RU2221578C1 - Способ получения очищенного активированного фактора x свертывания крови - Google Patents
Способ получения очищенного активированного фактора x свертывания крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2221578C1 RU2221578C1 RU2002128481/15A RU2002128481A RU2221578C1 RU 2221578 C1 RU2221578 C1 RU 2221578C1 RU 2002128481/15 A RU2002128481/15 A RU 2002128481/15A RU 2002128481 A RU2002128481 A RU 2002128481A RU 2221578 C1 RU2221578 C1 RU 2221578C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- column
- sodium citrate
- sodium
- deae
- blood coagulation
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови. Сущность изобретения состоит том, что криосупернатант свежезамороженной плазмы человека адсорбируют на колонне с ДЭАЭ-сефарозой FF, элюируют протромбиновый комплекс, осаждают его хлоридом бария, полученный осадок растворяют в цитрано-натриевом буфере, подвергают хроматографии на колонне с гепарин-сефарозой и последующей элюции фракции, содержащей фактор Х свертывания крови, затем инкубируют ее с раствором яда гадюки Рассела в конечной концентрации последнего 7,4-7,6 мкг/мл в течение 6-7 ч, подвергают смесь хроматографии на колонне с ДЭАЭ-сефарозой FF, элюируют целевой продукт цитрано-натриевым буфером, разбавляют его в 1,5-2,5 раза стабилизатором, содержащим альбумин, полиэтиленгликоль-6000, хлорид натрия, цитрат натрия, и лиофилизируют. Техническим результатом является упрощение технологии получения очищенного активированного фактора Х и повышение выхода целевого продукта. 2 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторному контролю содержания низкомолекулярного гепарина у больных, которым проводится гепаринотерапия по поводу заболеваний различной этиологии.
В настоящее время в мировой практике существует ряд методов, позволяющих получать очищенный активированный фактор Х свертывания крови (Ф Ха). Так, предложенный Kirchof В. (1) метод получения Ф Ха основан на сорбции факторов протромбинового комплекса, включающих и фактор X, из цитратной плазмы крови человека, предварительно обработанной ядом Echis carinatus для удаления фибриногена, и активации суммарной выделенной фракции факторов протромбинового комплекса ядом гадюки Рассела с последующим выделением целевого продукта на колонне с ионообменником и доочисткой либо на гидроксилапатите, либо препаративным электрофорезом, либо ультрацентрифугированием.
Недостатком этого метода является низкий выход целевого продукта и его низкая специфическая активность вследствие активации не только ФX, но и других факторов протромбинового комплекса.
Известен способ, предложенный Tishkoff G.H., Estry D.W. (2), основанный на выделении из плазмы крови человека факторов протромбинового комплекса осаждением хлоридом бария с последующим неоднократным отмыванием осадка, осаждением супернатанта хлористым аммонием и последующей очистке путем хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и полигомоаргининсефарозе. Фракцию элюатата, содержащую ФХ, активируют, пропуская ее через колонну с иммобилизованным активирующим ферментом, выделенным из яда гадюки Рассела. Реакцию останавливают, добавляя ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. Затем фракцию, содержащую Ф Ха, диализовали против буфера с 20 мМ Mes-Tris рН 5,9, 2 мМ бензамидина и 0,2% азида натрия.
Недостатком указанного способа получения очищенного Ф Ха является его высокая стоимость, трудоемкость, низкая воспроизводимость и невысокий выход целевого продукта.
Известен также способ, предложенный Herring S.W. et al. (3). Он заключается в выделении из плазмы крови протромбинового комплекса, из которого путем последовательного осаждения и хроматографии получают ФХ. Выделенный ФХ активируют, инкубируя при 37oС с раствором яда гадюки Рассела в присутствии ионов кальция, после чего полученный Ф Ха дополнительно очищают хроматографией на бензамидин-сефарозе. Раствор очищенного Ф Ха элюируют с колонны буфером, содержащим 5 мМ бензамидин, который является примесью препарата Ф Ха, что предопределяет необходимость дополнительной стадии очистки конечного продукта методом диализа.
