JP5301707B2 - 糖鎖捕捉物質およびその用途 - Google Patents
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Description
(1)ヒドラジド基を含む物質Aと、糖鎖および/または糖の誘導体とを、当該物質Aのヒドラジド基と当該糖鎖および/または糖の誘導体の還元末端との間のヒドラゾン形成によって結合することを特徴とする試料調製方法。
(2)物質Aがクロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むことを特徴とする(1)項に記載の試料調製方法。
(3)物質Aが下記から選ばれる物質またはその塩である(1)項に記載の試料調製方法。
(物質A):5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine (Dansylhydrazine); 2-hydrazinopyridine;9-fluorenylmethyl carbazate (Fmoc hydrazine);benzylhydrazine;4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide;2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide;7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide (DCCH);phenylhydrazine;1-Naphthaleneacethydrazide;2-hydrazinobenzoic acid;biotin hydrazide;phenylacetic hydrazide
(4)物質Aがアルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基およびこれら誘導体の少なくとも一つからなる部分を含む(1)項に記載の試料調製方法。
(5)物質Aが下記(式1)の構造を有する化合物である(4)項に記載の試料調製方法。
(6)物質Aが下記(式2)の構造を有する(1)項に記載の試料調製方法。
(7)物質Aが下記(式3)で表される(1)項に記載の試料調製方法。
(8)物質Aが下記の(式4)で表される架橋型ポリマー構造を有する(7)項に記載の試料調製方法。
(9)物質Aが下記の(式5)で表される架橋型ポリマー構造を有する(7)項に記載の試料調製方法。
(10)物質Aが平均粒径0.1μm以上500μm以下のポリマー粒子である(7)項〜(9)項のいずれか一項に記載の試料調製方法。
(11)物質Aが乾燥重量1mg当り100nmol以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である(7)項〜(10)項のいずれか一項に記載の試料調製方法。
(12)物質Aが乾燥重量1mg当り0.5μmol以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である(7)項〜(10)項のいずれか一項に記載の試料調製方法。
(13)物質AがpH3〜8で安定である(7)項〜(12)項のいずれか一項に記載の試料調製方法。
(14)物質Aが少なくとも1MPa以下の圧力下で安定である(7)項〜(12)項のいずれか一項に記載の試料調製方法。
(15)(7)項において、前記式(3)中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であることを特徴とする試料調製方法。
(16)(1)項〜(15)項のいずれか一項に記載の試料調製方法により物質Aと糖鎖および/または糖の誘導体とを結合させる糖鎖捕捉段階と、
前記糖鎖捕捉段階で捕捉された物質Aと糖鎖および/または糖の誘導体との複合体に、アミノオキシ基またはヒドラジド基を含む物質Bを作用させて、前記複合体と前記物質Bの間で生じるヒドラゾン−オキシム交換反応またはヒドラゾン−ヒドラゾン交換反応により、前記糖鎖および/または糖の誘導体を前記物質Aから切り離しつつ前記物質Bに結合させる糖鎖遊離段階と
を含む試料調製方法。
(17)物質Bがクロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むことを特徴とする(16)項に記載の試料調製方法。
