JP4899067B2 - 質量分析用生体関連分子のエステル化法及び得られたエステル化誘導体の質量分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、トリアゼン化合物を用いて、質量分析用の生体関連分子をエステル化する方法および得られたエステル化誘導体を質量分析する方法に関する。
本発明は、自然科学研究分野において、より詳しくは、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖等の生体関連分子の質量分析における解析感度を向上させるための新規かつ簡便な誘導体化に関する技術である。
従来から、生体関連分子中の酸性分子の質量分析における感度低下および分解物生成等の問題点を克服しようとする試みがあり、特にシアル酸含有糖鎖のシアル酸脱離を抑制するためにエステル化あるいはアミド化を施す手法が報告されている。例えば、特開2005-148054号公報(特許文献1)においては、生体関連分子の標識アミド化法が記載されている。しかしながら、生体関連分子中の酸性基を固相表面上で簡便かつ高収率に短時間で修飾する手法は存在しない。
特開2005-148054号公報
質量分析におけるタンパク質あるいはペプチドのＭＳ／ＭＳ(タンデムマス)解析では、しばしばアスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基部位において優先的に開裂が起きるため、他のアミノ酸残基の部位で開裂したフラグメントイオンが得られにくい。従って、全体としてフラグメントイオンの検出率が悪く、解析が困難になる問題がある。
また、シアル酸含有糖鎖の質量分析測定においては、ＩＳＤ（in source decay）やＰＳＤ（post source decay）で、またはイオントラップなどによるイオン単離の過程でシアル酸の脱離が容易に起こるため、標的イオンの絶対量が減少し、脱離によって生じた分子が相対的に増加し、正確な混成比を反映しない。さらに、シアル酸含有糖鎖のＭＳ／ＭＳ解析では、シアル酸の脱離が優先的に起こり、解析に十分な他のフラグメントイオンを得ることが難しい。
核酸(DNAあるいはRNA)分子の質量分析においてもその構造中に含まれるリン酸ジエステル結合に由来する上述同様の問題点が存在する。
そこで本発明の目的は、質量分析における生体関連分子の安定性を改善し解析精度および解析感度を向上させる方法を提供することにある。また本発明の目的は、質量分析における解析精度および感度を向上させる方法を用いて生体酸性分子を迅速に且つ簡便に解析する方法を提供することにある。
本発明は以下のとおりである。
[1]酸性基を有する生体関連分子とトリアゼン化合物とを反応させて前記酸性基の少なくとも一部をエステル化することを含む、質量分析に供するための、酸性基の少なくとも一部がエステル化された生体関連分子を調製する方法。
[2]酸性基を有する生体関連分子とトリアゼン化合物とを反応させて前記酸性基をエステル化し、次いで酸性基をエステル化した生体関連分子を質量分析に供することを含む生体関連分子の分析方法。
[3]酸性基がカルボキシル基、リン酸基およびスルホン酸基から成る群から選ばれる少なくとも1種である[1]または[2]に記載の方法。
[4]生体関連分子がタンパク質、ペプチド、糖質、複合糖質および核酸から成る群から選ばれる少なくとも1種である[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]トリアゼン化合物が一般式で表される[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
(式中、Ｘは、アリール基、置換アリール基、ヘタリール基または置換ヘタリール基であり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリルまたはベンジルである。)
[6]トリアゼン化合物が3-メチル-1-(p-トリル) トリアゼンである[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]トリアゼン化合物が安定同位体ラベルされた化合物である[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]安定同位体ラベルが重水素、重炭素または重窒素によるものである[7]に記載の方法。
