ES2251845T3 - Adn que comprende un gen especifico de antera de arroz y planta transgenica transformada con el. - Google Patents
Adn que comprende un gen especifico de antera de arroz y planta transgenica transformada con el.Info
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Abstract
Una molécula de ADN que comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación asociada, en la que la secuencia promotora activa la expresión de la secuencia de codificación específicamente en el tapete, endotecio y tejidos conectivos de anteras, pero no en microesporas o polen, y en la que la expresión de la secuencia de codificación empieza en la etapa de tétrada y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolado, en la que dicha secuencia promotora comprende una secuencia nucleotídica que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 3.
Description
ADN que comprende un gen específico de antera de
arroz y planta transgénica transformada con él.
La presente invención está en el campo de la
ingeniería genética de plantas. Se refiere principalmente a nuevas
secuencias de ADN que funcionan como promotores de la transcripción
específica de antera de secuencias de ADN de codificación en
secuencias de ADN recombinantes o quiméricas. La presente invención
se refiere también a secuencias de ADN recombinantes o quiméricas
que se expresan específicamente en la antera de una planta. Dichas
secuencias de ADN recombinantes o quiméricas pueden utilizarse para
crear plantas transgénicas, pero especialmente plantas transgénicas
macho estériles.
La creación de plantas macho estériles es de
interés económico en la producción de semillas híbridas. La
esterilidad masculina previene la autopolinización, que de otro modo
ocurre en muchas especies de plantas y reduce la multiplicación y la
producción de semillas híbridas. La antera es el órgano reproductor
masculino de las plantas con flor, que está compuesto por varios
tejidos tales como tapete, endotecio, tejidos conectivos, tejidos
vasculares, etc. y es responsable de la producción de polen. El
desarrollo de la antera puede dividirse en dos fases genéricas.
Durante la fase 1, se establece la morfología de la antera y las
células madre microesporales experimentan meiosis generando tétradas
de microesporas. Durante la fase 2, se diferencian granos de polen y
anteras y aparece degeneración de tejido, dehiscencia y liberación
de grano de polen. Entre los muchos genes distintos implicados en
estos desarrollos, sólo una pequeña fracción es específica de
antera.
Los genes específicos de antera que se han
reseñado hasta la fecha incluyen los genes Osc4, Osc6, YY1 e YY2 del
arroz [Hihara Y., et al., Plant Mol. Biol., 30:
1181-1193 (1996); Tsuchiya T., et al.,
Plant Mol. Biol., 26: 1737-1747 (1994)], los
genes TA29 y TA32 del tabaco [Koltunow, A.M. et al., Plant
Cell., 2: 1201-1224 (1990)], los genes SF2 y
SF18 del girasol [Domon, C. et al., Plant Mol. Biol.,
15: 643-646 (1990)], los genes 108 del tomate
[Smith, A.G., et al., Mol. Gen. Genet., 222:
9-16 (1990)]], NTM19 del tabaco [Oldenhof M.T. et
al., Plant Mol. Biol. 31: 213-225
(1996)] y los genes BA42, BA112 y A9 de Brassica napus [Scott, R.
et al., Plant Mol. Biol., 17: 195-207
(1991); Shen, J.B. et al., Mol. Gen. Genet., 234:
379-389 (1992)].
Algunos de estos genes se encuentran
exclusivamente en tejidos esporofíticos de las anteras, otros son
específicos de granos de polen o están presentes en ambos tejidos
esporofíticos y gametofíticos de las anteras.
El arroz es un ejemplo de una planta que se
propaga mediante autopolinización. Es difícil desarrollar arroz
híbrido sólo por alogamia. Para facilitar la producción de arroz
híbrido por alogamia, se describe un método en la técnica anterior
en el que las anteras se suprimen de las flores de arroz para
producir arroz macho estéril, y después se transfiere polen de otra
planta de arroz al mismo. Sin embargo, existe el problema de que
dicho método requiere una gran cantidad de tiempo y esfuerzo.
Por tanto, para producir arroz o cualquier otra
planta autopolinizante que tenga un carácter masculino estéril sin
los problemas anteriores descritos anteriormente, los presentes
inventores hicieron un esfuerzo creciente para desarrollar un método
que utiliza un gen que induce un desarrollo anormal de la
antera.
La invención proporciona, por tanto: una molécula
de ADN según la reivindicación 1. Se dan a conocer también moléculas
de ADN y métodos para la expresión específica de una región de
codificación de interés en el tapete, endotecio y tejidos conectivos
de anteras, pero no en las microesporas o el polen, en los que la
expresión de la secuencia de codificación de interés empieza en la
etapa de tétrada y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen
vacuolado. En particular, se proporcionan moléculas de ADN y métodos
en los que:
- \bullet
- El ADN comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos 50%, particularmente 65%, más particularmente 80%, y lo más particularmente 90% o más identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1.
- \bullet
- El ADN según la invención comprende la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1.
- \bullet
- Las moléculas de ADN se diseñan específicamente de tal modo que la secuencia de codificación está con orientación sin sentido.
La invención proporciona adicionalmente moléculas
de ADN y métodos en los que la secuencia de codificación codifica un
polipéptido que desestabilizará la formación de polen viable cuando
se exprese en células de antera. En una realización específica de la
invención, la secuencia de codificación codifica un polipéptido
seleccionado del grupo constituido por ARNasa, DTA,
TURF-13, pectato liasa, gin recombinasa, iaaL y
toxina cytA.
Se dan a conocer adicionalmente moléculas de ADN
y métodos como los citados anteriormente, en los que la secuencia de
ADN de la invención tiene más de 80%, particularmente 90%, y más
particularmente 95% de identidad de secuencia con 30 bases
consecutivas de cualquier sitio de la SEC ID Nº 1.
La invención proporciona adicionalmente moléculas
de ADN que comprenden una secuencia promotora capaz de activar la
expresión de una secuencia de codificación asociada específicamente
en el tapete, endotecio y tejido conectivo de anteras, pero no en
microesporas o polen, en las que la expresión de la secuencia de
codificación empieza en la etapa de tétrada y alcanza un nivel
máximo en la etapa de polen vacuolado.
En particular, se proporcionan en la presente
memoria métodos y moléculas de ADN como se citan anteriormente, en
los que:
- \bullet
- La secuencia promotora tiene 50%, particularmente 65%, más particularmente 80%, y lo más particuarmente 90% o más identidad de secuencia con la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 3.
- \bullet
- La secuencia promotora tiene la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 3.
- \bullet
- La secuencia promotora comprende una secuencia adicional que puede estar ligada operativamente a una secuencia de codificación de interés.
- \bullet
- La secuencia adicional comprende una secuencia que tiene 50%, particularmente 65%, más particularmente 80% y lo más particularmente 90% o más identidad de secuencia con la SEC ID Nº 10.
- \bullet
- La secuencia adicional comprende la SEC ID Nº 10.
- \bullet
- La secuencia promotora y la secuencia adicional tienen 50%, particularmente 65%, más particularmente 80% y lo más particularmente 90% o más identidad de secuencia con la SEC ID Nº 2.
- \bullet
- La secuencia promotora y la secuencia adicional se caracterizan por la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 2.
Además, se proporcionan moléculas de ADN en las
que el promotor comprende un fragmento obtenible a partir de la SEC
ID Nº 2, preferiblemente un fragmento capaz de activar la expresión
de una secuencia de codificación asociada específicamente en el
tapete, endotecio y tejido conectivo de anteras, pero no en
microesporas o polen, en las que la expresión de la secuencia de
codificación empieza en la etapa de tétrada y alcanza un nivel
máximo en la etapa de polen vacuolado.
