JP5115988B2 - 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質 - Google Patents
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Description
生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含む。
生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階と、
洗浄後に前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含む。
(担体)−S−S−L−A (1)
(式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Lはリンカー部位であり、Aは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−S−S−はジスルフィド結合である)。
また、前述した分析試料調製方法において、式(1)中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であってもよい。
下記式(1)で示される構造を有することを特徴としている:
(担体)−S−S−L−A (1)
(式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Lはリンカー部位であり、Aは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−S−S−はジスルフィド結合である)。
また、前述の糖鎖捕捉物質において、下記式(3)の構造を有してもよい:
また、前述した糖鎖捕捉物質において、式(1)中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であってもよい。
本実施形態は、生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および/または糖の誘導体(以下、単に「糖鎖」ということもある)を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階としてのステップS20と、糖鎖捕捉反応後の糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階としてのステップS30と、洗浄後に糖鎖捕捉物質から糖鎖を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階としてのステップS40とを含む。
ステップS10では、糖鎖および/または糖の誘導体、例えば糖鎖を含む複合分子、例えば糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質などを含む所定の生体試料から糖鎖を回収・精製するための予備処理が行われる。
このような糖鎖捕捉物質としては、具体的には、下記式(1)で示される構造を有するものが挙げられる。
(担体)−S−S−L−A (1)
(式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Lがリンカー部位であり、Aは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−S−S−はジスルフィド結合である。)
まず、リンカー部位Lの例として、ペプチド、オリゴペプチドおよびそれら誘導体から選ばれる部分を含む基が挙げられ、例えばアルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含んでいてもよい。
このように、リンカー部位Lにアルギニン(R)残基を挿入すると、MALDI−TOFMS測定時にイオン化が促進され,検出感度が向上することが知られている。また、トリプトファン(W)は蛍光性のアミノ酸であり、かつ疎水性であることから、逆相HPLCでの分離性向上と、蛍光検出感度向上を図ることができる。なお、フェニルアラニンおよびチロシンを用いた場合には、UV吸収による検出に適している。
このような2−アミノベンゾイル基は、蛍光性を付与するための標識化合物であり、糖鎖のHPLC分析に一般的に使用されている。したがって、この糖鎖捕捉物質により捕捉した糖鎖またはその誘導体にこの基を導入した標識化サンプルの調製を容易に行うことが可能になる。この標識化サンプルを用いることにより、糖鎖捕捉物質により捕捉された糖鎖またはその誘導体を、逆相カラムを用いたHPLCにて高分解能、高感度で分析することが可能になる。
Rとしては、例えば軽水素化または重水素化アセチル基、軽水素化または重水素化スクシニル基、レブリノイル基などが挙げられ、これらを下記に示す。
(糖鎖捕捉物質の調製)
(1)チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
前記スキーム1にしたがって、化合物(h)を合成した。
(a)WR-OMe(化合物(b))の合成
Z-WR-OMe(10 mg, 20 mmol)および10% Pd/C(10mg)にメタノール(5ml)を加え、水素ガス雰囲気下、室温で2時間攪拌した。反応溶液を水系メンブレンフィルタでろ過することによりPd/Cを除去し、ろ液を減圧濃縮することで目的物である化合物(b)(WR-OMe)を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の[M+H]+イオンをm/z:376に観測した。
Bocアミノオキシ酢酸(2.5mmol)のTHF(6ml)溶液を-20℃に冷却した。ついでN-メチルモルホリン(3.0mmol)とギ酸イソブチル(3.0mmol)を添加し、15分攪拌することで混合酸無水物を調製した。反応溶液を0℃とし、別の反応溶液にて化合物(b)(WR-OMe(3.0mmol))を水(3ml)に溶解し、炭酸水素ナトリウム(3.0mmol)を添加することにより調製したWR-OMe溶液を混合し、1時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製することで目的物である化合物(d)(Boc-NHOCH2CO-W-R-OMe)を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の[M+H]イオンをm/z:547に観測した。
化合物(d)を水酸化ナトリウム/メタノール溶液で処理することでケン化し,化合物(e)を得た。
化合物(e)をメタノールに溶解し,WSC(水溶性カルボジイミド)を3等量加えた。1等量のアミノエタンチオール(f)を加え,2時間攪拌することで縮合物を調製した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することで目的化合物(g)を得た。