Недостатком указанного способа является его сложность и невысокий выход целевого продукта.
Задачей данного изобретения является упрощение технологии получения Ф Ха и повышение выхода целевого продукта.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что свежезамороженную плазму человека размораживают при температуре 2-4oС и отделяют криопреципитат центрифугированием при 4000-5000 х g в течение 10-15 минут. Криосупернатант наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF и для освобождения от несвязанных белков промывают колонну забуференным 8-12 мМ трис-НСl до рН 7,2-7,4 физиологическим раствором в объеме, равном 10 объемам колонны. Фракцию, содержащую протромбиновый комплекс, включающий факторы свертывания крови II, V, IX и X, элюируют с колонны 0,5-0,7 М раствором хлорида натрия и осаждают 0,8-1,2 М раствором хлорида бария, который добавляют к раствору протромбинового комплекса в соотношении 1:10-15 (об/об). Полученный осадок растворяют в буфере, содержащем 20-25 мМ цитрат натрия и 20-25 мМ хлорид натрия при рН 7,2-7,4. Полученный раствор подвергают хроматографии на колонне с гепарин-сефарозой. Фракцию, содержащую ФХ, смывают буфером с 20-25 мМ цитратом натрия и 200-220 мМ хлоридом натрия. Затем к полученному элюату ФХ добавляют яд гадюки Рассела в концентрации 7,4-7,6 мкг/мл в присутствии 7,3-7,6 мМ раствора хлорида кальция, инкубируют при температуре 35-38oС в течение 6-7 часов, в результате чего происходит полная трансформация ФХ в активную форму Ф Ха. Затем Ф Ха наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF, уравновешенной в 30-45 мМ цитрате натрия с рН 7,2-7,4, промывают колонну от несвязанных с сорбентом белков и элюируют буфером, содержащим 30-45 мМ цитрат натрия и 180-220 мМ хлорид натрия, при рН 7,0-7,4. Полученный элюат, представляющий собой очищенный Ф Ха, разбавляют в 1,5-2,5 раза (об./об.) стабилизатором, содержащим альбумин в концентрации 0,4-0,6 об.%, полиэтиленгликоль-6000 в концентрации 0,4-0,6 об.%, хлорид натрия - 0,14-0,16 М и цитрат натрия - 15-25 мМ. Полученный целевой продукт лиофилизируют. Выход целевого продукта, полученного предлагаемым методом, составляет 20-25%. Количество общего белка в препарате составляет 0,04-0,05 мг/мл, т.е. степень очистки достигает 2400-2600 раз по отношению к исходной плазме.
Техническим результатом использования изобретения является получение высокоочищенного концентрированного Ф Ха, позволяющего проводить контроль гепаринотерапии, определяя концентрацию низкомолекулярного гепарина в плазме крови больных по его анти-Ха активности.
Пример
Контейнер со свежезамороженной плазмой крови размораживают в водяной бане при температуре 4oС и отделяют криопреципитат центрифугированием при 4500 x g в течение 15 минут. Криосупернатант наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF, для освобождения от несвязанных белков колонну однакратно промывают забуференным 10 мМ трис-HCl физиологическим раствором до рН 7,2-7,4. Фракцию, содержащую протромбированный комплекс, элюируют с колонны 0,5 М раствором хлорида натрия и осаждают 1 М раствором хлорида бария (конечная концентрация), который добавляют к раствору протромбинового комплекса в соотношении 1: 10 (об/об). Осадок растворяют в буфере, содержащем 20 мМ цитрат натрия и 20 мМ хлорид натрия при рН 7,2. Полученный раствор подвергают хроматографии на колонне с гепарин- сефарозой. Фракцию, содержащую ФХ, смывают буфером с 20 мМ цитратом натрия и 200 мМ хлорида натрия. Затем к элюату ФХ добавляют яд гадюки Рассела в концентрации 7,5 мкг/мл в присутствии 7,5 мМ раствора хлорида кальция, инкубируют при температуре 37oС в течение 7 часов, что приводит к полной трансформации ФХ в активную форму Ф Ха. Затем Ф Ха наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF, уравновешенной в 40 мМ цитрате натрия с рН 7,2, и элюируют буфером, содержащим 40 мМ цитрат натрия и 200 мМ хлорид натрия, при рН 7,2. Полученный элюат, представляющий собой очищенный Ф Ха, разбавляют в 2 раза (об/об) стабилизатором, содержащим альбумин в концентрации 0,5 об.%, полиэтиленгликоль-6000 - 0,5 об.%, хлорид натрия - 0,15 М, цитрат натрия - 20 мМ, и лиофилизируют. Полученный Ф Ха имеет удельную активность 34 ед/мг белка. Выход целевого продукта составляет 21% при 2500-кратной степени очистки по отношению к свежезамороженной плазме. Концентрация общего белка в препарате равна 0,045 мг/мл.
