ES2265660T3 - Mejoras relacionadas con la especificidad de la expresion genica. - Google Patents

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Abstract

La presente invención trata de mejorar la especificidad de la expresión del gen centrándose en un sitio de expresión específico de un gen diana. Por lo tanto se proporciona un gen quimérico que comprende un promotor que expresa en más de una región del organismo al que afecta. El promotor está unido a un agente que afecta al funcionamiento de un gen endógeno en la planta, el cual se expresa también en más de una región de la planta. El promotor y el agente se seleccionan de forma que haya un solapamiento es sus sitios de expresión a una o más localizaciones deseadas. Este(os) sitio(s) de solapamiento da(n) lugar a una especificidad aumentada y a la consecución de la expresión del gen.

Description

Mejoras relacionadas con la especificidad de la expresión génica.
Este invento se refiere a un método para aumentar la especificidad de la expresión génica. En particular, el invento se refiere al uso de un gen quimérico para generar un efecto dirigido altamente específico como un modo de proporcionar, por ejemplo pero no exclusivamente, una resistencia dirigida a los agentes causantes de enfermedades en plantas.
Para el propósito de este invento es útil describir de manera simplificada cómo un agente es construido y cómo funciona (véase la Figura 1 que muestra la estructura de un gen, el cual puede ser también un gen quimérico). Se puede considerar que un gen consiste en tres componentes (los números se refieren a los números en la Figura 1); 1. un promotor (P) que determina cuándo y dónde una secuencia codificante es transcrita, una secuencia codificante (CS) para la producción de una proteína y una secuencia reguladora 3' (3') que puede afectar algunas veces también a la transcripción de la secuencia codificante. La secuencia reguladora 3' es comúnmente conocida como un terminador. 2. Un gen es expresado cuando el promotor permite la transcripción y el procesamiento (10) de una copia activa de la secuencia codificante para producir un ARN mensajero (mARN). 3. El mARN es entonces traducido (11) para dar un producto proteico. 4. El producto proteico puede luego interactuar con un sustrato u otra proteína o una secuencia reguladora para causar un efecto (E).
Sin embargo, se debe observar que la regulación de la expresión de un gen puede ser afectada en cada etapa del proceso de expresión descrito anteriormente. Los factores pueden actuar sobre el promotor, en la maquinaria de transcripción para producir el mARN y en los procesos que modifican el mARN o que afectan a su estabilidad. Los factores pueden también actuar en la traducción de la proteína y en la renovación de la proteína dentro de la célula. Otros factores pueden influir en cómo la proteína interactúa con otros componentes y consigue sus efectos.
Para explicar el concepto del invento, considérense los siguientes genes, gen 1 y gen 2 en una planta. El gen 1 es activo en los tejidos A y B de una planta, mientras que el gen 2 es activo en las regiones B y C de una planta. Las actividades de los dos genes se solapan en la región B y esto puede ser descrito visualmente como en la Figura 2, que está en forma de un diagrama de Venn. De esta Figura es evidente que el sitio de la expresión mixta es más limitada o, en otras palabras, más especifica que los sitios de expresión de cualquiera de los genes por su cuenta.
Así en este invento, con respecto a las plantas, el gen quimérico contiene un promotor que se expresa en más de una región de la planta. El promotor está unido a un agente. El agente afectará el funcionamiento de un gen endógeno que también está expresado en más de una región de la planta. Las áreas en las que el promotor y el gen endógeno que ha de ser afectado son activos, no son idénticas pero se solapan en una o más localizaciones deseadas. Cuando el gen quimérico es transferido a una planta, el agente tendrá solo un efecto sobre el gen endógeno diana en las localizaciones de solapamiento.
Hay varias formas de ejemplificar el invento, del cual la tolerancia o resistencia a los nemátodos parásitos vegetales aumentada es un ejemplo práctico. Aunque los autores han usado alteraciones celulares y esterilidad de las plantas macho como ejemplos, el sistema puede ser usado también para la potenciación de un gen en un sitio particular.