(18)物質Bが下記のヒドラジド基を含む物質またはアミノオキシ基を含む物質からなる群から選ばれる物質または塩である(16)項に記載の試料調製方法。
(ヒドラジド基を含む物質)5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine (Dansylhydrazine);2-hydrazinopyridine;9-fluorenylmethyl carbazate (Fmoc hydrazine);benzylhydrazine;4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide;2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide;7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide (DCCH);phenylhydrazine;1-Naphthaleneacethydrazide;2-hydrazinobenzoic acid;phenylacetic hydrazide;
(アミノオキシ基を含む物質)O-benzylhydroxylamine;O-phenylhydroxylamine;O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine;O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine;2-aminooxypyridine;2-aminooxymethylpyridine;4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester;4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester;4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester。
(19)物質Bがアルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基およびこれら誘導体の少なくとも一つからなる部分を含む(16)項に記載の試料調製方法。
(20)物質Bが下記の(式7)で表される構造を有する(16)項に記載の試料調製方法。
(21)物質Bが固相担体である(16)項に記載の試料調製方法。
(22)物質Bがアミノオキシ基を含む固相担体である(21)項に記載の試料調製方法。
(23)物質Bが下記(式12)で表される(22)項に記載の試料調製方法。
(24)物質Bが下記の(式8)で表される構造を有するポリマー粒子である(23)項に記載の試料調製方法。
(25)物質Bが下記の(式9)で表される構造を有するポリマー粒子である(23)項に記載の試料調製方法。
(26)(21)項において、前記固相担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であることを特徴とする試料調製方法。
(27)(16)項〜(25)項のいずれか一項に記載の製造方法において、前記糖鎖遊離段階の後に、ヒドラゾン−オキシム交換またはヒドラゾン−ヒドラゾン交換反応を、少なくとも1回以上行うことを特徴とする試料調製方法。
(28)糖鎖および/または糖の誘導体を結合させた、下記の(式3)、(式4)または(式5)で表される構造を有する物質Aを、酸性条件で処理することにより、ヒドラゾン結合を解離させ、糖鎖および/または糖の誘導体を遊離させることを特徴とする試料調製方法。
(29)酸性条件での処理が、0.01〜10体積パーセントのトリフルオロ酢酸溶液による処理である(28)項に記載の試料調製方法。
(30)酸性条件での処理が、0.01〜1体積パーセントのトリフルオロ酢酸溶液による処理であり、25〜80℃で5〜60分間行われる(29)項に記載の試料調製方法。
(31)(1)項〜(30)項のいずれか一項に記載の試料調製方法により調製された分析試料。
(32)下記(式3)で表される物質Aの製造方法であって、
重合性基を含むカルボン酸エステルモノマーを含む原料を架橋剤存在下で重合させてカルボン酸エステル含有ポリマー粒子を得た後、当該カルボン酸エステル含有ポリマー粒子を10体積パーセント以上の濃度のヒドラジン溶液で処理することを特徴とする物質Aの製造方法。
