DE69929457T2

DE69929457T2 - Dna mit staubbeutel spezifisch exprimiertem gen aus reis und damit transformierte transgene pflanze

Info

Publication number: DE69929457T2
Application number: DE69929457T
Authority: DE
Inventors: Gynheung Pohang AN; Jong-Seong Davis JEON; Yong-Yoon Daechi-dong CHUNG; Sichul Lee
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1998-11-03
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2019-11-03
Also published as: JP2002528125A; EP1127143A2; AR021056A1; RU2004128482A; EP1127143B1; ID29567A; WO2000026389A2; RU2245921C2; CN1185350C; AU1268700A; PL348100A1; ES2251845T3; TR200101137T2; AU759042B2; IL142633A0; CA2347675A1; DE69929457D1; KR20010085990A; US20040060084A1; BR9914955A

Description

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der pflanzlichen Gentechnik. Sie betrifft primär neue DNA-Sequenzen, die als Promotoren der staubbeutelspezifischen Transkription von codierenden DNA-Sequenzen in rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen fungieren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante oder chimäre DNA-Sequenzen, die spezifisch im Staubbeutel einer Pflanze exprimiert werden. Die rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen können zur Schaffung von transgenen Pflanzen verwendet werden, aber speziell von transgenen männlich-sterilen Pflanzen.
Die Schaffung von männlich-sterilen Pflanzen ist von wirtschaftlichem Interesse in der Herstellung von Hybridsamen. Männliche Sterilität verhindert die Selbstbestäubung, die ansonsten in vielen Pflanzenarten auftritt und die Züchtung und Hybridsaatgutproduktion behindert. Der Staubbeutel ist das männliche Fortpflanzungsorgan von Blütenpflanzen, der aus verschiedenen Geweben wie dem Tapetum, Endothezium, Bindegeweben, Leitgeweben etc. zusammengesetzt ist, und ist für die Erzeugung von Pollen verantwortlich. Die Staubbeutelentwicklung kann in zwei allgemeine Phasen unterteilt werden. Während der Phase 1 wird die Morphologie des Staubbeutels eingerichtet, und Mikrosporen-Mutterzellen erfahren eine Meiose, wodurch Tetraden von Mikrosporen erzeugt werden. Während der Phase 2 differenzieren Pollenkörner und Staubbeutel, und die Gewebedegeneration, das Aufplatzen und die Pollenkornfreisetzung erfolgen. Unter den vielen verschiedenen Genen, die an diesen Entwicklungen beteiligt sind, ist nur ein geringer Bruchteil staubbeutelspezifisch. Staubbeutelspezifische Gene, die bislang angegeben wurden, schließen Osc4-, Osc6-, YY1- und YY2-Gene von Reis [Y. Hihara et al., Plant Mol. Biol., 30: 1181–1193 (1996); T. Tsuchiya et al., Plant Mol. Biol., 26: 1737–1747 (1994)], TA29- und TA32-Gene von Tabak [A. M. Koltunow et al., Plant Cell, 2: 1201–1224 (1990)], SF2- und SF18-Gene von der Sonnenblume [C. Domon et al., Plant Mol. Biol., 15: 643–646 (1990)], 108-Gene der Tomate [A. G. Smith et al., Mol. Gen. Genet. 222: 9–16 (1990)], NTM-19 von Tabak [M. T. Oldenhof et al., Plant Mol. Biol. 31: 213–225 (1996)] und BA42-, BA112- und A9-Gene von Brassica napus [R. Scott et al., Plant Mol. Biol. 17: 195–207 (1991); J. B. Shen et al., Mol. Gen. Genet. 234: 379–389 (1992)] ein. Einiger dieser Gene werden ausschließlich in Sporophytengewebe der Staubbeutel gefunden, andere sind pollenkornspezifisch oder sind sowohl in Sporophyten- als auch Gametophytengeweben der Staubbeutel vorhanden.
Reis ist ein Beispiel für eine Pflanze, die sich durch Selbstbestäubung vermehrt. Es ist schwierig Hybridreis allein durch Fremdbestäugung zu entwickeln. Zur Erleichterung der Herstellung von Hybridreis durch Fremdbestäubung wird ein Verfahren im Stand der Technik beschrieben, in dem die Staubbeutel aus Reisblüten entfernt werden, um männlich-sterilen Reis zu erzeugen, und dann Pollen aus einer anderen Reispflanze darauf übertragen werden. Jedoch besteht ein Problem darin, daß ein solches Verfahren einen großen Zeitaufwand und große Anstrengung erfordert.
Daher haben die vorliegenden Erfinder zur Erzeugung von Reis oder einer beliebigen anderen selbstbestäubenden Pflanze mit männlich-steriler Eigenschaft ohne die oben beschriebenen Probleme des Standes der Technik zunehmende Anstrengungen unternommen, um ein Verfahren unter Verwendung eines Gens zu entwickeln, das eine abnormale Entwicklung des Staubbeutels induziert.
Die Erfindung stellt somit ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 bereit. Auch offenbart werden DNA-Moleküle und Verfahren zur spezifischen Expression einer codierenden Region von Interesse im Tapetum, Endothezium und Bindegeweben von Staubbeuteln, aber nicht in Mikrosporen oder Pollen, worin die Expression der codierenden Sequenz von Interesse im Tetradenstadium beginnt und eine maximale Stärke im vakuolisierten Pollenstadium erreicht. Insbesondere werden DNA-Moleküle und Verfahren bereitgestellt, worin

– die DNA eine Nukleotidsequenz mit wenigstens 50%, insbesondere 65%, ganz besonders 80% und ganz speziell 90% oder mehr Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz umfaßt,
– die erfindungsgemäße DNA die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotidsequenz umfaßt,
– die DNA-Moleküle spezifisch geschaffen sind, so daß die codierende Sequenz in der Antisense-Orientierung ist.

