JP2001517076A - 遺伝子発現の特異性に関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ターゲット遺伝子の特異的発現部位を標的にすることによって遺伝子発現の特異性を改良することを目的とするものである。したがって、影響を及ぼされる生物の複数の領域で発現するプロモーターを含むキメラ遺伝子を提供する。このプロモーターは、植物の複数の領域において発現される植物内在性遺伝子の機能に影響を及ぼす作用物質に連結されている。このプロモーターおよび作用物質は、１以上の所望の位置にその発現部位におけるオーバーラップが存在するするように選択される。このオーバーラップ部位は、遺伝子発現の特異性およびターゲッティングを増大させる。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子発現の特異性に関する改良 本発明は、遺伝子発現の特異性を増大させる方法に関する。特に、本発明は、 例えば、限定するものではないが、植物における病因物質に対する標的耐性を付 与する様式として高度に特異的なターゲッティング効果を発生させるためのキメ ラ遺伝子の使用に関する。 本発明の目的のために、遺伝子がどのように構築され、それがどのように機能 するかを簡略化された方法で記載することは有用である（遺伝子の構造を示す図 １を参照されたい。この遺伝子はキメラ遺伝子でもあり得る）。遺伝子は、３つ の構成成分からなると考えることができる（数字は、図１中の数字を意味するも のである）。１．コード配列がいつ、どこで転写されるかを決定するプロモータ ー（Ｐ）、タンパク質産生のためのコード配列（ＣＳ）およびコード配列の転写 にも時として影響を及ぼし得る３’調節配列（３’）。３’調節配列は、通常、 ターミネーターとして公知である。２．プロモーターがコード配列の作動コピー の転写およびプロセシング（１０）を可能にすることによりメッセンジャーＲＮ Ａ（ｍＲＮＡ）を産生させる場合、遺伝子が発現される。３．次いでｍＲＮＡが 翻訳されて（１１）タンパク質産物が得られる。４．次にタンパク質産物が基質 もしくは別のタンパク質または調節配列と相互作用することにより効果（Ｅ）が 生じ得る。 しかしながら、遺伝子の発現調節は上記の発現プロセスの各段階で影響され得 るということに注意すべきである。因子は、プロモーターと、ｍＲＮＡを産生さ せるための転写可動部分と、およびｍＲＮＡを修飾するかまたはその安定性に影 響を及ぼすプロセスとにおいて作用し得る。また、因子は、タンパク質の翻訳お よび細胞内のタンパク質の代謝回転においても作用し得る。その他の因子は、タ ンパク質がその他の構成成分とどのように相互作用し、その効果をどのように得 るかに影響を及ぼし得る。 本発明の概念を説明するために、植物における下記の遺伝子、遺伝子１および 遺伝子２を考えてみる。遺伝子１は、植物の組織ＡおよびＢにおいて活性であり 、一方遺伝子２は植物の領域ＢおよびＣにおいて活性である。二つの遺伝子の活 性は、領域Ｂでオーバーラップし、これは図２のようにヴェン図形の形式で視覚 的に示すことができる。この図から、共同発現の部位はより限定される、すなわ ち、どちらかの遺伝子が単独で発現する部位よりも特異的であるということは明 白である。 したがって、本発明においては、植物に関して、キメラ遺伝子は植物の複数の 領域で発現するプロモーターを含む。プロモーターは一つの作用物質に連結され ている。この作用物質は、植物の複数の領域においても発現される内在性遺伝子 の機能に影響を及ぼすものである。プロモーターおよび影響される内在性遺伝子 が活性である範囲は同一ではないが、１以上の所望の位置でオーバーラップする 。キメラ遺伝子が植物に移入される場合、作用物質は、一つまたは複数のオーバ ーラップの位置でターゲット内在性遺伝子に影響を及ぼすのみである。 本発明を例示するにはいくつかの方法があり、植物寄生線虫動物に対する耐性 または抵抗性の増大が実際的な例である。本発明者らは、例として細胞破壊およ び雄性不稔性を使用したが、この系は、特定部位における遺伝子の増強にも使用 することができる。 細胞特異的破壊を得るためのいくつかの異なる機構が提案されている。最も簡 単な方法は、破壊系に連結された標的組織に特異的なプロモーターを含むキメラ 遺伝子を利用するものである。しかしながら、特異的プロモーターでさえ、その 標的組織以外の組織においてより小さい程度で発現し得るものであり、これが好 ましくない時がある。 その他の出願では、二つの構築物、すなわち細胞壊死系に連結された組織特異 的プロモーターを含むキメラ遺伝子を含有する第１の構築物（例えばbarnase） および標的領域以外の領域で活性なプロモーターであって保護物質に連結されて いるものを含むキメラ遺伝子を含有する第２の構築物（例えばbarstar）を利用 することによってこの問題を回避する試みがなされている。