KR20000033303A

KR20000033303A - 벼 약 특이적인 유전자를 포함하는 dna, 이러한 dna로형질전환시킨 유전자 전이 식물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20000033303A
Application number: KR1019980050126A
Authority: KR
Inventors: 안진흥; 전종성; 정용윤; 이시철
Original assignee: 정명식; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 2000-06-15

Abstract

본 발명은 식물 유전 공학분야에 관한 것이다.

본 발명은 주로, 재조합 또는 키메릭 DNA 서열에서 프로모터에 연결된 발현 가능한 및 바람직하게는 코딩 DNA 서열의 약 특이적 전사의 프로모터로서 작용하는 신규의 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 식물의 약에서 특이적으로 발현되는 재조합 또는 키메릭 DNA 서열에 관한 것이다. 이러한 재조합 또는 키메릭 DNA 서열을 사용하여 형질전환 식물(transgenic plant), 특히 형질전환된 웅성불임 식물을 생성시킬 수 있다.

Description

벼 약 특이적인 유전자를 포함하는 ＤＮＡ, 이러한 ＤＮＡ로 형질전환시킨 유전자 전이 식물 및 이의 제조방법

본 발명은 식물 유전 공학분야에 관한 것이다.

벼는 자가수분 방식으로 번식하기 때문에 타가수분에 의해서만 잡종 벼를 개발할 수 있다는 어려움이 있다. 타가수분에 의한 잡종 벼의 개발을 용이하게 하기 위해, 종래에는 벼 꽃에서 약을 제거하여 웅성불임 형질을 갖는 벼를 만든 후 다른 벼의 약으로부터 얻은 꽃가루를 옮겨주어 타가수분을 수행하는 방법이 시도되었다. 그러나 이 방법은 많은 시간과 노력이 소요되는 문제점이 있다.

웅성-번식 불능 식물을 생성시키는 것은 하이브리드 종자(seed)의 제조에 있어서 경제적으로 유리하다. 웅성불임은 많은 식물 종에서 발생되는 자가-수분을 방지시켜주고 품종 개량과 하이브리드 종자 생성을 방해한다.

약은 꽃식물의 웅성 생식기관으로 타페튬(tapetum), 엔도세시움(endothecium), 결합(connective) 조직, 관다발 조직 등의 다수 조직으로 구성되며 꽃가루의 생산을 담당한다. 약의 발달과정은 약의 형태가 확립되고 마이크로스포어(microspore) 모세포가 감수분열하여 테트라드(tetrad)의 마이크로스포어를 형성하는 제1기와, 꽃가루와 약이 분화되고 조직 퇴화, 열 개(dehiscence) 및 꽃가루 방출이 일어나는 제2기로 구분되는데, 이러한 발달과정에 관여하는 다양한 유전자중 일부분만이 약 특이적으로 발현된다.

현재까지 보고된 약 특이적인 유전자로는 벼의 Osc4, Osc6, YY1 및 YY2 유전자(Hihira, Y. et al., Plant Mol. Biol., 30, 1181-1193(1996); Tsuchiya, T. et al., Plant Mol. Biol., 26, 1737-1747(1994)), 담배의 TA29와 TA32 유전자(Koltunow, A.M. et al., Plant Cell, 2, 1201-1224(1990)), 해바라기의 SF2와 SF18 유전자(Domon, C. et al., Plant Mol. Biol., 643-646(1990)), 토마토의 108 유전자(Smith, A.G. et al., Mol. Gen. Genet., 222, 9-16(1990)), 유채의 BA112 및 A9 유전자(Scott, R. et al., Plant Mol. Biol., 17, 195-207(1991); Shen, J.B. et al., Mol. Gen. Genet., 234, 379-389(1992))가 있으며, 대부분의 유전자 산물이 꽃가루에 다량으로 축적되면서 꽃가루의 성숙 및 발아에 관여한다.

이에 본 발명자들은 종래 기술의 문제점이 없이 웅성불임 형질을 갖는 벼를 얻기 위해, 벼 약의 비정상적인 발달을 유도하는 유전자를 사용하는 방법을 개발하고자 연구를 거듭하였다.

따라서, 본 발명은

- 마이크로스포어 또는 꽃가루에서가 아니라 약의 타페튬(tapetum), 엔도세시움 및 결합 조직에서 목적하는 코딩 영역을 특이적으로 발현시키기 위한 방법 및 이를 위한 DNA 분자를 제공해주며, 이때 이러한 목적하는 코딩 서열의 발현은 테트라드(tetrad) 단계에서 개시되어 액포화된(vacuolated) 꽃가루기에서 최대 수준에 도달된다. 특히,

·프로모터 서열 및/또는 코딩 서열은 서열 1에 상응하는 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;

·프로모터 서열 및/또는 코딩 서열은 서열 1에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며;

·코딩 서열이 안티센스 배향이며;

·코딩 서열이 약 세포에서 발현될 때 생육되는 꽃가루의 형성을 파괴시킬 폴리펩타이드를 코딩하고;

·코딩 서열이 RNase, DTA, TURF-13, 펙테이트 리아제, gin 레콤비나제, iaaL 및 cytA 독소로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리펩타이드를 코딩하며;

·프로모터 서열이 목적하는 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있는 부가의 서열을 포함하고;

·부가의 서열이 서열 2의 엑손 1, 인트론 1 및 엑손 2의 일부를 포함하며;

·프로모터 서열 및 부가의 서열이 서열 2와 50% 이상의 상동성을 나타내며;

·프로모터 서열 및 부가의 서열이 서열 2의 뉴클레오티드 서열임을 특징으로 하고;

·프로모터 서열이 서열 2로부터 수득될 수 있는 단편을 포함하며;

·프로모터 DNA가 서열 3의 뉴클레오티드 서열임을 특징으로 하는, 상기한 바와 같은 DNA 분자 및 방법을 제공한다.

