JPWO2007108204A1 - 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質 - Google Patents

分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2007108204A1
JPWO2007108204A1 JP2008506173A JP2008506173A JPWO2007108204A1 JP WO2007108204 A1 JPWO2007108204 A1 JP WO2007108204A1 JP 2008506173 A JP2008506173 A JP 2008506173A JP 2008506173 A JP2008506173 A JP 2008506173A JP WO2007108204 A1 JPWO2007108204 A1 JP WO2007108204A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sugar chain
substance
analytical sample
sample preparation
trapping
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2008506173A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5115988B2 (ja
Inventor
秀行 島岡
秀行 島岡
洋光 倉本
洋光 倉本
西村　紳一郎
紳一郎 西村
康郎 篠原
康郎 篠原
嘉晃 三浦
嘉晃 三浦
潤一 古川
潤一 古川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hokkaido University NUC
Sumitomo Bakelite Co Ltd
Original Assignee
Hokkaido University NUC
Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hokkaido University NUC, Sumitomo Bakelite Co Ltd filed Critical Hokkaido University NUC
Priority to JP2008506173A priority Critical patent/JP5115988B2/ja
Publication of JPWO2007108204A1 publication Critical patent/JPWO2007108204A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5115988B2 publication Critical patent/JP5115988B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/60—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxyl groups bound to nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/17—Nitrogen containing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/18—Sulfur containing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/18—Sulfur containing
    • Y10T436/182—Organic or sulfhydryl containing [e.g., mercaptan, hydrogen, sulfide, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階とを含む分析試料調製方法。