Varios mecanismos diferentes han sido propuestos para obtener una alteración específica celular. El método más simple utiliza un gen quimérico que comprende un promotor específico del tejido diana unido a un sistema de alteración. Incluso los promotores específicos, sin embargo, pueden expresarse en menor grado en los tejidos distintos de los dirigidos, lo cual es algunas veces indeseable.
Otras aplicaciones han intentado solucionar este problema utilizando dos construcciones, la primera construcción que contiene un gen quimérico que comprende un promotor específico de tejido unido a un sistema de necrosis celular (por ejemplo, barnasa) y la segunda construcción que contiene un gen quimérico que comprende un promotor activo en regiones distintas de la dirigida, estando el promotor unido a un protector (por ejemplo barstar) que inactiva el sistema de necrosis. La necrosis en los tejidos distintos del deseado es por tanto suprimida por el protector (véase la solicitud de patente internacional Nº WO92/21757 (Plant Genetic Systems N.V.) y WO 93/10251 (Mogen Internacional
N.V.)).
Este invento puede proporcionar, por ejemplo, un sistema de alteración celular altamente específico usando una construcción única. Otros sistemas de regulación celular a los cuales el invento es aplicable serán conocidos por el profesional con experiencia.
Es un objeto del invento proporcionar un sistema de expresión específica de sitio o un sistema diana que es aplicable generalmente a cualquier organismo que tiene genes expresados en regiones diferentes pero en los que sus esferas de expresión se solapan.
También es un objeto del invento lograr aumentar la especificidad usando sólo una construcción que comprende un gen quimérico que comprende dos o más secuencias de ácidos nucleicos, cuya construcción es diseñada para interactuar con un gen endógeno en un organismo.
El presente invento proporciona un método para mejorar la especificidad de la regulación génica en una planta transformada que comprende:
(a)
la introducción de un gen quimérico en una célula de una planta en la que el gen quimérico comprende un promotor específico de tejido y una secuencia de ácidos nucleicos que regula la expresión de un gen diana o un producto del mismo, y en el que el promotor específico de tejido transcribe la secuencia de ácidos nucleicos en más de uno pero no en todos los sitios de expresión en la planta incluyendo al menos uno de los sitios de expresión múltiple del gen diana endógeno; y
(b)
la regeneración de una planta transformada que comprende el gen quimérico de las células,
en el que la expresión específica de tejido del gen quimérico regula la expresión del gen diana o actividad del producto del gen diana en la planta transformada en los sitios de expresión en los que el gen quimérico y el gen diana son ambos expresados.
Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia codificante o no codificante.
Preferiblemente, los niveles de expresión del gen diana pueden estar aumentados o disminuidos.
Preferiblemente, el organismo es una planta, de modo que la planta transformada o la progenie de la misma contiene el gen quimérico.
El mecanismo a través del cual el agente actúa en un gen puede pertenecer a cualquiera de los siguientes. La lista no debería ser considerada excluyente.
1.
antisentido.
2.
cosupresión.
3.
inhibición o activación del promotor de un gen diana.
4.
inhibición o activación de la transcripción.
5.
alteración de la estabilidad del ARN mensajero o degradación del mARN.
6.
inhibición o activación de la traducción.
7.
inhibición o activación de una proteína
8.
alteración de la renovación proteica.
9.
actuando como cofactor.
10.
alteración de las interacciones de proteína-proteína.
11.
alteración del flujo a través de un camino bioquímico.
Algunos ejemplos de estos mecanismos son tratados brevemente a continuación. Debería tenerse en cuenta que el mecanismo particular para ser seleccionado para lograr la regulación genética requerirá también un cierto nivel de la expresión específica de sitio para ser eficaz en el concepto del invento.
La disminución en los niveles de expresión puede ser ventajosamente lograda por el agente del gen quimérico que es una secuencia de ácidos nucleicos, la cual está en la orientación antisentido de todo o parte del promotor o una secuencia codificante o no codificante del gen diana.
Alternativamente, la disminución en los niveles de expresión puede ser lograda mediante la cosupresión del promotor o secuencia codificante o no codificante del gen diana.