したがって、所望の 組織以外の組織における壊死は、保護物質によって抑制される（国際特許出願番 号WO92/21757（Plant Genetic Systems N.V.）およびWO93/10251（Mogen Intern ational N.V.）を参照されたい）。 本発明は、例えば、一つの構築物を用いる高度に特異的な細胞破壊系を提供し 得るものである。本発明が適用可能なその他の細胞調節系は、当業者には公知で ある。 本発明の目的は、種々の領域で発現される遺伝子を有する任意の生物に一般的 に適用することができるが、その発現の範囲がオーバーラップするものである部 位特異的発現系またはターゲッティング系を提供することである。 また、本発明の目的は、２以上の核酸配列を含むキメラ遺伝子を含有する一つ の構築物のみを用いて特異性を増大させることであり、この構築物は生物におけ る内在性遺伝子と相互作用するように設計される。 本発明は、形質転換生物における遺伝子調節の特異性を改良する方法であって 、生物における内在性ターゲット遺伝子を同定する工程、ターゲット遺伝子の複 数の発現部位の位置を決定する工程、ターゲット遺伝子の発現部位の一つにおけ る発現を含む、生物において少なくとも２つの発現部位で遺伝子発現を生じさせ るプロモーターおよびターゲット遺伝子の発現を調節する核酸配列またはその産 物である作用物質を含むキメラ遺伝子を作製する工程、キメラ遺伝子を遺伝子形 質転換によって生物の細胞に安定に組み込む工程、ならびに形質転換細胞から生 物を再生させる工程を含み、形質転換生物はキメラ遺伝子を含み、生物における その遺伝子の発現により、形質転換生物またはその子孫における少なくとも一つ の特異的発現部位でターゲット遺伝子またはその産物が調節されるものである、 前記方法を提供する。 好ましくは、核酸配列はコードまたは非コード配列である。 好ましくは、ターゲット遺伝子の発現はアップレギュレートまたはダウンレギ ュレートされ得る。 好ましくは、生物は植物であり、よって形質転換植物またはその零余子(propa gules)はキメラ遺伝子を含む。 作用物質が遺伝子に作用する機構は、下記のいずれか一つに属し得る。ここに 挙げたものに限定されるものではない。 １．アンチセンス ２．共同抑制 ３．ターゲット遺伝子のプロモーターの阻害または活性化 ４．転写の阻害または活性化 ５．メッセンジャーＲＮＡ安定性の変更またはｍＲＮＡの分解 ６．翻訳の阻害または活性化 ７．タンパク質の阻害または活性化 ８．タンパク質代謝回転の変更 ９．共同因子としての作用 １０．タンパク質−タンパク質相互作用の変更 １１．生化学的経路によるフラックスの変更。 これらの機構のいくつかの実施例を以下に簡単に記載する。遺伝子調節を得る ために選択される特定の機構が、本発明の概念において有効であるために一定レ ベルの部位特異的発現をも必要とすることは心に留めておくべきである。 ダウンレギュレーションは、ターゲット遺伝子のプロモーターの全部もしくは 一部またはコードもしくは非コード配列のアンチセンス方向の核酸配列であるキ メラ遺伝子の作用物質によって都合よくなし得る。一方、ダウンレギュレーショ ンは、ターゲット遺伝子のプロモーターまたはコードもしくは非コード配列の共 同抑制によって得られ得る。 ターゲットのアップレギュレーションは、例えば、ターゲット遺伝子のプロモ ーターのアクチベーターを導入することによってなし得る。 これらの技術の組合せも用いることができる。 ターゲット遺伝子の遺伝子発現を調節するその他の適当な方法は、当業者には 公知である。 キメラ遺伝子の作用物質は複数の核酸配列を含み得るものであり、その配列の それぞれは発現された場合に特定の機能を果たす。したがって、一つのプロモー ターのみを用いることにより複数の内在性遺伝子の発現の特異性を得ることがで きる。 構築物は、発現カセットとして二つの別個のキメラ遺伝子を含み得るものであ り、各キメラ遺伝子は、プロモーター、作用物質のコード配列およびターミネー ターを含む。各キメラ遺伝子は、異なる内在性遺伝子に作用するものであり、こ の遺伝子は同一のターゲット部位または異なる部位で発現され得る。したがって 、ある期間にわたって、特定の生合成連鎖などの一連の事象においていくつかの 構成成分またはターゲット遺伝子をノックアウトするか、または増大させる可能 性がある。換言すれば、事象の一時的な連鎖がもたらされ得る。一方、各キメラ 遺伝子は二つの別個の構築物にて生物に移入することができ、各構築物は、一つ の発現カセット、すなわち一つのキメラ遺伝子を含む。 