[9]前記酸性基のエステル化は、実質的に全量の酸性基について行う[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]酸性基を有する生体関連分子を予め共有結合または非共有結合により固相担体に固定化した後に、前記エステル化を行い、エステル化後にエステル化生体関連分子を固相から回収し、回収したエステル化生体関連分子を質量分析に供する[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]酸性基を有する生体関連分子を遊離の状態でエステル化し、エステル化後にエステル化反応混合物中のエステル化生体関連分子をそのまま質量分析に供するか、またはエステル化反応混合物中のエステル化生体関連分子を精製後に質量分析に供する[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[12]質量分析がMALDI-TOF MSまたはMALDI-TOF MS /MSによる質量分析である[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]質量分析が液体クロマトエレクトロスプレーイオン化質量分析装置[LC-ESI-MSまたはLC-ESI-MS/MS]による質量分析である[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[1]酸性基を有する生体関連分子とトリアゼン化合物とを反応させて前記酸性基の少なくとも一部をエステル化することを含む、質量分析に供するための、酸性基の少なくとも一部がエステル化された生体関連分子を調製する方法。
[2]酸性基を有する生体関連分子とトリアゼン化合物とを反応させて前記酸性基をエステル化し、次いで酸性基をエステル化した生体関連分子を質量分析に供することを含む生体関連分子の分析方法。
[3]酸性基がカルボキシル基、リン酸基およびスルホン酸基から成る群から選ばれる少なくとも1種である[1]または[2]に記載の方法。
[4]生体関連分子がタンパク質、ペプチド、糖質、複合糖質および核酸から成る群から選ばれる少なくとも1種である[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]トリアゼン化合物が一般式で表される[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]トリアゼン化合物が3-メチル-1-(p-トリル) トリアゼンである[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]トリアゼン化合物が安定同位体ラベルされた化合物である[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]安定同位体ラベルが重水素、重炭素または重窒素によるものである[7]に記載の方法。
[9]前記酸性基のエステル化は、実質的に全量の酸性基について行う[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]酸性基を有する生体関連分子を予め共有結合または非共有結合により固相担体に固定化した後に、前記エステル化を行い、エステル化後にエステル化生体関連分子を固相から回収し、回収したエステル化生体関連分子を質量分析に供する[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]酸性基を有する生体関連分子を遊離の状態でエステル化し、エステル化後にエステル化反応混合物中のエステル化生体関連分子をそのまま質量分析に供するか、またはエステル化反応混合物中のエステル化生体関連分子を精製後に質量分析に供する[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[12]質量分析がMALDI-TOF MSまたはMALDI-TOF MS /MSによる質量分析である[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]質量分析が液体クロマトエレクトロスプレーイオン化質量分析装置[LC-ESI-MSまたはLC-ESI-MS/MS]による質量分析である[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、生体関連分子を迅速且つ簡便にエステル化でき、特に固相におけるエステル化法を用いることで、質量分析において生体関連分子の解析精度および感度を向上させる方法を提供することができる。又本発明によれば、質量分析における解析精度および感度を向上させる方法を用いて生体関連分子を定性ならびに定量解析する方法を提供することができる。さらに、本発明において、重水素標識された3-メチル-d3-1-(p-トリル)トリアゼンなどのトリアゼン化合物を作用させることにより、前記生体関連分子の安定同位体標識化合物を得ることができ、この化合物は、軽水素体との同時比較定量を含めた多検体質量分析を可能にする。