El aumento en los niveles de expresión del gen diana puede ser logrado, por ejemplo, mediante la introducción de un activador del promotor del gen diana.
Las combinaciones de estas tecnologías pueden ser también usadas.
Otros métodos adecuados de regulación de la expresión genética del gen diana serán conocidos por aquellos con experiencia en la técnica.
\newpage
El agente del gen quimérico puede comprender una o más secuencias de ácidos nucleicos, cada una de cuyas secuencias, cuando se expresan, lleva una función particular. Se puede obtener así la especificidad de la expresión de más de un gen endógeno usando sólo un promotor.
Una construcción puede contener dos genes quiméricos separados como casetes de expresión, comprendiendo cada gen quimérico un promotor, una secuencia codificante para un agente y su terminador. Cada gen quimérico actúa en un gen endógeno diferente, gen que puede estar expresado en el mismo sitio diana o en un sitio diferente. Existe así la posibilidad de eliminar o aumentar varios componentes o genes diana en una secuencia de eventos, tales como una cadena biosintética particular, a lo largo de un período de tiempo. En otras palabras, una cadena temporal de eventos puede ser efectuada. Alternativamente, cada gen quimérico puede ser transferido en el organismo en dos construcciones separadas, cada construcción contiene un casete de expresión, es decir, un gen quimérico.
La secuencia de ácidos nucleicos puede ser una secuencia de ADN o una secuencia de ARN.
El promotor del gen quimérico puede ser expresado en más de un sitio de expresión solapante del gen endógeno.
Ventajosamente, el promotor es un promotor inducible en nemátodos, tal como el promotor conocido aquí como el promotor KNT1 o el promotor RB7. Otros promotores que causan la expresión por otros agentes que actúan sobre ellos en otros sitios abordados o de crecimiento pueden ser utilizados dependiendo de la regulación de la expresión específica de sitio a ser lograda.
Ventajosamente, la secuencia de ácidos nucleicos es la o una parte de la secuencia antisentido del promotor RB7 ó KNT1 o la secuencia codificante del mismo.
Alternativamente, la secuencia de ácidos nucleicos puede ser una ribozima o una RNasa dirigida para degradar un ARN mensajero para efectuar, por ejemplo, al mecanismo 5 de la lista de mecanismos anteriores. También, los ARNs específicos pueden ser estabilizados o desestabilizados por nutrientes específicos, por ejemplo, hierro en el caso del mARN para el receptor proteico de la superficie celular para la transferrina; o ligandos, hormonas y productos de traducción, por ejemplo el efecto del dímero de la proteína tubulina sobre el mARN de tubulina. La selección de nutrientes, ligandos, hormonas o productos de traducción expresados o requeridos en ciertas localizaciones es deseable para el concepto del invento.
Un ejemplo de un activador de la transcripción es el factor de choque térmico de Drosophila que codifica una proteína libre en la célula. Tras el choque térmico, el factor del gen de choque térmico se une al promotor de la proteína de choque térmico HSP70 y conduce a aumentar la transcripción. Las proteínas de choque térmico se encuentran en las bacterias, en los animales y en las plantas. Los activadores adecuados para usar en el concepto del invento, que son específicos de sitio pueden ser seleccionados por el profesional con experiencia para lograr el mecanismo 4.
Los cofactores adecuados para efectuar el mecanismo 9 en un organismo incluyen vitaminas tales como ácido pantoténico y vitamina B6.
Finalmente, el mecanismo 10 podría ser efectuado introduciendo, por ejemplo, la proteína proteína quinasa dependiente de cAMP en un organismo. La proteína quinasa dependiente de cAMP actúa sobre la enzima glucógeno sintasa fosforilándola. La glucógeno sintasa se convierte en una forma menos activa y la síntesis del glucógeno es
inhibida.
El invento puede también utilizar un número de construcciones, teniendo cada fragmento de promotor génico del gen quimérico de cada construcción un solapamiento en el mismo sitio de expresión dirigida como cada uno de los otros fragmentos del promotor génico, de modo que se proporciona un solapamiento múltiple en el sitio de expresión único seleccionado para potenciar adicionalmente la especificidad del sistema. El otro sitio de expresión del gen quimérico puede ser el mismo que o diferente de los otros sitios de expresión de los otros fragmentos del promotor génico.