核酸配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。 キメラ遺伝子のプロモーターは、内在性遺伝子の一以上のオーバーラップ発現 部位において発現され得る。 都合がよいことに、プロモーターは、ここでＫＮＴ１プロモーターまたはＲＢ ７プロモーターとして公知のプロモーターのような線虫誘導プロモーターである 。その他の攻撃または増殖部位でそれらに作用するその他の作用物質によって発 現が誘導されるその他のプロモーターは、得られる部位特異的発現調節に依存し て利用され得る。 都合がよいことに、その核酸配列はＲＢ７もしくはＫＮＴ１プロモーターまた はそのコード配列のアンチセンス配列の全部または一部である。 一方、核酸配列は、例えば、上記の機構リストの中の機構５をもたらすために メッセンジャーＲＮＡを分解するためのリボザイムまたは標的ＲＮアーゼであり 得る。また、特異的ＲＮＡは、特異的栄養素、例えば移送のための細胞表面タン パク質受容体用のｍＲＮＡの場合には鉄；またはリガンド、ホルモンおよび翻訳 産物、例えばチューブリンｍＲＮＡにおけるチューブリンタンパク質二量体の効 果によっても安定化または不安定化され得る。本発明の概念には、一定の位置で 発現または要求される栄養素、リガンド、ホルモンまたは翻訳産物の選択が望ま しい。 転写のアクチベーターとしては、細胞内の遊離のタンパク質をコードするキイ ロショウジョウバエ（Drosphila）の熱ショック因子が例示される。熱ショック の際、熱ショック遺伝子因子は熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０のプロモーター に結合し、転写が増大される。熱ショックタンパク質は、細菌、動物および植物 において見出される。当業者は本発明の概念において使用に適した部位特異的で あるアクチベーターを選択することにより機構４を得ることができる。 生物において機構９をもたらすのに適当な共同因子としては、パントテン酸お よびビタミンＢ６のようなビタミンが挙げられる。 最後に、機構１０は、例えば、タンパク質ｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナー ゼを生物に導入することによってもたらされ得る。ｃＡＭＰ−依存性タンパク質 キナーゼは、酵素グリコーゲンシンターゼにそれをリン酸化することによって作 用する。グリコーゲンシンターゼは低活性体に変化し、グリコーゲン合成が阻害 される。 また、本発明は、いくつかの構築物も利用し得るものであり、各構築物のキメ ラ遺伝子の各プロモーター−遺伝子断片は、その系の特異性をさらに増大させる ために選択された１個の発現部位に多数のオーバーラップが付与されるように、 その他のプロモーター−遺伝子断片のそれぞれと同一のターゲット発現部位にオ ーバーラップを有する。キメラ遺伝子のその他の発現部位は、その他のプロモー ター−遺伝子断片のその他の発現部位と同一または異なるものであり得る。 本発明を容易に理解し、容易に実行することができるように、例として、下記 の図および実施例を参照し本発明を詳述する。 図２は、二つの別個の遺伝子が同一の植物内に存在する場合のそれらの遺伝子 の発現部位のオーバーラップを示すものであり、 図３は、本発明にしたがって植物を形質転換するのに用いられたベクターpATC 37010の地図を示すものであり、 図４は、植物を形質転換するのに用いられた対照ベクター、ベクターpATC3700 3の地図を示すものであり、そして 図５は、配列番号５および配列番号６をライゲートして、それぞれ図３および ４のベクターpATC37010およびpATC37003を産生させたpATCの地図を示すものであ る。 図２の部位Ｂにおける細胞特異的破壊は下記のようにして行うことができる。 遺伝子１由来の発現の特異性を調節するプロモーターが、構築物の遺伝子２の活 性を妨害する領域に連結され得る。構築物が植物に導入されると、遺伝子２の破 壊的作用物質が領域ＡおよびＢで発現されるであろう。遺伝子２は部位Ａで活性 ではないので、部位Ａにおいては効果はないであろう。構築物のプロモーターは 部位Ｃで活性ではなく、よって遺伝子２の破壊的作用物質は産生されないので、 部位Ｃでの効果はないであろう。遺伝子２に対する破壊的作用物質が存在し、遺 伝子２は活性でもあるので、部位Ｂでは遺伝子２の妨害が存在するであろう。実施例１ ヴェン構築物を用いた操作により植物寄生線虫に対する耐性または抵抗性を増 大させた。 根瘤線虫および包．線虫のような植物寄生線虫は、世界中の農作物収穫高を７ 〜14％低下させている。線虫は、植物根に侵入し、線虫がその栄養分を誘導する 独特の摂餌部位を生じさせることにより作用する。