Контейнер со свежезамороженной плазмой крови размораживают в водяной бане при температуре 4oС и отделяют криопреципитат центрифугированием при 4500 x g в течение 15 минут. Криосупернатант наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF, для освобождения от несвязанных белков колонну однакратно промывают забуференным 10 мМ трис-HCl физиологическим раствором до рН 7,2-7,4. Фракцию, содержащую протромбированный комплекс, элюируют с колонны 0,5 М раствором хлорида натрия и осаждают 1 М раствором хлорида бария (конечная концентрация), который добавляют к раствору протромбинового комплекса в соотношении 1: 10 (об/об). Осадок растворяют в буфере, содержащем 20 мМ цитрат натрия и 20 мМ хлорид натрия при рН 7,2. Полученный раствор подвергают хроматографии на колонне с гепарин- сефарозой. Фракцию, содержащую ФХ, смывают буфером с 20 мМ цитратом натрия и 200 мМ хлорида натрия. Затем к элюату ФХ добавляют яд гадюки Рассела в концентрации 7,5 мкг/мл в присутствии 7,5 мМ раствора хлорида кальция, инкубируют при температуре 37oС в течение 7 часов, что приводит к полной трансформации ФХ в активную форму Ф Ха. Затем Ф Ха наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF, уравновешенной в 40 мМ цитрате натрия с рН 7,2, и элюируют буфером, содержащим 40 мМ цитрат натрия и 200 мМ хлорид натрия, при рН 7,2. Полученный элюат, представляющий собой очищенный Ф Ха, разбавляют в 2 раза (об/об) стабилизатором, содержащим альбумин в концентрации 0,5 об.%, полиэтиленгликоль-6000 - 0,5 об.%, хлорид натрия - 0,15 М, цитрат натрия - 20 мМ, и лиофилизируют. Полученный Ф Ха имеет удельную активность 34 ед/мг белка. Выход целевого продукта составляет 21% при 2500-кратной степени очистки по отношению к свежезамороженной плазме. Концентрация общего белка в препарате равна 0,045 мг/мл.
Литература
1. Патент США 4334018, 1982.
1. Патент США 4334018, 1982.
2. Патент США 5219995, 1993.
3. Патент США 4501731, 1985.
Claims (3)
1. Способ получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови, характеризующийся тем, что криосупернатант свежезамороженной плазмы человека адсорбируют на колонне с ДЭАЭ-Сефарозой FF, элюируют протромбиновый комплекс, осаждают его хлоридом бария, полученный осадок растворяют в цитратно-натриевом буфере, подвергают хроматографии на колонне с гепарин-Сефарозой и последующей элюции фракции, содержащей фактор Х свертывания крови, затем инкубируют ее с раствором яда гадюки Рассела в конечной концентрации последнего 7,4-7,6 мкг/мл в течение 6-7 ч, подвергают смесь хроматографии на колонне с ДЭАЭ-Сефарозой FF, элюируют целевой продукт цитратно-натриевым буфером, разбавляют его в 1,5-2,5 раза стабилизатором, содержащим альбумин, полиэтиленгликоль-6000, хлорид натрия, цитрат натрия, и лиофилизируют.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для осаждения протромбинового комплекса добавляют хлорид бария в конечной концентрации 1М в соотношении 1:10-15 (об/об).