Para que el invento pueda ser comprendido fácilmente y llevado fácilmente a efecto, se hará ahora referencia, por medio del ejemplo, a la figura y ejemplo siguientes en los que:
La Figura 2 muestra el solapamiento de los sitios de expresión de los dos genes separados cuando están en la misma planta,
La Figura 3 muestra el mapa para el vector pATC37010 usado para transformar las plantas de acuerdo con el invento,
La Figura 4 muestra el mapa para el vector pATC37003, un vector testigo usado para transformar las plantas, y
La Figura 5 muestra el mapa para el pATC en el que la SEQ.ID.No. 5 y la SEQ.ID.No. 6 fueron ligadas para producir los vectores pATC37010 y pATC37003 de las Figuras 3 y 4 respectivamente.
\newpage
La interrupción específica celular en el sitio B en la Figura 2 puede ser conseguida como sigue. El promotor que regula la especificidad de la expresión del gen 1 puede ser unido a una región que va a interrumpir la actividad del gen 2 en una construcción. Cuando la construcción es introducida en las plantas, el agente perjudicial del gen 2 será expresado en las regiones A y B. No habrá efecto en el sitio A porque el gen 2 no es activo aquí. No habrá efecto en el sitio C porque el promotor de la construcción no es activo ahí y por tanto ningún agente perjudicial para el gen 2 es producido. Habrá interrupción del gen 2 en el sitio B puesto que el agente perjudicial para el gen 2 está presente y el gen 2 es también activo.
Ejemplo 1 Tolerancia o resistencia a los nemátodos parásitos vegetales aumentada mediante ingeniería usando las construcciones Venn
Los nemátodos parásitos vegetales tales como los nemátodos de nudos de raíz y los nemátodos císticos causan del 7 al 14% de las pérdidas en el rendimiento de las cosechas en el mundo entero. Los nemátodos actúan penetrando en las raíces de las plantas y generando sitios de alimentación únicos a través de los cuales ellos derivan sus nutrientes. Los sitios de alimentación son células vegetales alteradas, o bien células multinucleadas gigantes en el caso de los nemátodos de nudo de raíz o bien sincitios de varias células fusionadas juntas en el caso de los nemátodos císticos. Los nemátodos se vuelven sensibles y son totalmente dependientes de los sitios de alimentación para los nutrientes. El documento de patente norteamericana No. 5.589.622 describe una manera general de hacer las plantas resistentes uniendo los promotores específicos de las células de alimentación a sistemas de muerte celular o sistemas de interrupción celular para interrumpir las células de alimentación. Las células de alimentación son dañadas en su función, de modo que el nemátodo muere de inanición o tiene un suministro de alimento reducido y es incapaz o menos capaz de crecer y de producir progenie. Este método es un ejemplo del método más simple de interrupción específica celular descrito anteriormente. Otras patentes que utilizan este principio son aquellas que crean esterilidad en una planta, por ejemplo, la solicitud de patente internacional No. WO 89/10396 (Plant Genetic Systems
N.V.)
El promotor KNT1 que está expresado en las células de alimentación, en las puntas de raíz y en menor grado en otros meristemos, fue identificado. Otros investigadores han identificado un gen, RB7 expresado en las raíces y células gigantes (Conkling y otros 1990, Opperman y otros 1993). Los estudios de estos autores con el promotor RB7 unido al gen marcador GUS sugieren que el gen RB7 está expresado en el cuerpo de la raíz y no en la punta de la raíz. Una construcción Venn que contiene el promotor para el KNT1 unido a una secuencia antisentido parcial de la secuencia codificante RB7 y un terminador nos en un vector de transformación vegetal derivado del pBIN19 (Bevan, M. 1984) que contiene Agrobacterium tumefaciens C58 fue hecho. La construcción fue etiquetada pBIN05002 y fue depositada por Advanced Technologies (Cambridge) Ltd de 210 Cambridge Science Park, Inglaterra bajo el tratado de Budapest en el Reconocimiento internacional del depósito de micro-organismos para los propósitos del procedimiento de la patente en el National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen, Escocia el 20 de marzo de 1997 bajo el número de acceso NCIMB 40871. Las plantas de tabaco cv Heavy Western fueron transformadas con esta construcción usando la transformación vegetal mediada por Agrobacterium de acuerdo con el método de Horsch y otros (1985).