Die Erfindung stellt ferner DNA-Moleküle und Verfahren bereit, worin die codierende Sequenz eine Polypeptid codiert, das die Bildung von lebensfähigem Pollen bei Expression in den Staubbeutelzellen unterbrechen wird. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung codiert die codierende Sequenz ein Polypeptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus RNase, DTA, TURF-13, Pectatlyase, Ginrekombinase, iaaL und cytA-Toxin besteht.
Ferner offenbart werden DNA-Moleküle und Verfahren wie zuvor genannt, worin die DNA-Sequenz der Erfindung mehr als 80%, insbesondere 90% und ganz besonders 95% Sequenzidentität in den 30 aufeinanderfolgenden Basen jedes Orts von SEQ ID NO: 1 hat.
Die Erfindung stellt ferner DNA-Moleküle bereit, die eine Promotorsequenz umfassen, die die Expression einer assoziierten codierenden Sequenz spezifisch im Tapetum, Endothezium und Bindegewebe der Staubbeutel, aber nicht in den Mikrosporen oder Pollen antreiben kann, worin die Expression der codierenden Sequenz im Tetradenstadium beginnt und eine maximale Stärke im vakuolisierten Pollenstadium erreicht.
Insbesondere stellen wir hier Verfahren und DNA-Moleküle wie zuvor genannt bereit, worin

– die Promotorsequenz 50%, insbesondere 65%, ganz besonders 80% und ganz spezifisch 90% oder mehr Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 hat,
– die Promotorsequenz die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Nukleotidsequenz hat,
– die Promotorsequenz eine zusätzliche Sequenz umfaßt, die operativ mit einer codierenden Sequenz von Interesse verbunden werden kann,
– die zusätzliche Sequenz eine Sequenz mit 50%, insbesondere 65%, ganz besonders 80% und ganz spezifisch 90% oder mehr Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 10 umfaßt,
– die zusätzliche Sequenz SEQ ID NO: 10 umfaßt,
– die Promotorsequenz und zusätzliche Sequenz 50%, insbesondere 65%, ganz besonders 80% und ganz spezifisch 90% oder mehr Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 haben,
– die Promotorsequenz und zusätzliche Sequenz durch die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 gekennzeichnet sind.

Zusätzlich werden DNA-Moleküle bereitgestellt, worin der Promotor ein aus SEQ ID NO: 2 erhältliches Fragment umfaßt, bevorzugt ein Fragment, das die Expression einer assoziierten codierenden Sequenz spezifisch im Tapetum, Endothezium und Bindegewebe von Staubbeuteln, aber nicht in Mikrosporen oder Pollen antreiben kann, worin die Expression der codierenden Sequenz im Tetradenstadium beginnt und eine maximale Stärke im vakuolisierten Pollenstadium erreicht. Auch offenbart werden DNA-Moleküle, die ein offenes Leseraster umfassen, das ein Protein codiert, das durch eine Aminosäuresequenz mit 50%, insbesondere 65%, ganz besonders 80% und ganz spezifisch 90% oder mehr Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 4 gekennzeichnet ist. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung codiert das offene Leseraster ein Protein, das durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 gekennzeichnet ist. Ferner offenbart wird ein DNA-Molekül, das durch SEQ ID NO: 7 gekennzeichnet ist.
Zusätzlich bereitgestellt werden Expressionsvektoren, die eine erste Expressionskassette, die eine DNA der Erfindung zur Expression in einem Wirtsorganismus wie einem Mikroorganismus oder einer Pflanze und gegebenenfalls eine zweite Expressionskassette umfassen, die ein Gen von Interesse umfaßt. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung umfaßt die zweite Expressionskassette ein Markergen.
Die Erfindung stellt ferner das durch das wie hier zuvor erwähnte offene Leseraster codierte Protein bereit.
Zusätzlich werden transgene Pflanzen und Pflanzenmaterial und die geschlechtliche und/oder ungeschlechtliche Nachkommenschaft davon bereitgestellt, die mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz transformiert wurden. Insbesondere stellt die Erfindung bereit:

– eine transgene, männlich-sterile Pflanze, die mit einer DNA-Sequenz der Erfindung transformiert wurde,
– eine transgene Pflanzen oder Pflanzenmaterial gemäß der Erfindung, worin die Pflanze Reis, Weizen, Mais, Sorghum bicolor oder Knaulgras ist.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, die eine DNA umfaßt, die eine Promotorsequenz und assoziierte codierende Sequenz umfaßt, worin die Promotorsequenz die Expression der codierenden Sequenz spezifisch im Tapetum, Endothezium und Bindegeweben von Staubbeuteln, aber nicht in Mikrosporen oder Pollen antreibt, und worin die Expression der codierenden Sequenz im Tetradenstadium beginnt und eine maximale Stärke im vakuolisierten Pollenstadium erreicht. Insbesondere ein Verfahren, worin die Pflanze Reis, Weizen, Mais, Sorghum bicolor oder Knaulgras ist.