(33)前記カルボン酸エステルモノマーがカルボン酸メチルエステルである(32)項に記載の物質Aの製造方法。
(34)下記の(式10)で表される構造を有するモノマー。
(35)(34)項に記載のモノマーを重合させて得られる重合体。
(36)下記の(式11)で表される構造を有するモノマー。
(38)下記の(式13)で表される構造を有するモノマー。
(39)(38)項に記載のモノマーを重合させて得られる重合体。
(40)(39)項に記載の重合体において、前記(式13)の保護基[P]を、酸処理により脱保護して得られる重合体。
(41)下記の(式14)で表される構造を有するモノマー。
(43)(42)項に記載の重合体のt-butoxycarbonyl基を、酸処理により脱保護して得られる重合体。
(44)下記(式4)で表される物質Aの製造方法であって、
下記(式10)の構造を有するモノマーを架橋剤存在下で重合してカルボン酸エステル含有ポリマー粒子を得た後、当該カルボン酸エステル含有ポリマー粒子を10体積パーセント以上の濃度のヒドラジン溶液で処理することを特徴とする物質Aの製造方法。
(45)下記(式5)で表される物質Aの製造方法であって、
下記(式11)の構造を有するモノマーを架橋剤存在下で重合してカルボン酸エステル含有ポリマー粒子を得た後、当該カルボン酸エステル含有ポリマー粒子を10体積パーセント以上の濃度のヒドラジン溶液で処理することを特徴とする物質Aの製造方法。
(47)下記(式3)または(式12)で表される構造を有する物質Bからなる固相担体で構成される固相基板の表面に下記(工程1)〜(工程4)によって糖鎖および/または糖の誘導体を固定化する糖鎖マイクロアレイの製造方法。
(工程1)糖鎖および/または糖の誘導体と可溶性のヒドラジド基含有化合物とを結合させ、所定の分離手段によって糖鎖および/または糖の誘導体を、精製、および/または単離する工程。
(工程2)工程1で得られた化合物の溶液を、前記固相基板上に整列的に点着する工程。
(工程3)点着後の固相基板を所定の条件でインキュベートすることにより、糖鎖−物質Aの結合を、固相基板−糖鎖の結合に交換する反応を進行させ、糖鎖および/または糖の誘導体を固相基板に固定化する工程。
(工程4)固相基板上の未反応物を洗浄除去する工程。
(48)(47)項に記載の方法により製造される糖鎖マイクロアレイ。
(49)(48)項に記載の糖鎖マイクロアレイの表面に、検体を含む溶液を接触させ、所定の条件でインキュベートおよび洗浄操作を行った後に、固相基板上の点着部位の糖鎖および/または糖の誘導体に捕集された糖結合性物質を検出することにより、固定化された糖鎖および/または糖の誘導体と特異的に結合または吸着する糖結合性物質を探索するシステム。
(50)(48)項に記載の糖鎖マイクロアレイの表面に、検体を含む溶液を接触させ、固相基板上の点着部位の糖鎖および/または糖の誘導体に、前記検体中の糖結合性タンパク質を捕集させ、捕集した量を所定の定量化手段で定量化する結合性タンパク質の認識特異性を評価するシステム。
(51)下記(式3)または(式12)で表される構造を有する物質Bからなる固相担体で構成されるポリマーの表面に、糖鎖および/または糖の誘導体を固定化する糖鎖アフィニティビーズの製造方法。
(52)(51)項に記載の糖鎖アフィニティビーズの製造方法において、
前記ポリマー粒子の表面に下記(工程1)〜(工程3)によって糖鎖および/または糖の誘導体を固定化することを特徴とする糖鎖アフィニティビーズの製造方法。
(工程1)糖鎖および/または糖の誘導体と可溶性のヒドラジド基含有化合物とを結合させ、所定の分離手段によって糖鎖および/または糖の誘導体を、精製、および/または単離する工程。
(工程2)工程1で得られた化合物を、前記ポリマー粒子と接触させ、所定の条件でインキュベートすることにより、糖鎖−ヒドラジド基含有化合物の結合を、糖鎖−ポリマー粒子の結合に交換させ、糖鎖および/または糖の誘導体をポリマー粒子に固定化する工程。
(工程3)ポリマー粒子上の未反応物を洗浄除去する工程。
(53)(51)項または(52)項に記載の方法により製造される糖鎖アフィニティビーズ。
(54)(53)項に記載の糖鎖アフィニティビーズに検体を含む溶液を接触させ、所定の条件でインキュベートおよび洗浄操作を行った後に、捕捉された糖結合性物質を単離するシステム。
を提供する。
施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