Las plantas transgénicas regeneradas fueron transferidas al invernadero. Las plantas transgénicas y los testigos no transgénicos fueron infectados cada uno con alrededor de 100 individuos del nemátodos de nudos de raíz Meloidogyne javanica. Ocho semanas después de la infección fueron determinados el número de nudos de raíz visible y sus tamaños. Durante este período, el inóculo inicial tuvo la oportunidad de infectar, madurar y producir una segunda generación de nemátodos que a su vez pudo infectar las raíces de las plantas y madurar.
Ocho de las plantas transgénicas pBIN05002 de menor marcador fueron hechas crecer para producir semillas. La progenie de las plantas parentales fueron cribadas de nuevo para aumentar la tolerancia o resistencia a M. javanica, como se describe anteriormente. Además de las plantas pBIN05002, la progenie de las plantas transformadas con pBIN05101 que contienen el promotor KNT1 unido al gen marcador glucuronidasa (GUS) (Jefferson, R.A. y otros 1987) y la progenie de las plantas sin transformar fueron incluidas como testigos para comparación. El pBIN05101 fue también depositado en el NCIMB el 20 de marzo de 1997 bajo el número de acceso NCIMB 40870. La progenie de la línea vegetal 32 pBIN05002 mostró un aumento significativo en el número de plantas con bajo número de agallas como se muestra en la Tabla 1. Los resultados son significativos en un análisis de Chi cuadrado.
TABLA 1 El número de plantas en categorías de bajo y alto número de agallas para plantas testigo sin transformar, plantas testigo pBIN05101 y plantas de ensayo pBIN05002
Bajo número de agallas = 0 a 50 agallas por planta.
Alto número de agallas = 51+ agallas por planta.
Tratamiento Plantas con bajo Plantas con alto
número de agallas número de agallas
Plantas sin transformar 18 13
Plantas testigo pBIN05101 13 17
Plantas de ensayo de línea 25 7
32 pBIN05002
Ejemplo 2
El principio de solapamiento ilustrado en el ejemplo anterior usando un sistema de interrupción celular para aumentar la especificidad en la interrupción del nemátodo puede ser llevado a cabo igualmente bien en la flor de Arabidopsis, por ejemplo, u otras plantas para proporcionar flores con el patrón floral o estructura alterados, por ejemplo, la esterilidad de la planta macho. Este ejemplo utiliza las secuencias de ADN identificadas en Arabidopsis.
Hay cuatro elementos de la flor (sépalo, carpelo, pétalo y estambres) que se postula que están bajo el control de tres genes (Coen, E.S. and Meyerowitz, E.M., 1991).
Alterando el equilibrio de estos genes causa una alteración en el patrón floral. Por ejemplo, ambos genes agamous y apetala3 pueden ser expresados en la misma parte de la flor para dar lugar a la parte masculina de la flor, el estambre. El agamous es expresado tanto en los carpelos como en los estambres, mientras que el apetala3 es expresado tanto en los estambres como en los pétalos.
Para hacer una construcción siguiendo el principio de solapamiento, el cual es el tema de este invento, se requiere que el promotor de uno de los genes (por ejemplo, el agamous, activo en los carpelos y en los estambres) esté unido al interruptor de un segundo gen (por ejemplo apetala3, activo en los pétalos y en los tallos) para efectuar la interrupción sólo en los estambres.
