JP4946905B2

JP4946905B2 - オキシルアミノ基含有化合物および標識化された標的化合物

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Publication number: JP4946905B2
Application number: JP2008032538A
Authority: JP
Inventors: 碧阿部; 秀行島岡
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2008-02-14
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2028-02-14
Also published as: JP2009192337A

Description

本発明は、新規オキシルアミノ基化合物に関するもので、特に生体試料中に含まれる所定の生体高分子を効率よく分析するための標識化合物およびその使用方法に関するものである。

生体高分子とは、糖鎖、糖タンパク、糖ペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク、核酸、脂質などの総称である。

また、これら生体高分子は、医学、細胞工学、臓器工学などのバイオテクノロジー分野において重要な役割を担っており、これら物質による生体反応の制御機構を明らかにすることはバイオテクノロジー分野の発展に繋がることになる。

この中でも、糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達，タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。

なお、糖鎖とは、グルコース，ガラクトース，マンノース，フコース，キシロース，Ｎ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。

例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの生体高分子に含まれる糖鎖が、この生体高分子と互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる（非特許文献１）。

そのため近年糖鎖構造を迅速、簡便に、かつ精度高く解析する方法が求められるようになり、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、核磁気共鳴法（NＮＭＲ法）、質量分析法、レクチンアレイ法などの各種の方法による糖鎖解析が行われている。
中でも、高速液体クロマトグラフィーや質量分析機器による解析が盛んに行われているが、糖鎖の精製や標識化等に時間と工数のかかる作業が必要であり、ハイスループット解析が行える環境が整っていないのが現状である。

糖鎖生物学入門化学同人２００５年１１月１日発行第１版

本発明は、糖鎖等の標的化合物のハイスループット解析を可能とする、生体試料中に含有する糖鎖等の標的化合物を簡便に標識化でき、高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析機器どちらによる解析も可能である化合物を提供する事を目的としている。

本発明は以下の通りである。
（１）下記式（１）の構造を有するオキシルアミノ基含有化合物。

（２）（１）記載のオキシルアミノ基含有化合物によって標識化された糖鎖であることを特長とする標的化合物。
（３）（２）記載の標識化された標的化合物を作成する方法であって、糖鎖が糖鎖のアルデヒド基を介して結合している担体に対して、過剰量の前記オキシルアミノ基含有化合物を加える事によって成されるものである標識化された標的化合物を作成する方法。
（４）（２）記載の標識化された標的化合物を高速液体クロマトグラフィーにより検出する標的化合物の検出方法。
（５）前記検出方法が蛍光検出又はＵＶ吸収検出である（４）記載の標的化合物の検出方法。
（６）（２）記載の標識化された標的化合物を質量分析機器により検出する標的化合物の検出方法。
（７）前記検出方法において、前記標識化された標的化合物が負電荷を有さない場合、質量分析機器のポジティブモードにて検出する（６）記載の標的化合物の検出方法。
（８）前記検出方法において、前記標識化された標的化合物が負電荷を有する場合、質量分析機器のネガティブモードにて検出する（６）記載の標的化合物の検出方法。
（９）前記負電荷を有する化合物がシアル酸、硫酸化糖又はリン酸化糖を含む負電荷を有する糖鎖である（８）記載の標的化合物の検出方法。

本発明のオキシルアミノ基含有化合物によれば、生体試料中に含有する糖鎖等の標的化合物の選択的、且つ簡便な標識化が可能となる。また、標識化された糖鎖等の標的化合物は高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析機器による解析が可能であり、ハイスループット解析が可能となる。

本発明は下記式（１）の構造を有するオキシルアミノ基含有化合物であり、それによって標識化された標的化合物である。
下記式（１）の構造を有するオキシルアミノ基含有化合物は、Ｎ−アミノオキシアセチル−トリプトファンメチルエステル（Ｎ−Ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅｍｅｔｙｌｅｓｔｅｒ）である。該オキシルアミノ基含有化合物は、例えばトリプトファンメチルエステルを原料として合成する。以降、該化合物を、化合物Ａと称す。

化合物Ａと標的化合物とを反応させることによって、標的化合物の標識を行なう。標的化合物が糖鎖の場合、反応系においてｐＨが酸性の条件であるのが好ましく、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間である。開放系で行い、溶媒を完全に蒸発させるのが好ましい。

生体試料中に含有する糖鎖に化合物Ａを標識化させる場合、試料中から標識化された糖鎖を精製するのは手間がかかる。そこで、次に述べる工程を経て化合物Ａによる標識を行うのが望ましい。
（工程１）生体試料中に含有する糖鎖を糖鎖のアルデヒド基を介して担体に捕捉する。
（工程２）生体試料中から糖鎖捕捉担体を取り出し、洗浄することで糖鎖以外の生体高分子を除去する。
（工程３）化合物Ａを過剰に加えて反応させることにより化合物Ａにて標識された糖鎖を得る。