Description

本発明は、分析試料調製方法に関し、特に生体試料から糖鎖を分析するための分析試料として遊離させるための分析試料調製方法に関し、およびこの分析試料調製方法を用いて得られる分析試料に関し、さらにこの分析試料調製方法に使用される糖鎖捕捉物質に関する。
生体高分子は、医学、細胞工学、臓器工学などのバイオテクノロジー分野において重要な役割を担っており、これら物質による生体反応の制御機構を明らかにすることはバイオテクノロジー分野の発展に繋がることになる。
生体高分子の中でも、糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達，タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
なお、糖鎖とは、グルコース，ガラクトース，マンノース，フコース，キシロース，Ｎ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のペプチドグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの生体高分子に含まれる糖鎖が、他の生体高分子と互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
特許文献１には、このような糖鎖と特異的に反応しうる物質が記載されており、これらの物質を用いて糖鎖を分離などする方法が併せて記載されている。
国際公開第２００４／０５８６８７号パンフレット
ところで、特許文献１には、糖鎖捕捉物質に捕捉された糖鎖をこの糖鎖捕捉物質より遊離する（切り出す）ために、トリフルオロ酢酸や酸性樹脂などを用いた酸処理を用いる例が記載されている。このような過酷な条件に糖鎖をさらすことは、生体試料から取り出された糖鎖の末端に結合し、かつ、酸性条件で脱離しやすい性質を持つシアル酸残基の脱離など糖鎖の変性を引き起こすおそれがあり、より穏やかな条件での糖鎖切り出しを行うことが望まれていた。なお、糖鎖に結合するシアル酸の有無および結合場所は、疾患と関連することが多く、シアル酸が完全な状態で糖鎖を分析することが望まれ、分析前の前処理段階でシアル酸の一部でも脱離してしまうと正確な糖鎖情報を得ることができなくなるものである。
そこで、本発明は、糖鎖を含む生体試料より分析試料のための糖鎖を回収・精製するに際して、糖鎖捕捉物質を用いて糖鎖を捕捉し、この糖鎖の切り出しを穏やかな条件で行うことを可能にする分析試料調製方法、およびこの方法を適用して得られる分析試料、ならびにこの分析試料調製に用いられる糖鎖捕捉物質を提供することを目的としている。
本発明に係る分析試料調製方法は、
生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含む。
また、本発明に係る分析試料調製方法は、
生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階と、
洗浄後に前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含む。
前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質はジスルフィド結合を介して担体に固定化されており、前記切出段階はこのジスルフィド結合が切断される反応を含むことができる。
あるいは、前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉段階で用いられる糖鎖捕捉物質は、下記式（１）で示される構造を有してもよい：
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である）。
さらに、この分析試料調製方法において、捕捉部位Ａを、アミノオキシ基、ヒドラジド基のいずれかとすることができる。また、リンカー部位Ｌを、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むようにしてもよい。
また、前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質は、下記式（２）の構造を有してもよい：
Figure 2007108204
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質のリンカー部位Ｌが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むようにしてもよい。さらに、この糖鎖捕捉物質のリンカー部位Ｌが、システイン残基および２−アミノベンゾイル基を含んでいてもよい。
さらに、この分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質が、下記式（３）の構造を有してもよい：
Figure 2007108204
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
また、前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質が、下記式（４）の構造を有してもよい：
Figure 2007108204
（式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
さらに、この分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質が、下記式（５）または（６）の構造を有してもよい：
Figure 2007108204
また、前述した分析試料調製方法において、リンカー部位Ｌを、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基とすることができる。さらに、リンカー部位Ｌを、下記式に示す構造、または下記式に示す構造から任意に選ばれる複数の構造を組み合わせた構造を含むようにしてもよい。
Figure 2007108204
また、前述した分析試料調製方法において、切出段階では、還元剤の作用により、ジスルフィド結合を切断してもよい。
また、前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉段階で行われる糖鎖捕捉物質と生体試料との反応を、ｐＨ４〜８の条件で行ってもよい。
また、前述のいずれかの分析試料調製方法において、切出段階で行われる糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出す反応を、ｐＨが中性付近の条件で行ってもよい。
また、前述した分析試料調製方法において、式（１）中の担体が粒子であってもよい。
また、前述した分析試料調製方法において、式（１）中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であってもよい。
本発明に係る分析試料は、前述のいずれかの分析試料調製方法にて生体試料より調製されて得られるものである。
本発明に係る糖鎖捕捉物質は、
下記式（１）で示される構造を有することを特徴としている：
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である）。
この糖鎖捕捉物質において、捕捉部位Ａを、アミノオキシ基、ヒドラジド基のいずれかとすることができる。また、リンカー部位Ｌを、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むようにしてもよい。
あるいは、前述の糖鎖捕捉物質において、下記式（２）の構造を有してもよい：
Figure 2007108204
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
また、前述の糖鎖捕捉物質において、リンカー部位Ｌが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むようにしてもよい。さらに、このリンカー部位Ｌが、システイン残基および２−アミノベンゾイル基を含むようにしてもよい。
また、前述の糖鎖捕捉物質において、下記式（３）の構造を有してもよい：
Figure 2007108204
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
また、前述の糖鎖捕捉物質において、下記式（４）の構造を有してもよい：
Figure 2007108204
（式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
また、この糖鎖捕捉物質において、下記式（５）または（６）の構造を有してもよい：
Figure 2007108204
また、前述した糖鎖捕捉物質において、リンカー部位Ｌを、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基とすることができる。さらに、リンカー部位Ｌを、下記式に示す構造、または下記式に示す構造から任意に選ばれる複数の構造を組み合わせた構造を含むようにしてもよい。
Figure 2007108204
また、前述した糖鎖捕捉物質において、式（１）中の担体が粒子であってもよい。
また、前述した糖鎖捕捉物質において、式（１）中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であってもよい。
本発明によれば、糖鎖を含む生体試料より分析試料のための糖鎖を回収・精製するに際して、捕捉物質を用いて糖鎖を捕捉し、この糖鎖の切り出しを穏やかな条件で行うことを可能にする。