또한, 서열 1에 제시된 염기 서열을 갖는 벼(Oryza sativa) 약-특이적 유전자 및 이러한 유전자의 임의의 부위의 연속된 30개 염기중 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 제공한다. 또한, 본 발명에 따르는 DNA 서열로 형질전환시킨 형질전환 식물 및 이의 유성 및/또는 무성 자손을 제공한다. 이들 형질전환 식물은 우선적으로 웅성불임이고, 특히 벼, 밀, 옥수수, 수수(Sorghum bicolor) 또는 새발풀의 종에 적용가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 유전자 RA8의 벼 기관별 발현양상을 보여주는 RNA 블롯팅 결과이다.

도 2a는 13.7kb 크기의 벼 게놈 절편의 제한효소 지도이며, 도 2b는 4.3kb SacI-EcoRI 절편의 제한효소 지도이고, 도 2c는 본 발명에 따른 융합유전자의 구조이다.

도 3은 벼 게놈 DNA를 RA8 cDNA로 DNA 블롯팅한 결과이다.

도 4a, 4b, 4c, 4d, 4e 및 4f는 각각 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된 벼의 어린 꽃, 초기 액포화된 꽃가루기, 성숙한 꽃, 잎, 뿌리 및 비형질전환된 벼의 꽃을 조직화학적 GUS 분석한 결과이다.

도 5a, 5b, 5c 및 5d는 각각 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된 벼의 전 감수분열기, 테트라드로부터 마이크로스포어 방출기, 액포화된 꽃가루기 및 열개 직전의 약(anther)을 조직화하여 GUS 분석한 결과이다.

본 발명에서는 하기 서열 1의 염기서열을 갖는 벼(Oryza sativa L.) 약 특이적인 유전자 및 이 유전자의 임의의 부위의 연속된 30개 염기중 80% 이상이 상동성을 갖는 유전자를 제공한다.

또한, 상기 유전자중 -1196번째 내지 240번째 염기서열에 해당하는 하기 서열 2를 갖는 약 특이적 발현 조절인자를 제공한다.

또한, 상기 유전자중 -1196번째 내지 -1번째 염기 서열에 해당하는 하기 서열 3을 갖는 약 특이적 발현 프로모터를 제공한다.

본원 명세서 및 청구 범위를 명백하고도 일관되게 이해시키기 위해, 다음 정의가 제공된다:

발현: 이는 식물에서 내인성 유전자 또는 형질전환된 유전자(transgene)의 전사 및/또는 해독을 지칭한다. 예를 들어, 안티센스 제작물의 경우에는, 발현이 안티센스 DNA 만의 전사를 지칭할 수 있다.

유전자: 이는 코딩 서열 및 이에 연결된 조절 서열을 지칭하는데, 여기서 코딩 서열은 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA와 같은 RNA로 전사된다. 조절 서열의 예는 프로모터 서열, 5' 및 3' 비해독 서열 및 종결 서열이다. 존재할 수 있는 추가의 요소는, 예를 들면, 인트론이다.

프로모터: 이는 연결된 DNA 서열의 전사를 개시시키는 DNA 서열이다. 프로모터 영역은 또한, 액티베이터, 인핸서 및/또는 레프레서 등의, 유전자 발현의 조절인자로서 작용되는 요소를 포함할 수 있다.

서열 상동성: 서열 상동성 비율(%)은 동적 프로그래밍 연산을 기준으로 한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정한다. 본 발명의 범위 내에서 바람직한 컴퓨터 프로그램으로는 대상이 단백질인지 DNA인지에 상관없이 이용 가능한 모든 서열 데이터베이스를 탐색하도록 고안된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 조사 프로그램이 있다. 이러한 조사 수단의 버전 BLAST 2.0(Gapped BLAST)는 인터넷 상에서 공개적으로 이용 가능하다(현재 인터넷 주소: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 이는 전체(global) 정렬과는 반대로 국지적(local) 정렬을 추구하는 발견적 연산을 이용하므로 분리된 영역 만을 공유하는 서열 들간의 관계를 탐지할 수 있다. BLAST 조사에 설정된 스코어는 널리 정립된 통계학적 해석치이다. 상기 프로그램은 생략성(default) 수치에 대한 임의의 파라미터 세트를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.

형질전환: 이는 특정 세포 내로의 핵산 도입을 지칭한다. 특히, 목적하는 유기체의 게놈 내로 특정 DNA 분자를 안정적으로 통합시키는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 유전자는 벼(Oryza sativa L.)로부터 분리되고 약 특이적으로 발현하며 게놈상의 염기서열로는 서열 1로 표시된다. 서열 1에서 왼쪽 숫자는 염기 서열의 위치를 나타내며, 이중 1번은 cDNA의 개시점이다. 이 염기서열로부터 유추되는 아미노산 코딩 영역중 14번째와 15번째 코돈사이에 134bp 길이의 인트론 I이 존재하고 59번째 코돈에 594bp 길이의 인트론 II가 존재하는데, 이들 모두 5'와 3' 말단에 각각 GT 및 AG 서열을 포함하고 있다. 이 코딩 영역의 5' 비코딩 서열에는 -82번째 내지 -79번째 염기 위치에 CAAT 박스 서열인 CAAT가 위치하고, -53번째 내지 -47번째 염기 위치에는 TATA 박스서열인 TATAATA가 위치하며, TGA 종료 코돈으로부터 하류로 164번째 염기서열(1736번 위치)에 폴리(A) 꼬리가 위치하고, 3' 비코딩 영역에는 AATAA 컨센서스 폴리아데닐화 시그날 서열이 위치한다. 첫 번째 ATG 주위 서열은 보고된 외떡잎식물의 번역 개시 컨센서스 서열(Joshi, C.P. et al., Plant Mol. Biol. 35, 993-1001(1997))과도 일치한다.

