JP2002528125A

JP2002528125A - イネ葯特異的遺伝子を含むｄｎａおよびそれによって形質転換されたトランスジェニック植物

Info

Publication number: JP2002528125A
Application number: JP2000579761A
Authority: JP
Inventors: ギュンヘウン・アン; ジョン・ジョンソン; チュン・ヨンヨン; リー・シチュル
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1998-11-03
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2002-09-03
Also published as: BR9914955A; IL142633A0; ATE315659T1; DE69929457D1; ES2251845T3; PL348100A1; DE69929457T2; US20040060084A1; RU2004128482A; HUP0104221A3; KR20010085990A; CN1185350C; WO2000026389A2; AR021056A1; US20010051713A1; EP1127143B1; AU759042B2; AU1268700A; WO2000026389A3; RU2245921C2

Abstract

(57)【要約】本発明は、組換えまたはキメラＤＮＡ配列におけるコードＤＮＡ配列の、葯特異的転写のプロモーターとして機能する新規なＤＮＡ配列を記載する。本発明は、組換えまたはキメラＤＮＡ配列をも記載し、それは植物の葯内で特異的に発現される。該組換えまたはキメラＤＮＡ配列は、トランスジェニック植物、特にトランスジェニック雄性不稔植物の作出に使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、植物遺伝子工学の分野に関する。それはまず、組み換えまたはキメ
ラＤＮＡ配列におけるコードＤＮＡ配列の、葯特異的転写のプロモーターとして
機能する新規なＤＮＡ配列に関する。本発明は、組み換えまたはキメラＤＮＡ配
列にも関連し、それは植物の葯において特異的に発現される。該組み換えまたは
キメラＤＮＡ配列は、トランスジェニック植物、特に雄性不稔植物をつくるため
に使用され得る。

【０００２】雄性不稔植物の作出は、ハイブリッド種子の生産において経済的な関心事であ
る。雄性不稔は、多くの植物種でもしそれがなければ起こり、育種およびハイブ
リッド種子生産を妨げる、自家受粉を防止する。葯は、顕花植物の雄性の生殖器
官であり、タペータム、エンドテシウム、葯隔組織、維管束組織等のようないく
つかの組織を含み、花粉を生産するためのものである。葯発達は２の一般的なフ
ェーズに分けることができる。フェーズ１では、葯の形態はできており、小胞子
母細胞は減数分裂を経て、小胞子の四分子を生じる。フェーズ２では、花粉粒お
よび葯は分化し、組織退化、開葯、および花粉粒放出が起こる。これらの発達に
おいて、関連する多くの多様な遺伝子の内、小部分のみが葯特異的である。

【０００３】これまでに報告されてきた葯特異的遺伝子は、イネのＯｓｃ４、Ｏｓｃ６、Ｙ
Ｙ１およびＹＹ２遺伝子[Hihara Y, et al., Plant Mol. Biol., 30:1181-1193(
1996); Tsuchiya T., et al., Plant Mol. Biol., 26:1737-1747(1994)]、タバ
コのＴＡ２９およびＴＡ３２遺伝子[Koltunow, A.M. et al.,Plant Cell,2:1201
-1224(1990)]、ヒマワリのＳＦ２およびＳＦ１８遺伝子[Domon, C. et al.,Plan
t Mol. Biol.,15:643-646(1990)]、トマトの１０８遺伝子[Smith, A.G., Mol. G
en. Genet., 222:9-16(1990)]、タバコのＮＴＭ１９[Oldenhof M.T. et al. Pla
nt Mol Biol 31:213-225(1996)]、およびナタネ(Brassica napus)のＢＡ４２、
ＢＡ１１２およびＡ９遺伝子[Scott, R. et al., Plant Mol. Biol., 17:195-20
7(1991);Shen, J.B. et al.,Mol. Gen. Genet.,234:379-389(1992)] 遺伝子を含
む。これらの遺伝子のあるものは、葯の胞子体組織にもっぱら見出され、あるもの
は花粉粒特異的であり、または葯の胞子体および配偶体組織の双方に存在する。

【０００４】イネは、自家授粉型の繁殖をする植物の例である。他花生殖のみによってハイ
ブリッドイネを開発することは困難である。他花生殖によるハイブリッドイネの
生産を容易化するために、ある方法が先行文献に記載され、その中では、葯がイ
ネの花から削除され、雄性不稔イネを生産し、そして他のイネ植物からの花粉が
そこへ送達される。しかしながら、そのような方法は、多くの時間と労力を要す
るという問題がある。

【０００５】ゆえに、前記で記載されたような以前の問題のない、雄性不稔性の性質を持っ
たイネまたは他の任意の自家授粉植物を生産するために、本発明者は、鋭意努力
し、葯の異常発達を誘導する遺伝子を使用する方法を開発した。

【０００６】ゆえに本発明は：葯のタペータム、エンドテシウムおよび葯隔組織(小胞子または花粉ではない)に
おける目的のコード領域の特異的発現のためのＤＮＡ分子および方法を提供し、
ここで、目的のコード配列の発現は、四分子段階に開始し、液胞化花粉段階に最
大水準に達する。特に、 ●ＤＮＡが、配列番号１に示す配列と、少なくとも５０％、特に６５％、より特
に８０％、そして最も特に９０％またはそれより大きい配列同一性を有するヌク
レオチド配列を含む ●本発明のＤＮＡが、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む ●ＤＮＡ分子が、コード配列はアンチセンス配向であるように、特に設計されて
いるＤＮＡ分子および方法が提供される。

【０００７】本発明は、コード配列が、葯細胞で発現されるとき、生存能力のある花粉(via
ble pollen)の形成を中断させるポリペプチドをコードしている、ＤＮＡ分子お
よび方法をさらに提供する。本発明の特定の例では、コード配列は、ＲＮアーゼ
、ＤＴＡ，ＴＵＲＦ−１３、ペクテートリアーゼ、ｇｉｎレコンビナーゼ、ｉａ
ａＬおよびｃｙｔＡトキシンを含む群から選択されるポリペプチドをコードして
いる。本発明は、前記のように、本発明のＤＮＡ配列が、配列番号１の任意の位置の
一連の３０塩基において、８０％より大きい、特に９０％、そしてより特に９５
％より大きい配列同一性を有する、ＤＮＡ分子および方法をさらに提供する。

【０００８】本発明は、特に葯のタペテート、エンドテシウムおよび葯隔組織（小胞子また
は花粉ではない)における関連するコード配列の発現を駆動することのできるプ
ロモーター配列を含むＤＮＡ分子をさらに提供し、ここで、コード配列の発現は
、四分子段階に開始し、液胞化花粉段階に最大水準に達する。

【０００９】特に、ここでわれわれは、 ●プロモーター配列が、配列番号３のヌクレオチド配列と、５０％、特に６５％
、より特に８０％、そして最も特に９０％またはそれより大きい配列同一性を有
する ●プロモーター配列が、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する ●プロモーター配列が、目的のコード配列に操作可能なように連結されることが
できる付加的な配列を含む ●付加的な配列が、配列番号１０と、５０％、特に６５％、より特に８０％、そ
して最も特に９０％またはそれより大きい配列同一性を有する配列を含む ●付加的な配列が、配列番号１０を含む ●プロモーター配列および付加的な配列が、配列番号２と、５０％、特に６５％
、より特に８０％、そして最も特に９０％またはそれより大きい配列同一性を有
する ●プロモーター配列および付加的な配列が、配列番号２のヌクレオチド配列によ
って特徴付けられる前記のような方法およびＤＮＡ分子を提供する。

【００１０】さらに、プロモーターが、配列番号２から取得可能な断片、好ましくは、特に
葯のタペテート、エンドテシウムおよび葯隔組織（小胞子または花粉ではない)
における関連するコード配列の発現を駆動することができる断片を含み、ここで
、コード配列の発現は、四分子段階に開始し、液胞化花粉段階に最大水準に達す
る、ＤＮＡ分子が提供される。本発明は、配列番号４と、５０％、特に６５％、より特に８０％、そして最も
特に９０％またはそれより大きい配列同一性を有するアミノ酸配列によって特徴
付けられるタンパク質をコードしている、オープンリーディングフレームを含む
ＤＮＡ分子をも提供する。本発明の特定の態様では、配列番号４のアミノ酸配列
によって特徴付けられるタンパク質をコードしている。さらに別の特定の態様で
は、前記で記載されたようなＤＮＡ分子は、配列番号７によって特徴付けられて
いる。