本発明の第１の態様は、酸性基を有する生体関連分子とトリアゼン化合物とを反応させて前記酸性基の少なくとも一部をエステル化することを含む、質量分析に供するための、酸性基の少なくとも一部がエステル化された生体関連分子を調製する方法である。
さらに本発明の第２の態様は、酸性基を有する生体関連分子とトリアゼン化合物とを反応させて前記酸性基をエステル化し、次いで酸性基をエステル化した生体関連分子を質量分析に供することを含む生体関連分子の分析方法である。
本発明の第１の態様および第２の態様におけるエステル化は、共通であり、以下にまとめて説明する。
[エステル化]
本発明において、エステル化に供される生体関連分子は、酸性基を有する生体関連分子である。酸性基は、生体関連分子が有する官能基であって、酸性を示すものであれば、特に制限はない。そのような官能基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基およびスルホン酸基から成る群から選ばれる基を挙げることができる。生体関連分子の種類によって、上記酸性基のうちの一つの基を有する場合と、複数の基を有する場合とがあり得る。
本発明において、エステル化に供される生体関連分子は、酸性基を有する生体関連分子である。酸性基は、生体関連分子が有する官能基であって、酸性を示すものであれば、特に制限はない。そのような官能基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基およびスルホン酸基から成る群から選ばれる基を挙げることができる。生体関連分子の種類によって、上記酸性基のうちの一つの基を有する場合と、複数の基を有する場合とがあり得る。
また、本発明において、エステル化に供される生体関連分子は、酸性基を有する生体関連分子であれば、特に制限はない。そのような生体関連分子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、糖質、複合糖質および核酸から成る群から選ばれる分子を挙げることができる。
タンパク質は、より具体的には、例えば、１）ヒト由来の健常ならびに疾患状態より得られる生体試料（血清、細胞、組織、尿など）に含まれるタンパク質、２）ヒト以外の動物または植物中に見られるタンパク質、または、３）組み替え遺伝子操作により人為的に産生されたリコンビナントタンパク質である。また、上記タンパク質群に化学修飾などの操作を加えたタンパク質を含む。
ペプチドは、より具体的には、例えば、上記タンパク質群を含むタンパク質含有試料をタンパク質加水分解酵素(群)を作用させることにより得られるタンパク質限定加水分解物であることができる。
糖質は、例えば、自然界に広く見いだされる様々な単糖を構成成分とする有機化合物群であり、生体試料由来あるいは実験室において調製されうるものであり得る。より具体的には、複合糖質糖鎖、ヘパリン・ヒアルロン酸などの遊離糖質を含むものであることができる。
複合糖質は、より具体的には、例えば、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン、フォスファチジルアンカーなどの糖鎖を有する生体分子である。
核酸は、より具体的には、例えば、DNA、RNA、cDNA、オリグヌクレオチド等の核酸塩基を構成成分とし、リン酸ジエステル結合により連鎖状をとる有機化合物群の総称である。
本発明においてエステル化に用いられるトリアゼン化合物は、例えば、下記一般式で表される化合物であることができる。
(式中、Ｘは、アリール基、置換アリール基、ヘタリール基または置換ヘタリール基であり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリルまたはベンジルである。)