一つの観点から、本発明は、ヒドラジド基を含む物質Aと、糖鎖および/または糖の誘導体とを、当該物質Aのヒドラジド基と当該糖鎖および/または糖の誘導体の還元末端との間のヒドラゾン形成によって結合することを特徴とする試料調製方法を提供する。
低分子化合物として用いる場合には、物質Aは、アルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基およびこれら誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むことが、以下の観点から好ましい。
−(ヒドラジド基含有化合物成分)m−(架橋剤成分)n−
このような構造を有する物質Aとしては、下記の(式4)で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。
また、R6は−O−,−S−,−NH−,−CO−,−CONH−で中断されてもよい炭素数1〜20の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、i、jは1から5の整数を表す。
また、保護基[P]を脱保護する方法としては、通常の酸処理が挙げられる。
また、物質Bは、低分子化合物、固相担体のいずれの形態をとってもよい。
すなわち、この糖鎖マイクロアレイの製造方法は、下記(式3)または(式12)で表される構造を有する物質Bからなる固相担体で構成される固相基板の表面に下記(工程1)〜(工程4)によって糖鎖および/または糖の誘導体を固定化するものである。
(工程2)工程1で得られた化合物の溶液を、前記固相基板上に整列的に点着する工程。
(工程3)点着後の固相基板を所定の条件でインキュベートすることにより、糖鎖−物質Aの結合を、固相基板−糖鎖の結合に交換する反応を進行させ、糖鎖および/または糖の誘導体を固相基板に固定化する工程。
(工程4)固相基板上の未反応物を洗浄除去する工程。
例えば、この糖鎖マイクロアレイの表面に、検体を含む溶液を接触させ、所定の条件でインキュベートおよび洗浄操作を行った後に、固相基板上の点着部位の糖鎖および/または糖の誘導体に捕集された糖結合性物質を検出することにより、固定化された糖鎖および/または糖の誘導体と特異的に結合または吸着する糖結合性物質を探索するシステムが提供される。
(工程2)工程1で得られた化合物を、ポリマー粒子と接触させ、所定の条件でインキュベートすることにより、糖鎖−ヒドラジド基含有化合物の結合を、糖鎖−ポリマー粒子の結合に交換させ、糖鎖および/または糖の誘導体をポリマー粒子に固定化する工程。
(工程3)ポリマー粒子上の未反応物を洗浄除去する工程。
(A)ヒドラジド基含有化合物の調製
1.下記のヒドラジド化合物は市販品を用いた。
5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine (Dansylhydrazine); 2-hydrazinopyridine; 9-fluorenylmethyl carbazate (Fmoc hydrazine); benzylhydrazine; 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, hydrazide (BODIPY (tm) FL hydrazide); 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide (Marina Blue (tm) hydrazide); 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide (DCCH); phenylhydrazine; 1-Naphthaleneacethydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid
前述したスキーム1に示すルートでAcWRhを合成した(なお、Acはアセチル基、Wはトリプトファン残基、Rはアルギニン残基、hはヒドラジド基を示す)。