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
本発明に係る分析試料調製方法の実施形態の手順を示すフローチャートである。 本実施形態に係る分析試料調製方法を適用した装置を示すブロック図である。 実験例で得られた糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャートを示す図である。 実験例で得られた糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャートを示す図である。 図４で得られた目的物のＨＰＬＣによる分離パターンを示すグラフである。
以下に、本発明の分析試料調製方法およびこの方法を適用して得られる分析試料、ならびにこの方法に用いられる糖鎖捕捉物質について詳細に説明する。
図１は、本発明の分析試料調製方法にかかる実施形態として、糖鎖の捕捉、回収・精製の手順を示すフローチャートである。
本実施形態は、生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体（以下、単に「糖鎖」ということもある）を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階としてのステップＳ２０と、糖鎖捕捉反応後の糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階としてのステップＳ３０と、洗浄後に糖鎖捕捉物質から糖鎖を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階としてのステップＳ４０とを含む。
以下、図１に示した各ステップについて説明する。
ステップＳ１０では、糖鎖および／または糖の誘導体、例えば糖鎖を含む複合分子、例えば糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質などを含む所定の生体試料から糖鎖を回収・精製するための予備処理が行われる。
ここで、生体試料とは、生物由来の糖鎖が結合または付属する材料であれば特にその由来に限定はなく、動物、植物、細菌、ウイルス、培養細胞を問わないが、好ましくは動物由来の体液、例えば全血、血漿、血清、汗、唾液、尿、膵液、羊水、髄液、および動物由来の組織、例えば生検組織診断や手術により採取した試料などがあげられる。また、生体試料には、個体から予め分離されていないものも含まれ、例えば外部から試液が接触可能な粘膜組織、あるいは腺組織、好ましくは乳腺、前立腺、膵臓に付属する管組織の上皮が含まれる。
また、生体試料に行う予備処理としては、グリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解および必要に応じてプロテアーゼ処理、細胞破砕、脱脂処理、加熱変性処理が挙げられ、生体試料を予備処理して得られた試料は、溶液、分散液、懸濁液、乾燥体の状態で得られる。なお、予備処理済の生体試料は、そのまま次のステップで用いてもよいし、一度乾燥させて所望の溶液に溶解させてから次のステップで用いてもよい。
ステップＳ２０では、ステップＳ１０で得られた予備処理済の生体試料を用いて、特定の糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉させる糖鎖捕捉反応が行われる。
ここで、糖鎖捕捉反応、すなわち糖鎖捕捉物質と予備処理済の生体試料との反応は、予備処理済の試料に糖鎖捕捉物質を導入して、ｐＨが４〜８の条件にて、また反応温度が４〜９０℃、好ましくは２５〜９０℃、より好ましくは４０〜９０℃の条件における反応系で、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間行われる。
この反応で用いられる糖鎖捕捉物質は、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有する物質であり、このアミノオキシ基またはヒドラジド基が、水溶液などの溶液中で糖鎖より形成される環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡において、アルデヒド基と反応して特異的、かつ、安定な結合を形成して、糖鎖を捕捉することができるようになる。例えば、アミノオキシ基を例にとり、糖鎖捕捉反応とは、以下に示すような反応をいう。
Figure 2007108204
糖鎖捕捉物質は、ジスルフィド結合を介して担体に固定化されてものであり、後述するように、切出段階（ステップＳ４０）では、このジスルフィド結合が切断されることが好ましい。
このような糖鎖捕捉物質としては、具体的には、下記式（１）で示される構造を有するものが挙げられる。
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌがリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である。）
Ａは、前述のように、アミノオキシ基またはヒドラジド基であり、前述のように、糖鎖の環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡において、アルデヒド基と反応して糖鎖を捕捉する捕捉部位として機能する。
リンカー部位Ｌは、捕捉部位Ａとジスルフィド結合の部位とをつなぐリンカー部位を表す。
まず、リンカー部位Ｌの例として、ペプチド、オリゴペプチドおよびそれら誘導体から選ばれる部分を含む基が挙げられ、例えばアルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含んでいてもよい。
オリゴペプチドとしては、特にアルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインの少なくとも一つを含んだジペプチド（２量体）が好ましく、トリペプチド（３量体）以上のものであってもよい。
また、ペプチドまたはオリゴペプチドの誘導体としては、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびその他のアミノ酸の誘導体の少なくとも一つを含んだもの、およびこれらの化合物を構成する元素の一部が重元素化されたもの等が挙げられる。
式（１）中で、Ｌは、例えばジペプチドからなるリンカー部位とすることができ、例えば−アルギニン（Ｒ）−トリプトファン（Ｗ）−，−Ｒ−フェニルアラニン（Ｆ）−，−Ｒ−チロシン（Ｙ）−，−Ｒ−システイン（Ｃ）−などを挙げることができる。これらを代表して、以下の式（２）に、Ｌが−Ｒ−Ｗ−で示した構造を有する化合物を示す。
Figure 2007108204
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
このように、リンカー部位Ｌにアルギニン（Ｒ）残基を挿入すると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定時にイオン化が促進され，検出感度が向上することが知られている。また、トリプトファン（Ｗ）は蛍光性のアミノ酸であり、かつ疎水性であることから、逆相ＨＰＬＣでの分離性向上と、蛍光検出感度向上を図ることができる。なお、フェニルアラニンおよびチロシンを用いた場合には、ＵＶ吸収による検出に適している。
また、システインを用いた場合には、後述するようにシステイン残基を担体との結合部位として作用させることができるようになるため、下記スキーム１にて行う２−メルカプトエチルアミン（化合物（ｆ））を用いる反応などのチオール基を導入する反応を行う必要がなくなる。
式（２）に示した化合物は、下記のスキーム１に示したように、まず捕捉部位とリンカー部位とを備えた化合物（ｈ）を製造し、続くスキーム２にて、例えば活性化チオールセファロースを結合させた担体と反応させて得ることができる。
Figure 2007108204
Figure 2007108204
スキーム１において、化合物（ｂ）は、トリプトファン部分のアミノ基がフェニル基などにより保護された化合物（ａ）の脱保護により得られる。ここで、トリプトファン部分は、フェニルアラニン、チロシン、システインなどにより置換することもできる。
続いて、化合物（ｂ）とヒドロキシアミン（BocNHOCH2COOH）（ｃ）との混合酸無水物法などの縮合反応により、化合物（ｄ）が合成される。このヒドロキシアミンの保護基は、Bocに限られることはなく、Fmoc，Trocなどであってもよい。続いて、化合物（ｄ）の末端のメトキシ基の加水分解（ケン化）により、化合物（ｅ）が得られる。
化合物（ｅ）に２−メルカプトエチルアミン（化合物（ｆ））を作用させて縮合物（ｇ）を合成し、この縮合物（ｇ）を脱保護処理することにより、化合物（ｈ）が得られる。この脱保護処理としては、例えば保護基がＢｏｃである場合には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による処理が挙げられる。
また、上記式（１）のリンカーＬにおいて、標識化官能基を導入して、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を設けてもよい。標識化官能基としては、２−アミノベンゾイル基、ベンジル基、ナフチル基、アントラセニル基、ピリジル基などに代表される芳香族残基、Dansyl基、Fmoc基を含む置換基などが挙げられる。また、後述のように重水素化された（あるいはされていない）アセチル基などを含んでも良い。