Ｘは、例えば、アリール基、置換アリール基、ヘタリール基または置換ヘタリール基である。アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基などを挙げることができ、置換アリール基としては、例えば、トリル基を挙げることができる。ヘタリール基とはヘテロ芳香族基のことであり、例えば、ピリジル基やチエニル基などを挙げることができ、置換ヘタリール基としては、例えば、2-アミノピリジン基などを挙げることができる。好ましくは、Xは、トリアゼニル基に対してパラ位に電子供与体として機能する原子または原子団によって置換されたフェニル基であることができる。電子供与体として機能する原子としては例えば、酸素などを挙げることができ、また、原子団としては、-NH-などを挙げることができる。
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリルおよびベンジルの群から選択される。具体的には、C1〜C4-アルキルおよびベンジルが好ましく、さらにRは水素、炭素、窒素などが安定同位体によって標識された化合物であることができる。
トリアゼン化合物は、例えば、3-メチル-1-(p-トリル) トリアゼン、3,3-ビス(アミノエチル)-1-ヒドロキシ-2-オキソ-1-トリアゼン、3,3-ジメチル-1-(3-ニトロフェニル)トリアゼン、3-エチル-3-(エチルアミノエチル)-ヒドロキシ-2-オキソ-1-トリアゼン等であることができる。これらのトリアゼン化合物は市販品を入手可能である。
トリアゼン化合物は、安定同位体ラベルされた化合物であることもできる。安定同位体ラベルは、例えば、重水素、重炭素、重窒素であることができる。安定同位体ラベルされたトリアゼン化合物として、例えば、3-メチル-d3-1-(p-トリル) トリアゼン等を挙げることができる。
安定同位体ラベルされたトリアゼン化合物は、公知の方法により合成することができる。例えば、以下の参考文献に記載の手法と同様の合成法に従い、中間産物のジアゾニウム塩に重水素ラベルされたメチルアミン(CD3NH2)を作用させることで、3-メチル-d3-1-(p-トリル) トリアゼンを合成することができる。(参考文献: White EH, Baum AA, and Eitel DE, Organic Syntheses, Coll. Vol. 5, p.797: Vol. 48,p.102, "1-Methyl-3-p-tolyltriazene and its use in the esterification of acids")
酸性基のエステル化は、具体的には、以下の条件で行うことができる。
(1)生体関連分子とトリアゼン化合物の量比は、通常100〜1000倍程度のトリアゼン化合物を反応に供することが適当である。
(2)酸性基のエステル化には溶媒を使用することができる。例えば、固相上でのエステル化反応はアセトニトリル、ジメチルスルフォキシド(DMSO)-アセトニトリル 1:1混液、ジオキサンなどから固相担体にあわせて選択し、反応を行うことで高収率が得られる。また、溶液中の反応では、例えば、ジメチルスルフォキシド(DMSO)-アセトニトリル 1:1混液を反応溶媒として用いることで高収率に反応が進行する。
(3)反応温度は、例えば、室温から60°Cで行うことができる。ただし、通常は、37℃で十分な反応を行うことができる。
(4)反応時間は、３０分から一時間の保温で十分に反応を行うことができる。
(5)水分の存在は反応に好ましくなく、固相上では反応に先立ちアセトニトリルで洗浄することにより溶媒を置換し、アセトニトリル中にて反応を行うことができる。一方、溶液中で遊離の例えばシアル酸含有糖鎖をエステル化する場合、純アセトニトリル中では十分な反応の進行が見られず、反応溶媒中に例えば、50%のDMSOを混在させることにより良好な反応性があるので、アセトニトリルとDMSOの混合反応溶媒を用いることが好ましい。
(1)生体関連分子とトリアゼン化合物の量比は、通常100〜1000倍程度のトリアゼン化合物を反応に供することが適当である。
(2)酸性基のエステル化には溶媒を使用することができる。例えば、固相上でのエステル化反応はアセトニトリル、ジメチルスルフォキシド(DMSO)-アセトニトリル 1:1混液、ジオキサンなどから固相担体にあわせて選択し、反応を行うことで高収率が得られる。また、溶液中の反応では、例えば、ジメチルスルフォキシド(DMSO)-アセトニトリル 1:1混液を反応溶媒として用いることで高収率に反応が進行する。
(3)反応温度は、例えば、室温から60°Cで行うことができる。ただし、通常は、37℃で十分な反応を行うことができる。
(4)反応時間は、３０分から一時間の保温で十分に反応を行うことができる。