Der Aufbau und die Funktion der Erfindung
Auch offenbart wird ein staubbeutelspezifisches Gen aus Reis (Oryza sativa L.) mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Basensequenz und einem Gen mit mehr als 80% Sequenzidentität in den aufeinanderfolgenden 30 Basen jedes Orts auf dem Gen. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung den staub beutelspezifischen Expressionsregulator bereit, der eine Promotorsequenz und zusätzliche Sequenz mit SEQ ID NO: 2 umfaßt, entsprechend den Basensequenzen zwischen –1196 und 240 in dem Gen, dargestellt durch nt 1 bis nt 1436 von SEQ ID NO: 1.
Die vorliegende Erfindung stellt auch den staubbeutelspezifischen Expressionspromotor mit SEQ ID NO: 3 bereit, entsprechend den Basensequenzen zwischen –1196 und –1 in dem Gen, dargestellt durch nt 1 bis nt 1196 von SEQ ID NO: 1.
Definitionen
Um ein klares und einheitliches Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche sicherzustellen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt:
Chimär: wird zum Anzeigen verwendet, das eine DNA-Sequenz, wie zum Beispiel ein Vektor oder ein Gen, mehr als eine DNA-Sequenz unterschiedlichen Ursprungs umfaßt, die zusammen durch rekombinante DNA-Techniken fusioniert sind, was zu einer DNA-Sequenz führt, die nicht natürlich vorkommt und die insbesondere nicht in der zu transformierenden Pflanze vorkommt.
Expression: bezeichnet die Transkription und/oder Translation eines endogenen Gens oder eines Transgens in Pflanzen. Im Falle von zum Beispiel Antisense-Konstrukte kann Expression die Transkription nur der Antisense-DNA bezeichnen.
Gen: bezeichnet eine codierende Sequenz und assoziierte regulatorische Sequenz, worin die codierende Sequenz zu RNA transkribiert wird, wie zum Beispiel mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, Sense-RNA oder Antisense-RNA. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind Promotorsequenzen, 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen und Terminationssequenzen. Weitere Elemente, die vorhanden sein können, sind zum Beispiel Introns.
Markergen: bezeichnet ein Gen, das ein selektierbares oder durchmusterbares Merkmal codiert.
nt: Abkürzung für "Nukleotid".
Operativ gebunden an/assoziiert mit: eine regulatorische DNA-Sequenz wird als "operativ gebunden an" oder "assoziiert mit" einer DNA-Sequenz bezeichnet, die für eine RNA oder ein Protein codiert, falls die zwei Sequenzen so angeordnet sind, daß die regulatorische DNA-Sequenz die Expression der codierenden DNA-Sequenz beeinflußt.
Pflanze: bezeichnet jede Pflanze, insbesondere Samenpflanzen.
Pflanzenmaterial: bezeichnet Blätter, Stengel, Wurzeln, Blüten oder Blütenteile, Früchte, Pollen, Pollenschläuche, Samenanlagen, Embryosäcke, Eizellen, Zygoten, Embryos, Samen, Schnittlinge, Zell- oder Gewebekulturen oder einen beliebigen anderen Teil oder ein beliebiges anderes Produkt einer Pflanze.
Promotor: bezeichnet eine DNA-Sequenz, die die Transkription einer assoziierten DNA-Sequenz einleitet. Die Promotorregion kann auch Elemente einschließen, die als Regulatoren der Genexpression wirken, wie zum Beispiel Aktivatoren, Verstärker und/oder Repressoren.
Rekombinantes DNA-Molekül: eine Kombination von DNA-Sequenzen, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Technik zusammen verbunden werden.
Rekombinante DNA-Technik: Verfahren, die zum Verbinden von DNA-Sequenzen verwendet werden, wie zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Durchmusterbares Markergen: bezeichnet ein Gen, dessen Expression keinen selektiven Vorteil auf eine transformierte Zelle überträgt, aber dessen Expression die transformierte Zelle phänotypisch unterschiedlich von untransformierten Zellen macht.
Selektierbares Markergen: bezeichnet ein Gen, dessen Expression in einer Pflanzenzelle der Zelle einen selektiven Vorteil gibt. Der von den mit dem selektierbaren Markergen transformierten Zellen besessene selektive Vorteil kann auf ihrer Fähigkeit zum Wachsen in Gegenwart eines negativen selektiven Mittels, wie zum Beispiel eines Antibiotikums oder Herbizids, im Vergleich zum Wachstum von nicht-transformierten Zellen beruhen. Der von den transformierten Zellen besessene selektive Vorteil, verglichen mit nicht-transformierten Zellen, kann auch auf ihrer gesteigerten oder neuen Fähigkeit zur Verwendung einer hinzugegebenen Verbindung als Nährmittel, Wachstumsfaktor oder Energiequelle beruhen. Selektierbares Markergen bezeichnet auch ein Gen oder eine Kombination von Genen, deren Expression in einer Pflanzenzelle der Zelle beides gibt, einen negativen und einen positiven selektiven Vorteil.
Sequenzidentität: Der Prozentwert der Sequenzidentität wird unter Verwendung von Computerprogrammen bestimmt, die auf dynamischen Programmierungsalgorithmen beruhen. Computerprogramme, die im Umfang der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, schließen die BLAST-(Basic Local Alignment Search Tool)Suchprogramme ein, die zum Erforschen aller verfügbaren Sequenzdatenbanken geschaffen sind, unabhängig davon, ob die Suche ein Protein oder eine DNA ist. Version BLAST 2.0 (Gapped BLAST) dieses Recherchewerkzeugs wurde öffentlich im Internet verfügbar gemacht (derzeit htt://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/). Es verwendet einen heuristischen Algorithmus, der lokal im Gegensatz zu globalen Angleichungen sucht und deshalb Beziehungen unter Sequenzen detektieren kann, die nur isolierte Regionen teilen. Die in einer BLAST-Suche zugewiesenen Bewertungen haben eine wohldefinierte statistische Interpretation. Die Programme werden bevorzugt mit auf die Standardwerte eingestellten optionalen Parametern laufen gelassen.