Se dan a conocer también moléculas de ADN que
comprenden un marco de lectura abierto que codifica una proteína
caracterizada por una secuencia aminoacídica que tiene 50%,
particularmente 65%, más particularmente 80%, y lo más
particularmente 90% o más identidad de secuencia con la SEC ID Nº 4.
En una realización específica de la invención, el marco de lectura
abierto codifica una proteína caracterizada por la secuencia
aminoacídica SEC ID Nº 4. Se da a conocer adicionalmente una
molécula de ADN caracterizada por la SEC ID Nº 7.
Además, se proporcionan vectores de expresión que
comprenden un primer módulo de expresión que comprende un ADN de la
invención para expresión en un organismo hospedador tal como un
microorganismo o una planta y, opcionalmente, un segundo módulo de
expresión que comprende un gen de interés. En una realización
específica de la invención, el segundo módulo de expresión comprende
un gen marcador.
La invención proporciona adicionalmente la
proteína codificada por el marco de lectura abierto como se cita
anteriormente en la presente memoria.
Además, se proporcionan plantas transgénicas y
material de planta y la progenie sexual y/o asexual de las mismas,
que se han transformado con una secuencia de ADN según la invención.
La invención proporciona, en particular:
- \bullet
- Una planta transgénica macho estéril que se ha transformado con una secuencia de ADN de la invención.
- \bullet
- Una planta transgénica o material de planta según la invención, en el que la planta es arroz, trigo, maíz, Sorghum bicolor o dáctilo apelotonado.
La invención proporciona adicionalmente un
proceso para la producción de una planta transgénica que comprende
un ADN que comprende una secuencia promotora y una secuencia de
codificación asociada, en el que la secuencia promotora activa la
expresión de la secuencia de codificación específicamente en el
tapete, endotecio y tejidos conectivos de anteras, pero en
microesporas o polen, y en el que la expresión de la secuencia de
codificación empieza en la etapa de tétrada y alcanza un nivel
máximo en la etapa de polen vacuolado. En particular, un proceso en
el que la planta es arroz, trigo, maíz, Sorghum bicolor o
dáctilo apelotonado.
Se da a conocer también un gen específico de
antera de arroz (Oriza sativa L.) que tiene la secuencia de
bases mostrada en la SEC ID Nº 1 y un gen que tiene más de 80% de
identidad de secuencia con 30 bases consecutivas de cualquier sitio
en dicho gen. Además, la presente invención proporciona un regulador
de la expresión específico de antera que comprende una secuencia
promotora y una secuencia adicional que tienen la SEC ID Nº 2
correspondiente a las secuencias de bases entre -1195 y 240 en
dicho gen, representadas por nt 1 a nt 1436 de la SEC ID Nº 1.
La presente invención proporciona también el
promotor de la expresión específico de antera que tiene la SEC ID Nº
3, correspondiente a las secuencias de bases entre -1196 y -1 en
dicho gen, representadas por nt 1 a nt 1196 de la SEC ID Nº 1.
Para asegurar una comprensión clara y consistente
de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se proporcionan
las siguientes definiciones:
Quimérico: se utiliza para indicar que una
secuencia de ADN, tal como un vector o un gen, comprende más de una
secuencia de ADN de distinto origen que están fusionadas
conjuntamente mediante técnicas de ADN recombinante, dando como
resultado una secuencia de ADN que no aparece de forma natural, y
que particularmente no aparece en la planta que se va a
transformar.
Expresión: designa la transcripción y/o
traducción de un gen endógeno o un transgén en plantas. En el caso
de constructos sin sentido, por ejemplo, la expresión puede designar
la transcripción de sólo el ADN sin senti-
do.
do.
Gen: designa una secuencia de codificación
y la secuencia reguladora asociada, en el que la secuencia de
codificación se transcribe en ARN tal como ARNm, ARNr, ARNt, ARNsn,
ARN con sentido o ARN sin sentido. Son ejemplos de secuencias
reguladoras las secuencias promotoras, secuencias 5' y 3' no
traducidas y secuencias de terminación. Son elementos adicionales
que pueden estar presentes, por ejemplo, intrones.
Gen marcador: designa un gen que codifica
un rasgo seleccionable o detectable.
nt: abreviatura de "nucleótido"
Ligado operativamente a /asociado
operativamente con: se dice que una secuencia de ADN reguladora
está "ligada operativamente a" o "asociada operativamente
con" una secuencia de ADN que codifica un ARN o una proteína si
las dos secuencias están situadas de tal modo que la secuencia de
ADN reguladora afecta a la expresión de la secuencia de ADN de
codificación.
Planta: designa cualquier planta,
particularmente semillas de plantas.
Material de planta: designa hojas, tallos,
raíces, flores o partes de flores, frutos, polen, tubos polínicos,
óvulos, sacos embrionarios, células huevo, cigotos, embriones,
semillas, esquejes, cultivos celulares o de tejido o cualquier otra
parte o producto de una planta.
Promotor: designa una secuencia de ADN que
inicia la transcripción de una secuencia de ADN asociada. La región
promotora puede incluir también elementos que actúan como
reguladores de la expresión génica tales como activadores,
potenciadores y/o represores.
Molécula de ADN recombinante: una
combinación de secuencias de ADN que se unen conjuntamente
utilizando tecnología de ADN recombinante.
Tecnología de ADN recombinante:
procedimientos utilizados para unir conjuntamente secuencias de ADN
como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989,
Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gen marcador detectable: designa un gen
cuya expresión no confiere una ventaja selectiva a una célula
transformada, pero cuya expresión hace a la célula transformada
fenotípicamente distinta de células no transformadas.
Gen marcador seleccionable: designa un gen
cuya expresión en una célula de planta proporciona a la célula una
ventaja selectiva. La ventaja selectiva poseída por las células
transformadas con el gen marcador seleccionable puede ser debida a
su capacidad de crecer en presencia de un agente selectivo negativo,
tal como un antibiótico o un herbicida, comparado con el crecimiento
de células no transformadas. La ventaja selectiva poseída por las
células transformadas, comparadas con células no transformadas,
puede deberse también a su capacidad potenciada o nueva de utilizar
un compuesto añadido como nutriente, factor de crecimiento o fuente
de energía. El gen marcador seleccionable designa también un gen o
combinación de genes cuya expresión en una célula de planta
proporciona a la célula tanto una ventaja selectiva negativa como
positiva.
Identidad de secuencia: el porcentaje de
identidad de secuencia se determina utilizando programas
informáticos que están basados en algoritmos de programación
dinámica. Los programas informáticos preferidos dentro del alcance
de la presente invención incluyen los programas de búsqueda BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool) diseñados para explorar todas
las bases de datos de secuencias disponibles independientemente de
si la consulta es proteína o ADN. La versión BLAST 2.0 (BLAST con
huecos) de esta herramienta de búsqueda se ha puesto a disposición
pública en Internet (actualmente:
http://www.ncbi.nlm.nig.gov/BLAST/). Utiliza un algoritmo
heurístico que busca alineaciones locales en contraposición a
globales, y por lo tanto es eficaz para detectar relaciones entre
secuencias que comparten sólo regiones aisladas. Las puntuaciones
asignadas en una búsqueda BLAST tienen una interpretación
estadística bien definida. Dichos programas se procesan
preferiblemente con los parámetros opcionales fijados a los valores
por defecto.
Transformación: designa la introducción de
un ácido nucleico en una célula. En particular, designa la
integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un
organismo de interés.
- SEC ID Nº 1:
- secuencia nucleotídica del gen RA8 del arroz.
- SEC ID Nº 2:
- regulador de la expresión específico de antera que comprende el promotor de RA8 más el primer exón, primer intrón y parte del exón 2.
- SEC ID Nº 3:
- promotor de RA8
- SEC ID Nº 4:
- secuencia aminoacídica deducida de la proteína codificada por el gen RA8 del arroz.