摂餌部位は、変質植物細胞、 すなわち根瘤線虫の場合には巨大多核細胞、包．線虫の場合にはいくつかの細胞 か融合した融合細胞である。線虫は定着するようになり、栄養素の摂餌部位にま ったく依存している。本出願人らの米国特許第５，５８９，６２２号には、摂餌 細胞特異的プロモーターを細胞死または細胞破壊系に連結して摂餌細胞を破壊す ることによって植物抵抗性を得る一般的な方法が記載されている。摂餌細胞はそ れらの機能が損なわれ、その結果、線虫が餓死するか、または線虫への食物供給 が低減されるて、成長および子孫の産生の能力がなくなるか低くなる。この方法 は、上記の細胞特異的破壊の最も簡単な方法の例である。この原理を利用するそ の他の特許は、例えば、国際特許出願番号WO89/10396（Plant Genetic Systems N.V.）のような植物を不稔性にする特許である。 摂餌細胞、根端、およびその他の分裂組織（これは程度が低い）において発現 されるプロモーターＫＮＴ１を同定した。その他の研究者らは、根および巨細胞 において発現される遺伝子ＲＢ７を同定した（Conklingら，1990，Oppermanら， 1993）。マーカー遺伝子ＧＵＳに連結されたＲＢ７プロモーターを用いた本発明 者らの研究は、ＲＢ７遺伝子が根端ではなく、根の主要部において発現すること を示唆するものである。アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８を含む、pBIN19（Bevan，M．1984）誘導植物形質転換ベク ターにＲＢ７コード配列の部分アンチセンス配列に連結されたプロモーターＫＮ Ｔ１およびnosターミネーターを含むヴェン構築物を作製した。構築物は標識pBI NO5002であり、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約 のもとに、National Collection of Industrial and Marine Bacteria（ＮＣＩ ＭＢ）（23St．Machar Street，Aberdeen，Scotland）にAdvanced Technologies （ケンブリッジ）社（210 Cambridge Science Park，Cambridge CB4 4WA，Engla nd）によって1997年３月20日に寄託されており、受託番号NCIMB40871を得ている 。タバコ植物cv Heavy Westernを、アグロバクテリウム媒介植物形質転換を用い てHorschら（1985）の方法にしたがってかかる構築物により形質転換した。 再生トランスジェニック植物を温室に移した。トランスジェニック植物および 非トランスジェニック対照に、それぞれ約100匹の根瘤線虫Meloidogyne javanic aを感染させた。感染の８週間後、目に見える根瘤の数およびそのサイズを測定 した。この期間中、初期接種物は、感染し、成熟し、線虫の第２世代（今度はこ の第２世代が植物根瘤に感染し、成熟する）を産む機会を有していた。 最もスコアの低いトランスジェニックpBIN05002植物の中の８個を成長させて 種を生じさせた。親植物からの子孫を、上記のM．javanicaに対する耐性または 抵抗性の増大について再びスクリーニンク化た。pBIN05101植物に加えて、グル クロニダーゼマーカー遺伝子（ＧＵＳ）に連結されたＫＮＴ１プロモーターを含 むpBIN05101で形質転換された植物からの子孫（Jefferson，R.A.ら，1987）およ び非形質転換植物からの子孫を、比較のための対照として含ませた。pBIN05101 も、1997年３月20日にＮＣＩＭＢに寄託されており、受託番号NCIMB 40870を得 ている。pBIN05002植物系32の子孫は、表１に示したように、．瘤スコアの低い 植物の数が有意に増大していた。この結果はχ²分析において有意である。 表１ 非形質転換対照植物、対照pBIN05101植物およびpBIN05O02試験植物についての 低．瘤スコア区分と高．瘤スコア区分における植物の数 低．瘤スコア＝０〜５０．瘤／植物 高．瘤スコア＝５１＋．瘤／植物 処理 低．瘤スコアの植物 高．瘤スコアの植物 非形質転換植物 １８ １３ pBIN05101対照植物 １３ １７ pBIN05002系32試験植物 ２５ ７実施例２ 上記の実施例において、線虫破壊における特異性を増大させるための細胞破壊 系を用いて説明したオーバーラップの原理は、例えば、Arabidopsis、またはそ の他の植物の花においても同様に十分に実行されて、花のパターンまたは構造が 変化した花、例えば、雄性不稔性の花が得られ得る。