(5)水分の存在は反応に好ましくなく、固相上では反応に先立ちアセトニトリルで洗浄することにより溶媒を置換し、アセトニトリル中にて反応を行うことができる。一方、溶液中で遊離の例えばシアル酸含有糖鎖をエステル化する場合、純アセトニトリル中では十分な反応の進行が見られず、反応溶媒中に例えば、50%のDMSOを混在させることにより良好な反応性があるので、アセトニトリルとDMSOの混合反応溶媒を用いることが好ましい。
前記酸性基のエステル化は、実質的に全量の酸性基について行うことが適当である。本発明におけるトリアゼン化合物を用いたエステル化では、上記記載を考慮して、生体関連分子とトリアゼン化合物の量比、反応温度や反応時間等を制御することで、容易に、実質的に全量の酸性基がエステル化される。
本発明においては、酸性基を有する生体関連分子を予め共有結合または非共有結合により固相担体に固定化した後に、前記エステル化を行い、エステル化後にエステル化生体関連分子を固相から回収し、回収したエステル化生体関連分子を質量分析に供することができる。
酸性基を有する生体関連分子の固相担体への吸着あるいは固定化は、以下のように行うことができる。
測定に供する生体関連試料を、シリカゲル、アミノプロピルシリカゲル（例えばSep-Pak NH2, Waters社製）、あるいはポリアミド樹脂（例えば Discovery DPA-6S, Supelco社製）などの固相表面に順相による常法に従った手法により吸着させる。極性の高い生体関連試料はアセトニトリルなどの有機溶媒が多く存在する系において上述のような固相抽出に用いられる担体表面に容易に吸着させることができる。
測定に供する試料が遊離糖鎖の場合は、特に、遊離糖鎖の還元末端を市販のヒドラジド基あるいはアミノオキシ基を有する固相担体表面に固定することができる。例えば、Bio-Rad製 Affi-Gel Hzのようにヒドラジド基があらかじめ担持されているビーズを用いることができる。糖鎖分子を含む試料を、常法に従い酸性から中性の緩衝液中にてビーズと反応させ、ビーズ上に固定化させることもできる。エステル反応後の糖鎖は、糖鎖分子が分解されない程度の酸処理を行うことで、回収することができる。あるいは、遊離の低分子ヒドラジドまたはアミノオキシ化合物を持つイミン交換反応によっても回収することができる。
測定に供する試料が遊離のペプチドあるいは核酸分子の場合は、例えば、以下の(ア)〜(エ)のいずかの方法を用いることができる。
(ア)DNA，RNA，オリゴヌクレオチド等の核酸の 5'末端または3'末端に、市販キットを用いるなどしてチオール基を導入した後に、Pharmacia製 Thiopropyl Sepharose 6Bの活性化チオール基にジスルフィド結合で固定化する。タンパク質およびペプチドのセリンあるいはスレオニン残基にも同様に応用することができるので、タンパク質およびペプチドの固定化にも使用しうる。また、タンパク質およびペプチド中のシステイン残基も直接固定化に用いることができる。
(イ)DNA，RNA，オリゴヌクレオチド等の核酸の 5'末端または3'末端を、市販キットを用いるなどしてビオチン標識した後に、アビジン結合ビーズに固定化する。また、タンパク質およびペプチドのアミノ基あるいはチオール基にも容易にビオチン標識を行うことができることから、タンパク質およびペプチドの固定化にもアビジン結合ビーズを使用することができる。
(ウ)上記(ア)および(イ)を組み合わせることによっても当該分子群を固定化することができる。すなわちチオール基の導入後にチオール基反応性マレイミド等の官能基を有するビオチン分子を作用させることで当該生体試料の水酸基をビオチン標識し、アビジン結合ビーズへ固定化することができる。
(エ)タンパク質およびペプチドのアミノ基に市販の試薬によりチオール基を導入し、Pharmacia製 Thiopropyl Sepharose 6Bの活性化チオール基にジスルフィド結合で固定化することができる。
エステル化後のエステル化生体関連分子の固相からの回収は、以下のように行うことができる。1)ジスルフィド結合によって固相上に固定化されている場合は、50 mM〜100 mMのジチオスレイトールを含む中性の緩衝液と室温に３０分保温することで遊離されてくるので、遠心あるいは濾過により回収する。2)アビジンービオチン相互作用により固定化されている場合には、特にモノメリックアビジンの場合、5 mMのビオチン溶液中で保温することで遊離するので、遠心あるいは濾過により回収する。
回収したエステル化生体関連分子の質量分析については後述する。
本発明においては、酸性基を有する生体関連分子を遊離の状態でエステル化し、エステル化後にエステル化反応混合物からエステル化生体関連分子を単離し、単離したエステル化生体関連分子を質量分析に供することもできる。