２−アミノベンゾイル基を含む糖鎖捕捉物質としては、例えば上記式（１）において、リンカーＬに２−アミノベンゾイル基が含まれ、ジスルフィド結合の一方のイオウがシステイン由来の構造、例えば下記式（３）の構造を有するものが挙げられる。
Figure 2007108204
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
このような２−アミノベンゾイル基は、蛍光性を付与するための標識化合物であり、糖鎖のＨＰＬＣ分析に一般的に使用されている。したがって、この糖鎖捕捉物質により捕捉した糖鎖またはその誘導体にこの基を導入した標識化サンプルの調製を容易に行うことが可能になる。この標識化サンプルを用いることにより、糖鎖捕捉物質により捕捉された糖鎖またはその誘導体を、逆相カラムを用いたＨＰＬＣにて高分解能、高感度で分析することが可能になる。
式（３）に示した糖鎖捕捉物質は、下記のスキーム３に示したように、まず捕捉部位とリンカー部位とを備えた化合物（ｎ）を製造し、続くスキーム４にて、例えば活性化チオールセファロースを結合させた担体と反応させて得ることができる。
Figure 2007108204
Figure 2007108204
スキーム３において、シスチンのメチルエステル（化合物（ｉ））に、２−アミノ安息香酸（化合物（ｊ））を反応させて、化合物（ｉ）の窒素原子と化合物（ｊ）のカルボニル基との間でアミド結合を形成し、化合物（ｋ）が得られる。化合物（ｋ）と、ヒドラジン（化合物（ｌ））とを反応させて、アミノオキシ基を有する化合物（ｍ）が得られる。さらに、化合物（ｍ）をＤＴＴなどの還元剤を用いて還元し、ジスルフィド結合を切断して、２−アミノベンゾイル基と、システインとを有するアミノオキシ基含有化合物（ｎ）が得られる。
また、アセチル基を含む糖鎖捕捉物質としては、例えば上記式（３）において、２−アミノベンゾイル基が別の官能基で修飾された構造を有するもの、例えば上記式（１）において下記式（４）の構造を有するものが挙げられる。
Figure 2007108204
（式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
Ｒとしては、例えば軽水素化または重水素化アセチル基、軽水素化または重水素化スクシニル基、レブリノイル基などが挙げられ、これらを下記に示す。
Figure 2007108204
これらのうち、Ｒがアセチル基（-COCH3）、または重水素化アセチル基（-COCD3）であるものを好適に用いることができる。すなわち、上記式（４）において、下記（５）または（６）の構造を有するものを用いることができる。
Figure 2007108204
このようなアセチル基を導入することにより、捕捉した糖鎖またはその誘導体に重水素または軽水素を導入した標識化サンプル、すなわち重水素化または軽水素化サンプルの調製を容易に行うことが可能になる。
式（５）または（６）に示した糖鎖捕捉物質は、まず下記に示したようなスキーム５で調製された捕捉部位とリンカー部位とを備えた化合物（ｓ）を製造し、前述のスキーム４にて、例えば活性化チオールセファロースを結合させた担体と反応させて得ることができる。
Figure 2007108204
スキーム５において、前記スキーム３で得られた化合物（ｋ）に無水酢酸を作用させて、２−アミノベンゾイル基のアミノ基をアセチル化させて、化合物（ｑ）が得られる。このとき、無水酢酸である化合物（ｏ）を用いることにより軽水素化化合物（ｑ−１）が得られ、一方重水素化無水酢酸である化合物（ｐ）を用いることにより重水素化化合物（ｑ−２）が得られる。
続いて、化合物（ｑ−１）または（ｑ−２）と、ヒドラジンとを反応させて、アミノオキシ基を有する化合物（ｒ）が得られる。なお、化合物（ｒ）においてＲがアセチル基（-COCH3）であるときは軽水素化物（ｒ−１）が得られ、Ｒが重水素化アセチル基（-COCD3）であるときは重水素化物（ｒ−２）が得られる。
さらに、化合物（ｒ）にＤＴＴなどの還元剤を用いて還元し、ジスルフィド結合を切断して、アミノ基がアセチル化された２−アミノベンゾイル基と、システインとを有するアミノオキシ基含有化合物（ｓ）が得られる。なお、化合物（ｒ）においてＲがアセチル基（-COCH3）であるときは軽水素化物（ｓ−１）が得られ、Ｒが重水素化アセチル基（-COCD3）であるときは重水素化物（ｓ−２）が得られる。
以上のように、これらのような基をリンカー部位Ｌに導入する場合、捕捉された糖鎖を高精度かつ高感度に検出することができるようになる。
また、リンカー部位Ｌの例として、上述した標識化された基の他に、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基が挙げられ、例えば下記式に示す構造、または下記式に示す構造から任意に選ばれる複数の構造を組み合わせた構造を含むものであってもよい（式中、ｎは任意の整数を表す）。
Figure 2007108204
このように、標識化されていない基をリンカー部位Ｌに導入することにより、糖鎖捕捉物質を後述する固相基板からなる担体に適用することができる。
また、担体は無機物質または有機高分子物質であり、粒子、固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質の形態として用いられる。
ここで、担体として用いることができる無機物質としては、粒子状のものを用いることができ、例えばシリカ粒子、アルミナ粒子、ガラス粒子、金属粒子などが挙げられる。
また、有機高分子物質としては、アガロース、セファロースに代表される多糖類ゲル、ビニル化合物の重合体であるポリマーを粒子状にしたもの、固相基板の表面に固定化したものが挙げられる。また、これら物質を用いて固相基板の表面を構成してもよい。
また、粒子としたときの形状は球であることが好ましく、その粒径は、上限が２００μｍ、好ましくは１５０μｍであり、下限が２０μｍ、好ましくは５０μｍである。また、粒子の平均径は８０〜１００μｍである。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離，フィルタなどによる回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。粒径が上記の範囲よりも大幅に大きい場合、表面積が小さくなるために糖鎖との反応効率が低くなることがある。また、粒径が上記の範囲よりも大幅に小さい場合、特にフィルタによる粒子の回収が難しくなることがある。さらに、粒子をカラムに充填して用いる場合、粒径が過小であると通液の際の圧力損失が大きくなってしまうことがある。
また、固相基板としては、マイクロプレート、平板状の基板が挙げられる。このようにすることで、糖鎖捕捉物質を糖鎖マイクロアレイ用基板に適用して、分析試料を調製することが可能になる。
ここで、糖鎖捕捉反応は、上述のような粒子状の糖鎖捕捉物質をカラムなどに充填して予備処理済の生体試料を通してもよい（連続式）し、この粒子を予備処理済の生体試料中に投入して攪拌して行ってもよい（回分式）。また、粒子が予め充填された反応容器内に予備処理済みの生体試料を連続的に投入して攪拌して行ってもよい（半回分式）。
続いて、ステップＳ３０では、ステップＳ２０での糖鎖捕捉反応後の糖鎖捕捉物質を洗浄して、糖鎖捕捉物質に捕捉されなかった糖鎖、他の生体試料などを除去する。
ここで、糖鎖捕捉物質の洗浄に用いられる溶液としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に代表される界面活性剤の水溶液、メタノール、エタノールなどのアルコール類；水および水性緩衝液などが使用される。ここで、洗浄に水溶液が用いられる場合、この水溶液のｐＨは中性付近であることが好ましく、そのｐＨは４〜１０、より好ましくは６〜８である。
この洗浄処理は、前述したように連続式にて糖鎖捕捉反応を行った場合には、カラムに洗浄溶液を通して糖鎖捕捉反応から連続的に処理してもよい。また、回分式および半回分式の場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖鎖捕捉物質以外の物質を除去してもよい。
なお、ステップＳ３０の洗浄工程は、当初の生体試料の状態、例えば糖鎖以外の物質の混在の程度によっては行わなくても構わない。
ステップＳ４０では、必要に応じてステップＳ３０にて洗浄処理した後に、糖鎖捕捉物質から糖鎖を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる、すなわち前述した糖鎖捕捉物質を用いた場合、リンカー部位および捕捉部位からなる化合物を糖鎖捕捉物質から切り出す反応を行う。この際、捕捉部位は、糖鎖を捕捉したものと捕捉しなかったものの両方を含む。
この反応は、糖鎖捕捉物質に含まれるジスルフィド結合を切断する反応であって、これにより、担体とリンカー部位とが、短時間で高い反応率で切り離される。また、このジスルフィド結合の切断反応には、還元剤を作用させてもよく、使用可能な還元剤としてはジチオスレイトール、ジチオエリスリトール，２−メルカプトエタノール，２−メルカプトエチルアミンなどが挙げられる。これらの還元剤は固相化されているものを用いることもできる。
この反応は、ｐＨが中性付近、好ましくはｐＨ６〜９で行うことができ、このときの反応温度は４〜９０℃、好ましくは２５〜９０℃、より好ましくは４０〜９０℃で行うことができる。最も好ましい形態は、１〜１００ｍＭの重炭酸アンモニウム水溶液中での反応である。また、反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間である。