WR-OMe (b) (53 mg, 0.14 mmol) をDMF 1 ml に溶解し、WSC (40 mg, 0.20 mmol)、DMAP (5 mg, 0.041 mmol) および酢酸 (200 μl) を加え、室温で 3 時間攪拌した。さらに WSC (50 mg, 0.26 mmol) を追加し、終夜攪拌した。反応溶液を濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=1:1)により精製する事で目的とするAcWROMeを得た。1H NMR (500 MHz, CD3OD)δ7.70-7.00 (m, 5H, indole), 3.62 (s, 3H, OMe), 1.93 (s, 3H, Ac)
AcWROMe 10 mgを10% ヒドラジン/メタノール (5 ml) に溶解し、室温で12時間反応後、濃縮する事によりAcWRh(d)を調製した。MALDI-TOF MSによる解析により、目的物の[M + H]+ イオンをm/z:416.89に観測した。
1.メチルエステル含有モノマーの合成
以下のスキーム4に示すルートでメチルエステル含有モノマーを合成した。
無水メタクリル酸 (MAH : 5 g, 0.03 mol) (f) を 100 ml のクロロホルムに溶解させた溶液を、25 g の(エチレンジオキシ) ビス (エチルアミン) (EDBEA : 25 g, 0.17 mol) (g) を 100 mlのクロロホルムに溶解させた溶液に氷浴上で滴下投入した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム(展開溶媒:クロロホルム90容/メタノール10容の混合溶媒)にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物(h)を得た。
5gの化合物(h)(0.023mol)を100mlのクロロホルムに溶解させた溶液に、1.5当量のコハク酸モノメチル(i)および1.5当量の水溶性カルボジイミド化合物(WSC)である1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを加えて、密栓した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム(展開溶媒:クロロホルム90体積%/メタノール10体積%の混合溶媒)にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物(j)を得た。
また、得られた物質は、NMR、マトリックス支援レーザイオン化−飛行時間型質量分析器(MALDI−TOF−MS)により化合物(j)であることを確認した。
以下のスキーム5に示すルートでメチルエステル含有ポリマー粒子を合成した。
ポリマー粒子400 mgを容器にとり、ヒドラジン1水和物4 mlを加えて攪拌し、室温で2時間静置した。反応後、ヒドラジン1水和物を除去し、メタノールで洗浄したのち、1M塩酸でリンスした。その後さらに純水で洗浄した。
ポリマー粒子1mgを容器にとり、N-アセチル-D-ラクトサミン(LacNAc)1μmolを添加し、さらに、2%酢酸を含むアセトニトリル180μlを加えた。これを80℃で45分間加熱することによりLacNAcとビーズ上のヒドラジド基を反応させた。純水でビーズをリンスして未反応の糖鎖を回収し、それをMALDI-TOF-MS測定により定量(内部標準法)し、ビーズへのLacNAc結合量を求めた。ビーズ1mgあたり0.86μmol(860 nmol)のLacNAcが結合することが分かった。
Bio-Rad社製「アフィゲル-Hz」をそのまま用いた。
1.官能基量の定量
アフィゲル-Hzの分散液50μl(ビーズの乾燥重量として16.5 mg) を容器にとり、LacNAc1μmolを添加し、さらに、2%酢酸を含むアセトニトリル180μlを加えた。これを80℃で45分間加熱することにより LacNAcとビーズ上のヒドラジド基を反応させた。純水でビーズをリンスして未反応の糖鎖を回収し、それをMALDI-TOF-MS測定により定量(内部標準法)し、ビーズへのLacNAc結合量を求めた。ビーズ1mg(乾燥重量) あたり約8nmolのLacNAcが結合することが分かった。
(アミノオキシ基含有低分子化合物aoWRの合成) 前述したスキーム3にしたがってaoWR(化合物(n))を合成した。(aoはアミノオキシ基を示す)
化合物(m)にトリフルオロ酢酸(TFA)(2ml)を加え、-20℃で2時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエンを加えて共沸を繰り返してTFAを除去して、目的物である化合物(n)を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の[M+H]+イオンをm/z:448に観測した。