- SEC ID Nº 5:
- cebador 1
- SEC ID Nº 6:
- cebador 2
- SEC ID Nº 7:
- secuencia de ADNc de RA8
- SEC ID Nº 8:
- cebador de PCR
- SEC ID Nº 9:
- cebador de PCR
- SEC ID Nº 10:
- secuencia nucleotídica del primer exón, primer intrón y parte del exón 2 del gen RA8 del arroz.
\vskip1.000000\baselineskip
| Material depositado | Número de acceso | Fecha de depósito |
| Plásmido pGA1173-9 | KCTC 8899P | 29 de julio de 1998 |
\vskip1.000000\baselineskip
El depósito se realiza en el Korea Research
Institute and Biotechnology, organización adjunta al Korea Advanced
Institute of Science and Technology (KAIST).
De aquí en adelante, se describirá con detalle la
presente invención.
Se aísla el gen de la presente descripción de
arroz (Oryza sativa L.), se expresa específicamente en la
antera y la secuencia genómica del mismo se representa en la SEC ID
Nº 1. La secuencia de ADNc del gen RA8 se muestra en la SEC ID Nº 7.
La comparación de las secuencias de ADNc y genómica revela la
presencia de 2 intrones y 3 exones en la secuencia de codificación
del gen RA8. El intrón 1 de 134 pb está localizado entre los codones
14 y 15, correspondientes a los nt 1289 a nt 1422 de la SEC ID Nº 1,
y correspondiente a los nt 1556 a nt 2149 de SEC ID Nº 1, y el
intrón 2 de 594 pb está localizado en el codón 59 de la región
aminoacídica de codificación que se deduce de dichas secuencias de
bases, correspondiente a los nt 1556 a nt 2419 de la SEC ID Nº 1.
Ambos intrones contienen las secuencias consenso GT y AG en los
extremos 5' y 3', respectivamente. Con respecto a la SEC ID Nº 1,
los tres exones están localizados de la siguiente manera: exón 1: nt
1247 a nt 1288, exón 2: nt 1423 a 1555, exón 3: nt 2150 a 2766. En
la secuencia flanqueante 5' no de codificación de dicha región de
codificación, está localizada una secuencia de caja CAAT, CAAT, en
la posición de bases -82 a -79, correspondiente a nt 1116 a nt 1119
de la SEC ID Nº 1, y está localizada una secuencia de caja TATA,
TATAATA, en la posición de bases 53 a -47, correspondiente a los nt
1145 a nt 1151 de la SEC ID Nº 1. La cola de poli(A) está
localizada en la base 164 (nucleótido 2932 de la SEC ID Nº 1) cadena
abajo del codón de terminación de la traducción TGA. En la región 3'
no de codificación, está presente la secuencia señal de
poliadenilación consenso AATAA. La secuencia que rodea el primer ATG
se ajusta bien a la secuencia consenso iniciadora de la traducción
de monocotiledóneas como se reseña en la bibliografía [Joshi, C.P.,
et al., Plant. Mol. Biol., 35:
993-1001 (1997)].
Un marco de lectura abierto de dicha región de
codificación consiste en 264 restos aminoacídicos y tiene la
secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 4.
Una proteína deducida de dicho marco de lectura
abierto tiene una masa molecular de 26,4 kDa y un pI de 6,1. Los
aminoácidos principales que constituyen la proteína son alanina
(21,9%), glicina (9,9%) y prolina (10,2%), y la secuencia
aminoacídica de la misma contiene una región hidrófoba
N-terminal que puede estar implicada en la dirección
de la proteína a una fracción de membrana o espacio extracelular, un
motivo SPPPPPP similar a extensina y una región rica en glicina.
Según un análisis de homología con las bases de datos de Genebank,
dicha secuencia aminoacídica es nueva, y no muestra una identidad de
secuencia significativa con ningún gen reseñado hasta el
momento.
La expresión del gen según la presente invención
se caracteriza por estar regulada temporal y espacialmente. El
patrón de expresión espacial incluye que el gen se expresa sólo en
el órgano antera de la flor de arroz, pero no en otros órganos
florales distintos de antera, hojas y raíces, etc., y especialmente
entre los órganos de antera, se expresa sólo en tapete, endotecio y
tejidos conectivos, pero no en tejidos vasculares. El patrón de
expresión temporal incluye que los niveles de expresión del gen
aumentan a medida de maduran las flores, estando el gen escasamente
expresado en la etapa premeiosis, pero la expresión del mismo se
detecta por primera vez en el momento en que se liberan
microesporas de las tétradas. Se observan los niveles máximos en la
etapa de polen vacuolado, y una marcada reducción en la etapa de
polen maduro inmediatamente antes del florecimiento.
El gen de la presente invención puede obtenerse
mediante métodos de hibridación diferencial. Por ejemplo, mediante
un método que comprende hibridar una biblioteca de ADNc de antera
con una biblioteca de ADNc de origen no antera, tal como de hojas,
raíces o plántulas, y después de ello obtener el clon de ADNc de un
gen específico de antera que reacciona negativamente con la
biblioteca de ADNc de origen no antera. Además, el clon de ADNc
obtenido se utiliza como sonda para hibridar con una biblioteca
genómica y aislar un clon que reacciona positivamente con él, y para
subclonarlo para obtener un clon genómico del gen específico de
antera. Otro método para obtener el gen incluye un método en el que
se utilizan las secuencias de bases de dicha SEC ID Nº 1 para
sintetizar un cebador apropiado para un método de PCR convencional.
En una realización específica de la invención, el gen obtenido se
clona en un vector pBluescript SK(-) y se designa como plásmido
pGA1173-9. Este plásmido se deposita en el Korea
Research Institute of Bioscience and Biotechnology, organización
adjunta al Korea Advanced Institute of Science and Technology
(KAIST) con el número de depósito KCTC 8899P el 29 de julio de
1998.
La región que contiene el promotor de RA8 se
muestra en la SEC ID Nº 3, correspondiente a los nt 1 a nt 1196 de
la SEC ID Nº 1. Los nucleótidos transcritos del gen RA8 empiezan en
la posición 1197 de la SEC ID Nº 1. Un elemento que regula la
expresión específica de antera del gen de la presente invención está
localizado en la región que contiene el promotor, exón 1, intrón 1 y
parte del exón 2, y dicha región puede representarse como la SEC ID
Nº 2, correspondiente a la secuencia de bases entre los nt 1 y nt
1436 en la secuencia de bases de dicha SEC ID Nº 1. Este elemento
regulador puede obtenerse mediante un método de clonación
convencional a partir del ADN genómico del arroz o el plásmido
pGA1173-9, por ejemplo, en el que se utiliza la
secuencia de bases de dicha SEC ID Nº 2 para sintetizar el cebador
apropiado, y después de ello, se realiza un método de PCR
convencional.
El vector de expresión de planta de la presente
invención contiene, por ejemplo, dicho elemento regulador como se
muestra en la SEC ID Nº 2, en el que el regulador de la expresión
específico de antera se fusiona con otro gen de interés. Como gen
deseado, puede utilizarse un gen informador, tal como
beta-glucuronidasa (GUS), y con el fin de inducir el
desarrollo anormal de anteras de arroz, puede utilizarse DTA (un gen
tóxico que desestabiliza células), gen de ARNasa, etc. (véase a
continuación), pero el gen de interés no debería estar limitado a
estos.
El vector de expresión de planta puede contener
un segundo módulo de expresión que comprende un gen marcador que
permite la selección de transformantes. Los ejemplos de genes
marcadores seleccionables o detectables se describen a continuación.