상기 코딩 영역의 오픈 리딩 프레임은 264개 아미노산으로 구성되며 서열 3의 아미노산 서열을 갖는다.

이 오픈 리딩 프레임으로부터 유추되는 단백질은 분자량이 26.4kDa이고 pI값이 6.1이다. 이 단백질을 구성하는 주된 아미노산은 알라닌 21.9%, 글리신 9.9% 및 프롤린 10.2%이고, 아미노산 서열에는 이 단백질을 세포막 또는 세포외로 표적하는 역할을 할 것으로 추정되는 소수성의 N-말단 영역, 익스텐신과 유사한(extensin-like) SPPPPPP 모티프 및 글리신이 풍부한 영역이 포함되어 있다. 진뱅크(Genbank) 데이터베이스와의 상동성 분석에 따르면, 이 아미노산 서열은 현재까지 보고된 유전자와는 전혀 상동성을 보이지 않는 신규한 것이다.

본 발명의 유전자의 발현은 시-공간적으로 조절되는 특징이 있는데, 공간적으로는 벼 꽃의 약 기관에서만 발현되며 약 외의 다른 꽃 기관, 잎, 뿌리 등에서는 전혀 발현되지 않으며, 특히 약 기관중에서도 타페튬, 엔도세시움, 결합 조직에 한 정되어 발현되며, 관다발 조직에서는 전혀 발현되지 않는다. 또한 시간적으로는 꽃이 성숙되어감에 따라 발현량이 증가하는데, 전 감수분열기(pre-meiosis stage)에는 거의 발현되지 않다가 테트라드로부터 마이크로스포어 방출기(microspore-release stage)에 발현되기 시작하여 액포화된 꽃가루기(vacuolated-pollen stage)에 가장 활발히 발현되다가, 개화 직전의 성숙한 꽃가루기(mature pollen stage)에는 발현이 급격하게 감소한다.

본 발명의 유전자는 차별적 하이브리드화 방법을 통해 얻을 수 있는데, 예를 들면 벼 약 cDNA 라이브러리를 잎 cDNA 라이브러리와 하이브리드화시킨 후 잎 cDNA 라이브러리와 음성으로 반응하는 약 특이적 유전자의 cDNA 클론을 얻을 수 있다. 또한 이 cDNA 클론을 프로브로 사용하여 벼 게놈 라이브러리와 하이브리드화시켜 양성으로 반응하는 클론을 분리하고 서브 클로닝하여 약 특이적 유전자의 게놈 클론을 얻을 수 있다. 이 유전자를 얻는 또다른 방법으로는 상기 서열 1의 염기서열을 이용하여 적절하게 프라이머를 합성한 후 통상적인 PCR 방법을 사용하는 것이다. 얻어진 유전자를 플라스미드 pBluescript SK(-) 벡터에 클로닝한 후 이를 플라스미드 pGA1173-9로 명명하였으며, 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소에 1998년 7월 29일자로 기탁번호 제KCTC 8899P호로 기탁하였다.

본 발명의 유전자의 약 특이적 발현을 조절하는 인자는 프로모터, 엑손 I, 인트론 I 및 엑손 II의 일부를 포함하는 영역에 존재하며, 이 영역은 상기 서열 1의 염기서열중 -1196번째 내지 240번째의 염기 서열에 해당하는 서열 2로 표시될 수 있다. 이 조절인자는 벼 게놈 DNA 또는 플라스미드 pGA1173-9로부터 통상적인 클로닝 방법으로 얻을 수 있는데, 예를 들면 서열 2의 염기서열을 이용하여 적절하게 프라이머를 합성한 후 통상적인 PCR 방법을 수행하는 것이다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 서열 2로 표시되는 상기 조절인자를 포함하며, 이 조절인자는 다른 목적 유전자와 융합시켜 사용할 수 있다. 이때 목적 유전자로는 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS) 등의 리포터 유전자를 사용할 수도 있고, 벼 약의 비정상적인 발달을 유도할 목적으로 DT-A(세포를 파괴하는 독성 유전자), RNase 유전자 등을 사용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 발현 벡터는 상기 조절인자와 목적 유전자를 융합시킨 후 적절한 식물 발현 벡터와 연결하여 제작할 수 있는데, 예를 들면 상기 조절인자를 GUS와 리딩 프레임의 변화없이 융합한 후 식물 발현용 바이너리 벡터(binary vector) pGA1633에 연결하여 발현 벡터 pGA1647을 제작한다.

제작된 식물 발현 벡터를 통상적인 식물 형질전환 방법에 따라 벼의 캘러스에 도입하고 이로부터 뿌리와 잎의 분화를 유도한 다음 화분으로 옮겨 재배함으로써 형질전환된 벼를 얻을 수 있다.