特許文献:国際公開第2005/097844号パンフレットに記載の方法によりアミノオキシ基含有ポリマー粒子を作製した。
(1)糖タンパク質糖鎖の調製
糖タンパク質としてフェツイン(fetuin)またはリボヌクレアーゼB(ribonuclease B)を試料として用いた。糖タンパク質10 mgを容器に取り、50mM重炭酸アンモニウム溶液に溶解させた。少量の界面活性剤を添加し、60℃で30分インキュベートしたのち、N-glycosidase F(Roche社製)10unitを添加し、37℃で16時間インキュベートすることで糖鎖を遊離させた。
ヒト血清5 mLを容器にとり、50mM重炭酸アンモニウム溶液に溶解させた。少量の界面活性剤を添加し、60℃で30分インキュベートしたのち、N-glycosidase F(Roche社製)5unitを添加し、37℃で16時間インキュベートすることで糖鎖を遊離させた。
(1)市販ヒドラジド化合物と糖鎖との反応
実験例1(A)のヒドラジド化合物を10mMの濃度でメタノールまたはアセトニトリルに溶解し、ヒドラジド化合物溶液を得た。実験例2(1)のフェツイン糖鎖溶液(500pmol相当)にヒドラジド化合物溶液1μlを加え、さらにアセトニトリル100μlを加えた。80℃で45分間加熱することにより糖鎖とヒドラジド化合物とを反応させた。反応後の生成物をMALDI-TOF-MSで測定した。
実験例1(A)のAcWRhを10 mMの濃度でメタノールまたはアセトニトリルに溶解し、ヒドラジド化合物溶液を得た。実験例2(2)の血清糖鎖溶液(血清5μl相当量)を容器にとり、ヒドラジド化合物溶液1μlを加え、さらにアセトニトリル100μlを加えた。80℃で45分間加熱することにより糖鎖とヒドラジド化合物(AcWRh)とを反応させた。反応後の生成物をMALDI-TOF-MSで測定した。
実験例1(A)のヒドラジド基含有ポリマービーズ2.5mgを容器に測り取った。実験例2(2)の血清糖鎖溶液(血清5μl相当量)を加え、さらに、2%酢酸を含むアセトニトリル180μlを加えた。これを80℃で45分間加熱することにより糖鎖とビーズ上のヒドラジド基とを反応させた。少量の純水でビーズをリンスして未反応の糖鎖を回収し、それをMALDI-TOF-MS測定により定量したところ、80〜90%の糖鎖がビーズに結合したことが分かった。その後、ビーズを0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)水溶液、50%メタノール、4Mグアニジン水溶液、および純水で洗浄して、後述する糖鎖再遊離の実験に供した。
(1)AcWRh(d),AcWRh(e)と糖鎖の結合
キトトリオース水溶液に10等量の実験例1(A)のAcWRh(d)またはd-AcWRh(e)を添加し、酢酸でpH5に調整した。90℃で1時間加熱することによりキトトリオース-AcWRh(d)標識体およびキトトリオース-d-AcWRh(e)標識体を得た。
キトトリオース水溶液に10等量の実験例1(B)のaoWR(H)またはaoWR(D)を添加し、酢酸でpH5に調整した。90℃で1時間加熱することによりキトトリオース-aoWR標識体を得た。
以下の交換反応では、ヒドラジド基含有化合物でラベル化した糖鎖をアミノオキシ基含有化合物(またはヒドラジド基含有化合物)と反応させることで、ヒドラゾン−オキシム交換(またはヒドラゾン−ヒドラゾン交換)によりラベルの付け替えを行った。比較として、アミノオキシ基含有化合物でラベル化した糖鎖に対してもラベルの付け替えを試みた。反応の進行はMALDI-TOF-MSにより確認した。
(1)ヒドラゾン−ヒドラゾン交換反応
実験例5(1)のキトトリオース−AcWRh(d)標識体の溶液に10等量の実験例1(A)のd-AcWRh(e)を添加し、酢酸でpH5に調整した。90℃で1時間加熱反応後、反応液の一部を取り出し、内部標準として濃度既知の実験例5(2)のキトトリオース−aoWR(H)標識体と混合した。これをMALDI-TOF-MSで分析し、反応液中に含まれるキトトリオース−AcWRh(d)標識体と、この反応で得られたキトトリオース−d-AcWRh(e)標識体との比率を算出した。