Para ciertas especies diana, pueden preferirse diferentes marcadores
de selección antibióticos o herbicidas. Los marcadores de selección
utilizados rutinariamente en la transformación incluyen el gen
nptII, que confiere resistencia a kanamicina, paromomicina,
geneticina y antibióticos relacionados (Vieira y Messing, 1982,
Gene 19: 259-268; Bevan et al., 1983,
Nature 304: 184-187), el gen aadA
bacteriano (Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl.
Acids. Res. 19: 4083-4089), que codifica la
aminoglicósido 3'-adenililtransferasa y confiere
resistencia a estreptomicina o espectinomicina, el gen hph que
confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochlinger y
Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:
2929-2931) y el gen dhfr, que confiere resistencia a
metotrexato (Bourouis y Jarry, 1983, EMBO J. 2:
1099-1104). Otros marcadores que se van a utilizar
incluyen un gen fosfinotricina acetiltransferasa, que confiere
resistencia al herbicida fosfinotricina (White et al., 1990,
Nucl. Acids. Res. 18: 1062; Spencer et al., 1990,
Theor. Appl. Genet. 79: 625-631), un gen de
EPSP sintasa mutante que codifica resistencia a glifosato (Hinchee
et al., 1988, Bio/Technology 6:
915-922), un gen acetolactato sintasa (ALS) mutante
que confiere resistencia a imidazoliona o sulfonilurea (Lee et
al., 1988, EMBO J., 7: 1241-1248), un gen
psbA mutante que confiere resistencia a atrazina (Smeda et
al., 1993, Plant Physiol. 103: 911-917) o
un gen protoporfirinógeno oxidasa mutante como se describe en el
documento EP 0769059. Se utilizan también marcadores de selección
que dan como resultado una selección positiva, tal como un gen de
fosfomanosa isomerasa como se describe en la solicitud de patente WO
93/05163.
La identificación de las células transformadas
puede conseguirse mediante la expresión de genes marcadores
detectables tales como genes que codifican cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT), \beta-glucuronidasa
(GUS), luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP), o cualquier
proteína que confiera un rasgo fenotípicamente distinto a la célula
transformada.
Dicho vector de expresión puede construirse
fusionando dicho regulador de expresión específico de antera con el
gen deseado, y ligándolo después de ello con un vector de expresión
de planta apropiado. Por ejemplo, los elementos reguladores se
fusionan con GUS sin cambios en el marco de lectura, y el producto
fusionado se liga después con un vector binario pGA1633 capaz de
expresión en plantas, construyendo un vector de expresión
pGA1647.
La invención proporciona también un proceso según
la reivindicación 14.
Las secuencias de ADN recombinante de la
invención pueden introducirse en la célula de planta mediante una
serie de métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica
apreciarán que la elección de dicho método podría depender del tipo
de planta a la que esté dirigida la transformación, es decir,
monocotiledónea o dicotiledónea. Los métodos adecuados de
transformación de células de planta incluyen microinyección
(Crossway et al., 1986, BioTechniques 4:
320-334), electroporación (Riggs y Bates, 1986,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606),
transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee et
al., 1988, Bio/Technology 6: 915-922;
documento EP 0853675), transformación génica directa (Paszkowski
et al., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722) y
aceleración balística de partículas utilizando dispositivos
disponibles en Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin y Dupont, Inc.,
Wilmington, Delaware (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº
4.945.050 y McCabe et al., 1988, Bio/Technology 6:
923-926). Las células que se van a transformar
pueden ser células de hoja diferenciadas, células embriogénicas o
cualquier otro tipo de célula.
En la transformación directa de protoplastos, la
captación de material genético exógeno en un protoplasto puede
potenciarse mediante el uso de un agente químico o un campo
eléctrico. El material exógeno puede integrarse después en el genoma
nuclear. El trabajo previo se realiza en plantas de tabaco
dicotiledóneas, que dieron como resultado que el ADN extraño se
incorporara y transfiriera a plantas de progenie (Paszkowski et
al., 1984, EMBO J. 3: 2712-2722; Potrykus
et al.. 1985, Mol. Gen. Genet. 199:
169-177). Se transforman mediante este procedimiento
protoplastos de monocotiledóneas, por ejemplo de Triticum
monococcum, Lolium multiflorum (ballico italiano), maíz
y maíz dulce negro mejicano. Es una realización preferida adicional
el método de transformación de protoplasto para maíz como se da a
conocer en el documento EP 0292435, así como en EP 0846771. Para la
transformación de maíz, véase también Koziel et al., 1993,
Bio/Technology 11: 194-200. La transformación
de arroz puede llevarse a cabo mediante técnicas de transferencia
génica directa utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La
transformación mediada por protoplasto se describe para los tipos
Japonica y los tipos Indica (Zhang et al., 1988, Plant
Cell Rep., 7: 379-384; Shimamoto et al.,
1989, Nature 338: 274-276; Datta et
al., 1990, Bio/Technology 8: 736-740).
Además, ambos tipos son también transformables rutinariamente
utilizando bombardeo de partículas (Christou et al., 1991,
Bio/Technology 9: 957-962). La solicitud de
patente nº EP 0332581 describe técnicas para la generación,
transformación y regeneración de protoplastos de Pooideae. Estas
técnicas permiten la transformación de todas las plantas de Pooideae
incluyendo dáctilo y trigo. Además, se describe la transformación de
trigo en la solicitud de patente nº EP 0674715 y por Weeks et
al., 1993 (Plant Physiol. 102:
1077-1084).
El vector de expresión de planta así construido
puede introducirse, por ejemplo, en callos de arroz según el método
de transformación de planta convencional, e inducirse la
diferenciación de raíces y hojas a partir de ello, y puede
transferirse después a una maceta para cultivo, obteniéndose así el
arroz transformado.
El método preferido para transformar plantas es
la transformación mediada por Agrobacterium. Según la
transformación mediada por Agrobacterium como ejemplo
representativo, se transfiere el vector de expresión pGA1647 a
Agrobacterium tumefaciens que porta el plásmido Ti binario
utilizando el método de congelación-descongelación
(An, G. et al., (ed) "Plant Molecular Biology Manual",
pág. A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht (1998)) y después se hace crecer en medio líquido AB
suplementado con los antibióticos apropiados (Chilton,
M-D., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 71,
3672-3676 (1974)), y el producto así obtenido se
cocultiva con callos en un medio 2N6-As suplementado
con betaína 1 mM (Hiei, Y. et al., Plant J., 6,
271-282 (1994)) en la oscuridad a 25ºC durante
2-3 días. Se lavan los callos cocultivados con agua
estéril que contiene cefotaxima, y se incuban de nuevo en un medio
N6 que contiene un antibiótico preferido y cefotaxima durante
3-4 semanas para obtener callos de crecimiento
activo. Se transfieren estos callos a un medio de selección
apropiado, por ejemplo, medio MS (Life Technologies) suplementado
con NAA (ácido naftalenoacético) 0,2 mg/l, kinetina 2 mg/l, 2% de
sorbitol, 1,6% de Phytagar (Gibco), el antibiótico apropiado y
cefotaxima 250 mg/l, y después se cultivan durante
2-3 semanas en condiciones de luz continua a
30-60 \mumolm^{-2}s^{-1}, preferiblemente 40
\mumolm^{-2}s^{-1}, obteniéndose plántulas. Se plantan estas
plántulas y se hacen crecer en una cámara de crecimiento en
condiciones de 10 h de luz/14 horas de oscuridad, obteniéndose el
arroz transgénico.
En el caso de que el vector utilizado en dicho
método contenga el gen fusionado del elemento regulador de la
presente invención y los genes DTA o ARNasa, etc., la planta
transformada con el vector tiene el carácter estéril masculino.