Transformation: bezeichnet die Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle. Insbesondere bezeichnet sie die stabile Integration eines DNA-Moleküls in das Genom eines Organismus von Interesse.
Kurze Beschreibung der Sequenzen im Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 1 – Nukleotidsequenz des RA8-Gens aus Reis
SEQ ID NO: 2 – staubbeutelspezifischer Expressionsregulator, der den RA8-Promotor plus das erste Exon, erste Intron und Teil von Exon 2 umfaßt
SEQ ID NO: 3 – RA8-Promotor
SEQ ID NO: 4 – abgeleitete Aminosäuresequenz des durch das RA8-Gen aus Reis codierten Proteins
SEQ ID NO: 5 – Primer 1
SEQ ID NO: 6 – Primer 2
SEQ ID NO: 7 – RA8-cDNA-Sequenz
SEQ ID NO: 8 – PCR-Primer
SEQ ID NO: 9 – PCR-Primer
SEQ ID NO: 10 – Nukleotidsequenz des ersten Exonxs, ersten Introns und Teils aus Exon 2 aus dem RA8-Gen aus Reis

Hinterlegungen
Die Hinterlegung erfolgte beim Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, der angegliederten Organisation des Korea Advanced Institute of Science and Technologoy (KAIST).
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Das Gen der vorliegenden Offenbarung wird aus Reis (Oryza sativa L.) isoliert, exprimiert spezifisch im Staubbeutel, und seine Gensequenz ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die cDNA-Sequenz des RA8-Gens ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt. Ein Vergleich der cDNA- und genomischen Sequenzen zeigt die Gegenwart von 2 Introns und 3 Exons in der codierenden Sequenz des RA8-Gens. Intron 1 mit 134 bp befindet sich zwischen dem 14. und 15. Codon, entsprechend nt 1289 bis nt 1422 von SEQ ID NO: 1 und entsprechend nt 1556 bis nt 2149 von SEQ ID NO: 1, und Intron 2 mit 594 bp befindet sich am 59. Codon in der Aminosäure-codierenden Region, die aus den Basensequenzen abgeleitet ist, entsprechend nt 1556 bis nt 2149 von SEQ ID NO: 1. Beide Introns enthalten die Consensus-GT- und -AG-Sequenzen an den 5'- bzw. 3'-Enden. In bezug auf SEQ ID NO: 1 sind die drei Exons wie folgt lokalisiert: Exon 1: nt 1247 bis nt 1288; Exon 2: nt 1423 bis 1555; Exon 3: nt 2150 bis nt 2766. In der 5'-nicht-codierenden flankierenden Sequenz der codierenden Region befindet sich eine CAAT-Box-Sequenz, CAAT, in der Basenposition –82 bis –79, entsprechend nt 1116 bis nt 1119 von SEQ ID NO: 1, und eine TATA-Box-Sequenz, TATAATA, befindet sich in Basenposition –53 bis –47, entsprechend nt 1145 bis nt 1151 von SEQ ID NO: 1. Der Poly(A)-Schwanz befindet sich an der 164. Base (Nukleotid 2932 von SEQ ID NO: 1) stromabwärts des TGA-Translationsterminationscodons. In der 3'-nicht-codierenden Region ist die AATAA-Consensus-Polyadenylierungsignalsequenz vorhanden. Die das erste ATG umgebende Sequenz paßt gut mit der Translationsstart-Consensus-Sequenz von einkeimblättrigen Pflanzen zusammen, wie in der Literatur angegeben [C. P. Joshi et al., Plant Mol. Biol., 35: 993–1001 (1997)].
Ein offenes Leseraster der codierenden Region besteht aus 264 Aminosäureresten und hat eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4. Ein aus dem offenen Leseraster abgeleitetes Protein hat eine Molekülmasse von 26,4 kDa und einen pI von 6,1. Hauptaminosäuren, die das Protein aufbauen, sind Alanin (21,9%), Glycin (9,9%) und Prolin (10,2%), und die Aminosäuresequenz daraus enthält eine hydrophobe N-terminale Region, die an der Ausrichtung des Proteins in eine Membranfraktion oder den extrazellulären Raum beteiligt sein kann, ein Extensin-artiges SPPPPPP-Motiv und eine glycinreiche Region. Gemäß einer Homologieanalyse mit Genebank-Datenbanken ist eine solche Aminosäuresequenz neu und zeigt keine signifikante Sequenzidentität mit irgendwelchen bislang angegebenen Genen.
Die Expression des erfindungsgemäßen Gens ist dadurch gekennzeichnet, daß sie zeitlich und räumlich reguliert ist. Das räumliche Expressionsmuster schließt ein, daß das Gen nur im Staubbeutelorgan der Reisblüte exprimiert wird, aber nicht in anderen Blütenorganen als den Staubbeuteln, Blättern und Wurzeln etc., und speziell im Staubbeutelorgan wird es nur im Tapetum, Edothezium und Bindegeweben, aber nicht in Leitgefäßen exprimiert. Das zeitliche Expressionsmuster schließt ein, daß die Expressionsstärken des Gens zunehmen, wenn die Blüten reifen, wobei das Gen kaum im Prä-Meiose-Stadium exprimiert wird, aber seine Expression ist zuerst detektierbar zum Zeitpunkt, wenn Mikrosporen aus Tetraden freigesetzt werden. Die maximalen Stärken werden im vakuolisierten Pollenstadium beobachtet und nehmen scharf im reifen Pollenstadium unmittelbar vor dem Blühen ab.