実験例5(1)のキトトリオース−AcWRh(d)標識体の溶液に10等量の実験例1(B)のaoWR(H)を添加し、酢酸でpH5に調整した。90℃で1時間加熱反応後、反応液の一部を取り出し、内部標準として濃度既知の実験例5(2)のキトトリオース−aoWR(D)標識体と混合した。これをMALDI-TOF-MSで分析し、反応液中に含まれるキトトリオース−AcWRh(d)標識体と、この反応で得られたキトトリオース−aoWR(H)標識体との比率を算出した。
実験例5(2)のキトトリオース−aoWR(H)標識体の溶液に10等量の実験例1(A)のAcWRh(d)を添加し、酢酸でpH5に調整した。90℃で1時間加熱反応後、反応液の一部を取り出し、内部標準として濃度既知の実験例5(1)のキトトリオース−d-AcWRh(e)標識体と混合した。これをMALDI-TOF-MSで分析し、反応液中に含まれるキトトリオース−aoWR(H)と、この反応で得られたキトトリオース−AcWRh(d)との比率を算出した。
実験例5(2)のキトトリオース−aoWR(H)標識体の溶液に10等量の実験例1(B)のaoWR(D)を添加し、酢酸でpH5に調整した。90℃で1時間加熱反応後、反応液の一部を取り出し、内部標準として濃度既知の実験例5(1)のキトトリオース−AcWRh(d)標識体と混合した。これをMALDI-TOF-MSで分析し、反応液中に含まれるキトトリオース−aoWR(H)と、この反応で得られたキトトリオース−aoWR(D)の比率を算出した。
図3は上記4パターンの交換反応の収率を示したグラフである。
ヒドラゾン−ヒドラゾン交換反応およびヒドラゾン−オキシム交換の効率は、オキシム−ヒドラゾン交換およびオキシム−オキシム交換と比べて高いことがわかる。すなわち、ヒドラゾン結合はオキシム結合よりも交換反応を受けやすいといえる。さらに、ヒドラゾン−ヒドラゾン交換よりも、ヒドラゾン−オキシム交換の方が効率よく進行したこともわかった。
(A)交換反応効率の比較
実験例6における液相での交換反応の結果より、ヒドラゾン−オキシム交換が最も効率よく進行することが分かった。そこで、以下に示したように、固相から液相への交換反応についても同様に反応効率を比較した。
チャートのS/N比より明らかに、ヒドラジド基含有ビーズで捕捉し、アミノオキシ化合物で遊離した場合が最も効率がよいことがわかる。この結果は、実験例6における液相での反応効率比較の結果と一致する。
(1)ヒドラジド基含有ポリマービーズからの糖鎖再遊離
実験例4において糖鎖を結合させたヒドラジド基含有ポリマービーズに、20μlのaoWR(H)溶液(20mM)および180μlの2%酢酸/アセトニトリル溶液を加え、80℃で45分間加熱した。反応後、上清を回収し、内部標準物質(キトテトラオース)を添加してMALDI-TOF-MS測定を行うことにより、糖鎖回収量を算出した。
実験例4と同様の方法で血清糖鎖を捕捉させたアフィゲル-Hzに対し、実験例7(B)の(1)と同様の方法で糖鎖を再遊離させ、回収量を算出した。
内部標準物質のシグナル量から換算した結果、使用した糖鎖のうち56%の量を回収できたことが分かった。
以下に示したように、ヒドラジド化合物で標識化(ヒドラゾン結合)した糖鎖を、アミノオキシ基含有ポリマービーズと接触させることで、液相から固相へのヒドラゾン−オキシム交換反応を行った。この方法は、例えば蛍光性ヒドラジド化合物で糖鎖をラベル化後、HPLC等で糖鎖を単離し、それをビーズと反応させることによって、単離した糖鎖をビーズに固定化するといった応用が可能である。つまり、糖鎖混合物(たとえば糖タンパクから回収した糖鎖)から任意の糖鎖を選び出し、それをビーズ表面に呈示する方法として利用できる。また、応用例において、ビーズのかわりに固相基板も用いることができる。
実験例1(A)のAcWRh(d)を10mMの濃度でメタノールに溶解した。糖タンパク質であるフェツイン(fetuin)から遊離した糖鎖10pmol相当を容器にとり、ヒドラジド化合物溶液1μlを加え、さらに2%酢酸を含むアセトニトリル100μlを加えた。80℃で45分間加熱することにより糖鎖とAcWRh(d)とを反応させた。
実験例8(1)と同様の方法で糖鎖とd-AcWRh(e)とを反応させた。
5 mgのアミノオキシ基含有ポリマービーズを容器にとり、AcWRh(d)と結合した糖鎖を投入した。酢酸緩衝液でpH4に調整し、80℃で1時間反応させた。反応後、上清を回収し、内部標準として濃度既知のd-AcWRh(e)標識化糖鎖を加え、MALDI-TOF-MS測定を行うことにより糖鎖 (代表的にNA3: Asialo, galactosylated triantennary glycanに注目) の量を求めた。ネガティブコントロールとして、アミノオキシ基含有ポリマービーズを含まない系を同様に処理した。