La secuencia de ADN de codificación de la
presente invención puede ser cualquier secuencia de ADN que
codifique un polipéptido deseado. Sin embargo, son especialmente
preferidos para uso en la presente invención secuencias de ADN de
codificación que codifican un producto de polipéptido que, cuando se
expresa en tejido de antera, hace que la planta no produzca polen
viable. Los ejemplos de dichas secuencias de ADN de codificación
incluyen los genes que se describen en las siguientes
referencias.
a) gen de cadena A de toxina de difteria (DTA),
que inhibe la síntesis de proteínas (Greenfield et al., 1983,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6853; Palmiter et al.,
1987, Cell, 50: 435-443); b) gen de pectato
liasa pelE de Erwinia chrysanthemi EC16, que degrada la pectina
causando la lisis celular (Keen et al., 1986, J.
Bacteriology 168: 595); c) gen Turf-13
(TURF-13) de genomas mitocondriales de maíz
cms-T; este gen codifica un polipéptido designado
como URF13 que desestabiliza las membranas mitocondrial o plasmática
(Braun et al., 1990, Plant Cell 2: 153; Dewey et
al., 1987, Prot. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5374 y Dewey
et al., 1986, Cell 44: 439); d) gen de gin recombinasa
del gen del fago Mu, que codifica una recombinasa de ADN específica
de sitio que causará redistribuciones genómicas y pérdida de
viabilidad celular cuando se exprese en células de plantas (Maeser
et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 230:
170-176); 3) gen de ácido
indolacético-lisina sintetasa (iaaL) de
Pseudomonas syringae, que codifica una enzima que conjuga
lisina con ácido indolacético (IAA). Cuando se expresa en las
células de plantas, causa un desarrollo alterado debido a la
eliminación del IAA de la célula mediante conjugación (Romano et
al., 1991, Genes and Development 5:
438-446; Spena et al., 1991, Mol. Gen.
Genet. 227: 205-212; Roberto et al.,
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
5795-5801); y f) gen de toxina cytA de Bacillus
thuringiensis israeliensis que codifica una proteína
mosquiticida y hemolítica. Cuando se expresa en células de planta,
causa la muerte de la célula debido a la desestabilización de la
membrana celular (McLean et al., 1987, J. Bacteriology
169: 1017-1023, Ellar et al., patente de
EE.UU, nº 4.918.006, 1990).
La presente invención se describirá ahora con más
detalle con referencia a los ejemplos, pero no debe considerarse
como una limitación sobre el alcance de la presente invención.
Etapa
1
Se seccionan transversalmente en tres partes
flores de arroz (Oriza sativa L. Nakdong) en la etapa
vacuolada tardía. Se utiliza la parte media, que contiene anteras
intactas y partes de palea y lema, como muestra enriquecida en
antera. A partir de esta parte, se aísla ARNm enriquecido en antera
utilizando el kit de aislamiento de ARNm poly(A) Quick
(Stratagene, EE.UU.). Se construyen bibliotecas de ADNc de antera
con el kit de clonación ZAP-cDNA Gigapack 2 Gold
(Stratagene), que utiliza el ARNm como molde.
Se aplica el mismo proceso a hojas, que se
recogen de plántulas de arroz de seis días, para construir
bibliotecas de ADNc de hoja.
A partir de las bibliotecas de ADNc de antera
construidas, se seleccionan aleatoriamente 33 clones de ADNc y,
después de ello, se marcan las regiones de ADNc que se obtienen
escindiendo el ADN de clon respectivo con EcoRI con un isótopo
radiactivo 32P, e hibridan con placas de la biblioteca de ADNc de
hoja.
Como resultado de esto, seis clones de ADNc de
antera no reaccionan positivamente con las placas de la biblioteca
de ADNc de hoja y, entre estos clones, se selecciona un clon, que es
el más abundantemente presente en la biblioteca de ADNc, y se
designa como RA8.
A partir de este clon RA8, se utiliza el fago
auxiliar f1 R408 (Stratagene) para obtener un plásmido recombinante
pGA1173-4 (RA8), en el que se inserta un fragmento
de ADNc mediante excisión in vivo y se determinan las
secuencias de bases de ADNc de RA8, que se clonan en el plásmido
anterior, mediante el método de Sanger et al. (Sanger, F.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,
5463-5467 (1977)).
Dichas secuencias de bases se representan por la
SEC ID Nº 7. Como se muestra en la SEC ID Nº 7, la secuencia de
bases de ADNc de RA8 es de 1008 pb de tamaño. Está presente un marco
de lectura abierto del nt 51 al nt 842 de la SEC ID Nº 7 constituido
por 264 restos aminoacídicos. La proteína deducida de dicho marco de
lectura abierto tiene una masa molecular de 26,4 kDa y un pI de 6,1.
La secuencia que rodea el primer ATG se ajusta bien a la secuencia
consenso de inicio traduccional de monocotiledóneas como se reseña
en la bibliografía [Joshi, C.P. et al., Plant Mol.
Biol. 35: 993-1001 (1997)], la cola de
poli(A) está localizada en la secuencia de base 164 cadena
abajo del codón de terminación de la traducción TGA. En la región 3'
no de codificación, está presente una señal de poliadenilación
consenso AATAA.
Los restos aminoacídicos mayoritarios que
constituyen la secuencia aminoacídica anterior son alanina (21,9%),
glicina (9,9%) y prolina (10,2%), y la secuencia aminoacídica
contiene una región N-terminal hidrófoba que puede
estar implicada en la dirección de la proteína a una fracción de
membrana o espacio extracelular, un motivo SPPPPPP de tipo extensina
y una región rica en glicina. Según un análisis de homología con
bases de datos Genebank, se confirma que dicha secuencia
aminoacídica es un nuevo gen, que no muestra una identidad de
secuencia significativa con ningún gen reseñado hasta el
momento.
Etapa
2
Para confirmar si el gen RA8 obtenido de la etapa
1 anterior se expresa específicamente en las anteras, se aísla ARN
total de hojas, raíces, flores jóvenes, flores maduras y
paleas/lemas, pistilos y estambres de flores de arroz, se someten a
electroforesis y después se transfieren a una membrana de nailon. Se
utiliza ADNc de RA8 marcado con 32P como sonda para realizar la
transferencia de ARN.
El ARNm de RA8 está presente sólo en flores en
diversas etapas de desarrollo, pero no en hojas y raíces. El nivel
de expresión del gen RA8 aumenta durante el desarrollo de la flor,
alcanzando el nivel más alto en flores maduras. Para determinar la
especificidad de órgano en una flor, se realiza un experimento de
transferencia de ARN con el ARN total aislado de diferentes órganos
florales. Se disecciona cada uno de los órganos florales bajo un
microscopio de disección para minimizar la contaminación cruzada. El
resultado reveló que el ARNm de RA8 está presente en anteras, pero
no en carpelo o palea/lema.