Das erfindungsgemäße Gen kann mittels differentieller Hybridisierungsverfahren erhalten werden. Zum Beispiel durch ein Verfahren, das das Hybridisieren einer Staubbeutel-cDNA-Bibliothek mit einer cDNA-Bibliothek mit Nicht-Staubbeutelursprung, wie zum Beispiel aus Blättern, Wurzeln oder Sämlingen, und danach das Erhalten des cDNA-Klons eines staubbeutelspezifischen Gens umfaßt, das negativ mit der cDNA-Bibliothek mit Nicht-Staubbeutelursprung reagiert. Zusätzlich wird der erhaltene cDNA-Klon als Sonde verwendet, um ihn mit einer genomischen Bibliothek zu hybridisieren und einen Klon zu isolieren, der positiv damit reagiert, und ihn zu subklonieren, um einen genomischen Klon des staubbeutelspezifischen Gens zu erhalten. Ein anderes Verfahren zum Erhalten des Gens schließt ein Verfahren ein, in dem die Basensequenzen von SEQ ID NO: 1 zur Synthese eines geeigneten Primers für ein herkömmliches PCR-Verfahren verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird das erhaltene Gen in einen pBluescript SK(–)-Vektor kloniert und als Plasmid pGA1173-9 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde beim Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, der angegliederten Organisation des Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), unter der Hinterlegungs-Nr. KCTC 8899P am 29. Juli 1998 hinterlegt.
Die den RA8-Promotor enthaltende Region ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt, entsprechend nt 1 bis nt 1196 von SEQ ID NO: 1. Die transkribierten Nukleotide des RA8-Gens beginnen bei Position 1197 von SEQ ID NO: 1. Ein Element, das die staubbeutelspezifische Expression des Gens der vorliegenden Erfindung reguliert, befindet sich in der Region, die den Promotor, Exon 1, Intron 1 und einen Teil von Exon 2 enthält, und eine solche Region kann als SEQ ID NO: 2 dargestellt werden, entsprechend der Basensequenz zwischen nt 1 und nt 1436 in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1. Dieses regulatorische Element kann durch ein herkömmliches Klonierungsverfahren aus der genomischen DNA aus Reis oder aus Plasmid pGA1173-9 erhalten werden, worin zum Beispiel die Basensequenz von SEQ ID NO: 2 zur Synthese des geeigneten Primers verwendet wird und danach ein herkömmliches PCR-Verfahren durchgeführt wird.
Der Pflanzenexpressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthält zum Beispiel das wie in SEQ ID NO: 2 gezeigte regulatorische Element, worin der staubbeutelspezifische Expressionsregulator mit einem anderen Gen von Interesse fusioniert ist. Als gewünschtes Gen kann ein Reportergen, wie zum Beispiel beta-Glucuronidase (GUS), verwendet werden, und für den Zweck der Induzierung einer abnormalen Entwicklung der Reis-Staubbeutel können DTA (ein toxisches Gen, das Zellen sprengt), RNase-Gen, etc. verwendet werden (siehe unten), aber das Gen von Interesse sollte darauf nicht beschränkt sein. Der Pflanzenexpressionsvektor kann eine zweite Expressionskassette enthalten, die ein Markergen umfaßt, um die Selektion von Transformanten zu erlauben. Beispiele für selektierbare oder durchmusterbare Markergene werden nachfolgend beschrieben. Für bestimmte Zielarten können unterschiedliche Antibiotika- oder Herbizidselektionsmarker bevorzugt sein. Selektionsmarker, die routinemäßig in der Transformation verwendet werden, schließen das nptII-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin, Paromomycin, Geneticin und verwandte Antibiotika verleiht (Vieira and Messing, 1982, Gene 19: 259–268; Bevan et al., 1983, Nature 304: 184–187), das bakterielle aadA-Gen (Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4083–4089), das Aminoglycosid 3'-Adenylyltransferase codiert und Resistenz gegen Streptomycin oder Spectinomycin verleiht, das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochlinger und Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 2929–2931), und das dhfr-Gen ein, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis und Jarry, 1983, EMBO J. 2: 1099–1104). Andere zu verwendende Marker schließen ein Phophinothricinacetyltransferase-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18: 1062; Spencer et al. 1990, Theor. Appl. Genet. 79: 625–631), ein mutiertes EPSP-Synthasegen, das Glyphosatresistenz verleiht (Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6: 915–922), ein mutiertes Acetolactatsynthase-(ALS)-Gen, das Imidazolinon- oder Sulfonylharnstoff-Resistenz verleiht (Lee et al., 1988, EMBO J. 7: 1241–1248), ein mutiertes psbA-Gen, das Resistenz gegen Atrazin verleiht (Smeda et al., 1993, Plant Physiol. 103, 911–917), oder ein mutiertes Protoporphyrinogenoxidase-Gen wie in EP 0 769 059 beschrieben ein. Selektionsmarker, die zu einer positiven Selektion führen, wie ein Phosphomannose-Isomerase-Gen, wie in WO 93/05163 beschrieben, werden auch verwendet. Die Identifizierung von transformierten Zellen kann auch durch die Expression von durchmusterbaren Markergenen erreicht werden, wie zum Beispiel von Genen, die für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Glucuronidase (GUS), Luciferase oder grünes fluoreszentes Protein (GFP) oder jedes andere Protein codieren, das der transformierten Zelle ein phänotypisch besonders Merkmal verleiht.