工程１の担体は糖鎖のアルデヒド基と反応する官能基を有していることが好ましい。官能基としてはヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基であることがより好ましく、ヒドラジド基であることがさらに好ましい。
工程３の過剰に加える化合物Ａの量は、担体が有する糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基量に対して、好ましくは１．５倍量以上、より好ましくは３倍量以上、さらに好ましくは５倍量以上であり、最も好ましくは１０倍量以上である。置換するための反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。反応系の温度は，４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間である。開放系で行い溶媒を完全に蒸発させるのが好ましい。。

化合物Ａによって標識化された標的化合物の検出を高速液体クロマトグラフィーによって行うことが出来る。この場合、検出を化合物ＡのＵＶ吸収あるいは蛍光特性を利用して行うことが可能である。感度の面から考えて蛍光特性を利用して検出するのが望ましい。ＵＶ吸収波長は２８０ｎｍで、励起波長２８０ｎｍ、蛍光波長３５０ｎｍでの検出可能である。

化合物Ａによって標識化された標的化合物の検出を質量分析機器によって行なう場合について説明する。シアル酸、硫酸化糖、リン酸化糖などのような負電荷を有する化合物を標識した場合、ネガティブモードで検出するのが望ましい。また、質量分析機器のイオン化法がマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭａｔｒｉｘＡｓｓｉｓｔｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ法）の場合、シアル酸の脱離が起きやすいので予めカルボン酸をメチルエステル化し、ポジティブモードで測定するのが望ましいが、カルボン酸をメチルエステル化しない場合でも高速液体クロマトグラフィーにて標識化合物を単離し、ネガティブモードにて測定をすることで分子量を確認することも可能である。この際もやはり一部のシアル酸が脱離した分子量のピークが検出される可能性があるが、完全に化合物が単離された状態であればシアル酸が最も多くついている分子量が目的の化合物の分子量であると言える。

《実施例１》
本発明化合物の合成例を説明する。
（ａ）Ｂｏｃ−ＮＨＯＣＨ_２ＣＯ−Ｗ−ＯＭｅ（化合物Ｂ）の合成
Ｂｏｃアミノオキシ酢酸１００ｍｇ（０．５２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２．５ｍＬ）液を−２０℃に冷却した。ついで４−メチルモルホリン（０．６３ｍｍｏｌ）、イソブチルクロロホルメート（０．６３ｍｍｏｌ）を添加し、１５分攪拌することで混合酸無水物を調製した。反応溶液を０℃とし、ＴＨＦ：水＝１：１の混合溶媒１ｍＬに溶解させたＤ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ・ＨＣｌ（０．６３ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（０．６３ｍｍｏｌ）を添加した。、１時間攪拌後反応溶液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０：１）により精製することで目的物である化合物Ｂ（Ｂｏｃ−ＮＨＯＣＨ_２ＣＯ−Ｗ−ＯＭｅ、下式（２））を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、目的物の［Ｍ＋Ｎａ^＋］イオンをｍ／ｚ：４１４に観測した。
（ｂ）ＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ−Ｗ−ＯＭｅ（化合物Ａ）の合成
化合物Ｂ３０ｍｇを１ｍＬのメタノールに溶解させた後、４Ｍ塩酸ジオキサン溶液１ｍＬを加え１５分攪拌させた。反応液を減圧濃縮し、メタノールを加え共沸を繰り返してＴＦＡを除去して、目的物である化合物Ａ（ＮＨ_２ＯＣＨ_２ＣＯ−Ｗ−ＯＭｅ）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｎａ^＋］イオンをｍ／ｚ：３１４に観測した。

《実施例２》
本発明の化合物Ａによって標識化された標的化合物、及び検出方法を以下の実施例により説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例では、モデルケースとして糖タンパク質であるウシ血清由来フェチュインおよびウシ血清由来IgGの糖鎖を分析試料として調製する方法およびその測定方法を示す。

（生体試料の予備処理）
糖タンパクの一種であるウシ血清由来フェチュインおよびウシ血清由来ＩｇＧそれぞれ１ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム５０μLにＤＴＴ（ジチオスレイトール）を加え６０℃で３０分間反応させた後、ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）を加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いてトリプシンによるプロテアーゼ処理して、タンパク質部分をペプチド断片化し、グリコシダーゼＦによる処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させて、予備処理済の生体試料を得た。