Etapa
3
Se transfieren placas de bibliotecas genómicas de
arroz (que se construyeron mediante métodos estándar y se obtienen
de Steve Kay y Nam-Hi Chua de la Rockefeller
University en forma de ADN de fago lambda EMBL, en el que se inserta
ADN genómico de arroz) a una membrana de nailon (Hybond, Amersham),
e hibridan utilizando ADNc de RA8 marcado con el isótopo radiactivo
32P como sondas de hibridación. Se expone la membrana de nailon
hibridada a película de rayos X, y se obtienen los clones de fago de
las placas que se muestran positivas. Se aísla el ADN de fago
lambda a partir de estos clones de fago, se escinde con BamHI
obteniéndose un fragmento genómico de 13,7 kb, y se subclona de éste
un fragmento SacI-EcoRI de 4,3 kb. El fragmento SacI
de 2,9 kb obtenido a partir del fragmento SacI-EcoRI
de 4,3 kb contiene la secuencia flanqueante 5' y la región de
codificación 5', mientras que el fragmento
SacI-EcoRI de 1,5 kb adyacente contiene el resto de
la región de codificación, así como la región flanqueante 3'. Están
presentes dos intrones (intrón 1 e intrón 2) y 3 exones en la región
de codificación. Con respecto a la SEC ID Nº 1, los tres exones se
localizan de la siguiente manera: exón 1: nt 1247 a nt 1288, exón 2:
nt 1423 a 1555, exón 3: nt 2150 a nt 2766. El intrón 1 es de 134 pb
de tamaño y está localizado entre los codones 14 y 15,
correspondientes a los nt 1289 a nt 1422 de la SEC ID Nº 1, y el
intrón 2 es de 594 pb de tamaño y está localizado en el codón 59,
correspondiente a los nt 1556 a nt 2149 de la SEC ID Nº 1. Ambos
intrones contienen las secuencias consenso GT y AT en los extremos
5' y 3', respectivamente. La secuencia flanqueante 5' de la región
de codificación de RA8 contiene la secuencia de caja CAAT, CAAT, en
la posición de base -82 a -79, correspondiente a los nt 1116 a nt
1119 de la SEC ID Nº 1, y la secuencia de caja TATA, TATAATA, en la
posición de base -53 a -47, correspondiente a los nt 1145 a nt 1151
de la SEC ID Nº 1.
El fragmento SacI de 2,9 kg se clona en el
plásmido vector pBluescript SK(-), y este plásmido se designa como
pGA1173-9. Se deposita este plásmido en el Korea
Research Institute of Bioscience and Biotechnology, organización
adjunta del Korea Advanced Institute of Science and Technology
(KAIST) con número de depósito KCTC 8899P el 29 de julio de
1998.
Las secuencias de bases del fragmento de ADN
genómico que se clonan en el plásmido pGA1173-9 se
analizan utilizando el método de Sanger et al., y se
determina una región promotora de aproximadamente 2,5 kb en
comparación con el ADNc.
Para estudiar la complejidad genómica del clon
RA8, se aísla ADN genómico de hojas de plántulas de arroz de dos
semanas, se escinde con EcoRI, HindIII o PstI y después se somete a
transferencia de ADN con ADNc de RA8. La sonda de ADNc de RA8
hibridó con una sola banda del ADN genómico del arroz, y por tanto
el gen RA8 existe en forma de una sola copia en el genoma del
arroz.
Se construye el vector binario que contiene un
gen informador, GUS y un gen de selección hph (higromicina
fosfotransferasa) de la manera siguiente.
Se escinde un plásmido pGA748 (An, G. "Binary
Ti plasmids vectors, Agrobacterium protocols", Humana
Press, pág. 47-48) con BamHI e HindIII, y se inserta
después en él el promotor CaMV35S (Benfey et al.,
Science, 250, 959-966 (1993)). Se inserta un
gen resistente a la higromicina (higromicina fosfotransferasa, hph)
(Gritz et al., (1983) en el sitio BglII del plásmido así
obtenido. Se escinde este plásmido con HindIII y ClaI, se hacen
romos los extremos y después se ligan. Se escinde el plásmido así
obtenido con SacI, retirándose un fragmento de aproximadamente 0,5
kb, y después se liga de nuevo. En el sitio BamHI de este plásmido,
se inserta un adaptador sintético que tiene sitios de escisión
BamHI, HindIII, XbaI, SacI, HpaI, KpnI, ClaI y Bglll, construyendo
un plásmido pGA1182.
Se lleva a cabo la PCR utilizando el plásmido
pGA1182 como molde,
5'-TTGGCATGCACATAC-3' (SEC ID Nº 5)
como cebador 1 y
5'-CGGGATCCGTGTTTGACAGG-3' (SEC ID
Nº 6) como cebador 2. Se escinde el fragmento de aproximadamente 120
pb obtenido con BamHI y SphI, y después se liga con un fragmento de
aproximadamente 9 kb que se obtiene escindiendo el plásmido pGA1182
con las mismas enzimas de restricción. Entre los sitios BamHI y ClaI
del plásmido así obtenido, se inserta el gen GUS (Jefferson et
al., EMBO J., 6, 3901-3907 (1987)) para
construir el vector binario pGA1633.
Se somete a PCR el pGA1173-9 que
contiene 2,9 kb de ADN genómico de RA8 como se construye en la etapa
3 del ejemplo 1, con los cebadores oligoméricos sintéticos de SEC ID
Nº 8 (AATTAACCCTCACTAAAGGG) y SEC ID Nº 9 (GCGGATCCAGGTTGAACCAC). El
oligómero sintético mostrado en la SEC ID Nº 9 genera un sitio BamHI
en el exón 2 del gen RA8.
Se construye después el plásmido pGA1639, que
contiene la secuencia amplificada como anteriormente. El plásmido
pGA1639 contiene el fragmento SacI-BamHI de 2,7 kb
que comprende la región flanqueante 5', el exón 1, el intrón 1 y una
parte del exón 2 del gen RA8.
Este fragmento se conecta con la secuencia de
codificación de beta-glucuronidasa en pGA1633,
construyendo el vector de expresión de planta pGA1647. En el vector
pGA1647, la secuencia derivada del gen RA8 descrita anteriormente se
fusiona en el sitio BamHI recién introducido en el exón 2 con el gen
GUS sin ningún cambio del marco de lectura. Por tanto, se realiza
una fusión traduccional entre parte del gen RA8 y la secuencia de
codificación de beta-glucuronidasa.
Se transforma el vector de expresión pGA1647
construido en el ejemplo 2 en Agrobacterium tumefaciens
LBA4404 (Hoekema et al., Nature, 303,
179-181 (1983)) que porta el plásmido Ti binario
pAL4404 utilizando el método de
congelación-descongelación (An, G. et al.,
(ed) "Plant Molecular Biology Manual", pág.
A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht
(1988)).
Se hace crecer el Agrobacterium
tumefaciens transformado LBA4404 durante 3 días en medio líquido
AB suplementado con higromicina B 30 mg/l y tetraciclina 3 mg/l, y
se cocultiva con callos de tres semanas que se inducen a partir del
escutelo de semillas maduras en medio N6 (Chu, C.C. et al.,
Sci. Sin., 18, 659-668 (1975)) que contiene
2,5-D 2 mg/l, en medio 2N6-As
suplementado con betaína 1 mM (Hiei, Y. et al., Plant
J., 6, 271-282 (1994)) en la oscuridad a 25ºC
durante 2-3 días. Se lavan los callos cocultivados
con agua estéril que contiene cefotaxima 100 mg/l, y se incuban de
nuevo en un medio N6 que contiene higromicina 40 mg/l y cefotaxima
250 mg/l durante 3 semanas. Se transfieren callos resistentes a
higromicina de crecimiento activo al medio de selección [por
ejemplo, medio MS (Life Technologies) + NAA 0,2 mg/l (ácido
naftalenoacético) + kinetina 2 mg/l + 2% de sorbitol + 1,6% de
Phytagar (Gibco) + higromicina B 50 mg/l + cefotaxima 250 mg/l], y
después se cultivan durante 2-3 semanas en
condiciones de luz continua de 40 \mumolm^{-2}s^{-1}. Las
plántulas así obtenidas se siembran y se hacen crecer en una cámara
de crecimiento en condiciones de 10 h luz/14 horas oscuridad,
obteniéndose un total de 22 plantas de arroz transgénicas.