酸性基を有する生体関連分子を遊離の状態でエステル化する手法は前述の通りである。エステル化後のエステル化反応混合物から過剰試薬の除去が必要な場合には、以下のように行うことができる。例えば遊離糖鎖あるいは遊離ペプチドの場合には、シリカゲルを用いた固相抽出により未反応の試薬およびDMSOを洗浄除去後に、担体に結合した目的物を50%アセトニトリル水溶液により溶出回収することができる。あるいは同様に他のシリカゲルベースの担体、グラファタイズドカーボン樹脂(Alltech社 Carbograph樹脂)等によっても回収することができる。
[質量分析]
本発明においては、上記方法でエステル化されたエステル化生体関連分子は、質量分析によりその構造が解析される。質量分析に使用する機器は、対象となる生体関連分子の種類に応じて適宜選択できる。特に、生体関連分子が高分子であることを考慮すると、MALDI-TOF MSもしくはMALDI-TOF MS/MSまたはLC-ESI-MSもしくはLC-ESM-MS/MS (液体クロマトエレクトロスプレーイオン化質量分析装置)による質量分析であることが好ましい。尚、MSは質量分析計であり、MS/MSは、タンデムマス(2つ繋がった質量分析計)を意味する。
本発明においては、上記方法でエステル化されたエステル化生体関連分子は、質量分析によりその構造が解析される。質量分析に使用する機器は、対象となる生体関連分子の種類に応じて適宜選択できる。特に、生体関連分子が高分子であることを考慮すると、MALDI-TOF MSもしくはMALDI-TOF MS/MSまたはLC-ESI-MSもしくはLC-ESM-MS/MS (液体クロマトエレクトロスプレーイオン化質量分析装置)による質量分析であることが好ましい。尚、MSは質量分析計であり、MS/MSは、タンデムマス(2つ繋がった質量分析計)を意味する。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
［実施例１］
卵白由来のN-型糖鎖試料に対し、3-メチル-1-(p-トリル)トリアゼン(MTT)を用いてメチルエステル化が不溶性支持体上で行われることを質量分析によって確認する実験を行った。
卵白由来のN-型糖鎖試料に対し、3-メチル-1-(p-トリル)トリアゼン(MTT)を用いてメチルエステル化が不溶性支持体上で行われることを質量分析によって確認する実験を行った。
卵白由来のN-型糖鎖試料をSeko et al.の方法で調製し、PNGase Fにより常法に従って糖鎖を遊離させた。[Seko A, Koketsu M, Nishizono M, Enoki Y, Ibrahim HR, Juneja LR, Kim M, Yamamoto T. Occurence of a sialylglycopeptide and free sialylglycans in hen's egg yolk. Biochim Biophys Acta. 1997 Apr 17;1335(1-2):23-32.]
固相担体としてシリカゲルビーズ(Iatrobead, Iatron Laboratories)を用いた。約１mMの遊離糖鎖水溶液１μlを等量の10 mM HClとあわせ、２０倍量のアセトニトリルで希釈後に、あらかじめアセトニトリルで平衡化したシリカゲルビーズのカラムにのせ、アセトニトリルで洗浄した。カラムの出口をキャップした後に、100mMのMTT溶液（DMSO/アセトニトリル、１：１）を適当量加え、３７℃に１時間保温した。反応後、キャップを外し、アセトニトリルで洗浄し、次いで４％に水を含むアセトニトリル溶液で洗浄した。５０％アセトニトリル水溶液でカラムから糖鎖を溶出し、MALDI-TOF MSにより解析した。
反応のスキームを図1に示す。血清等のサンプルから全N-型糖鎖を選択的にビーズ上に固定化し、メチルエステル化によるシアル酸負電荷の消失後、血清全糖鎖を遊離させ回収する。固相上のため、夾雑物、反応試薬などが容易に洗浄除去され，試料の精製とともに、高感度検出化、糖鎖分子種の相対存在比の維持が達成される。
MALDI-TOF MSによる質量分析
別途用意したメチルエステル反応に供していない血清糖鎖とメチルエステルに供した血清糖鎖とについて質量分析を行った結果を図2に示す。未処理(下図)においては[M+Na]+と[M+2Na-H]+ の２本のピークが検出されている。それに対して、メチルエステル化処理した場合(上図)には、[M+Na]+のみのシンプルな解析結果が得られ、感度と精度の向上が示された。また、未処理サンプルに見られるピークが残存していないことからもエステル化反応は短時間のうちに十分進行したことが示された。