（糖鎖捕捉反応）
より簡便に生体試料中の糖鎖に本発明化合物Ａを結合させるために、体試料中に含有する糖鎖をアルデヒド基を介して担体に捕捉させた。その際、質量分析用の試料（ポジティブモード測定）はシアル酸の脱離を防ぐためにカルボン酸をメチルエステル化させた。質量分析用（ネガティブ測定）および高速液体クロマトグラフィー用の試料はシアル酸の情報を維持しておくためメチルエステル化は行わなかった。
（メチルエステル化あり）予備処理済の各生体試料の懸濁物２０μLをヒドラジド基を有するビーズ５ｍｇ（住友ベークライトＢＳ−Ｘ４１０４Ｓ）に添加し、８０℃で１時間反応させた。グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にてビーズを洗浄後、無水酢酸を添加し、室温で３０分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水、１，４−ジオキサンにてビーズを洗浄した。１００ｍＭの１−メチル−３−p−トリルトリアゼン（ＭＴＴ）（東京化成Ｎｏ．Ｍ０６４１）を２０μL加え、６０℃で１時間反応させシアル酸残基のカルボン酸をメチルエステル化した。反応後、メタノール、水、ジオキサンにてビーズを洗浄した。
（メチルエステル化なし）
予備処理済の各生体試料の懸濁物２０μLをヒドラジド基を有するビーズ５ｍｇ（住友ベークライトＢＳ−Ｘ４１０４Ｓ）に添加し、８０℃で１時間反応させた。グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にてビーズを洗浄後、無水酢酸を添加し、室温で３０分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にてビーズを洗浄した。

（化合物Ａによる糖鎖の標識化）
上記各ビーズに実施例１で得られた化合物Ａ（Ｎ−Ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅｍｅｔｙｌｅｓｔｅｒ）を２０ｍＭに調整した溶液を２０μL加え、８０℃で１時間反応させた。この反応にて、例えばグルコースがビーズに付加していた場合、下式（３）に示したような反応が起き、糖鎖がビーズから遊離、標識化される。標識化された糖鎖を水５０μLに溶解して回収した。

（化合物Ａ標識糖鎖の解析）
（質量分析機器による解析）
得られた糖鎖サンプル（メチルエステル化あり）をマトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）（Ｂｒｕｋｅｒ社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩＩ）によりポジティブモードにて分析した。マトリックスには２，５−ジヒドロキシ安息香酸を用いた。測定結果を図１に示す。上段はウシ由来フェツイン、下段はウシ由来ＩｇＧを測定した結果である。どちらにおいても目的の糖鎖に化合物Ａが付加した分子量に該当する場所にシャープなピークが得られた。
また、シアル酸含有糖鎖を持つフェツイン糖鎖サンプル（メチルエステル化なし）を同装置を用いてネガティブモードにて測定した。測定結果を図２に示す。レーザーにより一部シアル酸が失われた分子量のものも検出されたが、目的の糖鎖に化合物Ａが付加した分子量に該当する場所にシャープなピークが得られた。
（高速液体クロマトグラフィーによる解析）得られた糖鎖サンプル（メチルエステル化なし）を高速液体クロマトグラフィーにて測定した。ウシフェツイン由来糖鎖はアミノカラム（ＳｈｏｄｅｘＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ−５０）、ウシ由来ＩｇＧはアミドカラム（ＴＳＫ−ＧＥＬＡｍｉｄｅ−８０）にて励起波長２８０ｎｍ、蛍光波長３５０ｎｍにて検出した。測定結果を図３に示す。目的の糖鎖が化合物Ａの蛍光にて検出された。

実験例にて得られた化合物Ａ標識糖鎖の解析結果（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、ポジティブモード）である。上段：ウシ由来フェツイン糖鎖を化合物Ａで標識。下段：ウシ由来ＩｇＧ糖鎖を化合物Ａで標識実験例にて得られた化合物Ａ標識糖鎖の解析結果（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、ネガティブモード）である。化合物Ａにて標識したウシ由来糖タンパク質糖鎖を高速液体クロマトグラフィーにより測定した結果を示すチャート図である。

Claims

下記式（１）の構造を有するオキシルアミノ基含有化合物。
請求項１記載のオキシルアミノ基含有化合物によって標識化された糖鎖であることを特長とする標的化合物。
請求項２記載の標識化された標的化合物を作成する方法であって、糖鎖が糖鎖のアルデヒド基を介して結合している担体に対して、過剰量の前記オキシルアミノ基含有化合物を加える事によって成されるものである標識化された標的化合物を作成する方法。
請求項２記載の標識化された標的化合物を高速液体クロマトグラフィーにより検出する標的化合物の検出方法。
前記検出方法が蛍光検出又はＵＶ吸収検出である請求項４記載の標的化合物の検出方法。
請求項２記載の標識化された標的化合物を質量分析機器により検出する標的化合物の検出方法。
前記検出方法において、前記標識化された標的化合物が負電荷を有さない場合、質量分析機器のポジティブモードにて検出する請求項６記載の標的化合物の検出方法。
前記検出方法において、前記標識化された標的化合物が負電荷を有する場合、質量分析機
器のネガティブモードにて検出する請求項６記載の標的化合物の検出方法。
前記負電荷を有する化合物がシアル酸、硫酸化糖又はリン酸化糖を含む負電荷を有する糖鎖である請求項８記載の標的化合物の検出方法。