Para seleccionar una estirpe de planta que tenga
el mayor nivel de expresión en anteras entre las veintidós (22)
plantas de arroz transgénicas, se realiza una tinción histoquímica
de GUS para la parte floral del arroz transgénico según el método de
Dai et al. [Dai, Z. et al., Plant Mol. Biol.,
32, 1055-1065 (1996)], que se modifica para contener
20% de metanol en la solución de tinción, y después se fija en una
solución de fijación (50% de etanol, 5% de ácido acético y 3,7% de
formaldehído). Se observan las muestras bajo un microscopio de
disección (x 7,5 aumentos). A partir de este resultado, se
selecciona el arroz que exhibe el nivel de expresión de GUS más alto
en anteras y se designa como estirpe de planta transgénica
A11279.
Para estudiar los patrones de expresión espacial
y temporal del gen RA8, se analiza histoquímicamente la actividad
GUS como se describe en el ejemplo 3 en flores jóvenes, flores en la
etapa de polen vacuolado temprana, flores maduras, hojas y raíces
del arroz transgénico A11279 producido en el ejemplo 3, y después se
observan bajo un microscopio. Como control, se utiliza una flor de
arroz no transformado.
Se detecta la expresión de GUS activada por el
promotor RA8 sólo en la antera de flores de arroz, pero no en otros
órganos florales o en hojas o raíces. Además, el nivel de expresión
del gen informador de GUS aumentó a medida que maduraron las flores,
y el gen no se expresa en absoluto en las flores jóvenes en la etapa
premeiosis.
Para estudiar los patrones de expresión
específicos de antera de arroz del constructo de gen informador de
promotor de RA8, después de teñir y fijar cuatro anteras de arroz en
diferentes etapas de desarrollo según el mismo método descrito en el
ejemplo 3, se embeben en Paraplast (Sigma) y se seccionan con un
grosor de 10 \mum. Se observan las secciones bajo un microscopio
óptico (x 100 aumentos) utilizando iluminación de campo oscuro. En
la etapa premeiosis, no se detecta actividad GUS en ninguna parte de
la antera. La expresión de GUS se detecta por primera vez en el
momento en que las microesporas se liberan de las tétradas. Se
observa la mayor cantidad de actividad GUS en anteras en la etapa de
polen vacuolado. Sin embargo, en anteras en la etapa de polen maduro
justo antes o después de la dehiscencia, la actividad GUS decrece
repentinamente. Se observa que la tinción de GUS está limitada a
tapete, tejidos conectivos y endotecio.
Se consigue la transformación de maíz con un
nuevo gen preparado según el método anterior mediante bombardeo de
microproyectiles de embriones cigóticos inmaduros o callo
embriogénico de tipo I propagable en serie.
Se inician cultivos de callo de maíz embriogénico
de tipo I (Green et al., "Miami Winter Symposium" 20,
1983) a partir de embriones inmaduros de 1,5-2,5 mm
de longitud, a partir de material crecido en invernadero. Se
extirpan asépticamente los embriones de espigas de superficie
esterilizada aproximadamente 14 días después de la polinización. Los
embriones pueden disponerse en medio de iniciación de callo D con 2%
de sacarosa y clorambeno 5 mg/l (Duncan et al., Planta
165: 322-332, 1985) o en medio de iniciación de
callo KM con 3% de sacarosa y 2,4-d 0,75 mg/l (Kao
y Michayluk, Planta 126: 105-110, 1975). Los
embriones y cultivos embriogénicos se cultivan posteriormente en la
oscuridad. Se retiran las respuestas embriogénicas de los explantes
después de \sim14 días. Se disponen las respuestas embriogénicas
de los medios de iniciación de callo D en medios de mantenimiento de
callo D con 2% de sacarosa y 2,4-d 0,5 mg/l,
mientras que las de medios de iniciación de callo KM se disponen en
medios de mantenimiento de callo KM con 2% de sacarosa y dicamba 5
mg/l. Después de 3 a 8 semanas de subcultivo selectivo semanal en
medio de mantenimiento fresco, se establecen cultivos embriogénicos
compactos de alta calidad. Se seleccionan trozos de callo
embriogénico de crecimiento activo como tejido diana para suministro
génico. Los trozos de callo se disponen en placas diana que
contienen medio de mantenimiento con 12% de sacarosa aproximadamente
4 horas antes del suministro génico. Se disponen los trozos de callo
en círculos con radios de 8 y 10 mm desde el centro de la placa
diana.
Se precipita ADN de plásmido en
microtransportadores de oro como se describe en el manual de DuPont
Biolistics. Se utilizan 2 a 3 \mug de cada plásmido en cada
preparación de microtransportador de 6 proyectiles. Se suministran
los genes a las células de tejido diana utilizando el dispositivo
PDS-1000He Biolistics. Los ajustes en el dispositivo
Biolistics son los siguientes: 8 mm entre el disco de ruptura y el
macrotransportador, 10 mm entre el macrotransportador y la pantalla
de detención, y 7 cm entre la pantalla de detención y la diana. Se
dispara a cada placa diana dos veces utilizando discos de ruptura de
4.485 kPa. Se dispone una malla de acero inoxidable de 200 x 200
(McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) entre la pantalla
de detención y el tejido diana.
Siete días después del suministro génico, se
transfieren los trozos de tejido diana desde el medio osmótico alto
a medios de selección. Para selección utilizando el gen BAR, se
disponen trozos de tejido diana en medio de mantenimiento que
contiene glufosinato de amonio 100 mg/l (Basta®) o bialafós 20 mg/l
(Herbiace®). Se eliminan todos los aminoácidos de los medios de
selección. Después de 5 a 8 semanas en estos medios de selección de
alto nivel, se subcultiva cualquier callo en crecimiento en medio
que contiene Basta® 3-20 mg/l
Para selección utilizando el gen fosfato de
manosa isomerasa, se disponen los tejidos diana en sus respectivos
medios de mantenimiento que no contienen sacarosa y sí 1% de manosa.
No se eliminan los aminoácidos de estos medios. Después de 5 a 8
semanas, se subcultiva el callo en crecimiento en medio de
mantenimiento de callo D que no contiene sacarosa y sí 1,5% de
manosa o en medio de mantenimiento de callo KM que contiene 1% de
sacarosa y 0,5% de manosa. Se subcultiva el callo embriogénico que
crece en medios de selección cada 2 semanas durante 4 a 8 semanas
hasta que se produce suficiente callo para generar
10-20 plantas. El tejido que sobrevive a la
selección desde un trozo de tejido diana original se subcultiva como
colonia individual y se designa como evento de transformación
independiente.
En este punto, se transfieren las colonias
seleccionadas en Basta® a un medio MS modificado (Murashige y Skoog,
Physiol. Plant, 15: 473-497, 1962) que
contiene 3% de sacarosa (MS3S) sin agente de selección, y se
disponen a la luz. Se añaden ancimidol 0,25 mg/l y kinetina 0,5 mg/l
a este medio para inducir la germinación embrionaria o bien se añade
benciladenina 2 mg/l. Se transfieren las colonias seleccionadas
utilizando manosa a medio MS modificado que contiene 2% de sacarosa
y 1% de manosa (MS2S+1M) con las adiciones de ancimidol y kinetina
descritas anteriormente, o a un medio MS modificado que contiene 2%
de sacarosa y 0,5% de manosa (MS2S+0,5M) con la adición de
benciladenina descrita anteriormente.
Se transfieren colonias regeneradas de selección
en Basta® a medios MS3S sin ancimidol y kinetina ni benciladenina
después de 2 semanas. Las colonias regeneradas de la selección en
manosa se transfieren a medios MS2S+1M y MS2S+0,5M, respectivamente,
sin hormonas después de 2 semanas. Los brotes regenerados con o sin
raíces de todas las colonias se transfieren a cajas Magenta que
contienen medio MS3S, se recuperan eventualmente pequeñas plantas
con raíces y se transfieren a suelo en el invernadero.