Der Expressionsvektor kann durch Fusionieren des staubbeutelspezifischen Expressionsregulators mit dem gewünschten Gen und danach Ligieren an einen geeigneten Pflanzenexpressionsvektor konstruiert werden. Zum Beispiel wird das regulatorische Element mit GUS ohne Veränderungen des Leserasters fusioniert, und das fusionierte Produkt wird dann an einen binären Vektor pGA1633 ligiert, der in Pflanzen exprimiert werden kann, um einen Expressionsvektor pGA1647 zu konstruieren.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren gemäß Anspruch 14 bereit.
Die rekombinanten DNA-Sequenzen der Erfindung können in die Pflanzenzelle durch eine Anzahl wohlbekannter Verfahren eingeführt werden. Die Fachleute werden einsehen, daß die Wahl eines solchen Verfahrens von der Art der Pflanze abhängen kann, die für die Transformation beabsichtigt ist, das heißt einkeimblättrig oder zweikeimblättrig. Geeignete Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen schließen die Mikroinjektion (Crossway et al., 1986, Bio Techniques 4: 320–334), Elektroporation (Riggs und Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 5602–5606), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6: 915–922; EP 0 853 675 ), den direkten Gentransfer (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717–2722) und die ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen ein, die erhältlich sind von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (siehe z.B. US-PS 4,945,050 und McCabe et al., 1988, Bio/Technology 6: 923–926). Die zu transformierenden Zellen können differenzierte Blattzellen, embryogene Zellen oder jeder andere Zelltyp sein.
In der direkten Transformation von Protoplasten kann die Aufnahme von exogenem genetischem Material in einen Protoplasten durch die Verwendung eines chemischen Mittels oder eines elektrischen Feldes gesteigert werden. Das exogene Material kann dann in das Kerngenom integriert werden. Die frühere Arbeit wurde in zweikeimblättrigen Tabakpflanzen durchgeführt, was dazu führte, daß die Fremd-DNA eingeführt und auf Nachkommenschaftspflanzen übertragen wurde (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2712–2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 169–177). Einkeimblättrige Protoplasten, zum Beispiel von Triticum monococcum, Lolium multiflorum (Italienisches Weidelgras), Mais und schwarzem mexikanischem Zuckermais, werden durch dieses Verfahren transformiert. Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform ist das Protoplastentransformationsverfahren für Mais wie in EP 0 292 435 sowie in EP 0 846 771 offenbart. Für die Maistransformation siehe auch Koziel et al., 1993, Bio/Technology 11: 194–200. Die Transformation von Reis kann durch direkte Gentransfertechniken unter Verwendung von Protoplasten oder Partikelbombardierung durchgeführt werden. Die Protoplasten-vermittelte Transformation wird für Japonica- und Indica-Typen beschrieben (Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep., 7: 379–384; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274–276; Datta et al., 1990, Bio/Technology 8: 736–740). Die beiden obigen Typen sind auch routinemäßig transformierbar unter Verwendung der Partikelbombardierung (Christou et al., 1991, Bio/Technology 9: 957–962). EP 0 332 581 beschreibt Techniken zur Erzeugung, Transformation und Regeneration von Pooideae-Protoplasten. Diese Techniken erlauben die Transformation aller Pooideae-Pflanzen, einschließlich Dactylis und Weizen. Außerdem wird die Weizen-Transformation in EP 0 674 715 beschrieben; und von Weeks et al., 1993 (Plant Physiol. 102: 1077–1084).
Der so konstruierte Pflanzenexpressionsvektor kann zum Beispiel in die Kalli von Reis gemäß dem herkömmlichen Pflanzentransformationsverfahren eingeführt werden, und die Differenzierung von Wurzeln und Blättern wird daraus induziert und kann dann auf einen Blütentopf zur Kultivierung übertragen werden, um dadurch den transformierten Mais zu erhalten.
Das bevorzugte Verfahren zur Transformation von Pflanzen ist die Agrobacterium-vermittelte Transformation. Gemäß der Agrobacterium-vermittelten Transformation als repräsentatives Beispiel wird der Expressionsvektor PGA1647 auf Agrobacterium tumefaciens, das das binäre Ti-Plasmid trägt, unter Verwendung des Gefrier-Auftau-Verfahrens übertragen (G. An et al. (Hrsg.), Plant Molecular Biology Manual, S. A3/1–A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1998)) und dann in einem AB-Flüssigmedium kultiviert, das mit den geeigneten Antibiotika ergänzt ist (M.-D. Chilton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3672–3676 (1974)), und das so erhaltene Produkt wird mit Kalli auf einem 2N6-As-Medium, das mit 1 mM Betain ergänzt ist (Y. Hiei et al., Plant J. 6, 271–282 (1994)), in der Dunkelheit bei 25°C für 2–3 Tage co-kultiviert. Die co-kultivierten Kalli werden mit sterilem Wasser, das Cefotaxim enthält, gewaschen und erneut auf einem N6-Medium, das ein geeignetes Antibiotikum und Cefotaxim enthält, für 3–4 Wochen inkubiert, um aktiv wachsende Kalli zu erhalten. Diese Kalli werden auf ein geeignetes Selektionsmedium übertragen, zum Beispiel MS-Medien (Life Technologies), ergänzt mit 0,2 mg/l NAA (Naphthalinessigsäure), 2 mg/l Kinetin, 2% Sorbit, 1,6% Phytagar (Gibco), dem geeigneten Antibiotikum und 250 mg/l Cefotaxim, und dann für 2–3 Wochen unter kontinuierlichen Lichtbedingungen von 30–60 μmol/m²/s, bevorzugt 40 μmol/m²/s, kultiviert, um Pflänzlinge zu erhalten. Diese Pflänzlige werden ausgetopft und in einer Wachstumskammer unter der Bedingung von 10 h Licht/14 h Dunkelheit kultiviert, um den transgenen Reis zu erhalten.