アミノオキシ基含有ポリマービーズと反応させた系では、約20%の量の糖鎖しか観測されなかった。一方、ネガティブコントロールでは糖鎖量はほとんど変化しなかった。このことから、約80%量の糖鎖がアミノオキシ基含有ポリマービーズ上に結合したことが分かった。
(1)単糖固定化ビーズの調製
実験例1(B)のアミノオキシ基含有ポリマービーズ10mgを容器にとり、ガラクトース (Gal)、あるいは、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を10μmol添加した。2%酢酸を含むアセトニトリルを200μl添加し、80℃で1時間加熱することで糖をビーズに固定化した。その後、ビーズを0.5%SDS溶液、メタノール、純水で順次洗浄することで莢雑物を除去した。
3種類のHRP(horse radish peroxidase)標識化レクチン:HRP-Concanavalin A (Con A)、HRP-Wheat germ agglutinin (WGA)、HRP-Ricinus communis agglutinin (RCA120)(レクチンはいずれも生化学工業(株)製)を1μg/mlの濃度でそれぞれbinding buffer(50mM Tris/HCl、100mM NaCl、10mM CaCl2、10mM MgCl2、pH7.6)に溶解した。実験例9(1)にて単糖を固定化したビーズ1mgを容器に取り、これにいずれかのレクチン溶液を100μl加え、37℃で16時間穏やかに攪拌した。その後、ビーズを0.05%のTween-20を含むbinding bufferおよびbinding bufferで各1時間洗浄した。ビーズ上に結合したHRP標識化レクチンをperoxidase発色キット (住友ベークライト製)で発色させ、溶液の450nmの吸光度を測定することにより、レクチンの結合量を見積もった。
(1)オリゴ糖固定化ビーズの調製
実験例1(B)のアミノオキシ基含有ポリマービーズ10mgを容器にとり、実験例2(1)のフェツイン(fetuin)糖鎖あるいはribonuclease B糖鎖溶液を、糖鎖量に換算して1μmol相当添加した。2%酢酸を含むアセトニトリルを200μl添加し、80℃で1時間加熱することで糖鎖をビーズに固定化した。その後、ビーズを0.5%SDS溶液、メタノール、純水で順次洗浄することで莢雑物を除去した。
(Concanavalin A (Con A)の捕捉)
実験例10(1)にてRibonuclease B糖鎖を固定化済みのビーズ1mgを容器に取った。これにCon A溶液(10μg/ml)を1μl、およびbinding bufferを100μl加え、37℃で16時間穏やかに攪拌することでCon Aとビーズ上の糖鎖を結合させた。その後、ビーズを0.05%のTween-20を含むbinding bufferおよびbinding bufferで各1時間洗浄した。洗浄液を取り除き、ハプテンとして0.5 Mのmethyl-α-mannopyranosideを20μl加え、37℃で2時間攪拌することでビーズ上の糖鎖に結合したCon Aを遊離させた。上清を回収し、トリプシン溶液(Promega 社製 sequence grade trypsin)を加え、37℃で16時間静置し、遊離したCon Aをペプチド断片化した。一部を取ってMALDI-TOF-MS測定を行い、以下のように、データを既知のCon Aのアミノ酸配列を比較した。
(2)得られたスペクトルのうち代表的なものについてMS/MS解析を行い、「MASCOT MS/MS Ion Search(ペプチド断片のMS/MSデータから元のタンパクを推定するツール)」を用いて解析したところ、正しくCon A由来であることを確認した。
Claims (2)
- 下記(式1)または(式2)の構造を有する化合物。
- 請求項1に記載の化合物と、糖鎖および/または糖の誘導体とを、前記化合物のヒドラジド基と前記糖鎖および/または糖の誘導体の還元末端との間のヒドラゾン結合によって結合させることを特徴とする試料調製方法。
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