この実施例は、Arabidopsi sにおいて同定されたＤＮＡ配列を利用するものである。 花の中には３つの遺伝子の調節下にあると仮定される４つのエレメント（萼片 、心皮、花弁および雄ずい）が存在する（Coen，E.S.およびMeyerowitz，E.M.， 1991）。 これらの遺伝子のバランスを変更することにより、花パターンの変化が生じる 。例えば、遺伝子agamousおよびapetala3は、花の同一部分で発現して植物の雄 性部分である雄ずいを生じさせなければならない。agamousは、心皮および雄ず いの両方で発現し、一方apetala3は雄ずいおよび花弁の両方で発現する。 本発明の主題であるオーバーラップ原理にしたがって構築物を製造するために は、本発明者らは、雄ずいにおいてのみ破壊をもたらすために第２の遺伝子（例 えば、花弁および雄ずいで活性なapetala3）の破壊物質に連結された一の遺伝子 （例えば、心皮および雄ずいで活性なagamous）由来のプロモーターを必要とす る。 下記のTaqおよびTaq−エキステンダーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により公 表されている手順（Thomas，C.，1996）にしたがって下記の二つのプライマーを 用いることによって、agamousプロモーターの435塩基対断片をArabidopsis thal iana ＤＮＡから単離した： プライマー１（配列番号１） プライマー２（配列番号２） プライマーは、ゲノムagamous配列についてのジーンバンクＤＮＡ配列エント リーATAGAMSGで得られた配列に基づくものであった。プライマー１はその5'末端 に追加のHindIII制限部位を含む。プライマー２は、その5'末端に追加のBamHI制 限部位を含む。 下記のプライマーは、apetala3遺伝子配列の外側の部分を増幅するためにジー ンバンク配列エントリーATHAPETALAから設計された： プライマー３（配列番号３） プライマー４（配列番号４） プライマー３は、公表されているapetala3配列の992位にて増幅が開始される ように特異的に設計され、これは活性産物を産生させるための不適正リーディン グフレームにおける開始コドンであり、同一遺伝子ファミリー内のその他のMADS ボックス遺伝子と強い相同性を有する配列の初期部分を無効にするものである。 また、プライマー３は、望ましくないSacI制限部位を除去するために公表されて いる配列から１塩基対変更されている。プライマー３はその5'末端にBamHI制限 部位を有している。プライマー４はその5'末端にSacI部位を有している。1586bp 断片を、プライマー３および４を用いてＰＣＲによってArabidopsis ＤＮＡから 増幅させた。 下記のクローニング方法は当業者にはよく知られており、Sambrookら（1989） の方法にしたがうことによって成果を得ることができる。agamousプロモーター 断片をpBluescript誘導ベクター（Stratagene社，ケンブリッジ，UK）にHindIII −BamHI断片としてライゲートした。変更型apetala遺伝子断片を同一ベクター内 のagamousプロモーターの下流にBamHI-SacI断片としてライゲートした。また、 ベクターには、変更型apetala3配列の下流にSacI−EcoRI断片としてnosターミネ ーター配列も含まれていた。ベクターをpDVM37010と命名した。Jim Haselhoffか ら入手した、m-gfp-ERレポーター遺伝子の前にagamousプロモーターを含む第２ のプラスミド、ＭＲＣを対照として作製し、pDVM37003と命名した。 プロモーター−遺伝子断片−ターミネーターカセットをpDVM37010（配列番号 ５）およびpDVM37003（配列番号６）からNotI制限断片として切り出し、pBIN19 （Bevan，M．(1984)）誘導ベクターpATCにライゲートしてプラスミドpATC37010 （図３に示した地図）およびpATC37003（図４に示した地図）を得た。これらの 配列は、適当な制限部位、すなわちカセットの各末端におけるNotIを有する任意 のその他の同等のベクターにクローニングすることができる。pATCの地図を図５ に示す。これはpBIN19と比べて改変されている制限部位を有する。pATC37010は 、agamousプロモーターの調節下で共同抑制産物を産生して、花の発達中の雄ず いにおけるapetala3機能を不活性化する。 プラスミドをアグロバクテリウム ツメファシエンス宿主LBA4404に移入し、Be chtoldら（1993）の方法およびHorschら（1985）の方法を用いるNicotiana taba cum cv K326にしたがってArabidopsis thalianaの形質転換に使用した。