재조합 DNA 서열을 널리 공지된 수많은 방법으로 식물 세포에 도입할 수 있다. 당해 분야의 숙련인은 이러한 방법의 선택이 형질전환의 표적이 된 식물의 유형, 즉 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물에 좌우될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 식물 세포를 형질전환시키는데 적합한 방법으로는 현미주사법[참조:Crossway et al., 1986, Bio-Techniques 4:320-334], 전기천공법[참조:Riggs and Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:5602-5606], 아그로박테리움 매개 형질전환법[참조:Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6:915-922; EP 0 853 675], 직접적인 유전자 전달법[참조:Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2717-2722] 및 아그라세투스, 인코포레이티드(Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin) 및 듀퐁, 인코포레이티드 (Dupont, Inc.; Wilmington, Delaware)로부터 시판되고 있는 장치를 사용한 탄도(ballistic) 입자 가속법[참조: 미국 특허 제4,945,050호 및 문헌 McCabe et al., 1988, Bio/Technology 6:923-926]이 있다. 형질전환될 세포는 분화된 잎 세포, 배아발생적 세포 또는 기타 특정한 유형의 세포일 수 있다.

원형질체의 직접적인 형질전환법에서, 외인성 유전 물질을 원형질체내로 흡수시키는 것은 화학적 제제 또는 전기장을 사용함으로써 증진될 수 있다. 이어서, 이러한 외인성 유전 물질을 핵상 게놈내로 통합시킬 수 있다. 선행연구가 쌍자엽 담배 식물에서 수행되었는데, 여기서는 외래 DNA가 삽입되어 자손 식물로 전수된 것으로 나타났다[참조:Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2712-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet, 199:169-177]. 단자엽 식물 원형질체를 또한 이러한 과정에 의해, 예를 들면, 트리티큠 모노코큠(Triticum monococcum), 로륨 멀티풀로륨(Lolium multiflorum; 이탈리아산 독보리), 옥수수 및 블랙 멕시코산 스위트 콘에서 형질전환되었다. 부가의 바람직한 양태는 EP 0 292 435 및 EP 0 846 771에 기술된 바와 같이 옥수수에 대한 원형질체 형질전환법이다. 옥수수 형질전환에 대해서는 문헌[참조: Koziel et al., 1993, Bio/Technology 11:194-200]을 참조할 수 있다. 벼의 형질전환은 원형질체 또는 입자 충격을 이용한 직접적인 유전자 전달 기술에 의해 수행할 수 있다. 원형질체 매개된 형질전환은 자포니카형 및 인디카형에 대해 기술되어 있다[참조:Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep, 7:379-384; Shimamoto et al., 1989, Nature 338:274-276; Datta et al., 1990, Bio/Technology 8:736-740]. 상기한 두 유형은 또한 통상적으로 입자 충격을 이용하여 형질전환시킬 수 있다[참조:Christou et al., 1991, Bio/Technology 9:957-962]. 모 출원 EP 0 332 581에는 포이데애(Pooideae) 원형질체의 발생, 형질전환 및 재생에 대한 기술이 기재되어 있다. 이들 기술은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀을 포함한 모든 포이데애 식물의 형질 전환을 가능케 해준다. 또한, 밀 형질전환이 문헌[참조:EP 0 674 715; and Weeks et al., 1993, Plant Physiol. 102:1077-1084]에 기술되어 있다.

상기 식물 형질전환 방법으로는 아그로박테리움 매개 형질전환법이 바람직하다. 대표적인 예로 아그로박테리움 매개 형질전환법에 의하면, 상기 발현 벡터를 동결-해동법(An, G. et al., (eds) Plant Molecular Biology Manual, pp. A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht(1998))에 따라 2월 Ti 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스에 전이시킨 후 적절한 항생제가 포함된 AB 액체배지(Chilton, M-D, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3672-3676(1974))에서 배양하고, 캘러스와 함께 1mM 베타인(betaine)이 포함된 2N6-As 배지(Hiei, Y. et al., Plant J., 6, 271-282(1994))에서 암조건하에 25℃, 2 내지 3일 동안 공동배양(cocultivate)한다. 공동배양된 캘러스를 세폭탁심(cefotaxime)이 포함된 멸균수로 세척한 후 적절한 항생제 및 세포탁심이 포함된 N6 배지위에서 다시 3 내지 4주 동안 배양하여 성장이 좋은 캘러스를 얻는다. 이 캘러스를 적절한 선발 배지, 예를 들어 MS 배지(Life technoloies사), 0.2mg/ℓ NAA(naphthalen acetic acid), 2mg/ℓ 키네틴(kinetin), 2% 솔비톨, 1.6% 피트아가(Gibco), 적절한 항생제 및 250mg/ℓ 세포탁심을 포함하는 배지에 옮기고 30 내지 60μmol/m²/초, 바람직하게는 40μmol/m²/초의 연속적인 광조건하에 2 내지 3주 동안 배양하여 묘목을 얻는다. 이 묘목을 화분에 심은 후 생장챔버에서 10L/14D 조건하에 재배하여 형질전환된 벼를 얻는다.

상기 방법에 사용된 벡터가 본 발명의 조절인자를 DT-A 또는 RNase 유전자와 융합시킨 융합 유전자를 포함하는 경우에는, 이 벡터로 형질전환된 벼는 웅성불임 형질을 갖게 된다.