Un fragmento de 435 pares de bases del promotor agamous fue aislado del ADN de Arabidopsis thaliana usando la reacción en cadena de polimerasa con Taq y Taq-extender usando los dos cebadores siguientes según los procedimientos publicados (Thomas, C., 1996):
Cebador 1 (SEQ.ID.No. 1)
ATCGAAGCTT CTAAATGTAC TGAAAAGAAA CA
Cebador 2 (SEQ.ID.No. 2)
ACTGGGATCC GAAAATGGAA GGTAAGGTTG TGC
Los cebadores se basaron en la secuencia dada en la entrada de la secuencia de ADN del Genbank ATAGAMSG para la secuencia agamous genómica. El cebador 1 contiene un sitio de restricción HindIII añadido en su extremo 5'. El cebador 2 contiene un sitio de restricción BamHI añadido en su extremo 5'.
Los cebadores siguientes fueron diseñados a partir de la entrada de la secuencia del Genbank ATHAPETALA para amplificar parte de la secuencia del gen apetala3:
Cebador 3 (SEQ.ID.No. 3)
ATCGGGATCC ATGGGCTCAC GGTTTTGTGT GA
Cebador 4 (SEQ.ID.No. 1)
ATCGGAGCTC TTATTCAAGA AGATGGAAGG TAATGA
El cebador 3 fue diseñado específicamente para comenzar la amplificación en la posición 992 de la secuencia apetala3 publicada, que es codon de iniciación en el marco de lectura erróneo, para producir un producto activo y que evita la parte inicial de la secuencia que tiene una alta homología con otros genes con caja MADS en la misma familia génica. El cebador 3 contiene también un cambio de par de bases de la secuencia publicada para retirar un sitio de restricción SacI no deseado. El cebador 3 tiene un sitio de restricción BamHI en su extremo 5'. El cebador 4 tiene un sitio SacI en su extremo 5'. Un fragmento de 1586 pb fue amplificado a partir del ADN Arabidopsis usando los cebadores 3 y 4 usando PCR.
Los siguientes métodos de clonación son familiares para cualquiera con experiencia en la técnica y los resultados pueden ser obtenidos siguiendo los métodos en Sambrook y otros (1989). El fragmento del promotor agamous fue ligado a un vector derivado pBluescript (Stratagene Ltd., Cambridge, UK) como un fragmento HindIII-BamHI. El fragmento génico apetala alterado fue ligado aguas abajo del promotor agamous como un fragmento HindIII-BamHI en el mismo vector. El vector contenía también una secuencia terminadora nos aguas abajo de la secuencia apetala3 alterada como un fragmento SacI-EcoRI. El vector fue llamado pDVM37010. Un segundo plásmido que contenía el promotor agamous en frente del gen reportero m-gfp-ER obtenido por Jim Haselhoff, MRC fue hecho como un testigo y fue llamado pDVM37003.
Los casetes fragmento terminador promotor génico fueron cortados del pDVM37010 (SEQ.ID.No. 5) y del
pDVM37003 (SEQ.ID.No. 6) como fragmentos de restricción NotI y ligados al vector pATC derivado del pBIN19 (Bevan, M. (1984)) para dar los plásmidos pATC37010 (mapa mostrado en la Figura 3) y pATC37003 (mapa mostrado en la Figura 4). Estas secuencias podrían ser clonadas en cualquier otro vector equivalente que tiene sitios de restricción adecuados ahí, es decir, NotI en cada extremo del casete. El mapa para pATC es mostrado en la Figura 5. Tiene sitios de restricción modificados comparados con el PBIN19. El pATC37010 produce un producto de cosupresión bajo el control del promotor agamous para inactivar la función apetala3 en los estambres en desarrollo de la flor.
Los plásmidos fueron transferidos al hospedante Agrobacterium tumefaciens LBA4404 y usados para transformar la Arabidopsis thaliana siguiendo el método de Bechtold y otros (1993) y la Nicotiana tabacum cv K326 usando el método de Horsch y otros (1985). Se obtuvieron 8 plántulas de Arabidopsis transgénicas para el pATC37010 y 6 plántulas de Arabidopsis transgénicas para el pATC37003. Tres grupos de cien discos de hojas fueron usados para la transformación de Nicotiana por cada construcción. Se detectó el crecimiento de callos transgénicos para los 3
grupos.
Los plántulas de Arabidopsis fueron transferidas a tierra 10-14 días después de la germinación y crecieron hasta florecer. Las flores no presentaban estambres, y el doble de carpelos de rosa.