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизатор для лиофилизации целевого продукта содержит ингредиенты в следующем составе:
Альбумин 0,4 - 0,6%
Полиэтиленгликоль-6000 0,4 - 0,6%
Хлорид натрия 0,14 - 0,16 М
Цитрат натрия 15 - 25 мМ
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002128481/15A RU2221578C1 (ru) | 2002-10-24 | 2002-10-24 | Способ получения очищенного активированного фактора x свертывания крови |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002128481/15A RU2221578C1 (ru) | 2002-10-24 | 2002-10-24 | Способ получения очищенного активированного фактора x свертывания крови |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2221578C1 true RU2221578C1 (ru) | 2004-01-20 |
RU2002128481A RU2002128481A (ru) | 2004-04-27 |
Family
ID=32091783
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002128481/15A RU2221578C1 (ru) | 2002-10-24 | 2002-10-24 | Способ получения очищенного активированного фактора x свертывания крови |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2221578C1 (ru) |
-
2002
- 2002-10-24 RU RU2002128481/15A patent/RU2221578C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ВЕРЕМЕЕНКО К.Н. и др. Получение концентрата фибрионогена из небольших количеств плазмы аутогенной крови человека и его краткая характеристика. /Вопросы медицинской химии, 1991, 37, № 1, с. 44-46. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0317376B2 (fr) | Préparation de concentré de facteur IX humain de haute pureté et d'autres protéines plasmatiques | |
Machovich et al. | Action of heparin on thrombin-antithrombin reaction | |
US3842061A (en) | Method for isolation of antithrombin from animal tissue materials by adsorption on sulfated carbohydrate gel | |
US5143838A (en) | Method of producing thrombin from factor ii using calcium ions for the conversion on an anion exchanger | |
US3920625A (en) | Isolation of coagulation factors from biological material using cross linked sulfated, sulfonated carbohydrates | |
US4470969A (en) | Process for producing a concentrate of coagulation factors VII and VIIa | |
EP0230945B1 (en) | Thrombin-binding substance and process for preparing the same | |
JPS6254286B2 (ru) | ||
US3743722A (en) | Anti-coagulant isolation | |
US4510084A (en) | Method of producing an antithrombin III-heparin concentrate or antithrombin III-heparinoid concentrate | |
EP0607392A4 (en) | Plasma fraction purification. | |
JP2532535B2 (ja) | 組織タンパクpp4含有医薬 | |
US4638050A (en) | Thrombin-binding substance and process for its production | |
CA1078732A (en) | Process for the preparation of thrombinlike enzymes from snake venoms | |
US4473553A (en) | Process for producing a lipoprotein-poor concentrate of coagulation factors VII and VIIa | |
JPH0386900A (ja) | 新規なトロンビン結合性物質及びその製法 | |
US6063909A (en) | Preparation of factor IX | |
US4637932A (en) | Process for producing a concentrate enriched in coagulation factors VII and VIIa | |
JPH03155797A (ja) | 血液凝固第7因子または活性型血液凝固第7因子の調製方法 | |
JP3043558B2 (ja) | ヒト活性化プロテインc調製物及びその製法 | |
RU2221578C1 (ru) | Способ получения очищенного активированного фактора x свертывания крови | |
EP0229026B1 (en) | Therapeutic blood product, means and methods of preparing same | |
US20020031518A1 (en) | Plasminogen fragment having activity to inhibit tumor metastasis and growth and process for preparing same technical field | |
US3542646A (en) | Process for fractionally obtaining urokinase and blood coagulation accelerator in human urine | |
JPS63146898A (ja) | トロンビン結合性物質およびその製法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20101025 |