別途用意したメチルエステル反応に供していない血清糖鎖とメチルエステルに供した血清糖鎖とについて質量分析を行った結果を図2に示す。未処理(下図)においては[M+Na]+と[M+2Na-H]+ の２本のピークが検出されている。それに対して、メチルエステル化処理した場合(上図)には、[M+Na]+のみのシンプルな解析結果が得られ、感度と精度の向上が示された。また、未処理サンプルに見られるピークが残存していないことからもエステル化反応は短時間のうちに十分進行したことが示された。
上述のことから、糖鎖のエステル化によって質量解析における解析の精度および感度が上昇したことが示された。
本発明によると、生体分子の固相を用いた合成、分離、精製等の一般的な試料調製過程の一行程として、迅速かつ簡便に酸性官能基の酸性電荷をエステル導入により中性化することができる。酸性電荷を消失させることで質量分析における種々の問題点を克服し、解析精度および感度の向上が達成される。
また本発明によると、従来まで容易に解析できなかったグリコサミノグリカンや核酸関連分子などにおいても、その質量分析における高精度および高感度解析が可能になることが期待される。さらには質量分析によるSNPs解析においても大きな改良が期待される。
［実施例２］
不溶性支持体として金ナノパーティクル (GCNP)を用い、GCNP上に固定化されたシアル酸含有オリゴ糖のMTTによるメチルエステル化を行い、質量分析によりその有用性を確認する実験を行った。
不溶性支持体として金ナノパーティクル (GCNP)を用い、GCNP上に固定化されたシアル酸含有オリゴ糖のMTTによるメチルエステル化を行い、質量分析によりその有用性を確認する実験を行った。
GCNP上に共有結合によりGalβ1,4GlcNAc (LacNAc)二糖を坦持させた後に、リコンビナントラットα2,6-シアリルトランスフェラーゼを800μMのCMP-N-acetylneuraminic Acid (CMP-Neu5Ac) 存在下に50 mM カコジル酸バッファー（pH 6.0, 0.5 % Triton CF-54）中で37℃、24時間保温し、シアル酸含有オリゴ糖を坦持するGCNPを得た。反応後、脱イオン水で洗浄し、ミリポア社製YM-50を用いた限外濾過により精製した。
シアル酸含有GCNPを脱イオン水５μL中に溶解させ、１μlの５０mM塩酸および２００μlのアセトニトリルと混合した。遠心後、乾燥させ、５μlの0.2 M MTT溶液（DMSO-アセトニトリル，１：１）を加え、60°Cに1.5時間保温した。反応後、10μlの脱イオン水を加え、遠心操作により試薬と溶媒を除去した。沈渣中のGCNPおよびMTT処理を施していないシアル酸含有GCNPをMALDI-TOF MSにより解析した。
MALDI-TOF MSによる質量分析
MTT未処理およびMTT処理サンプルの質量分析スペクトルを図３に示す。未処理（上図、a）においてはシアル酸含有オリゴ糖の低感度性ゆえ、およびシアル酸の脱離に伴い、目的とする３糖のピークを検出することができなかった。一方、MTT処理サンプルにおいては、m/z 1526に目的とするメチルエステル化３糖由来のピーク（下図、b [2+Na]+）を安定に検出できることが示された。
MTT未処理およびMTT処理サンプルの質量分析スペクトルを図３に示す。未処理（上図、a）においてはシアル酸含有オリゴ糖の低感度性ゆえ、およびシアル酸の脱離に伴い、目的とする３糖のピークを検出することができなかった。一方、MTT処理サンプルにおいては、m/z 1526に目的とするメチルエステル化３糖由来のピーク（下図、b [2+Na]+）を安定に検出できることが示された。
上述の実験結果により、金ナノパーティクル上においてもMTTによるメチルエステル化が進行し、質量分析における感度・確度の向上が示され、実施例１の結果と合わせ、本発明の不溶性支持体に依らない汎用性の高さが明らかとなった。
［実施例３］
ペプチドカルボン酸のメチルエステル化ヘの応用例を示す。
不溶性支持体としてシリカゲルビーズを用い、モデルペプチドとしてトランスフェリン(Tf)のトリプシン分解物を供した。シリカゲル上に固定化されたTfぺプチドのMTTによるメチルエステル化後、質量分析によりメチルエステル化反応を確認する実験を行った。
ペプチドカルボン酸のメチルエステル化ヘの応用例を示す。