Las plantas transgénicas pATC37010 resistentes a la kanamicina fueron además cribadas para la presencia de los injertos deseados por PCR con polimerasa Taq usando los cebadores 1 y 4, siguiendo los procedimientos conocidos por el profesional con experiencia en la técnica. La PCR fue llevada a cabo durante 40 ciclos de incubación implicando las etapas de incubación a 94ºC durante 60 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 140 segundos. Las muestras positivas de PCR fueron identificadas por visualización de los productos de PCR tras la electroforesis en gel de agarosa siguiendo los procedimientos conocidos por el profesional con experiencia en la técnica.
Las plantas transgénicas pATC37003 testigo fueron además cribadas en lo que respecta a la presencia de los injertos deseados por PCR con polimerasa Taq usando los cebadores 1 y 7, siguiendo los procedimientos conocidos por el profesional con experiencia en la técnica. La PCR fue llevada a cabo durante 40 ciclos de incubación implicando las etapas de incubación a 94ºC durante 40 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 140 segundos. Las muestras positivas de PCR fueron identificadas por visualización de los productos de PCR tras la electroforesis en gel de agarosa siguiendo los procedimientos conocidos por el profesional con experiencia en la técnica.
Cebador 7 (SEQ.ID No. 7)
GAACTGGGAC CACTCCAGTG
En ambos casos, se identificaron plantas transgénicas que contenían la construcción adecuada.
Referencias
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Thomas, C. (1996). "PCR Techniques" in "Plant Gene Isolation": "Principles and Practice". G.D. Foster & D. Twell editors. John Wiley & Sons Ltd., pp 331-368.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Advanced Technologies (Cambridge) Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Millbank, Knowle Green
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Staines
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Middlesex
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: England
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: TW18 1DY
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DEL INVENTO: Improvements Relating to the Specificity of Gene Expression
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN CORRESPONDIENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: British-American Tobacco Co. Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Regents Park Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Southampton
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Hampshire
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: England
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: SO15 8TL
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete 3,5''
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Viglen P5/75
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS Windows 3,1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Microsoft Word 2,0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: Aún no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN: Aún no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 9706381,2
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE FICHERO: 27 de marzo de 1997
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Mrs. M.R. Walford/Mr.K.J.H. MacLean
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA: RD-ATC-17
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 01703777155
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 01703779856
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ.ID.No: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Cebador sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Sitio de restricción HindIII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5-10
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ.ID.No: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCGAAGCTT CTAAATGTAC TGAAAAGAAA CA 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ.ID.No: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Cebador sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: Si
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Sitio de restricción HindIII
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5-10
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ.ID.No: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTGGGATCC GAAAATGGAA GGTAAGGTTG TGC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ.ID.No: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Cebador sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Sitio de restricción BamHI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5-10
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: codon inicial
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11-13
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: cambio de bases deliberado de A a G
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ.ID.No: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCGGGATCC ATGGGCTCAC GGTTTTGTGT GA 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ.ID.No: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Cebador sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: Si
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Sitio de restricción SacI
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5-10
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ.ID.No: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCGGAGCTC TTATTCAAGA AGATGGAAGG TAATGA 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ.ID.No: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2319
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal en la fuente circular en el plásmido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN plasmídico
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Landsberg
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Promotor agamous de Arabidopsis (Genbank ATAGAMSG)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 26-441
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante apetala3 de Arabidopsis (Genbank ATHPETALA)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 448-2013
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Terminador nos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2020-2286
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ.ID.No: 5
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ.ID.No: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1559
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal en la fuente circular en el plásmido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN plásmido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: promotor agamous Arabidopsis (Genbank ATAGAMSG)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 26-441
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: secuencia codificante-proteína fluorescente verde
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LUGAR: 443-1258
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: terminador nos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1260-1526
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ.ID.No: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ.ID.No: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Cebador sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Aequorea victoria 
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: Si
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ.ID.No: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAACTGGGAC CACTCCAGTG 
\hfill
20
4
5
6
7
8
9
10
11

Claims (28)

1. Un método para mejorar la especificidad de la regulación génica en una planta transformada que comprende:
(a)
la introducción de un gen quimérico en una célula de una planta en la que el gen quimérico comprende un promotor específico de tejido y una secuencia de ácidos nucleicos que regula la expresión de un gen diana o de un producto del mismo, y en la que el promotor específico de tejido transcribe la secuencia de ácidos nucleicos en más de uno pero no en todos los sitios de expresión en la planta que incluye al menos uno de los sitios de expresión múltiple del gen diana endógeno; y
(b)
la regeneración de una planta transformada que comprende el gen quimérico de las células, en las que la expresión específica de tejido del gen quimérico regula la expresión del gen diana o la actividad del producto del gen diana en la planta transformada en los sitios de expresión en los que el gen quimérico y el gen diana están ambos expresados.