中性付近で、糖鎖切り出し反応を行うことができるため、従来のトリフルオロ酢酸による切出しのような強酸の存在下での切出し反応に比べて、シアル酸残基の脱離など捕捉された糖鎖の加水分解などを引き起こすことを抑制することができるようになる。
また、式（１）の構造中、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の部分は還元剤の作用により、効率よく切断することが可能なため、捕捉された糖鎖の遊離効率が高く、糖鎖分析の感度を高くすることができる。
ステップＳ５０では、切り出し反応により得られた捕捉部位を含む化合物と担体とを分離して、捕捉部位を含む化合物の部分を回収し、分析試料の調製処理は終了する。この回収方法としては、遠心分離、ろ過などの分離操作方法が挙げられる。
このようにして、糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む化合物が取り出される。なお、捕捉しなかった捕捉部位を含む化合物も一緒に取り出されるが、糖鎖の同定には差し支えなく、また両者を分離することも容易であるため、特段の問題にはならない。
図２は、本実施形態の分析試料調製方法を適用した装置を示すブロック図である。なお、各構成の説明で、図１のフローチャートの各手順に関連する場合には、そのステップ番号を併せて示す。
生体試料導入部１０には、生体試料を所定の手法で予備処理して（ステップＳ１０）得られた予備処理済の生体試料を装入し、この生体試料が後述する反応部１２に導入されるようになっている。
洗浄液導入部１４には、前述の糖鎖捕捉反応後の反応混合物の洗浄（ステップＳ３０）を行う際の洗浄液を装入し、この洗浄液が後述する反応部１２に導入されるようになっている。
還元剤導入部１６には、前述の糖鎖の切出段階（ステップＳ４０）で用いられる還元剤を含有する溶液を装入し、この還元剤の溶液が後述する反応部１２に導入されるようになっている。
反応部１２は、生体試料導入部１０、洗浄液導入部１４および還元剤導入部１６に接続されている。また、反応部１２には、例えば前述した粒子状の糖鎖捕捉物質が充填されており、この粒子が充填された部分において、糖鎖捕捉段階（ステップＳ２０）、洗浄段階（ステップＳ３０）、糖鎖切出段階（ステップＳ４０）を実行する場を提供するようになっている。
溶出物取出部１８は、反応部１２の溶出側に設けられており、切出段階（ステップＳ４０）の後に、反応部１２より糖鎖捕捉物質の担体から切り離された捕捉部位を含む化合物が溶出され、こうして得られる溶出物を取り出すことができるようになっている。
分離部２０では、溶出物取出部１８で得られる溶出物を装入して、捕捉部位を含む化合物と、担体とが、前述したような方法により分離されるようになっている。なお、分離部２０は、溶出物取出部１８と直接接続し、反応部１２からの溶出物が直接装入されるようになっていてもよいし、あるいは溶出物取出部１８にて得られる溶出物を人による操作により、装入されるようになっていてもよい。
この処理装置によれば、予備処理が済んだ生体試料を生体試料導入部１０より反応部１２に導入し、反応部１２では導入された生体試料を、前述したような条件で保持し、この生体試料から糖鎖が糖鎖捕捉物質により捕捉される糖鎖捕捉反応が起こる（ステップＳ２０）。
続いて、洗浄液導入部１４より洗浄液を反応部１２に導入し、糖鎖捕捉反応後の糖鎖捕捉物質の表面を前述した条件で洗浄して、生体試料の捕捉されなかった糖鎖以外の物質および未反応の糖鎖が洗い流される（ステップＳ３０）。
さらに、還元剤導入部１６より還元剤を含む溶液を反応部１２に導入して、前述した条件にて糖鎖捕捉物質の表面において、捕捉部位を含む化合物の切り出し反応が行われ、糖鎖捕捉物質の捕捉部位を含む化合物が切り出されて溶出され、溶出物取出部１８にて取り出される（ステップＳ４０）。
続いて、分離部２０では、この溶出物から、捕捉部位を含む化合物と担体とを分離し、捕捉部位を含む化合物を含む分析試料が得られる。
このようにして、糖鎖を含む生体試料より分析試料のための糖鎖を回収・精製するに際して、糖鎖捕捉物質を用いて糖鎖を捕捉し、この糖鎖を捕捉する化合物の切り出しを穏やかな条件で、例えば捕捉された糖鎖を分解することなく回収することが可能になる。また、生体試料より糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む化合物を含む分析試料が直接得られるため、この糖鎖の同定、定量が容易になる。
なお、捕捉しなかった捕捉部位を含む化合物も一緒に取り出されるが、糖鎖の同定には差し支えなく、また両者を分離することも容易であるため、特段の問題にはならない。
なお、図２では、生体試料導入、糖鎖捕捉工程（ステップＳ２０）、洗浄工程（ステップＳ３０）、糖鎖切出工程（ステップＳ４０）を連続的に処理するように構成された装置を説明したが、これに限定されることはなく、例えば生体試料に糖鎖捕捉物質からなる粒子を導入して、震とうまたは攪拌して、糖鎖を糖鎖捕捉物質に捕捉（ステップＳ２０）させて得られる反応物をフィルタにかけてろ過して、このフィルタ上で洗浄液を導入して洗浄（ステップＳ３０）した後に、ろ取した反応物に還元剤を作用させて、切り出し反応（ステップＳ４０）を行ってもよい。なお、各段階の処理を行う条件は上述したものが適用できる。
また、本実施形態に係る分析試料は、前述した分析試料調製方法にて生体試料より調製されて得られ、具体的には前記の糖鎖捕捉物質のジスルフィド結合由来のチオール基と、リンカー部位とを含む、例えば下記式（ｔ−１）および（ｔ−２）で示される物質として得られる。
Figure 2007108204
Figure 2007108204
したがって、このような分析試料は、リンカー部位にペプチド、２−アミノベンゾイル基、重水素化された官能基などを含んでいる。特に、ペプチドを含むものは、前述したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定による検出感度を向上させることができ、２−アミノベンゾイル基を含むものは前述したように蛍光を検出することでＨＰＬＣ分析が可能になる。
また、重水素化された官能基を含むものは、質量分析による検出感度を向上させ、定性および定量が可能になる。
例えば、化合物（６）の糖鎖捕捉物質を用いて重水素化されたサンプルおよび化合物（５）を用いて軽水素化されたサンプルを組み合わせて用いることにより、例えば未知の糖鎖含有サンプル（例えば、血清を処理したもの）に含まれる糖鎖の質量分析による定性および定量分析が可能になる。
これにより、例えば組成も濃度も既知のサンプルを重水素標識化し、未知のサンプルを軽水素標識化して、両サンプルを混合してから質量分析を行った場合、重水素化サンプルの各ピークは軽水素化サンプルの対応する各ピークよりも導入した重水素の数だけ高分子量の方にシフトして観測される。そこで、各ピークの位置（ｍ／ｚ値）および強度を解析して、未知のサンプルの各ピークが示す糖鎖の種類と、そのサンプル中の濃度とがわかる。このような解析は、既知サンプルを軽水素化し、未知サンプルを重水素化することによっても可能である。
また、この解析において、健常人から採取したサンプルを重水素化し、疾病患者から採取したサンプルを軽水素化することにより、あるいは健常者サンプルを軽水素化し、疾病患者サンプルを重水素化することにより、両者のサンプル中に含まれる糖鎖の種類、量における相違を解析することが可能になる。したがって、このような分析試料は、糖の代謝が関与する生体反応に基づく疾病の診断、このような生体反応を制御することによる治療などの用途に好適に使用される。
また、本実施形態の分析試料は、分子中にジスルフィド結合由来のチオール基（−ＳＨ）が存在する。このチオール基と特異的に反応する化合物を、この分析試料に導入することができる。例えば、この化合物としてＩＣＡＴ（Isotope Coded Affinity Tag）試薬を用いることにより、本実施形態の分析試料をＩＣＡＴ法による定量分析に適用させることができる。
以下、本発明を以下の実験例からなる実施例により説明する。しかし、本発明はこれら実験例に限定されるものではない。
（実験例１）
（糖鎖捕捉物質の調製）
（１）チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
前記スキーム１にしたがって、化合物（ｈ）を合成した。
（ａ）WR-OMe（化合物（ｂ））の合成
Z-WR-OMe（10 mg, 20 mmol）および10% Pd/C（10mg）にメタノール（5ml）を加え、水素ガス雰囲気下、室温で２時間攪拌した。反応溶液を水系メンブレンフィルタでろ過することによりPd/Cを除去し、ろ液を減圧濃縮することで目的物である化合物（ｂ）（WR-OMe）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］+イオンをm/z：376に観測した。
（ｂ）Boc-NHOCH2CO-W-R-OMe（化合物（ｄ））の合成
Bocアミノオキシ酢酸（2.5mmol）のＴＨＦ（6ml）溶液を-20℃に冷却した。ついでN-メチルモルホリン（3.0mmol）とギ酸イソブチル（3.0mmol）を添加し、１５分攪拌することで混合酸無水物を調製した。反応溶液を０℃とし、別の反応溶液にて化合物（ｂ）（WR-OMe（3.0mmol））を水（３ｍｌ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム（3.0mmol）を添加することにより調製したWR-OMe溶液を混合し、１時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製することで目的物である化合物（ｄ）（Boc-NHOCH2CO-W-R-OMe）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］イオンをm/z：547に観測した。