Für den Fall, daß der im Verfahren verwendete Vektor das fusionierte Gen aus dem regulatorischen Element der vorliegenden Erfindung und DTA- oder RNase-Genen etc. enthält, hat die mit dem Vektor transformierte Pflanze die männlich-sterile Eigenschaft.
Die codierende DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung kann jede DNA-Sequenz sein, die ein gewünschtes Polypeptid codiert. Speziell bevorzugt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind jedoch codierende DNA-Sequenzen, die ein Produkt von Polypeptid codieren, das bei Expression in Staubbeutelgewebe die Pflanze dazu führt, keinen lebensfähigen Pollen zu erzeugen. Beispiele für solche codierenden DNA-Sequenzen schließen die Gene ein, die in den folgenden Literaturstellen beschrieben werden:

a) Gen der Diphtheria-Toxin A-Kette (DTA), das die Proteinsynthese hemmt (Greenfield et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 6853; Palmiter et al., 1987, Cell 50: 435–443);
b) Pectatlyase-Gen peIE aus Erwinia chrysanthemi EC16, das Pectin abbaut, was zur Zelllyse führt (Keen et al., 1986, J. Bacteriology 168: 595);
c) T-urf13-(TURF-13)-Gen aus mitochondrialen Genomen aus cms-T-Mais: dieses Gen codiert ein als URF13 bezeichnetes Polypeptid, das mitochondriale oder Plasmamembranen zerstört (Braun et al., 1990, Plant Cell 2: 153; Dewey et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 5374 und Dewey et al., 1986, Cell 44: 439);
d) Gin-Rekombinasegen aus dem Phagen Mu-Gen, das eine ortsspezifische DNA-Rekombinase codiert, die zu Genomumlagerungen und Verlust an Zellebensfähigkeit bei Expression in Pflanzenzellen führen wird (Maeser et al., 1991, Mol. Gen Genet. 230: 170–176);
e) Indolessigsäure-Lysinsynthetase-Gen (iaaL) aus Pseudomonas syringae, das ein Enzym codiert, das Lysin an Indolessigsäure (IAA) konjugiert. Bei Expression in den Zellen von Pflanzen verursacht es eine veränderte Entwicklung aufgrund der Entfernung von IAA aus der Zelle über Konjugation (Romano et al., 1991, Genes and Development 5: 438–446; Spena et al., 1991, Mol. Gen Genet. 227: 205–212; Roberto et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5795–5801) und
f) CytA-Toxin-Gen aus Bacillus thuringiensis israeliensis, das ein moskitozides und hämolytisches Protein codiert. Bei Expression in Pflanzenzellen verursacht es den Tod der Zelle aufgrund der Zerstörung der Zell membran (McLean et al., 1987, J. Bacteriology 169: 1017–1023; Ellar et al., US-PS 4,918,006, 1990).

Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird jetzt in größerem Detail unter Verweis auf die Beispiele beschrieben, aber dies sollte nicht als Beschränkung für den Umfang der vorliegenden Erfindung aufgefaßt werden.
Beispiel 1: Isolierung von Reisstaubbeutel-spezifischem Gen, RA8
Schritt 1: Isolierung des RA8-Gens
Reis-(Oryza sativa L. Nakdong)-Blüten im späten vakuolisierten Stadium werden in drei Teile unterteilt. Der mittlere Teil, der intakte Staubbeutel und Teile der Palea und Lemma enthält, wird als Staubbeutel-angereicherte Probe verwendet. Aus diesem Teil wird Staubbeutel-angereicherte mRNA unter Verwendung des Poly(A)-Quick-mRNA-Isolation-Kit (Stratagene, USA) isoliert. Die Staubbeutel-cDNA-Bibliotheken werden mit dem ZAP-cDNA Gigapack 2 Gold Cloning Kit (Stratagene) konstruiert, das die mRNA als Matrize verwendet.
Der gleiche Prozeß wird für die Blätter eingesetzt, die aus 6 Tage alten Sämlingen von Reis geerntet werden, um Blatt-cDNA-Bibliotheken zu konstruieren.
Aus den konstruierten Staubbeutel-cDNA-Bibliotheken werden 33 cDNA-Klone zufällig selektiert, und danach werden cDNA-Regionen, die durch Spalten der jeweiligen Klon-DNA mit EcoRI erhalten werden, mit einem radioaktiven Isotop ³²P markiert und mit Plaques aus der Blatt-cDNA-Bibliothek hybridisiert.
Als Ergebnis reagieren sechs Staubbeutel-cDNA-Klone nicht positiv mit den Plaques aus der Blatt-cDNA-Bibliothek, und unter diesen Klonen wird ein Klon, der am häufigsten in der Staubbeutel-cDNA-Bibliothek vorhanden ist, selektiert und als RA8 bezeichnet.
