記物質Ａが下記の（式３）で表される構造を有するポリマー粒子である請求項１記載の試料調製方法。
   

   
5. 前記ビオチン誘導体Ｂが下記（式４）で表されるビオチンヒドラジドである請求項１〜４いずれか記載の試料調製方法。
   

   
6. 前記ビオチン誘導体Ｂが下記（式５）で表されるアミノオキシビオチンである請求項１〜４記載の試料調製方法。
   

   

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