2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia codificante o no codificante.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que los niveles de expresión de dicho gen diana están aumentados.
4. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que los niveles de expresión de dicho gen diana están disminuidos.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2,ó 4 en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos están en la orientación antisentido.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que dichos ácidos nucleicos están en la orientación homosentido.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que la secuencia de ácidos nucleicos codifica un activador de la expresión del gen diana.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que el gen quimérico comprende más de una secuencia de ácidos nucleicos, permitiendo obtener la especificidad de más de un gen diana.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, en el que el promotor del gen quimérico dirige la expresión en más de un sitio de expresión de solapamiento del gen diana.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9, en el que dicho promotor es el promotor KNT1 o el promotor RB7.
11. El método según la reivindicación 10, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos es la o una parte de la secuencia de dicho promotor RB7 o KNT1 en la orientación antisentido.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11, en el que el promotor es inducible.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 12, en el que la secuencia de ácidos nucleicos codifica un activador de transcripción.
14. El método según la reivindicación 13, en el que dicho activador de transcripción es un factor de choque térmico.
15. El método según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 14, en el que el mecanismo en el que la secuencia de ácidos nucleicos regula la expresión del gen diana o la actividad del producto del gen diana es una seleccionada a partir del grupo que consiste en: regulación antisentido; cosupresión; inhibición del promotor del gen diana; inhibición de la transcripción; alteración de la estabilidad del ARN mensajero o degradación de mARN; inhibición de la traducción; inhibición de una proteína, alteración de la renovación de la proteína; actuando como un cofactor; alteración de las interacciones proteína-proteína; y alteración del flujo a través de la ruta bioquímica.
16. El método según la reivindicación 15, en el que la secuencia de ácidos nucleicos codifica una ribozima.
17. El método según la reivindicación 15, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia que codifica una RNasa que degrada específicamente el mARN del gen diana.
18. El método según la reivindicación 15, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia que codifica un agente estabilizador del mARN del gen diana.
19. El método según la reivindicación 15, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia que codifica un agente desestabilizador del mARN del gen diana.
20. El método según la reivindicación 15, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia que codifica una proteína que reprime la transcripción del gen diana.
21. El método según la reivindicación 15, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia que codifica una proteína que reprime la traducción del gen diana.
22. El método según la reivindicación 15, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia que codifica un inhibidor del producto del gen diana.
23. El método según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en el que dicho promotor es activado para expresión por medios distintos a un nemátodo.
24. Una célula que tiene un vector de transformación pBIN05002 y el número de acceso NCIMB 40871.
25. El vector de transformación pBIN05002 contenido en la célula de la reivindicación 24.
26. Una construcción que comprende el plásmido pATC 37010.
27. Una construcción que comprende un casete promotor génico fragmento terminador como contenido en el plásmido pATC 37010.
28. Una planta y progenie de la misma resultado de llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en el que la planta y la progenie de la misma contienen dicho gen quimérico.
ES98913933T 1997-03-27 1998-03-27 Mejoras relacionadas con la especificidad de la expresion genica. Expired - Lifetime ES2265660T3 (es)

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GBGB9706381.2A GB9706381D0 (en) 1997-03-27 1997-03-27 Improvements relating to the specificity of gene expression
GB9706381 1997-03-27

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