본 발명의 코딩 DNA 서열은 목적하는 폴리펩타이드를 코딩하는 특정한 DNA 서열일 수 있다. 그러나, 본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 것은 약 조직에서 발현될 때 식물이 생존성(viable) 꽃가루를 생산하지 못하도록 하는 폴리펩타이드의 생성물을 코딩하는 코딩 DNA 서열이다. 이러한 코딩 DNA 서열의 예로는 다음 참조 문헌(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다)에 기술된 유전자가 있다:

a) 단백질 합성을 억제시키는 디프테리아 독소 A-쇄 유전자(DTA)[참조:Greenfield et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:6853; Palmiter et al., 1987, Cell 50:435-443]

b) 세포 분해를 야기시키면서 펙틴을 분해시키는, 어위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi) EC16으로부터의 펙테이트 리아제 유전자 peIE[참조:Keen et al., 1986, J. Bacteriology 168:595]

c) 미토콘드리아 또는 원형질 막을 파괴시키는 URF13으로 명명된 폴리펩타이드를 코딩하는, cms-T 옥수수 미토콘드리아 게놈으로부터의 T-urf13(TURF-13)[참조:Braun et al., 1990, Plant Cell 2:153: Dewey et al., 1987, Proc. Natl. Acad Sci USA, 84:5374; Dewey et al., 1986, Cell 44:439]

d) 식물의 세포에서 발현될 때 세포 생육성을 상실하고 게놈 재배열을 유발시킬 부위-특이적 DNA 레콤비나제를 코딩하는, 파아지 Mu 유전자로부터의 gin 레콤비나제 유전자[참조:Maeser et al., 1991, Mol Gen Genet 230:170-176]

e) 리신을 인돌아세트산(IAA)에 접합시키는 효소를 코딩하는, 슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringe)로부터의 인돌 아세트산-리신 신세타제 유전자(iaaL). 이는 식물 세포에서 발현될 때, 접합을 통한 세포로부터의 IAA의 제거로 인해 변형된 진행을 유발시킨다[참조:Romano et al., 1991, Genes and Development 5:438-446; Spena et al., 1991, Mol Gen Genet 227:205-212; Roberto et al., 1990, Pro Natl Acad Sci USA, 87:5795-5801]

f) 모기 박멸성 및 용혈성인 단백질을 코딩하는, 바실러스 투린지엔시스 이스라엘리엔시스(Bacillus thuringiensis israeliensis)로부터의 CytA 독소 유전자. 이는 식물 세포에서 발현될 때, 세포막의 파괴로 인해 세포의 사멸을 야기시킨다[참조:McLean et al., 1987, J. Bacteriology 169:1017-1023; Ellar et al., 미국 특허 제4,918,006호, 1990].

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예: 바이너리 벡터 pGA1633의 제작

리포터 유전자인 GUS와 선별 유전자인 hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제)를 포함하는 바이너리 벡터를 다음과 같이 제작하였다.

플라스미드 pGA748(An G, Binary Ti plasmid vectors, Agrobacterium protocols, Humana Press, pp. 47-58)를 BamHI과 HindIII로 절단한 후 CaMV35S 프로모터(Benfey et al., Science, 250, 959-966(1993))를 삽입하였다. 얻어진 플라스미드의 BglII 위치에 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin phosphotransferase, hph)(Gritz et al., (1983))를 삽입하였다. 이 플라스미드를 HindIII과 ClaI으로 절단하고 평활 말단으로 만든 후 연결시켰다. 얻어진 플라스미드를 SacI으로 절단하여 약 0.5kb 단편을 제거한 다음 다시 연결시켰다. 이 플라스미드의 BamHI 위치에 BamHI, HindIII, XbaI, SacI, HpaI, KpnI, ClaI 및 BgIII 절단부위를 갖는 합성 어댑터를 삽입하여 플라스미드 pGA1182를 제작하였다.

이 플라스미드 pGA1182를 주형으로 하고, 하기 서열 4의 프라이머 1 및 서열 5의 프라이머 2를 사용하여 PCR을 수행하였다.

5'-TTGGCATGCACATAC-3'

5'-CGGGATCCGTGTTTGACAGG-3'

얻어진 약 120bp 단편을 BamHI과 SphI을 절단한 후, 플라스미드 pGA1182를 동일한 제한효소로 절단하여 얻은 약 9kb 단편에 연결시켰다. 얻어진 플라스미드의 BamHI과 ClaI 위치에 GUS 유전자(Jefferson et al., EMBO J, 6, 3901-3907(1987))를 삽입하여 바이너리 벡터 pGA1633를 제작하였다.

실시예 1: 벼 약 특이적인 유전자 RA8의 분리

(단계 1) 유전자 RA8의 분리

액포화기의 벼(Oryza sativa L. Nakdong) 꽃을 세 부분으로 절단하여 온전한 약을 포함하는 중간 부분을 얻고, 이 부분으로부터 폴리(A) 퀵 mRNA 분리 키트(poly(A) Quick mRNA Isolation Kit, Stratagene사, 미국)를 이용하여 약 mRNA를 분리하였다. 이 mRNA를 주형으로 하고 ZAP-cDNA 기가팩II 골드 클로닝 키트(ZAP-cDNA GigapackII Gold Cloning Kit, Stratagene사)를 이용하여, 약 cDAN 라이브러리를 제작하였다.

한편 발아후 6일된 벼 묘목의 잎에 대하여 동일한 방법으로 실시하여 잎 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

제작된 약 cDNA 라이브러리로부터 33개의 클론을 무작위로 선별한 후, 각각의 클론 DNA를 EcoRI으로 절단하여 얻은 cDNA 영역을 방사선 동위원소³²P로 표지한 다음 잎 cDNA 라이브러리 플라크와 하이브리드화시켰다.

그 결과, 6개의 약 cDNA 클론이 잎 cDNA 라이브러리 플라크와 양성 반응을 보이지 않았으며, 이중 약 cDNA 라이브러리에 가장 풍부하게 존재하는 하나의 클론을 선별하여 RA8로 명명하였다.

이 RA8 클론으로부터 f1 헬퍼 파아지(helper phage) R408(Stratagene사)을 이용하여 생체내 절단(in vivo excision)에 의해 cDNA 단편이 삽입된 재조합 플라스미드 pGA1173-4(RA8)를 얻고, 이 플라스미드에 클로닝된 RA8 cDNA의 염기서열을 생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467(1977))에 따라 결정하였다.