不溶性支持体としてシリカゲルビーズを用い、モデルペプチドとしてトランスフェリン(Tf)のトリプシン分解物を供した。シリカゲル上に固定化されたTfぺプチドのMTTによるメチルエステル化後、質量分析によりメチルエステル化反応を確認する実験を行った。
常法に従い、Tfをトリプシンによりペプチドへと加水分解後、１０μlの分解物を１０μlの0.1 M塩酸と混合し、さらに４００μlのアセトニトリルを加えた。シリカゲル（５０μl）をスピンカラムに充填し、アセトニトリルで平衡化した後に混合液を添加した。遠心により非結合物を除去後、アセトニトリルで遠心操作により洗浄した。５０μlの0.１ M MTT溶液（DMSO-アセトニトリル，１：１）を加え、60°Cに1時間保温した。反応後、４００μlのアセトニトリルを加え、遠心操作により試薬と溶媒を除去した。ついで９６％アセトニトリル水溶液で遠心洗浄し、５０μlの５０％アセトニトリル水溶液にてシリカゲルよりペプチドを溶出させた。溶出液中およびMTT処理を施していないぺプチド分解物をMALDI-TOF MSにより解析した。
MALDI-TOF MSによる質量分析
MTT未処理およびMTT処理サンプルの質量分析スペクトルを図４に示す。未処理（上図）において見られるププチド中、代表的なメチルエステル化物を図４下図に示す。ペプチド配列中のグルタミン酸あるいはアスパラギン酸の数量に応じてメチルエステル化された分子量のペプチドが確認された。
MTT未処理およびMTT処理サンプルの質量分析スペクトルを図４に示す。未処理（上図）において見られるププチド中、代表的なメチルエステル化物を図４下図に示す。ペプチド配列中のグルタミン酸あるいはアスパラギン酸の数量に応じてメチルエステル化された分子量のペプチドが確認された。
上述の実験結果により、MTTを用いた本発明によりペプチド配列中のカルボン酸においてもメチルエステル化を施すことが可能であることが示された。
本発明エステル化法は、自動化ロボットを用いたハイスループット解析システムに導入可能であり、また各種生体関連分子のラベル化キットの標識試薬として利用可能である。従来、質量分析による解析が困難であった核酸関連分子も対象としており、質量分析によるハイスループットな塩基配列決定にも応用可能である。
Claims (10)
- 酸性基を有する生体関連分子を予め共有結合または非共有結合により固相担体に固定化した後に、酸性基を有する生体関連分子とトリアゼン化合物とを反応させて前記酸性基のエステル化を行い、エステル化後にエステル化生体関連分子を固相から回収し、回収した生体関連分子を質量分析に供することを含む生体関連分子の分析方法。
- 酸性基がカルボキシル基およびリン酸基から成る群から選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の方法。
- 生体関連分子がタンパク質、ペプチド、糖質、複合糖質および核酸から成る群から選ばれる少なくとも１種である請求項２〜３のいずれか１項に記載の方法。
- トリアゼン化合物が一般式で表される請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
- トリアゼン化合物が３−メチル−１−（ｐ−トリル）トリアゼンである請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
- トリアゼン化合物が安定同位体ラベルされた化合物である請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 安定同位体ラベルが重水素、重炭素または重窒素によるものである請求項７に記載の方法。
- 前記酸性基のエステル化は、実質的に全量の酸性基について行う請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 質量分析がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳによる質量分析である請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 質量分析が液体クロマトエレクトロスプレーイオン化質量分析装置［ＬＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ］による質量分析である請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
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