Se ensaya en las plantas la expresión del gen PMI
utilizando un ensayo de rojo de clorofenol de 48 pocillos modificado
en el que los medios no contienen sacarosa y sí 0,5% de manosa. Se
disponen muestras de hoja (\sim5 mm x 5 mm) en este medio de
ensayo y se hacen crecer en la oscuridad durante \sim72 horas. Si
la planta expresa el gen PMI, puede metabolizar la manosa y los
medios se volverán amarillo. Si no, los medios permanecerán
rojos.
Se han creado también eventos de transformación
utilizando callo de tipo I obtenido de embriones cigóticos inmaduros
utilizando técnicas de cultivo estándar. Para suministró génico, se
preparan aproximadamente 300 mg de callo de tipo I subcultivando en
medio fresco 1 a 2 días antes del suministro génico, seleccionando
trozos de tejido diana y disponiéndolos en un patrón de anillo de 10
mm desde el centro de la placa diana en medio que contiene de nuevo
12% de sacarosa. Después de aproximadamente 4 horas, se bombardea el
tejido utilizando el dispositivo PDS-1000/HE
Biolistics de DuPont. Los plásmidos de interés precipitan en
partículas de oro de 1 \mum utilizando el protocolo estándar de
DuPont. Se suministran los genes utilizando dos proyectiles por
placa diana a 4.485 kPa. Aproximadamente 16 horas después del
suministro génico, se transfiere el callo a medio de cultivo
estándar que contiene 2% de sacarosa sin agente de selección. A los
12 ó 13 días después del suministro génico, se transfieren los
trozos de tejido diana a medio de selección que contiene
fosfinotricina 40 mg/l en forma de Basta o bialafós. Se subcultiva
el callo para selección durante 12 a 16 semanas, después de lo cual
se transfiere el callo superviviente y en crecimiento a medio de
regeneración estándar que contiene fosfinotricina 3 mg/l en forma de
Basta para la producción de plantas.
Una técnica preferida para la transformación de
trigo implica el bombardeo con partículas de embriones de trigo
inmaduros, e incluye una etapa rica en sacarosa o rica en maltosa
antes del suministro génico. Antes del bombardeo, se planta
cualquier número de embriones (0,75-1 mm de
longitud) en medio MS con 3% de sacarosa (Murashige y Skoog, 1962) y
2,4-D 3 mg/l para la inducción de embriones
somáticos, que se permite proceder en la oscuridad. El día elegido
para el bombardeo, se retiran los embriones del medio de inducción y
se disponen en medio osmótico (es decir, medio de inducción con
sacarosa o maltosa añadida a la concentración deseada, típicamente
15%). Se permiten plasmolizar los embriones durante
2-3 h y se bombardean después. Es típico veinte
embriones por placa diana, aunque no crítico. Se precipita un
plásmido portador de gen apropiado en partículas de oro de tamaño
micrométrico utilizando procedimientos estándar. Cada placa de
embriones se dispara con el dispositivo de helio Biolistics de
DuPont utilizando una presión de impulsión de \sim6.900 kPa y
utilizando un tamiz de malla 80 estándar. Después del bombardeo, se
disponen de nuevo los embriones en la oscuridad para recuperarse
durante aproximadamente 24 h (aún en medio osmótico). Después de 24
horas, se retiran los embriones del medio osmótico y se vuelven a
disponer en medio de inducción, donde permanecen durante
aproximadamente un mes antes de la regeneración.
Aproximadamente un mes después, se transfieren
explantes embrionarios con callo embriogénico en desarrollo a medio
de regeneración (MS+ NAA 1 mg/litro, GA 5 mg/litro) que contiene
adicionalmente un agente de selección apropiado. Después de
aproximadamente un mes, se transfieren los brotes desarrollados a
recipientes estériles mayores conocidos como GA7, que contenían MS
de mitad de potencia, 2% de sacarosa y la misma concentración de
agente de selección. Se describe con detalle la transformación
estable de trigo en la solicitud de patente EP 0674715.
<110> Novartis AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen específico de antera de arroz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> S-30723A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR 98-46973
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-11-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR 98-50126
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-11-1998
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver 2.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3003
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1196
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 264
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 15
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggcatgca catac
\hfill15
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<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<400> 6
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\hfill20
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<210> 7
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<211> 1008
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<213> Oryza sativa
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<210> 8
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<220>
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<210> 9
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<212> ADN
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<220>
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artificial: oligonucleótido
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<210> 10
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<211> 240
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<212> ADN
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<213> Oryza sativa
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (15)
1. Una molécula de ADN que comprende una
secuencia promotora y una secuencia de codificación asociada, en la
que la secuencia promotora activa la expresión de la secuencia de
codificación específicamente en el tapete, endotecio y tejidos
conectivos de anteras, pero no en microesporas o polen, y en la que
la expresión de la secuencia de codificación empieza en la etapa de
tétrada y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolado, en
la que dicha secuencia promotora comprende una secuencia
nucleotídica que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la
secuencia mostrada en la SEC ID Nº 3.
2. Una molécula de ADN según la reivindicación 1,
en la que la secuencia promotora comprende la secuencia nucleotídica
mostrada en la SEC ID Nº 3.
3. Una molécula de ADN según la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en la que la secuencia de codificación es de
orientación sin sentido.
4. Una molécula de ADN según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia de codificación
codifica un polipéptido que desestabilizará la formación de polen
viable cuando se exprese en células de antera.
5. Una molécula de ADN según la reivindicación 4,
en la que la secuencia de codificación codifica un polipéptido
seleccionado del grupo constituido por ARNasa, DTA,
TURF-13, pectato liasa, gin recombinasa, iaaL y
toxina cytA.
6. Una molécula de ADN según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia promotora
comprende una secuencia adicional que puede estar ligada
operativamente a una secuencia de codificación de interés, en la que
la secuencia adicional comprende una secuencia que tiene 50% o más
de identidad de secuencia con la SEC ID Nº 10.
7. Una molécula de ADN según la reivindicación 6,
en la que la secuencia adicional comprende la SEC ID Nº 10.
8. Una molécula de ADN según la reivindicación 6
o la reivindicación 7, en la que la secuencia promotora y la
secuencia adicional tienen 50% o más de identidad de secuencia con
las respectivas secuencias de SEC ID Nº 2.
9. Una molécula de ADN según la reivindicación 8,
en la que la secuencia promotora y la secuencia adicional se
caracterizan por la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº
2.
10. Un vector de expresión que comprende un
primer módulo de expresión que comprende un ADN de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 para expresión en un organismo hospedador
tal como un microorganismo o una planta y, opcionalmente, un segundo
módulo de expresión que comprende un gen de interés.
11. Una planta transgénica y la progenie sexual
y/o asexual de la misma, que se ha transformado con una secuencia de
ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
12. Una planta transgénica macho estéril que se
ha transformado con una secuencia de ADN según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
13. Una planta transgénica según una cualquiera
de las reivindicaciones 11 ó 12, en la que la planta es arroz,
trigo, maíz, Sorghum bicolor o dáctilo apelotonado.
14. Un proceso para la producción de una célula
de planta transgénica que contiene un ADN que comprende una
secuencia promotora y una secuencia de codificación asociada, en el
que la secuencia promotora activa la expresión de la secuencia de
codificación específicamente en el tapete, endotecio y tejidos
conectivos de anteras, pero no en microesporas o polen, y en el que
la expresión de la secuencia de codificación empieza en la etapa de
tétrada y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolado,
comprendiendo dicho proceso introducir un ADN según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9 en una célula de planta.
15. Un proceso según la reivindicación 14, en el
que la célula de planta es una célula de arroz, trigo, maíz,
Sorghum bicolor o dáctilo apelotonado.
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