【００１１】さらに、微小器官のような宿主の器官または植物における発現のための本発明
のＤＮＡを含む第一の発現カセット、および要すれば、所望の遺伝子を含む第二
の発現カセットを含む発現ベクターが、提供される。本発明の特定の例では、第
二の発現カセットはマーカー遺伝子を含む。本発明は、前記で記載されたようなオープンリーディングフレームによってコ
ードされるタンパク質をさらに提供する。

【００１２】さらに、トランスジェニック植物および植物材料(plant material)およびその
有性生殖および／または無性生殖の後代が、提供され、本発明によれば、それは
ＤＮＡ配列で形質転換されている。特に本発明は ●本発明のＤＮＡ配列で形質転換された、トランスジェニック雄性不稔植物 ●植物がイネ、コムギ、トウモロコシ、モロコシ(Sorghum bicolor)またはオー
チャードグラスである、本発明による、トランスジェニック植物または植物材料
を提供する。

【００１３】本発明は、プロモーター配列および関連するコード配列を含むＤＮＡを含むト
ランスジェニック植物の生産のための方法をさらに提供し、ここで、プロモータ
ー配列は、特に葯のタペータム、エンドテシウムおよび葯隔組織(小胞子または
花粉ではない)におけるコード配列の発現を駆動し、コード配列の発現は、四分
子段階に開始し、液胞化花粉段階に最大の水準に達する。特に、植物がイネ、コ
ムギ、トウモロコシ、モロコシまたはオーチャードグラスである、方法である。

【００１４】発明の構成および機能特定の態様では、本発明は、配列番号１に示す塩基配列を有する、イネ(Olyza
sativa L.)葯特異的遺伝子、および該遺伝子における任意の位置の一連の３０
塩基において８０％より大きい配列同一性を有する遺伝子を提供する。さらに、本発明は、配列番号１のｎｔ１ないしｎｔ１４３６によってあらわさ
れる該遺伝子における、−１１９６および２４０位の間の塩基配列に一致する配
列番号２を有する、プロモーター配列および付加的な配列を含む、葯特異的発現
レギュレーターを提供する。

【００１５】本発明は、配列番号１のｎｔ１ないしｎｔ１１９６によって現される該遺伝子
における、−１１９６および-１の間の塩基配列に一致する配列番号３を有する
、葯特異的発現プロモーターをも提供する。

【００１６】定義本明細書および特許請求の範囲の明確かつ矛盾のない理解を確保するために、
以下の定義が提供される。

【００１７】キメラ:は、ベクターまたは遺伝子のようなＤＮＡ配列が、組み換えＤＮＡ技
術によって相互に融合され、一つのＤＮＡ配列となる、別個の起源の１より多い
ＤＮＡ配列からなることを示すときに使用され、それは自然には存在せず、形質
転換されるべき植物に特に存在しない。

【００１８】発現:は、植物における外生遺伝子またはトランスジーンの転写および／また
は翻訳を意味する。例えばアンチセンス構築物の場合、発現は、アンチセンスＤ
ＮＡのみの翻訳を意味し得る。

【００１９】遺伝子：は、コード配列および関連する調節配列を意味し、ここで、コード配
列はｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセ
ンスＲＮＡのようなＲＮＡに転写される。調節配列の例は、プロモーター配列、
５’および３’非翻訳配列および終結配列である。存在し得るさらなるエレメン
ｔは、例えばイントロンである。

【００２０】マーカー遺伝子:は、選択またはスクリーニング可能な特徴をコードしている
遺伝子を意味する。ｎｔ：は、「ヌクレオチド」の略語である。

【００２１】に操作可能なように結合して／に関連して:は、調節ＤＮＡ配列が、コードＤ
ＮＡ配列の発現に影響するように２の配列が位置するならば、調節ＤＮＡ配列が
、ＲＮＡまたはタンパク質をコードしているＤＮＡ配列「に操作可能なように結
合して」または「に関連して」いるといわれる。

【００２２】植物:は、任意の植物、特に種子植物を意味する。植物材料:は、葉、茎、根、花、花部分、果実、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、
卵細胞、接合子、胚、種子、挿し木、細胞または組織培養物または植物の任意の
他の部分または生産物を意味する。

【００２３】プロモーター:は、関連するＤＮＡ配列の転写を開始するＤＮＡ配列を意味す
る。プロモーター領域は、アクチベーター、エンハンサー、および／またはレプ
レッサーのような遺伝子発現のレギュレーターとして働く要素をも含みうる。

【００２４】組み換えＤＮＡ分子:組み換えＤＮＡ技術を使用して相互に結合されるＤＮＡ
配列の組み合わせ

【００２５】組み換えＤＮＡ技術:例えばSambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY
: Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるようなＤＮＡ配列を相互
に結合するために使用される技術

【００２６】スクリーンマーカー遺伝子:は、発現が、形質転換された細胞に選択的な優位性
を付与しないが、形質転換された細胞を、形質転換されていない細胞から表現型
的に区別させる遺伝子を意味する。

【００２７】選択マーカー遺伝子:は、植物における発現が、細胞に選択的な優位性を与え
る遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子で形質転換された細胞に所有される選
択的な優位性は、形質転換されていない細胞の成長と比較して、抗生物質または
除草剤のような負の選択薬剤の存在下で成長する能力のためであり得る。形質転
換された細胞によって所有される選択的優位性は、形質転換されていない細胞と
比較して、栄養、成長ファクターまたはエネルギー源として添加される化合物を
利用する増強されたまたは新規な能力のためでもあり得る。選択マーカー遺伝子
は、植物細胞における発現が、細胞に負および正の双方の選択的優位性を付与す
る遺伝子またはその組み合わせをも意味する。

【００２８】配列同一性:配列同一性のパーセンテージは、ダイナミックプログラミングア
ルゴリズムに基づくコンピュータープログラムを使用して決定される。本発明の
範囲内で、好ましいコンピュータープログラムは、対象がタンパク質であるかＤ
ＮＡであるかに関係なく、利用可能な配列データベースのすべてを探索するよう
に設計されている、ＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)サーチプ
ログラムを含む。このサーチツールのバージョンＢＬＡＳＴ2.0(Grapped BLAST)
は、インターネット上で公衆に利用可能とされた(現在、http://www.ncbi.nlm.n
ih.gov/BLAST/)。それは帰納的なアルゴリズムを使用しており、全体的アライン
メントに対するローカルを探し、そして遊離した領域のみを共有するアラインメ
ント間の関連性を検出することができる。ＢＬＡＳＴサーチにおいて与えられた
スコアは、よく特定された統計的な解釈を有する。該プログラムは、デフォルト
値にセットした所望のパラメーターで好ましくは運用される。

【００２９】形質転換:は、細胞への核酸の導入を意味する。特に、標的生物のゲノムへの
、ＤＮＡ分子の安定的な組み込みを意味する。

【００３０】配列リストの配列の簡単な説明配列番号１イネＲＡ８遺伝子のヌクレオチド配列配列番号２第一エキソン、第一イントロンおよびエキソン２の一部をプラスさ
れたＲＡ８プロモーターを含む葯特異的発現レギュレーター配列番号３ＲＡ８プロモーター配列番号４イネＲＡ８遺伝子によってコードされるタンパク質の演繹されたア
ミノ酸配列配列番号５プライマー１配列番号６プライマー２配列番号７ＲＡ８ｃＤＮＡ配列配列番号８ＰＣＲプライマー配列番号９ＰＣＲプライマー配列番号１０イネＲＡ８遺伝子の第一エキソン、第一イントロンおよびエキソ
ン２の一部のヌクレオチド配列

【００３１】寄託

【表１】 Korea Advanced Instiute of Science and Technology(KAIST)の付属機関であ
る、Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnologyに寄託がなさ
れている。