化合物(g)にTFA(2ml)を加え、−20℃で2時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエンを加え共沸を繰り返してTFAを除去して、目的物である化合物(h)を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の[M+H]イオンをm/z:493に観測した。
前記スキーム2にしたがって、化合物(h)の溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、室温で一昼夜静置後、純水で余剰試薬を除去して、式(2)の糖鎖捕捉物質を得た。
(生体試料の予備処理)
ヒト血清(5μl)をトリプシン消化することにより、含まれるタンパクをペプチド断片化した。トリプシンを熱変性で不活化したのち、ペプチド:NグリカナーゼF(Roche社製)処理によりペプチドから糖鎖を遊離させた。さらに、塩酸でpH2に調整し、90℃で1時間処理することにより、シアル酸含有糖鎖を脱シアリル化した。
実験例1で調製した糖鎖捕捉物質(10mg)に処理済み血清を添加した。酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液により反応液のpHを4に調整したのち、80℃で1時間静置することで糖鎖を糖鎖捕捉物質に結合させた。
糖鎖捕捉反応後の反応物を0.5%のSDS、50%のメタノール、純水で洗浄した。
洗浄後の反応物に、50mMジチオスレイトールを10μl添加し、室温で30分静置した。フィルタろ過により糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む下記式の化合物(t−1)を含むろ液と、糖鎖捕捉物質の担体を含む部分とを分離し、ろ液を回収した。
ろ液をMALDI-TOF-MSで測定したところ,図3に示したように,チャートにおいて血清から捕捉された糖鎖に化合物(h)が付加した分子量に相当するm/z値にシャープなピークを観測した。図3では、各ピークに対応して、m/z値から推定される糖鎖を模式的に示している。なお、図3において、還元末端の標識化合物(h)の構造は省略されている。
(糖鎖捕捉物質の調製)
(1)チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム3にしたがって、化合物(n)を合成した。
(a)(2-AB-Cys-OMe)2(化合物(k))の合成
(Cys-OMe)2(3.4g, 12.7mmol)をテトラヒドロフラン(THF)に溶解した。ついで2−アミノ安息香酸(2-aminobenzoic acid:(j))(3.5g, 25.4mmol)およびカルボジイミダゾールを添加し、室温で16時間攪拌した。生成物を重曹および食塩の飽和水溶液で抽出精製することで目的物である化合物(k)((2-AB-Cys-OMe)2)を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の[M+H]+イオンをm/z:507に観測した。
化合物(k)(5.0mg, 9.9mmol)および過剰量のヒドラジン水和物(l)をメタノールに溶解し、室温で16時間攪拌することで化合物(m)を得た。
化合物(m)を100mM DTT, 25mM重炭酸アンモニウム水溶液に溶解し、室温で1時間攪拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製することで化合物(n)を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の[M+H]+イオンをm/z:255に観測した。
前記スキーム4にしたがって、化合物(n)の水/アセトニトリル溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、室温で一昼夜静置後、純水で余剰試薬を除去して、式(3)の糖鎖捕捉物質を得た。
(糖鎖捕捉反応)
式(3)の糖鎖捕捉物質を、理論官能基量が300nmolとなるよう容器に測り取り、酢酸2%を含むアセトニトリルで分散させた。これに50μlのN-アセチルラクトサミン(LacNAc)を加え、80℃で1時間加熱することでLacNAcを糖鎖捕捉物質に捕捉させた。
反応物に100mMジチオスレイトール(DTT, 25mM重炭酸アンモニウム水溶液)を20μl添加し、60℃で30分静置した。フィルタろ過により糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む下記式の化合物(t−2)を含むろ液と、糖鎖捕捉物質の担体を含む部分とを分離し、ろ液を回収した。
ろ液をMALDI-TOF-MSで測定したところ、図4に示したように、チャートにおいてLacNAcに化合物(n)が付加した分子量に相当する場所にシャープなピークを観測した。図4において、ピーク(A)は糖鎖捕捉しなかった未反応物である化合物(n)由来であり、ピーク(B)は捕捉されなかった未反応物の糖鎖(LacNAc)由来であり、ピーク(C)は糖鎖(LacNAc)を捕捉した目的物由来である。
別途調製した化合物(t−2)をHPLCで測定したところ、図5に示す分離パターンが得られた。各ピークを分取してMALDI-TOF-MSで分析したところ、図中矢印で示すピーク位置に化合物(t−2)の分子量に相当するピークを観測した。
(糖鎖捕捉物質の調製)
(1)チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム5にしたがって重水素アセチル化リンカー(化合物(s−1))を合成した。
(a)化合物(q−1)の合成
実験例3で得られた化合物(k)(5.0g, 9.9mmol)をピリジンに溶解した。これに無水酢酸を過剰量添加し,室温で16時間攪拌することで化合物(q−1)を得た。
実験例3(1)(b)と同様の方法で化合物(q−1)とヒドラジン水和物(l)を反応させ,化合物(r−1)を得た。
実験例3(1)(c)と同様の方法で化合物(r−1)をDTTで処理し、化合物(s−1)を得た。得られた生成物をMALDI-TOF-MSで測定したところ,目的物の[M+H]+イオンをm/z:297に観測した。
(2)糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム4にしたがって、化合物(s−1)を含む溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、式(5)の糖鎖捕捉物質を得る。
(糖鎖捕捉物質の調製)
(1)チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム5にしたがって軽水素アセチル化リンカー(化合物(s−2))を合成した。
(a)化合物(q−2)の合成
実験例3で得られた化合物(k)(5.0g, 9.9mmol)をピリジンに溶解した。これに無水酢酸-d6を過剰量添加し,室温で16時間攪拌することで化合物(q−2)を得た。
実験例3(1)(b)と同様の方法で化合物(q−2)とヒドラジン水和物(l)を反応させ,化合物(r−2)を得た。