이 염기서열은 하기 서열 7과 같으며, 이로부터 유추되는 아미노산 서열도 함께 나타내었다.

서열 7에서 왼쪽 숫자는 염기서열의 위치를, 오른쪽의 숫자는 아미노산 서열의 위치를 나타낸다. 서열 7에서 보듯이, RA8 cDNA의 염기서열은 1008 bp 길이이고, 264개 아미노산으로 이루어진 오픈 리딩 프레임 1개를 포함한다. 이 오픈 리딩 프레임으로부터 유추되는 단백질은 26.4kDa이고 6.1의 pI 값을 가진다.

첫 번째 ATG 주위 서열은 보고된 외떡잎식물의 번역 개시 컨센서스 서열(Joshi, C.P. et al., Plant Mol. Biol., 35, 993-1001(1997))과도 일치하며, TGA 종료 코돈으로부터 하류로 164번째 염기서열에는 폴리(A) 꼬리가 위치하고, 3' 비코딩 영역에는 AATAA 컨센서스 폴리아데닐화 시그날 서열이 있다.

아미노산 서열을 구성하는 주된 아미노산은 알라닌 21.9%, 글리신 9.9% 및 프롤린 10.2%이고, 아미노산 서열에는 이 단백질을 세포막 또는 세포외로 표적하는 역할을 할 것으로 추정되는 소수성의 N-말단 영역, 익스텐신과 유사한 SPPPPPP 모티프 및 글리신이 풍부한 영역이 포함되어 있다. 이 아미노산 서열을 진뱅크 데이터베이스와 상동성을 분석한 결과, 현재까지 보고된 유전자와는 전혀 상동성을 보이지 않는 신규한 유전자로 확인되었다.

(단계 2) RNA 블롯팅 분석

단계 1에서 얻은 RA8 유전자가 약 특이적으로 발현되는지를 확인하기 위하여, 벼의 잎, 뿌리, 어린 꽃, 성숙한 꽃, 꽃의 외영과 내영, 암술 및 수술에서 각각 전체 RNA를 분리한 후 전기영동하고 나이론 막으로 옮긴 다음, 방사선 동위원소³²P로 표지된 RA8 cDNA를 프로브로 사용하여 RNA 블롯팅을 수행하였다.

그 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 A는 약이고, C는 암술이며, P는 외영과 내영이고, FP는 꽃 원기(primodia)이며, YF는 어린 꽃이고, EF는 초기 액포화된 꽃 가루기의 꽃이고, LF는 후기 액포화된 꽃가루기의 꽃이며, L은 잎이고, R은 뿌리이다. 도 1에서 보듯이 RA8 mRNA는 약에만 존재하며 꽃이 성숙해지면서 점차 많아지므로, RA8 유전자는 약 특이적으로 발현하며 꽃이 성숙해감에 따라 발현량이 증가함을 알 수 있다.

(단계 3) RA8 게놈 클론의 분리

벼 게놈 라이브러리(록펠러 대학의 스티브 케이와 남-하이 추아로부터 얻음, 벼 게놈 DNA가 EMBL 람다 파아지 DNA에 삽입된 형태임)의 플라크를 나일론 막(Hybond, Amersham사)에 옮긴 후 방사선 동위원소³²P로 표지된 RA8 cDNA를 프로브로 사용하여 하이브리드화하였다. 하이브리드화된 나일론 막을 X-선 필름에 노출시킨 후 양성으로 나타난 플라크로부터 파아지 클론을 얻었다.

이 파아지 클론으로부터 람다 파아지 DNA를 분리한 후 BamHI으로 절단하여 13.7kb 게놈 절편을 얻고, 이중 4.3kb SacI-EcoRI 절편을 서브 클로닝하였다.

이 13.7kb 절편과 4.3kb SacI-EcoRI 절편의 제한효소 지도는 각각 도 2a 및 2b와 같다. 도 2a 및 2b에서, A는 ApaI이고, B는 BamHI이며, H는 HindIII이고, N은 NcoI이고, P는 PstI이며, R은 EcoRI이고, S는 SacI이며, Sc는 ScaI이고, V는 EcoRI이며, X는 XhoI이고, 흰 부분은 인트론이고 검은 부분은 코딩 영역이며 회색 부분은 프로모터 및 전사종결영역이며 화살표는 전사방향을 나타낸다. 도 2a 및 2b에서 보이는 2.9kb의 SacI 절편에는 5' 인접서열(flanking sequence)과 5'의 코딩 영역이 포함되어 있고, 인접한 1.5kb SacI-EcoRI 절편에는 나머지 코딩 영역과 3' 인접서열이 포함되어 있다. 코딩 영역에는 2개의 인트론(I, II)이 존재하는데, 인트론 I은 14번째와 15번째 코돈사이에 134bp 길이로 존재하고 인트론 II는 59번째 코돈에 594bp 길이로 존재하며, 모두 5'와 3' 말단에 각각 GT 및 AT 서열을 포함하고 있다. RA8 코딩 영역의 5' 인접서열에는 -82번째 내지 -79번째 염기 위치에 CAAT 박스 서열인 CAAT가 있고, -53번째 내지 -47번째 염기 위치에는 TATA 박스서열인 TATAATA가 있다.

SacI 절편을 플라스미드 pBluescript SK(-) 벡터에 클로닝하였으며 이 플라스미드를 pGA1173-9로 명명하였다. 이 플라스미드 pGA1173-9를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소에 1998년 7월 29일자로 기탁번호 제 KCTC 8899P호로 기탁하였다.