（ｃ）Boc-NHOCH2CO-W-R-OH（化合物（ｅ））の合成
化合物（ｄ）を水酸化ナトリウム／メタノール溶液で処理することでケン化し，化合物（ｅ）を得た。
（ｄ）Boc-NHOCH2CO-W-R-NHCH2CH2SH（化合物（ｇ））の合成
化合物（ｅ）をメタノールに溶解し，ＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）を３等量加えた。１等量のアミノエタンチオール（ｆ）を加え，２時間攪拌することで縮合物を調製した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することで目的化合物（ｇ）を得た。
（ｅ）NH2OCH2CO-W-R-NHCH2CH2SH（化合物（ｈ））の合成
化合物（ｇ）にＴＦＡ（2ml）を加え、−２０℃で２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエンを加え共沸を繰り返してＴＦＡを除去して、目的物である化合物（ｈ）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］イオンをm/z：493に観測した。
（２）糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム２にしたがって、化合物（ｈ）の溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、室温で一昼夜静置後、純水で余剰試薬を除去して、式（２）の糖鎖捕捉物質を得た。
Figure 2007108204
（実験例２）
（生体試料の予備処理）
ヒト血清（５μｌ）をトリプシン消化することにより、含まれるタンパクをペプチド断片化した。トリプシンを熱変性で不活化したのち、ペプチド：ＮグリカナーゼＦ（Roche社製）処理によりペプチドから糖鎖を遊離させた。さらに、塩酸でｐＨ２に調整し、９０℃で１時間処理することにより、シアル酸含有糖鎖を脱シアリル化した。
（糖鎖捕捉反応）
実験例１で調製した糖鎖捕捉物質（10mg）に処理済み血清を添加した。酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液により反応液のｐＨを４に調整したのち、８０℃で１時間静置することで糖鎖を糖鎖捕捉物質に結合させた。
（洗浄）
糖鎖捕捉反応後の反応物を0.5%のSDS、50%のメタノール、純水で洗浄した。
（糖鎖切出（遊離）反応）
洗浄後の反応物に、５０ｍＭジチオスレイトールを１０μｌ添加し、室温で３０分静置した。フィルタろ過により糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む下記式の化合物（ｔ−１）を含むろ液と、糖鎖捕捉物質の担体を含む部分とを分離し、ろ液を回収した。
Figure 2007108204
（MALDI-TOF-MS分析）
ろ液をMALDI-TOF-MSで測定したところ，図３に示したように，チャートにおいて血清から捕捉された糖鎖に化合物（ｈ）が付加した分子量に相当するｍ／ｚ値にシャープなピークを観測した。図３では、各ピークに対応して、ｍ／ｚ値から推定される糖鎖を模式的に示している。なお、図３において、還元末端の標識化合物（ｈ）の構造は省略されている。
（実験例３）
（糖鎖捕捉物質の調製）
（１）チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム３にしたがって、化合物（ｎ）を合成した。
（ａ）(2-AB-Cys-OMe)2（化合物（ｋ））の合成
(Cys-OMe)2（3.4g, 12.7mmol）をテトラヒドロフラン（THF）に溶解した。ついで２−アミノ安息香酸（2-aminobenzoic acid：（ｊ））（3.5g, 25.4mmol）およびカルボジイミダゾールを添加し、室温で１６時間攪拌した。生成物を重曹および食塩の飽和水溶液で抽出精製することで目的物である化合物（ｋ）（(2-AB-Cys-OMe)2）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］+イオンをm/z：507に観測した。
（ｂ）(2-AB-Cys-CONHNH2)2（化合物（ｍ））の合成
化合物（ｋ）（5.0mg, 9.9mmol）および過剰量のヒドラジン水和物（ｌ）をメタノールに溶解し、室温で１６時間攪拌することで化合物（ｍ）を得た。
（ｃ）2-AB-Cys-CONHNH2（化合物（ｎ））の合成
化合物（ｍ）を100mM DTT, 25mM重炭酸アンモニウム水溶液に溶解し、室温で１時間攪拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製することで化合物（ｎ）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］+イオンをm/z：255に観測した。
（２）糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム４にしたがって、化合物（ｎ）の水／アセトニトリル溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、室温で一昼夜静置後、純水で余剰試薬を除去して、式（３）の糖鎖捕捉物質を得た。
Figure 2007108204
（実験例４）
（糖鎖捕捉反応）
式（３）の糖鎖捕捉物質を、理論官能基量が300nmolとなるよう容器に測り取り、酢酸２％を含むアセトニトリルで分散させた。これに５０μｌのN-アセチルラクトサミン（LacNAc）を加え、80℃で１時間加熱することでLacNAcを糖鎖捕捉物質に捕捉させた。
（糖鎖切出（遊離）反応）
反応物に100mMジチオスレイトール（DTT, 25mM重炭酸アンモニウム水溶液）を２０μｌ添加し、６０℃で３０分静置した。フィルタろ過により糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む下記式の化合物（ｔ−２）を含むろ液と、糖鎖捕捉物質の担体を含む部分とを分離し、ろ液を回収した。
Figure 2007108204
（MALDI-TOF-MS分析）
ろ液をMALDI-TOF-MSで測定したところ、図４に示したように、チャートにおいてLacNAcに化合物（ｎ）が付加した分子量に相当する場所にシャープなピークを観測した。図４において、ピーク（Ａ）は糖鎖捕捉しなかった未反応物である化合物（ｎ）由来であり、ピーク（Ｂ）は捕捉されなかった未反応物の糖鎖（LacNAc）由来であり、ピーク（Ｃ）は糖鎖（LacNAc）を捕捉した目的物由来である。
（HPLC分析）
別途調製した化合物（ｔ−２）をＨＰＬＣで測定したところ、図５に示す分離パターンが得られた。各ピークを分取してMALDI-TOF-MSで分析したところ、図中矢印で示すピーク位置に化合物（ｔ−２）の分子量に相当するピークを観測した。
（実験例５）
（糖鎖捕捉物質の調製）
（１）チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム５にしたがって重水素アセチル化リンカー（化合物（ｓ−１））を合成した。
（ａ）化合物（ｑ−１）の合成
実験例３で得られた化合物（ｋ）（5.0g, 9.9mmol）をピリジンに溶解した。これに無水酢酸を過剰量添加し，室温で１６時間攪拌することで化合物（ｑ−１）を得た。
（ｂ）化合物（ｒ−１）の合成
実験例３（１）（ｂ）と同様の方法で化合物（ｑ−１）とヒドラジン水和物（ｌ）を反応させ，化合物（ｒ−１）を得た。
（ｃ）化合物（ｓ−１）の合成
実験例３（１）（ｃ）と同様の方法で化合物（ｒ−１）をＤＴＴで処理し、化合物（ｓ−１）を得た。得られた生成物をMALDI-TOF-MSで測定したところ，目的物の［M+H］+イオンをm/z：297に観測した。
（２）糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム４にしたがって、化合物（ｓ−１）を含む溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、式（５）の糖鎖捕捉物質を得る。
（実験例６）
（糖鎖捕捉物質の調製）
（１）チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム５にしたがって軽水素アセチル化リンカー（化合物（ｓ−２））を合成した。
（ａ）化合物（ｑ−２）の合成
実験例３で得られた化合物（ｋ）（5.0g, 9.9mmol）をピリジンに溶解した。これに無水酢酸-d6を過剰量添加し，室温で１６時間攪拌することで化合物（ｑ−２）を得た。
（ｂ）化合物（ｒ−２）の合成
実験例３（１）（ｂ）と同様の方法で化合物（ｑ−２）とヒドラジン水和物（ｌ）を反応させ，化合物（ｒ−２）を得た。
（ｃ）化合物（ｓ−２）の合成
実験例３（１）（ｃ）と同様の方法で化合物（ｒ−２）をＤＴＴで処理し、化合物（ｓ−２）を得た。得られた生成物をMALDI-TOF-MSで測定したところ，目的物の［M+H］+イオンをm/z：300に観測した。
（２）糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム４にしたがって、化合物（ｓ−２）を含む溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、式（６）の糖鎖捕捉物質を得る。
Figure 2007108204