実験例3(1)(c)と同様の方法で化合物(r−2)をDTTで処理し、化合物(s−2)を得た。得られた生成物をMALDI-TOF-MSで測定したところ,目的物の[M+H]+イオンをm/z:300に観測した。
(2)糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム4にしたがって、化合物(s−2)を含む溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、式(6)の糖鎖捕捉物質を得る。
Claims (29)
- 生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含み、
前記糖鎖捕捉段階で用いられる前記糖鎖捕捉物質は、下記式(1)で示される、ジスルフィド結合を介して担体に固定化された構造を有し、前記切出段階はこのジスルフィド結合が切断される反応を含む分析試料調製方法。
(担体)−S−S−L−A (1)
(式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Lはリンカー部位であり、Aは糖鎖を捕捉する捕捉部位であってアミノオキシ基またはヒドラジド基からなり、−S−S−はジスルフィド結合である。) - 生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階と、
洗浄後に前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含み、
前記糖鎖捕捉段階で用いられる前記糖鎖捕捉物質は、下記式(1)で示される、ジスルフィド結合を介して担体に固定化された構造を有し、前記切出段階はこのジスルフィド結合が切断される反応を含む分析試料調製方法。
(担体)−S−S−L−A (1)
(式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Lはリンカー部位であり、Aは糖鎖を捕捉する捕捉部位であってアミノオキシ基またはヒドラジド基からなり、−S−S−はジスルフィド結合である。) - 請求項1または2に記載の分析試料調製方法において、
前記リンカー部位Lが、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むことを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項1または2に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉物質のリンカー部位Lが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むことを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項5に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉物質のリンカー部位Lが、システイン残基および2−アミノベンゾイル基を含むことを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項1または2に記載の分析試料調製方法において、
前記リンカー部位Lが、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基であることを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の分析試料調製方法において、
前記切出段階では、還元剤の作用により、ジスルフィド結合が切断されることを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉段階で行われる糖鎖捕捉物質と生体試料との反応は、pH4〜8の条件で行われることを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載の分析試料調製方法において、
前記切出段階で行われる糖鎖捕捉物質から糖鎖および/または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出す反応は、pHが中性付近の条件で行われることを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載の分析試料調製方法において、
式(1)中の担体が粒子であることを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載の分析試料調製方法において、
式(1)中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であることを特徴とする分析試料調製方法。 - 請求項1〜16のいずれか1項に記載の分析試料調製方法にて生体試料より調製されて得られる分析試料。
- 下記式(1)で示される構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質:
(担体)−S−S−L−A (1)
(式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Lはリンカー部位であり、Aは糖鎖を捕捉する捕捉部位であってアミノオキシ基またはヒドラジド基からなり、−S−S−はジスルフィド結合である)。 - 請求項18に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Lが、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。 - 請求項18に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Lが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。 - 請求項21に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Lが、システイン残基および2−アミノベンゾイル基を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。 - 請求項18に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Lが、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基であることを特徴とする糖鎖捕捉物質。 - 請求項18〜27のいずれか1項に記載の糖鎖捕捉物質において、
式(1)中の担体が粒子であることを特徴とする糖鎖捕捉物質。 - 請求項18〜27のいずれか1項に記載の糖鎖捕捉物質において、
式(1)中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であることを特徴とする糖鎖捕捉物質。
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