이 플라스미드 pGA1173-9에 클로닝된 게놈 DNA 단편의 염기서열을 생거 등의 방법에 따라 분석하였으며, cDNA와 비교하여 약 2.5kb의 프로모터 영역을 결정하였다.

이상의 결과를 종합하면 서열 1과 같다.

서열 1a

서열 1b

한편, RA8 클론의 게놈의 복합성(complexity)을 확인하기 위해, 발아후 2주된 벼의 잎으로부터 분리된 게놈 DNA을 EcoRI, HindIII 또는 PstI로 절단한 후 이 절편을 RA8 cDAN로 DNA 블롯팅시켰다. 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 R은 EcoRI 절편이고, H는 HindIII 절편이며, P는 PstI 절편이다. 도 3에서 보듯이, RA8 cDNA는 벼 게놈 DNA중 하나의 밴드와 하이브리드화되므로, RA8 유전자는 벼 게놈에서 단일 카피로 존재함을 알 수 있다.

실시예 2: 식물 발현 벡터의 제조

실시예 1의 단계 3에서 제작한 2.9kb의 RA8 게놈 DNA를 포함하는 pGA 1173-9에 대해 하기 서열 8 및 9의 합성 올리고머 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다.

AATTAACCCTCACTAAAGGG

GCGGATCCAGGTTGAACCAC

상기로부터의 증폭물을 포함하는 플라스미드 pGA1639를 제작하였다. 여기서 pGA1639는 RA8 유전자의 5' 플랭킹 영역, 엑손 I, 인트론 I 및 엑손 II의 일부를 포함하는 2.7kb BamHI 절편을 포함한다.

상기한 pGA1639의 BamHI 절편(서열 9 포함)을 바이너리 벡터 pGA1633의 BamHI 위치에 연결하여 식물 발현 벡터 pGA1647을 제작하였다. 이때 벡터 pGA1647에서 RA8 유래의 프로모터 내지 엑손 II 일부가 GUS 유전자 일부와 리딩 프레임의 변화없이 융합된다. 이 융합유전자의 구조를 모식적으로 나타내면 도 2c와 같다. 도 2c에서 H, N, P, R 및 V는 도 2a 및 2c에서 설명한 바와 같고, B'는 융합을 위해 만들어진 BamHI 절단부위이며, Tnos는 노팔린 합성효소(nopaline synthase)이다.

실시예 3: 형질전환된 벼의 제조

실시예 2에서 제작된 발현 벡터 pGA1647을, 동결-해동법(freeze-thaw method; An, G, et al., (eds) Plant Molecular Biology Manual, pp. A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht(1988))에 따라 2원 Ti 플라스미드 pAL4404(Hoekema et al., Nature, 303, 179-181(1983))를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Hoekema et al., Nature, 303, 179-181(1983))에 형질전환시켰다.

형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404를 30mg/ℓ의 하이그로마이신 B와 3mg/ℓ의 테트라사이클린이 포함된 AB 액체배지에서 3일 동안 배양한 후, 2mg/ℓ의 2,5-D이 포함된 N6 배지(Chu, C.C. et al., Sci. Sin., 18, 659-668(1975))에서 성숙한 씨의 스쿠텔룸(scutellum)으로부터 유도된 3주령의 캘러스와 함께 1mM 베타인(betaine)이 포함된 2N6-As 배지(Hiei, Y, et al., Plant J., 6, 271-282(1994))에서 암조건하에 25℃, 2 내지 3일 동안 공동배양(cocultivate)하였다. 공동배양한 캘러스를 100mg/ℓ 세폭탁심(cefotaxime)이 포함된 멸균수로 세척하고 40mg/ℓ 하이그로마이신과 250mg/ℓ 세포탁심이 포함된 N6 배지위에서 3주 동안 배양하였다. 성장이 좋은 하이그로마이신 저항성 캘러스를 선발 배지[MS 배지(Life technoloies사) + 0.2mg/ℓ NAA(naphthalen acetic acid) + 2mg/ℓ 키네틴(kinetin) + 2% 솔비톨 + 1.6% 피트아가(Gibco) + 50mg/ℓ 하이그로마이신 + 250mg/ℓ 세포탁심]에 옮기고 연속적인 40μmol/m²/초 광조건하에 2 내지 3주 동안 배양하였다. 묘목을 화분에 심은 후 생장챔버에서 10L/14D 조건하에 재배하여 모두 22개의 형질전환된 벼를 얻었다.

22개의 형질전환된 벼중에서 약에서의 발현률이 가장 높은 식물주를 선별하기 위해, 형질전환된 벼의 꽃 부위를 염색용액에 20% 메탄올이 포함되도록 변형된 다이 등의 방법(Dai, Z. et al., Plant Mol. Biol., 32, 1055-1065(1996))에 따라 조직화학적 GUS 염색을 한 후, 고정액(50% 에탄올, 5% 아세트산 및 3.7% 포름알데히드)에 담그어 고정시키고, 해부현미경(×7.5 배율)하에서 관찰하였다. 이러한 결과로부터 약에서 GUS의 발현량이 가장 큰 벼를 선별하였으며 형질전환 식물주 A11279라 명명하였다.

실시예 4: 형질전환된 벼의 조직화학적 GUS 분석

RA8 유전자의 공간-시간적 발현양상을 조사하기 위해, 실시예 3에서 얻은 형질전환 식물주 A11279의 벼에서 얻은 어린 꽃, 초기 액포화된 꽃가루의 꽃, 성숙한 꽃, 잎 및 뿌리를, 실시예 3에서와 동일한 방법으로 조직화학적 GUS 염색 및 고정한 후 현미경 하에서 관찰하였다. 이때 대조구로는 비형질전환된 벼의 꽃을 사용하였다.