pATC370 10については８個のトランスジェニックArabidopsis苗木およびpATC37003につい ては６個のトランスジェニックArabidopsis苗木が得られた。100個の葉盤３群を 、各構築物に対するNicotiana形質転換に用いた。トランスジェニックカルス増 殖が３群全てについて検出された。 発芽の10〜14日後にArabidopsis苗木を土壌に移し、開花するまで成長させた 。花は雄ずいおよびダブルローズ(double rose)心皮を示さなかった。 カナマイシン耐性pATC37010トランスジェニック植物を、プライマー１および ４を用いてTaqポリメラーゼによるＰＣＲによって当業者に公知の手順にしたが って、さらに所望の挿入物の存在についてスクリーニングした。ＰＣＲでは、94 ℃で60秒間、60℃で30秒問、および72℃で140秒間のインキュベーション工程を 含む40サイクルのインキュベーションを行った。ＰＣＲ陽性試料を、当業者に公 知の手順にしたがってアガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の視覚化によっ て同定した。 対照pATC37003トランスジェニック植物を、プライマー１およびプライマー７ を用いてTaqポリメラーゼによるＰＣＲによって当業者に公知の手順にしたがっ て、さらに所望の挿入物の存在についてスクリーニングした。ＰＣＲでは、94℃ で40秒間、60℃で30秒間、および72℃で140秒間のインキュベーション工程を含 む40サイクルのインキュベーションを行った。ＰＣＲ陽性試料を、当業者に公知 の手順にしたがってアガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の視覚化によって 同定した。 プライマー７（配列番号７） いずれの場合においても、適切な構築物を含むトランスジェニック植物が同定 された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年２月２６日（１９９９．２．２６） 【補正内容】 ６．前記核酸配列がアンチセンス方向のものである、請求項１〜４のいずれか１ 項に記載の方法。 ７．前記核酸がセンス方向のものである、請求項１、２または４に記載の方法。 ８．前記核酸がセンス方向のものである、請求項１、２または３に記載の方法。 ９．前記ターゲット遺伝子のアップレギュレーションが、前記ターゲット遺伝子 のプロモーターのアクチベーターの導入から生じるものである、請求項３に記載 の方法。 １０．前記キメラ遺伝子の前記作用物質が複数の核酸配列を含み、その配列のそ れぞれは、発現された場合に特定の機能を果たすものである、請求項１〜９のい ずれか１項に記載の方法。 １１．前記キメラ遺伝子のプロモーターが、前記内在性遺伝子の複数のオーバー ラップ発現部位で発現される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 １２．前記プロモーターがＫＮＴ１プロモーターまたはＲＢ７プロモーターであ る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １３．前記プロモーターがそれに作用するその他の物質によって発現されるもの である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １４．前記核酸配列が、ＲＢ７またはＫＮＴＩプロモーターまたはそのコード配 列のアンチセンス配列の全部または一部である、請求項１〜１２のいずれか１項 に記載の方法。 １５．前記核酸配列が、１以上のリボザイム、メッセンジャーＲＮＡを分解する ための標的ＲＮアーゼ、または特異的ＲＮＡの安定化もしくは不安定化物質であ る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １６．前記核酸が転写のアクチベーターを含む、請求項１〜１１および１３のい ずれか１項に記載の方法。 １７．転写の前記アクチベーターがタンパク質をコードする熱ショック因子であ る、請求項１６に記載の方法。 １８．前記作用物質が前記遺伝子上で作用する機構が、アンチセンス、共同抑制 、ターゲット遺伝子のプロモーターの阻害もしくは活性化、転写の阻害もしくは 活性化、メッセンジャーＲＮＡ安定性の変更もしくはｍＲＮＡの分解、翻訳の阻 害もしくは活性化、タンパク質の阻害もしくは活性化、タンパク質代謝回転の変 更、共同因子としての作用、タンパク質−タンパク質相互作用の変更、または生 化学的経路によるフラックスの変更からなる群の１以上である、請求項１〜１７ のいずれか１項に記載の方法。 １９．受託番号NCIMB 40871の寄託された構築物。 ２０．プラスミドpATC 37010またはそのプラスミドに含まれるようにプロモータ ー−遺伝子断片−ターミネーターカセットを含む構築物。 ２１．請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を行うことにより得られた植 物およびその子孫。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 トーマス、クリストファー、ジョン、ロバ ート イギリス、ケンブリッジ シービー４ ６ ゼットジー ミルトン ザ オークス ７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．形質転換生物における遺伝子調節の特異性を改良する方法であって、生物に おける内在性ターゲット遺伝子を同定する工程、ターゲット遺伝子の複数の発現 部位の位置を決定する工程、ターゲット遺伝子の発現部位の一つにおける発現を 含む、生物において少なくとも２つの発現部位で遺伝子発現を生じさせるプロモ ーターおよびターゲット遺伝子の発現を調節する核酸配列またはその産物である 作用物質を含むキメラ遺伝子を作製する工程、キメラ遺伝子を遺伝子形質転換に よって生物の細胞に安定に組み込む工程、ならびに形質転換細胞から生物を再生 させる工程を含み、形質転換生物はキメラ遺伝子を含み、生物におけるその遺伝 子の発現により、形質転換生物またはその子孫における少なくとも一つの特異的 発現部位でターゲット遺伝子またはその産物が調節されるものである、前記方法 。 ２．前記核酸配列がコードまたは非コード配列である、請求項１に記載の方法。 ３．前記ターゲット遺伝子の発現がアップレギュレートされる、請求項１または ２に記載の方法。 ４．前記ターゲット遺伝子の発現がダウンレギュレートされる、請求項１または ２に記載の方法。 ５．前記生物が植物である、請求項１、２、３または４に記載の方法。 ６．前記核酸配列がアンチセンス方向のものである、請求項１〜４のいずれか１ 項に記載の方法。 ７．前記核酸がセンス方向のものである、請求項１、２または４に記載の方法。 ８．前記核酸がセンス方向のものである、請求項１、２または３に記載の方法。 ９．前記ターゲット遺伝子のアップレギュレーションが、前記ターゲット遺伝子 のプロモーターのアクチベーターの導入から生じるものである、請求項３に記載 の方法。 １０．前記キメラ遺伝子の前記作用物質が複数の核酸配列を含み、その配列のそ れぞれは、発現された場合に特定の機能を果たすものである、請求項１〜９のい ずれか１項に記載の方法。 １１．前記キメラ遺伝子のプロモーターが、前記内在性遺伝子の複数のオーバー ラップ発現部位で発現される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 １２．前記プロモーターがＫＮＴ１プロモーターまたはＲＢ７プロモーターであ る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １３．前記プロモーターがそれに作用するその他の物質によって発現されるもの である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １４．前記核酸配列が、ＲＢ７またはＫＮＴ１プロモーターまたはそのコード配 列のアンチセンス配列の全部または一部である、請求項１〜１２のいずれか１項 に記載の方法。 １５．前記核酸配列が、１以上のリボザイム、メッセンジャーＲＮＡを分解する ための標的ＲＮアーゼ、または特異的ＲＮＡの安定化もしくは不安定化物質であ る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １６．前記核酸が転写のアクチベーターを含む、請求項１〜１１および１３のい ずれか１項に記載の方法。 １７．転写の前記アクチベーターがタンパク質をコードする熱ショック因子であ る、請求項１６に記載の方法。 １８．前記作用物質が前記遺伝子上で作用する機構が、上記で１〜１１と番号付 けされた前記機構の中の１以上である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の 方法。 １９．受託番号NCIMB 40871の寄託された構築物。 ２０．プラスミドpATC 37010またはそのプラスミドに含まれるようにプロモータ ー−遺伝子断片−ターミネーターカセットを含む構築物。 ２１．請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって形質転換された植物 およびその子孫。