Claims (33)

  1. 生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
    糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
    を含む分析試料調製方法。
  2. 生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
    糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階と、
    洗浄後に前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
    を含む分析試料調製方法。
  3. 請求項１または２に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉物質はジスルフィド結合を介して担体に固定化されており、前記切出段階はこのジスルフィド結合が切断される反応を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
  4. 請求項１または２に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉段階で用いられる糖鎖捕捉物質は、下記式（１）で示される構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
    （担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ （１）
    （式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である）。
  5. 請求項４に記載の分析試料調製方法において、
    前記捕捉部位Ａが、アミノオキシ基、ヒドラジド基のいずれかであることを特徴とする分析試料調製方法。
  6. 請求項４に記載の分析試料調製方法において、
    前記リンカー部位Ｌが、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
  7. 請求項３または４に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉物質は、下記式（２）の構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
    Figure 2007108204
    （式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
  8. 請求項４に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉物質のリンカー部位Ｌが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
  9. 請求項８に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉物質のリンカー部位Ｌが、システイン残基および２−アミノベンゾイル基を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
  10. 請求項９に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉物質が、下記式（３）の構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
    Figure 2007108204
    （式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
  11. 請求項９に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉物質が、下記式（４）の構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
    Figure 2007108204
    （式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
  12. 請求項１１に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉物質が、下記式（５）または（６）の構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
    Figure 2007108204
  13. 請求項４に記載の分析試料調製方法において、
    前記リンカー部位Ｌが、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基であることを特徴とする分析試料調製方法。
  14. 請求項１３に記載の分析試料調製方法において、
    前記リンカー部位Ｌが、下記式に示す構造、または下記式に示す構造から任意に選ばれる複数の構造を組み合わせた構造を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
    Figure 2007108204
  15. 請求項３〜１４のいずれか１項に記載の分析試料調製方法において、
    前記切出段階では、還元剤の作用により、ジスルフィド結合が切断されることを特徴とする分析試料調製方法。
  16. 請求項４に記載の分析試料調製方法において、
    前記糖鎖捕捉段階で行われる糖鎖捕捉物質と生体試料との反応は、ｐＨ４〜８の条件で行われることを特徴とする分析試料調製方法。
  17. 請求項１〜１６のいずれかに記載の分析試料調製方法において、
    前記切出段階で行われる糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出す反応は、ｐＨが中性付近の条件で行われることを特徴とする分析試料調製方法。
  18. 請求項４に記載の分析試料調製方法において、
    式（１）中の担体が粒子であることを特徴とする分析試料調製方法。
  19. 請求項４に記載の分析試料調製方法において、
    式（１）中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であることを特徴とする分析試料調製方法。
  20. 請求項１〜１９のいずれかに記載の分析試料調製方法にて生体試料より調製されて得られる分析試料。
  21. 下記式（１）で示される構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
    （担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ （１）
    （式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である）。
  22. 請求項２１に記載の糖鎖捕捉物質において、
    前記捕捉部位Ａが、アミノオキシ基、ヒドラジド基のいずれかであることを特徴とする糖鎖捕捉物質。
  23. 請求項２１に記載の糖鎖捕捉物質において、
    前記リンカー部位Ｌが、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。
  24. 請求項２１に記載の糖鎖捕捉物質において、
    下記式（２）の構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
    Figure 2007108204
    （式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
  25. 請求項２１に記載の糖鎖捕捉物質において、
    前記リンカー部位Ｌが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。
  26. 請求項２５に記載の糖鎖捕捉物質において、
    前記リンカー部位Ｌが、システイン残基および２−アミノベンゾイル基を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。
  27. 請求項２６に記載の糖鎖捕捉物質において、
    下記式（３）の構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
    Figure 2007108204
    （式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
  28. 請求項２６に記載の糖鎖捕捉物質において、
    下記式（４）の構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
    Figure 2007108204
    （式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
  29. 請求項２８に記載の糖鎖捕捉物質において、
    下記式（５）または（６）の構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
    Figure 2007108204
  30. 請求項２１に記載の糖鎖補足物質において、
    前記リンカー部位Ｌが、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基であることを特徴とする糖鎖補足物質。
  31. 請求項３０に記載の糖鎖補足物質において、
    前記リンカー部位Ｌが、下記式に示す構造、または下記式に示す構造から任意に選ばれる複数の構造を組み合わせた構造を含むことを特徴とする糖鎖補足物質。
    Figure 2007108204
  32. 請求項２１に記載の糖鎖補足物質において、
    式（１）中の担体が粒子であることを特徴とする糖鎖捕捉物質。
  33. 請求項２１に記載の糖鎖補足物質において、
    式（１）中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であることを特徴とする糖鎖捕捉物質。
JP2008506173A 2006-03-16 2007-03-13 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質 Expired - Fee Related JP5115988B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008506173A JP5115988B2 (ja) 2006-03-16 2007-03-13 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006073170 2006-03-16
JP2006073170 2006-03-16
PCT/JP2007/000214 WO2007108204A1 (ja) 2006-03-16 2007-03-13 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質
JP2008506173A JP5115988B2 (ja) 2006-03-16 2007-03-13 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2007108204A1 true JPWO2007108204A1 (ja) 2009-08-06
JP5115988B2 JP5115988B2 (ja) 2013-01-09