그 결과는 도 4a, 4b, 4c, 4d, 4e 및 4f와 같으며, 이들은 각각 형질전환된 벼의 어린 꽃, 초기 액포화된 꽃가루기의 꽃, 성숙한 꽃, 잎, 뿌리 및 비형질전환된 벼의 꽃이다. 도 4a, 4b, 4c, 4d 및 4e에서 보듯이, RA8 유전자는 벼 꽃의 약에서만 발현되며, 약 외의 다른 꽃 기관, 잎, 뿌리에서는 전혀 발현되지 않는다. 또한 RA8 유전자는 꽃이 성숙되어감에 따라 별현량이 증가되며, 전 감수분열기의 어린 꽃에서는 전혀 발현되지 않는다.

RA8 유전자의 벼 약 특이적 발현양상을 조사하기 위해, 성장 시기를 달리하는 4개의 벼 약을 실시예 3에서와 동일한 방법으로 염색 및 고정한 후 파라플라스트(Paraplast, Sigma사)에 포매하고 10㎛ 두께로 절단하여 박편을 얻고, 이 박편을 광학현미경(x100 배율)하에서 암시야 조명(dark-field illumination)으로 관찰하였다.

그 결과는 도 5a, 5b, 5c 및 5d와 같으며, 이들은 각각 형질전환된 벼의 전 감수분열기, 테트라드로부터 마이크로스포어 방출기, 액포화된 꽃가루기 및 열개 직전의 약을 나타내며, 붉은 색으로 염색된 부위는 GUS의 발현을 의미한다. 도 5a, 5b, 5c 및 5d에서 보듯이, RA8 유전자는 전 감수분열기에는 거의 발현되지 않으며, 마이크로스포어 방출기에 발현되기 시작하여 액포화된 꽃가루기에 가장 활발히 발현되다가, 개화 직전의 성숙한 꽃가루기에는 발현이 급격하게 감소한다. 또한 RA8 유전자는 약의 타폐튬, 엔도세시움, 결합 조직에 한정되어 발현되며, 관다발 조직에서는 전혀 발현되지 않았다.

본 발명에 따른 재조합 또는 키메릭 DNA 서열을 사용하여 형질전환 식물, 특히 형질전환된 웅성불임 식물을 생성할 수 있다.

Claims

프로모터 서열이 마이크로스포어 또는 꽃가루에서가 아닌 약(anther)의 타페튬, 엔도세시움 및 결합 조직에서 특이적으로 코딩 서열의 발현을 구동시키고, 코딩 서열의 발현이 테트라드 단계에서 개시되어 액포화된 꽃가루기에서 최대 수준에 도달되는 프로모터 서열 및 이에 연결된 코딩 서열을 포함하는 DNA.
제1항에 있어서, 프로모터 서열 및/또는 코딩 서열이 서열 1에 상응하는 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.

서열 1a

서열 1b
제1항에 있어서, 프로모터 서열 및/또는 코딩 서열이 서열 1에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열이 안티센스 배향인 DNA.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열이 약 세포에서 발현될 때 생존 꽃가루의 형성을 파괴시킬 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA.
제5항에 있어서, 코딩 서열이 RNase, DTA, TURF-13, 펙테이트 리아제, gin 레콤비나제, iaaL 및 cytA 독소로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA.
서열 1에 제시된 염기 서열을 갖는 벼(Oryza sativa) 약 특이적 유전자 및 이러한 유전자의 임의의 부위의 연속된 30개 염기중 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자.
마이크로스포어 또는 꽃가루에서가 아닌 약의 타페튬, 엔도세시움 및 결합 조직에서 특이적으로 연결된 코딩 서열의 발현을 구동시킬 수 있고, 코딩 서열의 발현이 테트라드 단계에서 개시되어 액포화된 꽃가루기에서 최대 수준에 도달되는, 프로모터 서열을 포함하는 DNA.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열이 목적하는 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있는 부가의 서열을 포함하는 DNA.
제9항에 있어서, 부가의 서열이 서열 2의 엑손 1, 인트론 1 및 엑손 2의 일부를 포함하는 DNA.
제9항 또는 제10항에 있어서, 프로모터 서열 및 부가의 서열이 서열 2의 각각의 서열과 50% 이상의 상동성을 지니고 있는 DNA.

서열 2
제9항 또는 제10항에 있어서, 프로모터 서열 및 부가의 서열이 서열 2의 뉴클레오티드 서열임을 특징으로 하는 DNA.
제12항에 있어서, 프로모터 서열이 서열 2로부터 수득될 수 있는 단편을 포함하는 DNA.
제13항에 있어서, 서열 3의 뉴클레오티드 서열임을 특징으로 하는 DNA.

서열 3
제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA 서열로 형질전환시킨 유전자 전이(transgenic) 식물 및 이의 유성 및/또는 무성 자손.
제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA 서열로 형질전환시킨 유전자 전이 웅성불임 식물.
제15항 또는 제16항에 있어서, 식물이 벼, 밀, 옥수수, 수수(Sorghum bicolor) 또는 새발풀인 유전자 전이 식물.
마이크로스포어 또는 꽃가루에서가 아닌 약의 타페튬, 엔도세시움 및 결합 조직에서 특이적으로 코딩 서열의 발현을 구동시키는 프로모터 서열 및 이에 연결되어 발현이 테트라드 단계에서 개시되어 액포화된 꽃가루기에서 최대 수준에 도달되는 코딩 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 유전자 전이 식물을 제조하는 방법.
제18항에 있어서, 식물이 벼, 밀, 옥수수, 수수 또는 새발풀인 방법.