【００３２】以下に、本発明を詳細に記載する。本発明の遺伝子は、イネ(Olyza sativa L.)から単離され、葯において特異的
に発現し、そのゲノム配列は配列番号１に現される。ＲＡ８遺伝子のｃＤＮＡ配
列は、配列番号７に示される。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の比較によって、ＲＡ
８遺伝子のコード配列において２のイントロンおよび３のエキソンの存在がわか
る。１３４ｂｐのイントロン１は第１４および第１５コドンの間に位置し、配列
番号１のｎｔ１２８９ないしｎｔ１４２２に一致し、配列番号１のｎｔ１５５６
ないしｎｔ２１４９に一致し、５９４ｂｐのイントロン２は、アミノ酸コード領
域における第５９コドンに位置し、該塩基配列から演繹され、配列番号１のｎｔ
１５５６ないしｎｔ２１４９に一致する。双方のイントロンは、コンセンサスＧ
ＴおよびＡＧ配列をそれぞれ５’および３’末端に含む。

【００３３】配列番号１に関して、３のエキソンが、以下のように位置する:エキソン１:ｎ
ｔ１２４７ないしｎｔ１２８８;エキソン２:ｎｔ１４２３ないしｎｔ１５５５;
エキソン３:ｎｔ２１５０ないしｎｔ２７６６。該コード領域の５’非コードフ
ランキング配列において、ＣＡＡＴボックス配列、ＣＡＡＴは、塩基位置−８２
ないし−７９に位置し、配列番号１のｎｔ１１１６ないしｎｔ１１１９に一致し
、そしてＴＡＴＡボックス配列、ＴＡＴＡＡＴＡは塩基位置−５３ないし−４７
に位置し、配列番号１のｎｔ１１４５ないしｎｔ１１５１に一致する。ポリ（Ａ
）テイルは、第１６４塩基（配列番号１のヌクレオチド２９３２）においてＴＧ
Ａ翻訳終結コドンから下流に位置する。３’非コード領域において、ＡＡＴＡＡ
コンセンサスポリアデニル化シグナル配列が存在する。第一ＡＴＧの周辺の配列
は、文献に報告されたように単子葉植物の翻訳開始コンセンサス配列によく適合
する[Joshi, C.P.et al.,Plant Mol.Biol.,35:993-1001(1997)]。

【００３４】該コード領域のオープンリーディングメモリーは、２６４のアミノ酸残基を含
み、配列番号４のアミノ酸配列を有する。該オープンリーディングフレームから演繹されたタンパク質は、26.4ｋＤａの
分子量および6.1のｐＩを有する。そのタンパク質を構成する主要なアミノ酸は
、アラニン（21.9％）、グリシン（9.9％）およびプロリン（10.2％）であり、
そのアミノ酸配列は、膜分画または細胞外空間へタンパク質をターゲッティング
させることにおいて関連し得る、疎水性のＮ末端領域、エクステンシン様ＳＰＰ
ＰＰＰＰモチーフおよびグリシンに富む領域を含む。ジーンバンクデータベース
との相同性分析によれば、そのようなアミノ酸配列は新規であり、これまでに報
告されたようなすべての遺伝子と有意な配列同一性を示さない。

【００３５】本発明によれば、遺伝子の発現は、時間的および位置的に調節されることによ
って特徴付けられる。位置的発現パターンは、遺伝子がイネの花の葯器官におい
てのみ発現されるが、他の、葯の他の花器、葉および根等において発現されず、
そして特に葯器官においても、タペータム、エンドテシウム、および葯隔組織の
みにおいて発現されるが維管束組織においては発現されないことを含む。時間的
発現パターンは、遺伝子の発現水準が、花の成熟にしたがって増大することを含
み、ここで遺伝子は、プレ減数分裂段階ではほとんど発現されないが、その発現
は、小胞子が四分子から解放されるとき、最初に検出可能である。最大水準は、
液胞化花粉段階において観察され、開花の直前の、成熟花粉段階において急激に
減少する。

【００３６】本発明の遺伝子は、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法によって取
得することができる。例えば、葯ｃＤＮＡライブラリーと、葉、根または苗から
のような非−葯起源のｃＤＮＡライブラリーとをハイブリダイズさせ、その後、
非−葯起源のｃＤＮＡライブラリーと、反応しない葯特異的遺伝子のｃＤＮＡク
ローンを取得することを含む方法による。さらに、取得されたｃＤＮＡクローン
を、ゲノムライブラリーとハイブリダイズさせるためのプローブとして使用し、
それと反応するクローンを単離し、それをサブクローン化し葯特異的遺伝子のゲ
ノムクローンを取得する。

【００３７】遺伝子を取得する他の方法は、該配列番号１の塩基配列が、通常のＰＣＲ法の
ための適当なプライマーを合成するために使用される方法を含む。本発明の特定
の態様では、取得された遺伝子は、pBluescript SK(-)ベクターにクローン化さ
れ、プラスミドpGA1173-9と名づけられる。このプラスミドは、Korea Advanced
Institute of Science and Technology(KAIST)の付属機関であるKorea Research
Institute of Bioscience and Biotechnologyに寄託No.KCTC8899Pの下、１９９
８年７月２９日に寄託される。

【００３８】ＲＡ８プロモーターを含む領域は、配列番号３に示され、配列番号１のｎｔ１
ないしｎｔ１１９６に一致する。ＲＡ８遺伝子の転写されたヌクレオチドは、配
列番号１の１１９７位に開始する。本発明の遺伝子の葯特異的発現を調節するエ
レメントは、プロモーター、エキソン１、イントロン１およびエキソン２の一部
を含む領域に位置され、そのような領域は、該配列番号１の塩基配列におけるｎ
ｔ１およびｎｔ１４３６の間の塩基配列に一致する配列番号２に現されることが
できる。調節エレメントは、通常のクローン化方法によってイネゲノムＤＮＡま
たはプラスミドpGA1173-9から取得され、例えば、配列番号２の塩基配列は適当
なプライマーを合成するために使用され、そしてその後通常のＰＣＲ法が実施さ
れる。

【００３９】本発明の植物発現ベクターは、例えば、配列番号２に示されたような該調節エ
レメントを含み、ここで葯特異的発現レギュレーターは、もう一つの関心のある
遺伝子に融合されている。所望による遺伝子として、ベータグルクロニダーゼ（
ＧＵＳ）のようなレポーター遺伝子が使用され得、イネ葯の異常発達を誘導する
目的のためにＤＴＡ（細胞を崩壊させる毒性遺伝子)、ＲＮアーゼ遺伝子等が、
使用され得る(以下参照)が、関心のある遺伝子はこれに限定されない。

【００４０】植物発現ベクターは、形質転換体の選択を可能にするマーカー遺伝子を含む第
二の発現カセットを含みうる。選択またはスクリーンマーカー遺伝子の例は以下
に記載される。ある標的種に関し、異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが
好ましくありうる。形質転換において日常的に使用される選択マーカーは、カナ
マイシン、パロモマイシン、ジェネティシンおよび関連する抗生物質に対する抵
抗性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子(Vieira and Messing, 1982, Gene 19: 259-26
8; Bevan et al.,1983, Nature 304: 184-187) アミノグリコシド3'-アデニリル
トランスフェラーゼをコードし、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン
に対する抵抗性を付与するバクテリア性ａａｄＡ遺伝子(Goldschmidt-Clermont,
1991, Nucl. Acids Res. 19:4083-4089)、抗生物質ハイグロマイシンに対する
抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子(Blochlinger and Diggelmann, 1984, Mol. Cell
. Biol. 4: 2929-2931)、およびメトトレキセートに対する抵抗性を付与するｄ
ｈｆｒ遺伝子(Bourouis and Jarry, 1983, EMBO J. 2: 1099-1104)を含む。使用
される他のマーカーは、除草剤ホスヒノスリシンに対する抵抗性を付与する、ホ
スヒノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(White et al., 1990, Nucl.
Acids Res. 18:1062; Spencer et al., 1990, Theor.Appl. Genet. 79:625-631
)、グリホサート抵抗性をコードしている変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子(Hinche
e et al., 1988, Bio/Technology 6: 915-922)、イミダゾリンまたはスルホニル
ウレア抵抗性を付与する変異アセトラクテートシンターゼ(ＡＬＳ)遺伝子(Lee e
t al., 1988, EMBO J. 7:1241-1248)、アトラジンに対する抵抗性を付与する変
異ｐｓｂＡ遺伝子(Smeda et al., 1993, Plant Physiol. 103: 911-917)、また
はＥＰ0769059において記載されたような変異プロトポルヒリノーゲノキシダー
ゼ遺伝子を含む。ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子のような、特許出願WO93
/05163において記載されたように、正の選択を生じる選択マーカーも、使用され
る。

【００４１】形質転換された細胞の同定は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ(ＣＡＴ)、β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、ルシフェラーゼ、および緑色蛍
光タンパク質(ＧＦＰ)または表現型的に明瞭な特徴を形質転換された細胞に付与
する他の任意のタンパク質をコードしている遺伝子のようなスクリーン遺伝子の
発現を通しても達成され得る。

【００４２】該発現ベクターは、該葯特異的発現レギュレーターと所望の遺伝子を融合させ
ることによって構築され得、その後それを適当な植物発現ベクターにライゲート
する。例えば、調節エレメントは、読み枠を変えることなくＧＵＳと融合され、
そして融合産物は、植物中で発現可能なバイナリーベクターpGA1633にライゲー
トされ、発現ベクターpGA1647を構築する。

【００４３】本発明の組み換えＤＮＡ配列は、植物細胞へ多くの周知の方法によって導入さ
れることができる。当業者は、そのような方法が、形質転換のための標的とされ
る植物の型(すなわち単子葉または双子葉植物のような)に、依存し得ることを認
識する。植物細胞を形質転換する適当な方法は、マイクロインジェクション(Cro
ssway et al., 1986, Bio Techniques 4:320-334)、電気穿孔法(Riggs and Bate
s, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:5602-5606)、アグロバクテリウム−
仲介形質転換(Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6:915-922; EP0853675)
、ディレクトジーントランスファー(Paszlowski et al., 1984, EMBO J. 3:2717
-2722)、およびAgracetus, Inc., Madison, WisconsinおよびDupont, Inc., Wil
mington, Delawareから入手可能である装置を使用するバリスチックパーティク
ルアクセラレーション (例えば米国特許No.4945050およびMcCabe et al., 1988,
Bio/Technology 6:923-926参照)を含む。形質転換されるべき細胞は、葉細胞、
胚形成細胞、または任意の他の細胞の型であってよい。

【００４４】プロトプラストの直接形質転換において、外生遺伝子物質のプロトプラストへ
の取り込みは、化学的薬剤または電場の使用によって増強され得る。そして外生
物質は、核内ゲノムに組み込まれ得る。双子葉植物タバコ植物において先行的な
研究がなされ、外来ＤＮＡは組み込まれ、後代植物へ伝達されるという結果であ
った(Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2712-2722; Potrykus et al., 1985
, Mol Gen. Genet 199: 169-177)。例えば、Triticum monococcum, Lolium mult
ifllorum(イタリアンライグラス)、トウモロコシ、およびブラックメキシカンス
イートコーンのような単子葉植物のプロトプラストは、この方法によって形質転
換される。さらなる好ましい態様は、EP0292435およびEP0846771に記載されたよ
うなトウモロコシのためのプロトプラスト形質転換法である。トウモロコシ形質
転換について、Koziel et al., 1993, Bio/technology 11: 194-200も参照され
たい。

【００４５】イネの形質転換は、プロトプラストまたはパーティクルボンバードメントを利
用する、ディレクトジーントランスファー技術によって実施されることができる
。プロトプラスト−仲介形質転換は、ジャポニカ型およびインディカ型について
記載される(Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep., 7:379-384; Shimamoto et
al., 1989, Nature 338:274-276; Datta et al., 1990, Bio/Technology 8:736-
740)。前記の両方の型は、パーティクルボンバードメントを使用して日常的に形
質転換可能である(Christou et al., 1991, Bio/Technology 9:957-962)。特許
出願No.EP0332581には、Pooideaeプロトプラストの生成、形質転換および再生に
関する技術が記載されている。これらの技術は、Dactylisおよびコムギを含むす
べてのPooideae植物の形質転換を可能にする。さらに、コムギの形質転換は、特
許出願No.EP0674715において；およびWeeks et al., 1993(Plant Physiol. 102:
1077-1084)によって記載される。

【００４６】こうして構築された植物発現ベクターは、例えば、通常の植物形質転換方法に
よって、イネのカルス(calli)に導入されることができ、根および葉の分化がそ
こから誘導され、そして栽培のための植木鉢に移植され、それによって形質転換
されたイネが得られる。

【００４７】植物を形質転換する好ましい方法は、アグロバクテリウム−仲介形質転換であ
る。アグロバクテリウム−仲介形質転換によれば、代表的な例として、発現ベク
ターPGA1647を、凍結−融解法(An, G. et al.,(eds)Plant Molecular Biology M
anual, pp. A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht(1988))を使
用して、バイナリーＴｉプラスミドを有するAgrobacterium tumefaciensに送達
し、そして適当な抗生物質を添加したＡＢ液体培地(Chilton, M-D, Pro. Natl.
Acad. Sci. USA, 71, 3672-3676(1974))中で成長させ、そして得られた産物を、
１ｍＭのベタインを添加した２Ｎ６−Ａｓ培地(Hiei, Y.et al., Plant J.,6, 2
71-282(1994))上で、暗黒下２５℃で２−３日間カルスと共培養する。共培養し
たカルスを、セホタキシムを含む無菌水で洗浄し、再び適当な抗生物質およびセ
ホタキシムを含むＮ６培地で３−４週間インキュベートし、活発に成長している
カルスを得る。これらのカルスを、適当な選択培地、例えば、0.2ｍｇ／ＬのＮ
ＡＡ(ナフタレン酢酸)、２ｍｇ／Ｌのカイネチン、２％のソルビトール、１．６
％のphytoagar(Gibco)、適当な抗生物質、および250ｍｇ／Ｌのセホタキシムを
添加したＭＳ培地(Life Technologies)に移植し、そして30-60μmol m^-2 秒^-1、
好ましくは40μmol m^-2 秒^-1の連続光条件下２−３週間培養し、小植物を得る。
これらの小植物をポット植えし、10時間光／14時間暗黒の条件下のグロースチャ
ンバー内で成長させ、トランスジェニックイネを得る。

【００４８】該方法において使用されるベクターが、本発明の調節エレメントおよびＤＴＡ
またはＲＮアーゼ遺伝子等の融合された遺伝子を含む場合、ベクターで形質転換
された植物は、雄性不稔の性質を有する。

【００４９】本発明のコードＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドをコードしている任意のＤ
ＮＡ配列であってよい。しかしながら、葯組織で発現されるときに、植物に生存
能力のある花粉を生産させないポリペプチドの産物をコードしているコードＤＮ
Ａ配列が、本発明における使用では特に好ましい。そのようなコードＤＮＡ配列
の例は、ここで引用によって完全に本明細書の一部とされる、以下の引用中に記
載の遺伝子を含む： a)Diptheria toxin A-chain遺伝子(ＤＴＡ)、タンパク質合成を阻害する(Greenf
ield et al., 1983, Proc. Ntl. Acad. Sci., USA, 80:6853; Palmiter et al.
, 1987, Cell 50:435-443); ｂ) Erwinia chrysanthemi EC16からのペクテートリアーゼ遺伝子ｐｅｌＥ、ペ
クチンを分解する (Keen et al., 1986, J. Bacteriology 168:595); ｃ)ｃｍｓ−Ｔトウモロコシミトコンドリアゲノムからの、Ｔ−ｕｒｆ１３（Ｔ
ＵＲＦ−１３）遺伝子:この遺伝子は、ミトコンドリアまたは原形質膜を崩壊さ
せるＵＲＦ１３として呼ばれるポリペプチドをコードしている(Braun et al., 1
990, Plant Cell 2: 153; Dewey et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
84:5374 and Dewey et al., 1986, Cell 44:439); ｄ)ファージＭｕ遺伝子からのＧｉｎレコンビナーゼ遺伝子、植物細胞で発現さ
れるとき、ゲノム再配列(rearrangemet)および細胞生存能の喪失を引き起こす部
位特異的ＤＮＡレコンビナーゼ(Maeser et al., 1991, Mol Gen Genet 230:170-
176); ｅ)Pseudmonas syringaeからのインドール酢酸−リジンシンターゼ遺伝子(ｉａ
ａＬ)、リジンをインドール酢酸(ＩＡＡ)に共役させる酵素をコードしている。
植物細胞で発現されるとき、共役による細胞からのＩＡＡの除去による変化した
発達を引き起こす(Pomano et al., 1991, Genes and Development 5:438-446; S
pena et al., 1991, Mol Gen Genet 227:205-212; Roberto et al., 1990, Pro
Natl Acad Sci USA, 87:5795-5801);およびｆ)殺蚊性および溶血性タンパク質をコードしている、Bacillus thyringiensis
israeliensisからのＣｙｔＡトキシン遺伝子。植物細胞で発現されるとき、細胞
膜の崩壊のための細胞死を引き起こす(McLean et al., 1987, J. Bacteriology
169:1017-1023; Ellar et al., 米国特許No. 4918006,1990)。

【００５０】実施例本発明を、実施例を示すことによってより詳細に記載するが、本発明の範囲の
限定として解釈されるべきではない。

【００５１】実施例１:イネ葯特異的遺伝子、ＲＡ８の単離段階１:ＲＡ８遺伝子の単離後期液胞化段階のイネ(Oryza sativa L. Naldong)の花を、３部分に横断切片
化し、無傷の葯および内花頴および外花頴の部分を含む、真中部分を、葯に富む
試料として使用する。この部分から、葯に富むmRNAを、poly(A)Quick mRNA Isol
ation Kit(Stratagene, USA)を使用して単離する。葯ｃＤＮＡライブラリーを、
ｍＲＮＡを鋳型として使用する、ZAP-cDNA Gigapack 2 Gold Cloning Kit(Strat
agene)で構築する。

【００５２】同じ方法を葉に適用し、葉を、６日齢のイネの苗から採取し、葉ｃＤＮＡライ
ブラリーを構築する。構築された葯ｃＤＮＡライブラリーより、３３ｃＤＮＡクローンを無作為に選
択し、その後、それぞれのクローンＤＮＡのＥｃｏＲＩによる切断によって得ら
れる、ｃＤＮＡ領域を、放射性活性アイソトープ３２Ｐで標識化し、葉のｃＤＮ
Ａライブラリーからのプラークとハイブリダイズさせる。

【００５３】この結果として、６の葯ｃＤＮＡクローンは、葉ｃＤＮＡライブラリーからの
プラークと反応せず、これらのクローンの中で、葯ｃＤＮＡクローンの中に最も
豊富に存在する、１クローンを選択しＲＡ８と命名する。このＲＡ８クローンから、ｆ１ヘルパーファージＲ４０８(Stratagene)を、組
換えプラスミドｐＧＡ１１７３-４(ＲＡ８)を得るために使用し、その中へイン
ビボエクシジョンによってｃＤＮＡ断片を挿入し、前記のプラスミドにクローン
化される、ＲＡ８ｃＤＮＡの塩基配列を、Sanger et al.(Snager, F. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467(1977))の方法によって決定する。

【００５４】該塩基配列を、配列番号７として示す。配列番号７に示すように、ＲＡ８ｃ
ＤＮＡの塩基配列は、１００８ｂｐの大きさである。配列番号７のｎｔ５１ない
しｎｔ８４２に、オープンリーディングフレームが存在し、２６４のアミノ酸残
基を含む。該オープンリーディングフレームから演繹されたタンパク質は、26.4
ｋＤａの分子量および6.1のｐＩを有する。第一のＡＴＧの周辺の配列は、文献[
Joshi, C. P. et al., Plant Mol. Biol., 35:993-1001(1997)]に報告されたよ
うな単子葉植物の翻訳開始コンセンサス配列とよく適合し、ポリ(Ａ)テイルは、
ＴＧＡ翻訳終結コドンから下流に第164塩基配列において位置する。3’非翻訳領
域に、ＡＡＴＡＡコンセンサス配列ポリアデニル化シグナル配列が、存在する。

【００５５】前記のアミノ酸配列を構成する主要なアミノ酸残基は、アラニン(21.9％)、グ
リシン(9.9％)およびプロリン(10.2％)であり、そのアミノ酸配列は、膜分画ま
たは細胞外空間へタンパク質をターゲティングさせることに関連し得る疎水性Ｎ
末端領域、エクステンシン様ＳＰＰＰＰＰＰモチーフおよびグリシンに富む領域
を含む。ジーンバンクデータベースとの相同性分析によれば、そのようなアミノ
酸配列は、新規な遺伝子であることが確認され、これまでに報告されたようなす
べての遺伝子と有意な配列同一性を示さない。

【００５６】段階２:ＲＮＡブロッティング分析前記の段階１から得られたＲＡ８遺伝子は、葯に特異的に発現されるか確認す
るために、全ＲＮＡを、葉、根、若い花、成熟花、および内花頴／外花頴、イネ
の花の雌蕊および雄蕊から単離し、電気泳動し、そしてナイロン膜に移す。３２
Ｐ標識化ＲＡ８ｃＤＮＡをプローブとして使用し、ＲＮＡブロッティングを実
施する。

【００５７】ＲＡ８ｍＲＮＡは、様々な発達段階において、花にのみ存在するが、葉およ
び根には存在しない。ＲＡ８遺伝子の発現水準は、花の発達中に増大し、成熟花
において最高水準に達する。花の中での器官特異性を決定するために、異なる花
器から単離された全ＲＮＡと、ＲＮＡブロット試験を実施する。花器のそれぞれ
を、解剖顕微鏡下で切開し、クロスコンタミネーションを最小化する。この結果
、ＲＡ８ｍＲＮＡは、葯に存在するが、心皮または内花頴／外花頴には存在し
ないことが明らかとなった。

【００５８】段階３:ＲＡ８ゲノムクローンの単離イネゲノムライブラリーのプラーク(標準的な方法によって構築され、Rockfel
ler UniversityのSteve KayおよびNam-Hi Chuaから、ＥＭＢＬラムダファージＤ
ＮＡの形態で得られ、そこへイネゲノムＤＮＡが挿入されている)を、ナイロン
膜(Hybond, Amersham)に移し、そして放射性アイソトープ３２Ｐ標識化ＲＡ８
ｃＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして使用することによってハイブ
リダイズさせる。ハイブリダイズされたナイロン膜をエックス線フィルムに曝露
し、ファージクローンを、陽性を示したプラークから取得する。

【００５９】ラムダファージＤＮＡを、これらのファージクローンから単離し、ＢａｍＨＩ
で切断し、13.7ｋｂのゲノム断片を取得し、そしてこのうち、4.3ｋｂのＳａｃ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片をサブクローン化する。4.3ｋｂのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断
片から取得される、2.9ｋｂのＳａｃＩ断片、それは５’フランキング配列およ
び５’コード領域を含み、一方、隣接する1.5ｋｂのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片
は、残りのコード領域および3’フランキング配列を含む。２のイントロン(イン
トロン１およびイントロン２)および３のエキソンが、コード領域に存在する。

【００６０】配列番号１に関して、３のエキソン以下のように位置する:エキソン１:ｎｔ１
２４７ないしｎｔ１２８８；エキソン２:ｎｔ１４２３ないしｎｔ１５５５;エキ
ソン３:ｎｔ２１５０ないしｎｔ２７６６。イントロン１は、１３４ｂｐの大き
さで、第１４および第１５コドンの間に位置し、配列番号１のｎｔ１２８９ない
しｎｔ１４２２に一致し、そしてイントロン２は、５９４ｂｐの大きさであり、
第５９のコドンに位置し、配列番号１のｎｔ１５６６ないしｎｔ２１４９に一致
する。イントロンの双方は、５’および３’末端に、コンセンサスＧＴおよびＡ
Ｔ配列をそれぞれ含む。ＲＡ８コード領域の５’フランキング配列は、ＣＡＡＴ
ボックス配列、塩基位置−８２ないし−７９におけるＣＡＡＴを含み、配列番号
１のｎｔ１１１６ないしｎｔ１１１９に一致し、そしてＴＡＴＡボックス、−５
３ないし−４７塩基位置におけるＴＡＴＡＡＴＡは、配列番号１のｎｔ１１４５
ないしｎｔ１１５１に一致する。

【００６１】 2.9ｂｐのＳａｃＩ断片を、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ(−)ベク
ターにクローン化し、そしてこのプラスミドをｐＧＡ１１７３−９と命名する。
このプラスミドは、Korea Advanced Instiute of Science and Technology(KAIS
T)の付属機関である、Korea Research Institute of Bioscience and Biotechno
logyに、寄託No.KCTC 8899Pで、1998年7月29日に寄託がなされている。

【００６２】プラスミドｐＧＡ１１７３−９にクローン化される、ゲノムＤＮＡ断片の塩基
配列を、Sager et alの方法を使用して分析し、そしておよそ2.5ｋｂのプロモー
ター領域をｃＤＮＡとの比較によって決定する。ＲＡ８クローンのゲノム的な複雑さの研究するために、２週齢のイネ苗の葉か
ら単離したゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＰｓｔＩで切断
し、そしてＲＡ８ｃＤＮＡとＤＮＡブロッティングに付する。ＲＡ８ｃＤＮＡ
プローブは、イネゲノムＤＮＡの単一バンドとハイブリダイズし、ゆえに、ＲＡ
８遺伝子は、イネゲノム中に単一コピーとして存在する。

【００６３】実施例２:植物発現ベクターの生産レポーター遺伝子、ＧＵＳおよび選択遺伝子、ｈｐｈ(ハイグロマイシンホス
ホトランスフェラーゼ)を含む、バイナリーベクターを、以下のように構築する
。プラスミドｐＧＡ７４８(An G. Binary Ti plasmid vectors, Agrobacterium
protocols, Humana Press. pp. 47-58)を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
切断し、そしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Benfey et al., Science, 250, 95
9-966(1993))を、そこへ挿入する。ハイグロマイシン抵抗性遺伝子(ハイグロマ
イシンホスホトランスフェラーゼ、ｐｈｐ)(Gritz et al.,(1983))を、得られた
プラスミドのＢｇＩＩＩ部位に挿入する。プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＣ
ｌａＩで切断し、平滑末端化し、そしてライゲートさせる。得られたプラスミド
をＳａｃＩで切断し、およそ０．５ｋｂの断片を除去し、そして再びライゲート
する。このプラスミドのＢａｍＨＩ部位に、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳａｃＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＣｌａＩおよびＢｇＩＩＩ切断部位を有
する合成アダプターを挿入し、プラスミドｐＧＡ１１８２を構築する。

【００６４】ＰＣＲをプラスミドＰＧＡ１１８２を鋳型として、５’−ＴＴＧＧＣＡＴＧＣ
ＡＣＡＴＡＣ−３’(配列番号５)をプライマー１として、そして５’− ＣＧＧ
ＧＡＴＣＣＧＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＧ−３’(配列番号６)をプライマー２として
使用して、ＰＣＲを実施する。得られたおよそ１２０ｂｐの断片を、ＢａｍＨＩ
およびＳｐｈＩで切断し、そして、およそ９ｋｂの断片にライゲートし、それは
プラスミドｐＧＡ１１８２を同じ制限酵素で切断することによって得られる。こ
うして得られたプラスミドのＢａｍＨＩおよびＣｌａＩ部位の間に、ＧＵＳ遺伝
子(Jefferson et al., EMBO J, 6, 3901-3907(1987))を、挿入し、バイナリーベ
クターｐＧＡ１６３３を構築する。実施例１の段階３において構築されたような、2.9ｋｂのＲＡ８ゲノムＤＮＡ
を含むｐＧＡ１１７３−９を、配列番号８(ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡ
ＡＧＧＧ)および配列番号９(ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＣＣＡＣ)の合
成オリゴマープライマーと、ＰＣＲに付する。配列番号９に示す合成オリゴマー
は、ＲＡ８遺伝子のエキソン２におけるＢａｍＨＩ部位を生じる。

【００６５】前記のように増幅された配列を含む、プラスミドｐＧＡ１６３９を構築する。
プラスミドｐＧＡ１６３９は、ＲＡ８遺伝子の５’フランキング領域、エキソン
１、イントロン１、およびエキソン２の一部を含む2.7ｋｂのＳａｃＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を含む。この断片を、ｐＧＡ１６３３におけるβ−グルクロニダーゼコード配列に結合
させ、植物発現ベクターＰＧＡ１６４７を構築する。ベクターｐＧＡ１６４７に
おいて、前記記載のＲＡ８遺伝子由来配列を、エキソン２内の新しく導入された
ＢａｍＨＩ部位において、すべての読み枠の変更をすることなく、ＧＵＳ遺伝子
と融合する。そしてＲＡ８遺伝子部分およびβ−グルクロニダーゼコード配列の
間に翻訳融合(translational fusion)を作成する。

【００６６】実施例３:トラスジェニックイネの生産実施例２において構築された発現ベクターｐＧＡ１６４７を、バイナリーＴｉ
プラスミドｐＡＬ４４０４を有する、Agrobacterium tumefaciens ＬＢＡ４４０
４(Hoekema et al., Nature, 303, 179-181(1983))に、凍結−融解法(An, G. et
al., (eds)Plant Moleculae Biology Manual, pp. A3/1-A3/19,Kluwer Academi
c Publishers, Dordrecht(1988))を使用して形質転換する。

【００６７】形質転換されたAgrobacterium tumefaciensＬＢＡ４４０４を、３０ｍｇ／Ｌ
のハイグロマイシンＢおよび３ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを添加されたＡＢ液
体培地中で３日間成長させ、成熟種子の胚盤より、２ｍｇ／Ｌの２，５−Ｄを含
むＮ６培地(Chu, C. C. et al., Sci., Sin., 18, 659-668(1975))において誘導
される３週齢カルスとともに、１ｍＭのベタインを添加された２Ｎ６−Ａｓ培地
(Hiei, Y. et al., Plant J., 6, 271-282(1994))上で、暗黒で２５℃で２−３
週間共培養する。共培養されたカルスを、１００ｍｇ／Ｌのセホタキシムを含む
無菌水で洗浄し、そして再び４０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンおよび２５０ｍｇ
／Ｌセホタキシムを含むＮ６培地上で３週間インキュベートする。活発に成長し
ているハイグロマイシン抵抗性カルスを、選択培地[例えば、ＭＳ培地(Life Tec
hnologies)+0.2mg/L NAA(ナフタレン酢酸)+2mg/L カイネチン+2%ソルビトール+1
.6%のphytoagar(Gibco)+50mg/LのハイグロマイシンＢ+250mg/Lセホタキシム]上
に移植し、そして40μmol m^-2s^-1連続光条件下、２−３週間培養する。こうして
得られた小植物を、ポット植えとし、１０時間光／１４時間暗黒条件の下のグロ
ースチャンバー内で成長させ、全部で２２のトランスジェニックイネ植物を得る
。

【００６８】２２のトランスジェニックイネ植物の中で葯中の最高の発現水準を有する植物
系統を選抜するために、組織化学的ＧＵＳ染色を、トランスジェニックイネの花
部分について、染色液に２０％のメタノールを含むように修正したDai et al.の
方法[Dai, Z. et al., Plant Mol. Biol., 32, 1055-1065(1996)]にしたがって
実施し、固定液(５０％エタノール、５％酢酸、および３．７％ホルムアルデヒ
ド)中で固定する。試料を、解剖顕微鏡(×7.5倍率)下で観察する。この結果から
、葯内で最高のＧＵＳ発現水準を示すイネを選抜し、トランスジェニック植物系
統Ａ１１２７９と命名する。

【００６９】実施例４:トランスジェニックイネの組織化学的ＧＵＳ分析ＲＡ８遺伝子の位置的および時間的発現パターンを研究するために、実施例３
で生産されたトランスジェニックイネＡ１１２７９からの、若い花、早期液胞化
花粉段階における花、成熟花、葉、および根を、実施例３に記載したようなＧＵ
Ｓ活性について組織化学的に分析し、その後顕微鏡下で観察する。コントロール
として、形質転換されないイネの花を使用する。ＲＡ８プロモーターによって駆動されるＧＵＳ発現は、イネ花の葯内のみで検
出されるが、他の花器内、または葉もしくは根内で検出されない。さらに、花が
成熟するにつれて、ＧＵＳレポーター遺伝子の発現水準は、増大するが、遺伝子
はプレ減数分裂段階の若い花では全く発現されない。

【００７０】ＲＡ８プロモーター−レポーター遺伝子構築物のイネ葯特異的発現パターンを
研究するために、実施例３に記載したのと同じ方法にしたがって、異なる発達段
階における４のイネ葯を染色し固定した後、Paraplast(Sigma)に包埋し、１０μ
ｍの厚さに切片化する。切片を、ダークフィールドイルミネーションを使用して
、光学顕微鏡(×１００倍率)下で観察する。プレ減数分裂段階においてＧＵＳ活
性は、葯のいずれの部分においても検出されない。ＧＵＳ発現は、小胞子が四分
子から解放されるとき、最初に検出可能である。ＧＵＳ活性の最高の量は、液胞
化花粉段階における葯において観察される。しかしながら、裂開の直前または直
後の成熟花粉段階における葯において、ＧＵＳ活性は突然減少する。ＧＵＳ染色
がタペータム、葯隔、およびエンドテシウム組織に限られることが観察される。

【００７１】実施例５:トランスジェニックトウモロコシの生産前記の方法にしたがって調製された新規な遺伝子によるトウモロコシの形質転
換は、未熟接合体の胚または無菌的に増殖可能なタイプＩ胚形成カルスのマイク
ロプロジェクタイルボンバードメントによって実施する。タイプＩ胚形成トウモロコシカルス培養(Green et al., Maiami Winter Sympo
sium 20, 1983)を、1.5-2.5ｍｍ長の、グリーンハウス育成材料からの、未熟胚
からイニシエートする。胚を授粉のおよそ14日後の表面殺菌された雌穂から無菌
的に切除する。胚を、２％スクロースおよび５ｍｇ/Ｌクロラムベンを有するＤ
カルスイニシエーション培地(Duncan et al., Planta 165: 322-332, 1985)上に
、または３％のスクロースおよび0.75ｍｇ／Ｌの２，４−ｄを有するＫＭカルス
イニシエーション培地(Kao and Michayluk, Planta 126: 105-110, 1975)上に置
き得る。

【００７２】胚および胚形成培養を、引き続き暗黒下で培養する。〜１４日後、胚形成反応
物を外植体から取り出す。Ｄカルスイニシエーション培地からの胚形成反応物を
、２％スクロースおよび0.5ｍｇ／Ｌの２，４−ｄを有するＤカルス維持培地上
に置き、一方ＫＭイニシエーション培地からのものを２％スクロースおよび５ｍ
ｇ／ＬのDicambaを有するＫＭカルス維持培地上に置く。週毎の新しい維持培地
への選択継代培養の３ないし８週間後、良質の小さい胚形成培養物が得られる。
活発に成長している胚形成カルス断片を、遺伝子送達のためのターゲット組織と
して選択する。カルス断片を、遺伝子送達のおよそ４時間前に、１２％のスクロ
ースを有する維持培地を含むターゲットプレート上に置く。カルス断片を、ター
ゲットプレートの中心から８および１０ｍｍの半径で円状に並べる。

【００７３】プラスミドＤＮＡをDupont Biolisticsマニュアルに記載の通りに金マイクロ
キャリアーに沈殿させる。各プラスミドの２ないし３μgを、各６ショットのマ
イクロキャリアーの調製において使用する。ＰＤＳ−１０００Ｈｅ Biolistics
装置を使用して、遺伝子をターゲット組織細胞に送達する。Biolistics装置の設
定は、以下の通り：ラプチャーディスクとマクロキャリアーの間は８ｍｍ、マク
ロキャリアーとストッピングスクリーンの間は１０ｍｍ、そしてストッピングス
クリーンとターゲットの間は７ｃｍである。各ターゲットプレートを、６５０ｐ
ｓｉラプチャーディスクを使用して２度撃つ。２００×２００ステンレススチー
ルメッシュ(McMaster-Carr, New Brunswick, NJ)を、ストッピングスクリーンと
ターゲット組織の間におく。

【００７４】遺伝子送達の７日後、ターゲット組織断片を、高浸透圧培地から選択培地に移
植する。ＢＡＲ遺伝子を使用する選択のために、ターゲット組織断片を１００ｍ
ｇ／Ｌのグルホシネートアンモニウム(Basta(商標))または２０ｍｇ／Ｌのビア
ラホス(Herbiace(商標))を含む維持培地上に置く。すべてのアミノ酸を選択培地
から除去する。これらの高水準選択培地上での５ないし８週間の後、すべての成
長しているカルスを３−２０ｍｇ／ＬのBasta(商標)を含む培地上に継代培養す
る。

【００７５】マンノースホスフェートイソメラーゼ遺伝子を使用する選択のために、ターゲ
ット組織を、スクロースを含まず１％マンノースを含むそれぞれの維持培地上に
置く。アミノ酸をこれらの培地からのぞく。５ないし８週間の後、成長している
カルスを、スクロースを含まず1.5％のマンノースを含むＤカルス維持培地また
は１％スクロースおよび0.5％マンノースを含むＫＭカルス維持培地に継代培養
する。選択培地上で成長している胚形成カルスを、１０−２０植物を生成するた
めに十分なカルスが生産されるまで、４ないし８週間、２週間ごとに継代培養す
る。もとのターゲット組織断片からの選択を生存した組織を、単一コロニーとし
て継代培養し、独立的な形質転換事象を示す。

【００７６】ある時点で、Basta(商標)で選択されたコロニーを、３％スクロース(MS３S)を
含み、選択薬剤を含まない修正ＭＳ培地(Murashige and Skoog, Physiol. Plant
, 15:473-497, 1962)に移植し、光中に置く。0.25ｍｇ／Lアンシミドールおよび
0.5ｍｇ／Ｌカイネチンをこの培地に添加し、胚発芽を誘導し、または２ｍｇ／
Ｌのベンジルアデニンを添加する。マンノースを使用して選択されたコロニーを
、２％スクロースおよび１％マンノース(ＭＳ２Ｓ＋１Ｍ)を含み、前記で記載の
アンシミドールおよびカイネチン添加を有する修正ＭＳ培地、または２％スクロ
ースおよび0.5％マンノース(ＭＳ2Ｓ＋0.5Ｍ)を含み、前記のようにベンジルア
デニンを有する修正ＭＳ培地に移す。

【００７７】２週間後に、Basta(商標)選択からの再生コロニーを、アンシミドールおよび
カイネチンまたはベンジルアデニンを欠くＭＳ３Ｓ培地に移植する。２週間後に
、マンノース選択からの再生コロニーを、それぞれホルモンを欠くＭＳ２Ｓ＋１
ＭおよびＭＳ２Ｓ＋0.5Ｍ培地に移植する。すべてのコロニーからの根を有する
または有しない再生シュートを、ＭＳ３Ｓ培地を含むMagentaボックスに移植し
、根を有する小植物を最終的に回復し、グリーンハウスの土に移植する。

【００７８】培地がスクロースを含まず0.5％マンノースを含む場合、４８−ウェルクロロ
フェノールレッド検定を使用して、ＰＭＩ遺伝子の発現について植物を試験する
。葉試料(〜５ｍｍ×５ｍｍ)を、この検定培地上に置き、暗黒下で〜７２時間成
長させる。植物がＰＭＩ遺伝子を発現するならば、マンノースを代謝することが
でき、培地は黄変する。そうでないならば、培地は赤いままである。

【００７９】標準的な培養技術を使用する、未熟接合体の胚から得られるタイプＩカルスを
使用して、形質転換事象を起こさせる。遺伝子送達のために、およそ３００ｍｇ
のタイプＩカルスを、遺伝子送達の１ないし２日前の、新しい培地への継代培養
、ターゲット組織断片の選択、そしてターゲットプレートの中心から１０ｍｍの
環状パターンでのさらに12％スクロースを含む培地上への配置、によって調製す
る。およそ４時間後、DuPontからのＰＤＳ−１０００ＨｅBiolistic装置を使用
して、組織をボンバードする。関心のあるプラスミドを、Dupontからの標準的な
プロトコルを使用して、１μｍの金のパーティクルに沈殿させる。６５０ｐｓｉ
においてターゲットプレートあたり２ショット使用により遺伝子を送達する。

【００８０】遺伝子送達のおよそ１６時間後、カルスを、２％スクロースを含み選択薬剤を
有さない標準的な培養培地に移植する。遺伝子送達の１２または１３日後、ター
ゲット組織断片を、４０ｍｇ／ｌのBastaまたはビアラホスのようなホスヒノス
リシンを含む選択培地に移植する。カルスを選択上で１２ないし１６週間継代培
養し、その後生存し成長しているカルスを、植物の生産のために、３ｍｇ／ｌの
Bastaのようなホスヒノスリシンを含む標準的な再生培地に移植する。

【００８１】実施例６:コムギの形質転換コムギの形質転換のための好ましい技術は、未熟コムギ胚のパーティクルボン
バードメントを含み、遺伝子送達に先立って、高スクロースまたは高マルトース
段階のいずれかを含む。ボンバードメントに先立って、任意の数の胚(0.75-1mm
長）を、体細胞胚の誘導のために、３％スクロースおよび３ｍｇ／ｌの２,４−
Ｄを有するＭＳ培地(Murashige and Skoog, 1962)に置き、暗黒下で続行させる
。ボンバードメントの選択された日に、胚を、誘導培地から取り出し、浸透圧調
節物質(すなわち、所望の濃度、典型的には１５％で添加されたスクロースまた
はマルトースを有する誘導培地)上に置く。胚を、２−３時間、原形質分離させ
、その後ボンバードする。ターゲットプレートあたり２０の胚が典型的であるが
、これは重要なことではない。

【００８２】適当な遺伝子を運ぶプラスミドを、標準的な方法を使用してマイクロメーター
のサイズの金のパーティクルに沈殿させる。胚の各プレートを、〜１０００ｐｓ
ｉのバーストプレッシャーを使用し、標準的な８０メッシュスクリーンを使用し
て、Dupont Biolisticsヘリウム装置で撃つ。ボンバードメントの後、胚を暗黒
下へ戻し、約２４時間回復させる(なお浸透圧調節物質上)。２４時間後、胚を浸
透圧調節物質から取り出し、誘導培地上に戻し、再生前約１ヶ月そのままとする
。

【００８３】およそ１ヶ月後、発達中の胚形成カルスを有する胚外植体を、再生培地(ＭＳ
＋１ｍｇ／リットルＮＡＡ、５ｍｇ／リットルＧＡ)に移植し、それは、さらに
適当な選択薬剤を含む。約１ヶ月後、発達したシュートを、ＧＡ７ｓとして知ら
れ、半分濃度のＭＳ、２％スクロースおよび等濃度の選択薬剤を含むより大きな
無菌コンテナーに移す。コムギの安定的な形質転換は、特許出願EP0674715に詳
細に記載されている。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジョン・ジョンソンアメリカ合衆国95616カリフォルニア州デイビス、ラッセル・パーク・ナンバー５、 408番 (72)発明者チュン・ヨンヨン大韓民国ソウル、デチドン、カンナムク、ミド・アパートメント101−109 (72)発明者リー・シチュル大韓民国235−900カンウォンド、サムチョク、ドクイェエウプ、９バン、１リＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD13 CD17 CD21 CG01 HA01 4B024 AA08 BA79 CA04 DA01 EA03 FA02 GA17 GA21 HA14 4H045 AA10 BA10 CA31 EA05 FA74 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プロモータ配列および関連するコード配列を含むＤＮＡであ
って、プロモーター配列が、特に葯のタペータム、エンドテシウムおよび葯隔組
織内でコード配列の発現を駆動するが、小胞子または花粉内で駆動せず、コード
配列の発現が、四分子段階に開始し液胞化花粉段階に最大水準に達する、ＤＮＡ
。
【請求項２】配列が、配列番号１に示す配列と、５０％またはそれより大
きい配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】配列が、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む、請求項
１記載のＤＮＡ。
【請求項４】コード配列が、アンチセンス配向である、請求項１ないし３
のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項５】コード配列が、葯細胞で発現されるとき、生存能力のある花
粉の形成を中断させるポリペプチドをコードする、請求項１ないし３のいずれか
に記載のＤＮＡ。
【請求項６】コード配列が、ＲＮアーゼ、ＤＴＡ、ＴＵＲＦ−１３、ペク
テートリアーゼ、ｇｉｎレコンビナーゼ、ｉａａＬおよびｃｙｔＡトキシンを含
む群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】配列番号１の任意の位置の一連の３０塩基において、８０％
より大きい配列同一性を有する、ＤＮＡ配列。
【請求項８】特に葯のタペータム、エンドテシウム、および葯隔組織内で
、関連するコード配列の発現を駆動することができるが、小胞子または花粉内で
駆動しない、プロモーター配列を含むＤＮＡであって、コード配列の発現が、四
分子段階に開始し、液胞化花粉段階に最大水準に達する、ＤＮＡ。
【請求項９】プロモーター配列が、配列番号３のヌクレオチド配列と５０
％またはそれより大きい配列同一性を有する、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】プロモーター配列が、配列番号３に示すヌクレオチド配列
を有する、請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】プロモーター配列が、目的のコード配列に操作可能に連結
されることのできる付加的な配列を含む、請求項１ないし１０のいずれかに記載
のＤＮＡ。
【請求項１２】付加的な配列が、配列番号１０と５０％またはそれより大
きい配列同一性を有する配列を含む、請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】付加的な配列が、配列番号１０を含む、請求項１１に記載
のＤＮＡ。
【請求項１４】プロモーター配列および付加的な配列が、配列番号２のそ
れぞれの配列と５０％またはそれより大きい配列同一性を有する、請求項９ない
し１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】プロモーター配列および付加的な配列が、配列番号２のヌ
クレオチド配列によって特徴付けられる、請求項９ないし１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】プロモーターが配列番号２から取得可能な断片を含む、請
求項１５に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】配列番号４と、５０％またはそれより大きい配列同一性を
有するアミノ酸配列によって特徴付けられる、タンパク質をコードしているオー
プンリーディングフレームを含むＤＮＡ。
【請求項１８】オープンリーディングフレームが、配列番号４のアミノ酸
配列によって特徴付けられるタンパク質をコードしている、請求項１７に記載の
ＤＮＡ。
【請求項１９】配列番号７によって特徴付けられる、請求項１７または１
８のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２０】微生物または植物のような宿主生物における発現のための
、請求項１ないし１９のいずれかに記載のＤＮＡを含む、第一の発現カセット、
および要すれば、所望の遺伝子を含む第二の発現カセットを含む、発現ベクター
。
【請求項２１】請求項１７ないし１９のいずれかのオープンリーディング
フレームによってコードされているタンパク質。
【請求項２２】請求項１ないし１９のいずれかに記載のＤＮＡ配列で形質
転換された、トランスジェニック植物およびその有性生植および／または無性生
殖の後代。
【請求項２３】請求項１ないし１９のいずれかに記載のＤＮＡ配列で形質
転換されたトランスジェニック雄性不稔植物。
【請求項２４】植物がイネ、コムギ、トウモロコシ、モロコシまたはオー
チャードグラスである、請求項２２または２３に記載のトランスジェニック植物
。
【請求項２５】プロモーター配列および関連するコード配列を含むＤＮＡ
を含む、トランスジェニック植物の生産のための方法であって、プロモーター配
列が、特に葯のタペータム、エンドテシウムおよび葯隔組織内でコード配列の発
現を駆動するが、小胞子または花粉内で駆動せず、コード配列の発現が四分子段
階に開始し、液胞化花粉段階に最大水準に達する、方法。
【請求項２６】植物が、イネ、コムギ、トウモロコシ、モロコシまたはオ
ーチャードグラスである、請求項２５記載の方法。