Family

ID=38522240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008506173A Expired - Fee Related JP5115988B2 (ja) 2006-03-16 2007-03-13 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質

Country Status (3)

Country Link
US (1) US7964410B2 (ja)
JP (1) JP5115988B2 (ja)
WO (1) WO2007108204A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5076878B2 (ja) * 2007-12-25 2012-11-21 住友ベークライト株式会社 糖タンパク質糖鎖の分析方法
JP5130999B2 (ja) * 2008-03-31 2013-01-30 住友ベークライト株式会社 抗癌剤の有効性予測方法
KR101578960B1 (ko) * 2008-04-30 2015-12-18 스미토모 베이클리트 컴퍼니 리미티드 당쇄 표지 방법
US20160168196A1 (en) * 2013-08-16 2016-06-16 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Compound for labeling sugar chain sample
CN109482150A (zh) * 2017-09-11 2019-03-19 中国科学院大连化学物理研究所 一种糖肽或糖蛋白富集材料及其制备和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003313197A (ja) * 2002-04-19 2003-11-06 Japan Science & Technology Corp 高い会合速度定数を有するリガンドの生産方法、およびこの生産方法を実施するリガンド生産システム
CN101104594A (zh) 2002-12-26 2008-01-16 盐野义制药株式会社 用捕捉糖链的分子纯化/浓缩糖链的方法和分析糖链结构的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007108204A1 (ja) 2007-09-27
US20090068752A1 (en) 2009-03-12
JP5115988B2 (ja) 2013-01-09
US7964410B2 (en) 2011-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5301705B2 (ja) 糖鎖捕捉物質およびその用途
Kramer et al. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides
Lee et al. Fabrication of chemical microarrays by efficient immobilization of hydrazide-linked substances on epoxide-coated glass surfaces
JP5115988B2 (ja) 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質
JP2008530538A (ja) 固相のオリゴ糖タグ付け：固定化糖質の操作技術
WO2011109326A2 (en) Crosslinking reagents, methods, and compositions for studying protein-protein interactions
JP4783292B2 (ja) 分析試料調製方法および分析試料ならびに分析試料調製用化合物
Duléry et al. Ethoxyethylidene protecting group prevents N-overacylation in aminooxy peptide synthesis
Richardson et al. Exploring neoglycoprotein assembly through native chemical ligation using neoglycopeptide thioesters prepared via N→ S acyl transfer
CA2700587A1 (en) Glycoproteins and glycosylated cells and a method for the preparation of the same
JPH03501623A (ja) 蛋白誘導体及びその調製法
WO1995018971A1 (en) Methods for the solid phase synthesis of glycoconjugates
JP2023514316A (ja) ペプチドおよびタンパク質のｃ末端の標識法
CN112898172A (zh) 可被羧肽酶酶解的双亲和功能团化合物的合成方法
WO2022260135A1 (ja) 固相抽出を利用した蛍光プローブライブラリの調製方法、及びこれを用いた酵素活性計測方法
JP3587390B2 (ja) リン酸化アミノ酸誘導体及びリン酸化ペプチド合成方法
JP2018145151A (ja) 多機能型ペプチドプローブ及びこれを用いた標的分子の選択的濃縮法
Galibert et al. Preparation of peptide and other biomolecular conjugates through chemoselective ligations
AU2021210878A1 (en) Compounds and methods for selective C-terminal labeling
Brimble et al. Recent Developments in Neoglycopeptide Synthesis
JP2005291836A (ja) 標的物質濃縮用機能性タグ、及び該機能性タグの使用方法
JP2006008692A (ja) 人工複合糖質

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20100309

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120508

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120709

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120918

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20121010

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151026

Year of fee payment: 3

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees