KR100301922B1

KR100301922B1 - 벼약특이적인유전자,이유전자의약특이적발현조절인자,이조절인자를포함하는식물발현벡터및이벡터로형질전환된벼의제조방법

Info

Publication number: KR100301922B1
Application number: KR1019980046973A
Authority: KR
Inventors: 안진흥; 전종성; 정용윤; 이시철
Original assignee: 정명식; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 1998-11-03
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2001-11-05
Also published as: KR20000031106A; UA74535C2

Abstract

본 발명은 하기 서열 1의 염기서열을 갖는 벼(Oryza sativaL.) 약(anther) 특이적인 유전자, 이 유전자의 약 특이적 발현 조절인자, 이 조절인자를 포함하는 식물 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 벼의 제조 방법에 관한 것이다.

서열 1

Description

벼 약 특이적인 유전자, 이 유전자의 약 특이적 발현 조절인자, 이 조절인자를 포함하는 식물 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 벼의 제조 방법{RICE ANTHER SPECIFIC GENE, NEGULATORY FACTOR THEREOF, PLANT EXPRESSION VECTOR COMPRISING SAME AND PROCESS FOR PREPARING TRANSGENIC RICE PLANT USING SAME}

본 발명은 벼 약 특이적인 유전자, 이 유전자의 약 특이적 발현 조절인자, 이 조절인자를 포함하는 식물 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 벼의 제조 방법에 관한 것이다.

벼는 자가수분 방식으로 번식하기 때문에 타가수분에 의해서만 잡종 벼를 개발할 수 있다는 어려움이 있다. 타가수분에 의한 잡종 벼의 개발을 용이하게 하기위해, 종래에는 벼 꽃에서 약(꽃밥)을 제거하여 웅성불임 형질을 갖는 벼를 만든 후 다른 벼의 약으로부터 얻은 꽃가루를 옮겨주어 타가수분을 수행하는 방법이 시도되었다. 그러나 이 방법은 많은 시간과 노력이 소요되는 문제점이 있다.

약은 꽃식물의 웅성 생식기관으로 타페튬(tapetum), 엔도세시움(endothecium), 결합(connective) 조직, 관다발 조직 등의 다수 조직으로 구성되며 꽃가루의 생산을 담당한다. 약의 발달과정은 약의 형태가 확립되고 마이크로스포어(microspore) 모세포가 감수분열하여 테트라드의 마이크로스포어를 형성하는 제 1 기와, 꽃가루와 약이 분화되고 조직 퇴화, 열개(dehiscence) 및 꽃가루 방출이 일어나는 제 2 기로 구분되는데, 이러한 발달과정에 관여하는 다양한 유전자중 일부만이 약 특이적으로 발현된다.

현재까지 보고된 약 특이적인 유전자로는 벼의 Osc4, Osc6, YY1 및 YY2 유전자(Hihira, Y. et al.,Plant Mol. Biol.,30, 1181-1193(1996); Tsuchiya, T. etal.,Plant Mol. Biol.,26, 1737-1747(1994)), 담배의 TA29와 TA32 유전자(Koltunow, A.M. et al.,Plant Cell,2, 1201-1224(1990)), 해바라기의 SF2와 SF18 유전자(Domon, C. et al.,Plant Mol. Biol.,15, 643-646(1990)), 토마토의 108 유전자(Smith, A.G. et al.,Mol. Gen. Genet.,222, 9-16(1990)), 유채의 BA112 및 A9 유전자(Scott, R. et al., Plant Mol. Biol., 17, 195-207(1991); Shen, J.B. et al.,Mol. Gen. Genet.,234, 379-389(1992))가 있으며, 대부분의 유전자 산물이 꽃가루에 다량으로 축적되면서 꽃가루의 성숙 및 발아에 관여한다.

이에 본 발명자들은 종래 기술의 문제점이 없이 웅성불임 형질을 갖는 벼를 얻기 위해, 벼 약의 비정상적인 발달을 유도하는 유전자를 사용하는 방법을 개발하고자 하였으며, 이 방법에 사용될 약 특이적인 유전자 및 이 유전자의 약 특이적 발현 조절인자를 얻기 위해 연구를 거듭하였다.

본 발명의 목적은 벼 약 특이적인 유전자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자의 약 특이적 발현 조절인자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 이 조절인자를 포함하는 식물 발현 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 벼의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명에 따른 유전자 RA8의 벼 기관별 발현양상을 보여주는 RNA 블롯팅 결과이다.

도 2a는 13.7kb 크기의 벼 게놈 절편의 제한효소 지도이며, 도 2b는 4.3kb SacI-EcoRI 절편의 제한효소 지도이고, 도 2c는 본 발명에 따른 융합유전자의 구조이다.

도 3은 벼 게놈 DNA를 RA8 cDNA로 DNA 블롯팅한 결과이다.

도 4a, 4b, 4c, 4d, 4e 및 4f는 각각 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된 벼의 어린 꽃, 초기 액포화된 꽃가루기, 성숙한 꽃, 잎, 뿌리 및 비형질전환된 벼의 꽃을 조직화학적 GUS 분석한 결과이다.

도 5a, 5b, 5c 및 5d는 각각 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된 벼의 전 감수분열기, 테트라드로부터 마이크로스포어 방출기, 액포화된 꽃가루기 및 열개 직전의 약을 조직화학적 GUS 분석한 결과이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 서열 1의 염기서열을 갖는 벼(Oryza sativaL.) 약 특이적인 유전자 및 이 유전자의 임의의 부위의 연속된 30 염기중 80% 이상이 상동성을 갖는 유전자를 제공한다.

서열 1

다른 목적에 따라, 상기 유전자중 -1196 번째 내지 240 번째 염기서열에 해당하는 하기 서열 2를 갖는 약 특이적 발현 조절인자를 제공한다.

서열 2

또다른 목적에 따라, 상기 조절인자를 포함하는 식물 발현 벡터를 제공한다.

또다른 목적에 따라, 상기 벡터를 벼의 캘러스에 도입하고 뿌리와 잎을 유도한 후 식물체로 재배하는 단계를 포함하는 형질전환된 벼의 제조 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 유전자는 벼(Oryza sativaL.)로부터 분리되고 약 특이적으로 발현하며 게놈상의 염기서열로는 서열 1로 표시된다. 서열 1에서 왼쪽 숫자는 염기서열의 위치를 나타내며, 이중 1 번은 cDNA의 개시점이다. 이 염기서열로부터 유추되는 아미노산 코딩 영역중 14 번째와 15번째 코돈사이에 134 bp 길이의 인트론 I이 존재하고 59번째 코돈에 594 bp 길이의 인트론 II가 존재하는데, 이들 모두 5'와 3' 말단에 각각 GT 및 AG 서열을 포함하고 있다. 이 코딩 영역의 5' 비코딩 서열에는 -82번째 내지 -79번째 염기 위치에 CAAT 박스 서열인 CAAT가 위치하고, -53번째 내지 -47번째 염기 위치에는 TATA 박스서열인 TATAATA가 위치하며, TGA 종료코돈으로부터 하류로 164 번째 염기서열(1736번 위치)에 폴리(A) 꼬리가 위치하고, 3' 비코딩 영역에는 AATAA 컨센서스 폴리아데닐화 시그날 서열이 위치한다. 첫 번째 ATG 주위 서열은 보고된 외떡잎식물의 번역 개시 컨센서스 서열(Joshi, C.P. et al.,Plant Mol. Biol.,35, 993-1001(1997))과도 일치한다.

상기 코딩 영역의 오픈 리딩 프레임은 264 개 아미노산으로 구성되며 서열 3의 아미노산 서열을 갖는다.

서열 3

이 오픈 리딩 프레임으로부터 유추되는 단백질은 분자량이 26.4 kDa이고 pI 값이 6.1이다. 이 단백질을 구성하는 주된 아미노산은 알라닌 21.9%, 글리신 9.9% 및 프롤린 10.2%이고, 아미노산 서열에는 이 단백질을 세포막 또는 세포외로 표적하는 역할을 할 것으로 추정되는 소수성의 N-말단 영역, 익스텐신과 유사한(extensin-like) SPPPPPP 모티프 및 글리신이 풍부한 영역이 포함되어 있다. 진뱅크(Genbank) 데이터베이스와의 상동성 분석에 따르면, 이 아미노산 서열은 현재까지 보고된 유전자와는 전혀 상동성을 보이지 않는 신규한 것이다.

본 발명의 유전자의 발현은 시-공간적으로 조절되는 특징이 있는데, 공간적으로는 벼 꽃의 약 기관에서만 발현되며 약 외의 다른 꽃 기관, 잎, 뿌리 등에서는 전혀 발현되지 않으며, 특히 약 기관중에서도 타페튬, 엔도세시움, 결합 조직에 한정되어 발현되며, 관다발 조직에서는 전혀 발현되지 않는다. 또한 시간적으로는 꽃이 성숙되어감에 따라 발현량이 증가하는데, 전 감수분열기(pre-meiosis stage)에는 거의 발현되지 않다가 테트라드(tetrad)로부터 마이크로스포어 방출기(microspore-release stage)에 발현되기 시작하여 액포화된 꽃가루기(vacuolated-pollen stage)에 가장 활발히 발현되다가, 개화 직전의 성숙한 꽃가루기(mature pollen stage)에는 발현이 급격하게 감소한다.

본 발명의 유전자는 차별적 하이브리드화 방법를 통해 얻을 수 있는데, 예를 들면 벼 약 cDNA 라이브러리를 잎 cDNA 라이브러리와 하이브리드화시킨 후 잎 cDNA 라이브러리와 음성으로 반응하는 약 특이적 유전자의 cDNA 클론을 얻을 수 있다. 또한 이 cDNA 클론을 프로브로 사용하여 벼 게놈 라이브러리와 하이브리드화시켜 양성으로 반응하는 클론을 분리하고 서브 클로닝하여 약 특이적 유전자의 게놈 클론을 얻을 수 있다. 이 유전자를 얻는 또다른 방법으로는 상기 서열 1의 염기서열을 이용하여 적절하게 프라이머를 합성한 후 통상적인 PCR 방법을 사용하는 것이다. 얻어진 유전자를 플라스미드 pBluescript SK(-) 벡터에 클로닝한 후 이를 플라스미드 pGA1173-9로 명명하였으며, 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소에 1998년 7월 29일자로 기탁번호 제 KCTC 8899P 호로 기탁하였다.

본 발명의 유전자의 약 특이적 발현을 조절하는 인자는 프로모터, 엑손 I,인트론 I 및 엑손 II의 일부를 포함하는 영역에 존재하며, 이 영역은 상기 서열 1의 염기서열중 -1196 번째 내지 240 번째의 염기 서열에 해당하는 서열 2로 표시될 수 있다. 이 조절인자는 벼 게놈 DNA 또는 플라스미드 pGA1173-9로부터 통상적인 클로닝 방법으로 얻을 수 있는데, 예를 들면 서열 2의 염기서열을 이용하여 적절하게 프라이머를 합성한 후 통상적인 PCR 방법을 수행하는 것이다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 서열 2로 표시되는 상기 조절인자를 포함하며, 이 조절인자는 다른 목적 유전자와 융합시켜 사용할 수 있다. 이때 목적 유전자로는 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS) 등의 리포터 유전자를 사용할 수도 있고, 벼 약의 비정상적인 발달을 유도할 목적으로 DT-A(세포를 파괴하는 독성 유전자), RNase 유전자 등을 사용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 발현 벡터는 상기 조절인자와 목적 유전자를 융합시킨 후 적절한 식물 발현 벡터와 연결하여 제작할 수 있는데, 예를 들면 상기 조절인자를 GUS와 리딩 프레임의 변화없이 융합한 후 식물 발현용 바이너리 벡터(binary vector) pGA1633에 연결하여 발현 벡터 pGA1647을 제작한다.

제작된 식물 발현 벡터를 통상적인 식물 형질전환 방법에 따라 벼의 캘러스에 도입하고 이로부터 뿌리와 잎의 분화를 유도한 다음 화분으로 옮겨 재배함으로써 형질전환된 벼를 얻을 수 있다.

상기 식물 형질전환 방법으로는, 아그로박테리움 매개 형질전환법, 입자사출방법 등을 들 수 있으며, 아그로박테리움 매개 형질전환법이 바람직하다. 대표적인 예로 아그로박테리움 매개 형질전환법에 의하면, 상기 발현 벡터를동결-해동법(An, G. et al., (eds)Plant Molecular Biology Manual, pp. A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht(1998))에 따라 2원 Ti 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스에 전이시킨 후 적절한 항생제가 포함된 AB 액체배지(Chilton, M-D,Pro. Natl. Acad. Sci. USA,71, 3672-3676(1974))에서 배양하고, 캘러스와 함께 1 mM 베타인(betaine)이 포함된 2N6-As 배지(Hiei, Y. et al.,Plant J.,6, 271-282(1994))에서 암조건하에 25℃, 2 내지 3일 동안 공동배양(cocultivate)한다. 공동배양된 캘러스를 세폭탁심(cefotaxime)이 포함된 멸균수로 세척한 후 적절한 항생제 및 세포탁심이 포함된 N6 배지위에서 다시 3 내지 4주 동안 배양하여 성장이 좋은 캘러스를 얻는다. 이 캘러스를 적절한 선발 배지, 예를 들어 MS 배지(Life technoloies사), 0.2㎎/ℓ NAA(naphthalen acetic acid), 2㎎/ℓ 키네틴(kinetin), 2% 솔비톨, 1.6% 피트아가(Gibco), 적절한 항생제 및 250㎎/ℓ 세포탁심을 포함하는 배지에 옮기고 30 내지 60μmol/㎡/초, 바람직하게는 40μmol/㎡/초의 연속적인 광조건하에 2 내지 3주동안 배양하여 묘목을 얻는다. 이 묘목을 화분에 심은 후 생장챔버에서 10L/14D 조건하에 재배하여 형질전환된 벼를 얻는다.

특히 상기 방법에 사용된 벡터가 본 발명의 조절인자를 DT-A 또는 RNase 유전자와 융합시킨 융합유전자를 포함하는 경우에는, 이 벡터로 형질전환된 벼는 웅성불임 형질을 갖게 된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예: 바이너리 벡터 pGA1633의 제작

리포터 유전자인 GUS와 선별 유전자인 hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제)를 포함하는 바이너리 벡터를 다음과 같이 제작하였다.

플라스미드 pGA748(An G, Binary Ti plasmid vectors, Agrobacterium protocols, Humana Press, pp. 47-58)를 BamHI과 HindIII로 절단한 후 CaMV35S 프로모터(Benfey et al.,Science,250, 959-966(1993))를 삽입하였다. 얻어진 플라스미드의 BglII 위치에 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin phosphotransferase, hph)(Gritz et al., (1983))를 삽입하였다. 이 플라스미드를 HindIII과 ClaI으로 절단하고 평활 말단으로 만든 후 연결시켰다. 얻어진 플라스미드를 SacI으로 절단하여 약 0.5kb 단편을 제거한 다음 다시 연결시겼다. 이 플라스미드의 BamHI 위치에 BamHI, HindIII, XbaI, SacI, HpaI, KpnI, ClaI 및 BglII 절단부위를 갖는 합성 어댑터를 삽입하여 플라스미드 pGA1182를 제작하였다.

이 플라스미드 pGA1182를 주형으로 하고, 하기 서열 4의 프라이머 1 및 서열 5의 프라이머 2를 사용하여 PCR을 수행하였다.

서열 4

5'-TTGGCATGCACATAC-3'

서열 5

5'-CGGGATCCGTGTTTGACAGG-3'

얻어진 약 120bp 단편을 BamHI과 SphI을 절단한 후, 플라스미드 pGA1182를 동일한 제한효소로 절단하여 얻은 약 9kb 단편에 연결시켰다. 얻어진 플라스미드의 BamHI과 ClaI 위치에 GUS 유전자(Jefferson et al., EMBO J, 6, 3901-3907(1987))를 삽입하여 바이너리 벡터 pGA1633를 제작하였다.

실시예 1: 벼 약 특이적인 유전자 RA8의 분리

(단계 1) 유전자 RA8의 분리

액포기의 벼(Oryza sativaL. Nakdong) 꽃을 세 부분으로 절단하여 완전한 약을 포함하는 중간 부분을 얻고, 이 부분으로부터 폴리(A) 퀵 mRNA 분리 키트(poly(A) Quick mRNA Isolation Kit, Stratagene사, 미국)를 이용하여 약 mRNA를 분리하였다. 이 mRNA를 주형으로 하고 ZAP-cDNA 기가팩II 골드 클로닝 키트(ZAP-cDNA GigapackII Gold Cloning Kit, Stratagene사)를 이용하여, 약 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

한편 발아후 6일된 벼 묘목의 잎에 대하여 동일한 방법으로 실시하여 잎 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

제작된 약 cDNA 라이브러리로부터 33개의 클론을 무작위로 선별한 후, 각각의 클론 DNA를 EcoRI으로 절단하여 얻은 cDNA 영역을 방사선 동위원소³²P로 표지한 다음 잎 cDNA 라이브러리 플라크와 하이브리드화시켰다.

그 결과, 6 개의 약 cDNA 클론이 잎 cDNA 라이브러리 플라크와 양성 반응을 보이지 않았으며, 이중 약 cDNA 라이브러리에 가장 풍부하게 존재하는 하나의 클론을 선별하여 RA8로 명명하였다.

이 RA8 클론으로부터 f1 헬퍼 파아지(helper phage) R408(Stratagene사)을 이용하여 생체내 절단(in vivo excision)에 의해 cDNA 단편이 삽입된 재조합 플라스미드 pGA1173-4(RA8)를 얻고, 이 플라스미드에 클로닝된 RA8 cDNA의 염기서열을 생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467(1977))에 따라 결정하였다.

이 염기서열은 하기 서열 6와 같으며, 이로부터 유추되는 아미노산 서열도 함께 나타내었다.

서열 6

서열 6에서 왼쪽 숫자는 염기서열의 위치를, 오른쪽의 숫자는 아미노산 서열의 위치를 나타낸다. 서열 6에서 보듯이, RA8 cDNA의 염기서열은 1008 bp 길이이고, 264 개 아미노산으로 이루어진 오픈 리딩 프레임 1 개를 포함한다. 이 오픈 리딩 프레임으로부터 유추되는 단백질은 26.4 kDa이고 6.1의 pI 값을 가진다.

첫 번째 ATG 주위 서열은 보고된 외떡잎식물의 번역 개시 컨센서스 서열(Joshi, C.P. et al.,Plant Mol. Biol.,35, 993-1001(1997))과도 일치하며, TGA 종료 코돈으로부터 하류로 164 번째 염기서열에는 폴리(A) 꼬리가 위치하고, 3' 비코딩 영역에는 AATAA 컨센서스 폴리아데닐화 시그날 서열이 있다.

아미노산 서열을 구성하는 주된 아미노산은 알라닌 21.9%, 글리신 9.9% 및 프롤린 10.2%이고, 아미노산 서열에는 이 단백질을 세포막 또는 세포외로 표적하는 역할을 할 것으로 추정되는 소수성의 N-말단 영역, 익스텐신과 유사한 SPPPPPP 모티프 및 글리신이 풍부한 영역이 포함되어 있다. 이 아미노산 서열을 진뱅크 데이터베이스와 상동성을 분석한 결과, 현재까지 보고된 유전자와는 전혀 상동성을 보이지 않는 신규한 유전자로 확인되었다.

(단계 2) RNA 블롯팅 분석

단계 1에서 얻은 RA8 유전자가 약 특이적으로 발현되는지를 확인하기 위하여, 벼의 잎, 뿌리, 어린 꽃, 성숙한 꽃, 꽃의 외영과 내영, 암술 및 수술에서 각각 전체 RNA를 분리한 후 전기영동하고 나이론 막으로 옮긴 다음, 방사선 동위원소³²P로 표지된 RA8 cDNA를 프로브로 사용하여 RNA 블롯팅을 수행하였다.

그 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 A는 약이고, C는 암술이며, P는 외영과 내영이고, FP는 꽃 원기(primodia)이며, YF는 어린 꽃이고, EF는 초기 액포화된 꽃가루기의 꽃이고, LF는 후기 액포화된 꽃가루기의 꽃이며, L은 잎이고, R은 뿌리이다. 도 1에서 보듯이 RA8 mRNA는 약에만 존재하며 꽃이 성숙해지면서 점차 많아지므로, RA8 유전자는 약 특이적으로 발현하며 꽃이 성숙해감에 따라 발현량이 증가함을 알 수 있다.

(단계 3) RA8 게놈 클론의 분리

벼 게놈 라이브러리(록펠러 대학의 스티브 케이와 남-하이 추아로부터 얻음, 벼 게놈 DNA가 EMBL 람다 파아지 DNA에 삽입된 형태임)의 플라크를 나일론 막(Hybond, Amersham사)에 옮긴 후 방사선 동위원소³²P로 표지된 RA8 cDNA를 프로브로 사용하여 하이브리드화하였다. 하이브리드화된 나일론 막을 X-선 필름에 노출시킨 후 양성으로 나타난 플라크로부터 파아지 클론을 얻었다.

이 파아지 클론으로부터 람다 파아지 DNA를 분리한 후 BamHI으로 절단하여 13.7kb 게놈 절편을 얻고, 이중 4.3kb SacI-EcoRI 절편을 서브 클로닝하였다.

이 13.7kb 절편과 4.3kb SacI-EcoRI 절편의 제한효소 지도는 각각 도 2a 및 2b와 같다. 도 2a 및 2b에서, A는 ApaI이고, B는 BamHI이며, H는 HindIII이고, N은 NcoI이고, P는 PstI이며, R은 EcoRI이고, S는 SacI이며, Sc는 ScaI이고, V는 EcoRV이며, X는 XhoI이고, 흰 부분은 인트론이고 검은 부분은 코딩 영역이며 회색 부분은 프로모터 및 전사종결영역이며 화살표는 전사방향을 나타낸다. 도 2a 및 2b에서 보이는 2.9 kb의 SacI 절편에는 5' 인접서열(flanking sequence)과 5'의 코딩 영역이 포함되어 있고, 인접한 1.5kb SacI-EcoRI 절편에는 나머지 코딩 영역과3' 인접서열이 포함되어 있다. 코딩 영역에는 2개의 인트론(I, II)이 존재하는데, 인트론 I은 14 번째와 15번째 코돈사이에 134 bp 길이로 존재하고 인트론 II는 59번째 코돈에 594 bp 길이로 존재하며, 모두 5'와 3' 말단에 각각 GT 및 AG 서열을 포함하고 있다. RA8 코딩 영역의 5' 인접서열에는 -82번째 내지 -79번째 염기 위치에 CAAT 박스 서열인 CAAT가 있고, -53번째 내지 -47번째 염기 위치에는 TATA 박스서열인 TATAATA가 있다.

SacI 절편을 플라스미드 pBluescript SK(-) 벡터에 클로닝하였으며 이 플라스미드를 pGA1173-9로 명명하였다. 이 플라스미드 pGA1173-9를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소에 1998년 7월 29일자로 기탁번호 제 KCTC 8899P 호로 기탁하였다.

이 플라스미드 pGA1173-9에 클로닝된 게놈 DNA 단편의 염기서열을 생거 등의 방법에 따라 분석하였으며, cDNA와 비교하여 약 2.5kb의 프로모터 영역을 결정하였다.

이상의 결과를 종합하면 서열 7와 같다.

서열 7

한편, RA8 클론의 게놈의 복합성(complexity)을 확인하기 위해, 발아후 2주된 벼의 잎으로부터 분리된 게놈 DNA을 EcoRI, HindIII 또는 PstI로 절단한 후 이절편을 RA8 cDNA로 DNA 블롯팅시켰다. 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 R은 EcoRI 절편이고, H는 HindIII 절편이며, P는 PstI 절편이다. 도 3에서 보듯이, RA8 cDNA는 벼 게놈 DNA중 하나의 밴드와 하이브리드화되므로, RA8 유전자는 벼 게놈에서 단일 카피로 존재함을 알 수 있다.

실시예 2: 식물 발현 벡터의 제조

실시예 1의 단계 3에서 얻은 플라스미드 pGA1173-9에 대해 하기 서열 6 및 7의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여, RA8 유전자의 프로모터 영역과 엑손 I, 인트론 I, 엑손 II의 일부를 포함하는 영역(서열 1중 -1196 내지 240번째 염기에 해당함)을 증폭하였다.

서열 6

AATTAACCCTCACTAAAGGG

서열 7

GCGGATCCAGGTTGAACCAC

증폭된 DNA를 제조예에서 제작된 바이너리 벡터 pGA1633의 BamHI 위치에 연결하여 식물 발현 벡터 pGA1647을 제작하였다. 이때 벡터 pGA1647에서 RA8 유래의 프로모터 내지 엑손 II 일부가 GUS 유전자 일부와 리딩 프레임의 변화없이 융합된다. 이 융합유전자의 구조를 모식적으로 나타내면 도 2c와 같다. 도 2c에서 H, N, P, R 및 V는 도 2a 및 2c에서 설명한 바와 같고, B^*는 융합을 위해 만들어진BamHI 절단부위이며, Tnos는 노팔린 합성효소(nopaline synthase)이다.

실시예 3: 형질전환된 벼의 제조

실시예 2에서 제작된 발현 벡터 pGA1647을, 동결-해동법(freeze-thaw method; An, G. et al., (eds)Plant Molecular Biology Manual, pp. A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht(1998))에 따라 2원 Ti 플라스미드 pAL4404(Hoekema et al.,Nature,303, 179-181(1983))를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Hoekema et al.,Nature,303, 179-181(1983))에 전이시켰다.

전이된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404를 30㎎/ℓ의 하이그로마이신 B와 3㎎/ℓ의 테트라사이클린이 포함된 AB 액체배지에서 3일 동안 배양한 후, 2㎎/ℓ의 2,5-D이 포함된 N6 배지(Chu, C.C. et al.,Sci. Sin.,18, 659-668(1975))에서 성숙한 씨의 스쿠텔룸(scutellum)으로부터 유도된 3주령의 캘러스와 함께 1 mM 베타인(betaine)이 포함된 2N6-As 배지(Hiei, Y. et al., Plant J., 6, 271-282(1994))에서 암조건하에 25℃, 2 내지 3일 동안 공동배양(cocultivate)하였다. 공동배양한 캘러스를 100㎎/ℓ 세폭탁심(cefotaxime)이 포함된 멸균수로 세척하고 40㎎/ℓ 하이그로마이신과 250㎎/ℓ 세포탁심이 포함된 N6 배지위에서 3주 동안 배양하였다. 성장이 좋은 하이그로마이신 저항성 캘러스를 선발 배지[MS 배지(Life technoloies사) + 0.2㎎/ℓ NAA(naphthalen acetic acid)+ 2㎎/ℓ 키네틴(kinetin) + 2% 솔비톨 + 1.6% 피트아가(Gibco) + 50㎎/ℓ 하이그로마이신 + 250㎎/ℓ 세포탁심]에 옮기고 연속적인 40μmol/㎡/초 광조건하에 2 내지 3주동안 배양하였다. 묘목을 화분에 심은 후 생장챔버에서 10L/14D 조건하에 재배하여 모두 22개의 형질전환된 벼를 얻었다.

22개의 형질전환된 벼중에서 약에서의 발현률이 가장 높은 식물주를 선별하기 위해, 형질전환된 벼의 꽃 부위를 염색용액에 20% 메탄올이 포함되도록 변형된 다이 등의 방법(Dai, Z. et al.,Plant Mol. Biol.,32, 1055-1065(1996))에 따라 조직화학적 GUS 염색을 한 후, 고정액(50% 에탄올, 5% 아세트산 및 3.7% 포름알데히드)에 담그어 고정시키고, 해부현미경(x7.5 배율)하에서 관찰하였다. 이러한 결과로부터 약에서 GUS의 발현량이 가장 큰 벼를 선별하였으며 형질전환 식물주 A11279라 명명하였다.

실시예 4: 형질전환된 벼의 조직화학적 GUS 분석

RA8 유전자의 공간-시간적 발현양상을 조사하기 위해, 실시예 3에서 얻은 형질전환 식물주 A11279의 벼에서 얻은 어린 꽃, 초기 액포화된 꽃가루기의 꽃, 성숙한 꽃, 잎 및 뿌리를, 실시예 3에서와 동일한 방법으로 조직화학적 GUS 염색 및 고정한 후 현미경 하에서 관찰하였다. 이때 대조구로는 비형질전환된 벼의 꽃을 사용하였다.

그 결과는 도 4a, 4b, 4c, 4d, 4e 및 4f와 같으며, 이들은 각각 형질전환된 벼의 어린 꽃, 초기 액포화된 꽃가루기의 꽃, 성숙한 꽃, 잎, 뿌리 및 비형질전환된 벼의 꽃이다. 도 4a, 4b, 4c, 4d 및 4e에서 보듯이, RA8 유전자는 벼 꽃의 약에서만 발현되며, 약 외의 다른 꽃 기관, 잎, 뿌리에서는 전혀 발현되지 않는다. 또한 RA8 유전자는 꽃이 성숙되어감에 따라 발현량이 증가되며, 전 감수분열기의 어린 꽃에서는 전혀 발현되지 않는다.

RA8 유전자의 벼 약 특이적 발현양상을 조사하기 위해, 성장 시기를 달리하는 4개의 벼 약을 실시예 3에서와 동일한 방법으로 염색 및 고정한 후 파라플라스트(Paraplast, Sigma사)에 포매하고 10㎛ 두께로 절단하여 박편을 얻고, 이 박편을 광학현미경(x100 배율)하에서 암시야 조명(dark-field illumination)으로 관찰하였다.

그 결과는 도 5a, 5b, 5c 및 5d와 같으며, 이들은 각각 형질전환된 벼의 전 감수분열기, 테트라드로부터 마이크로스포어 방출기, 액포화된 꽃가루기 및 열개 직전의 약을 나타내며, 붉은 색으로 염색된 부위는 GUS의 발현을 의미한다. 도 5a, 5b, 5c 및 5d에서 보듯이, RA8 유전자는 전 감수분열기에는 거의 발현되지 않으며, 마이크로스포어 방출기에 발현되기 시작하여 액포화된 꽃가루기에 가장 활발히 발현되다가, 개화 직전의 성숙한 꽃가루기에는 발현이 급격하게 감소한다. 또한 RA8 유전자는 약의 타페튬, 엔도세시움, 결합 조직에 한정되어 발현되며, 관다발 조직에서는 전혀 발현되지 않았다.

본 발명에 따른 RA8 유전자는 벼 약 특이적인 발현을 하며, 이러한 약 특이적 발현을 조절하는 인자는 이 유전자의 프로모터, 엑손 I, 인트론 I 및 엑손 II를포함하는 영역에 존재하므로, 이 영역이 목적 유전자와 융합된 융합유전자를 벼에 도입함으로써 잡종벼의 개발에 유용한 웅성불임형질을 갖는 벼를 얻을 수 있다.

Claims

하기 서열 1의 염기서열을 갖는 벼(Oryza sativaL.) 약 특이적인 유전자 및 이 유전자의 임의의 부위의 연속된 30 염기중 80% 이상이 상동성을 갖는 유전자:

서열 1
하기 서열 2를 갖는 벼(Oryza sativaL.) 약 특이적 발현 조절인자:

서열 2
제 2 항의 조절인자를 포함하는 식물 발현 벡터.
제 3 항에 있어서,

식물 발현 벡터 pGA1647.
제 3 항의 벡터를 벼의 캘러스에 도입하고 뿌리와 잎을 유도한 후 식물체로 재배하는 단계를 포함하는, 형질전환된 벼의 제조 방법.