Mit diesem RA8-Klon wird der f1-Helferphage R408 (Stratagene) verwendet, um ein rekombinantes Plasmid pGA1173-4 (RA8) zu erhalten, in das das cDNA-Fragment durch in-vivo-Ausschneiden inseriert wird, und die Basensequenzen der RA8-cDNA, die in das obige Plasmid kloniert sind, werden durch das Verfahren von Sanger et al. bestimmt (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463–5467 (1977)).
Die Basensequenzen werden durch SEQ ID NO: 7 dargestellt. Wie in SEQ ID NO: 7 gezeigt, hat die Basensequenz der RA8-cDNA eine Größe von 1008 bps. Ein offenes Leseraster ist von nt 51 bis nt 842 von SEQ ID NO: 7 vorhanden, das aus 264 Aminosäureresten besteht. Das aus dem offenen Leseraster abge leitete Protein hat eine Molekülmasse von 26,4 kDa und ein pI von 6,1. Die das erste ATG umgebende Sequenz paßt gut zusammen mit der Translationsstart-Konsensus-Sequenz von einkeimblättrigen Pflanzen wie in der Literatur angegeben [C. P. Joshi et al., Plant Mol. Biol., 35: 993–1001 (1997)], und der Poly(A)-Schwanz befindet sich an der 164. Basensequenz stromabwärts vom TGA-Translationsterminationscodon. In der 3'-nicht-codierenden Region ist eine AATAA-Kondensus-Polyadenylierungssignalsequenz vorhanden.
Hauptaminosäurereste, die die obige Aminosäuresequenz aufbauen, sind Alanin (21,9%), Glycin (9,9%) und Prolin (10,2%), und die Aminosäuresequenz enthält eine hydrophobe N-terminale Region, die an der Ausrichtung des Proteins auf eine Membranfraktion oder den extrazellulären Raum beteiligt sein kann, ein Extensin-artiges SPPPPPP-Motiv und eine glycinreiche Region. Gemäß einer Homologieanalyse mit Genebank-Datenbanken wird bestätigt, daß eine solche Aminosäuresequenz ein neues Gen ist, das keine signifikante Sequenzidentität mit irgendwelchen bislang angegebenen Genen zeigt.
Schritt 2: RNA-Blotting-Analyse
Zur Bestätigung, ob das aus dem obigen Schritt 1 erhaltene RA8-Gen spezifisch in den Staubbeuteln exprimiert wird, wird vollständige RNA aus Blättern, Wurzeln, jungen Blüten, reifen Blüten und Paleas/Lemmas, Stempeln und Staubblättern von Reisblüten isoliert, elektrophoretisch behandelt und dann auf eine Nylonmembran übertragen. Die ³²P-markierte RA8-cDNA wird als Sonde verwendet, um das RNA-Blotting durchzuführen.
Die RA8-mRNA ist nur in Blüten zu verschiedenen Entwicklungsstadien vorhanden, aber nicht in Blättern und Wurzeln. Die Expressionsstärke des RA8-Gens erhöht sich während der Blütenentwicklung, wobei sie die höchste Stärke in reifen Blüten erreicht. Zur Bestimmung der Organspezifität innerhalb einer Blüte wird ein RNA-Blot-Experiment mit der gesamten, aus unterschiedlichen Blütenorganen isolierten RNA durchgeführt. Jedes der Blütenorgane wird unter einem Präpariermikroskop zerlegt, um die Kreuzkontamination zu minimieren. Das Ergenis zeigte, daß die RA8-mRNA in Staubbeuteln vorhanden ist, aber nicht im Fruchtblatt oder der Palea/Lemma.
Schritt 3: Isolierung des genomischen RA8-Klons
Plaques aus genomischen Bibliotheken von Reis (die durch Standardverfahren konstruiert werden und von Steve Kay und Nam-Hi Chua von der Rockefeller University in Form von EMBL lambda-Phagen-DNA erhalten werden, in die die genomische Reis-DNA inseriert ist) werden auf eine Nylonmembran (Hybond, Amersham) übertragen und unter Verwendung der mit dem radioaktiven Isotop ³²P markierten RA8-cDNA als Hybridisierungssonden hybridisiert. Die hybridisierte Nylonmembran wird mit Röntgenfilm in Kontakt gebracht, und Phagenklone werden aus Plaques erhalten, die als positiv nachgewiesen werden. Die lambda-Phagen-DNA wird aus diesen Phagenklonen isoliert, mit BamHI gespalten, um ein genomisches 13,7 kb-Fragment zu erhalten, und aus diesem wird ein 4,3 kb-SacI-EcoRI-Fragment subkloniert. Das 2,9 kb-SacI-Fragment, das aus dem 4,3 kb-SacI-EcoRI-Fragment erhalten wird, enthält die 5'-flankierende Sequenz und die 5'-codierende Region, wohingegen das benachbarte 1,5 kb SacI-EcoRI-Fragment die verbleibende codierende Region sowie die 3'-flankierende Sequenz enthält. Zwei Introns (Intron 1 und Intron 2) und 3 Exons sind in der codierenden Region vorhanden. In bezug auf SEQ ID NO: 1 sind die drei Exons wie folgt lokalisiert: Exon 1: nt 1247 bis nt 1288; Exon 2: nt 1423 bis 1555; Exon 3: nt 2150 bis nt 2766. Intron 1 hat eine Größe von 134 bps und befindet sich zwischen dem 14. und 15. Codon, entsprechend nt 1289 bis nt 1422 von SEQ ID NO: 1, und Intron 2 hat eine Größe von 594 bps und befindet sich am 59. Codon, entsprechend nt 1556 bis nt 2149 von SEQ ID NO: 1. Beide Introns enthalten die Konsensus-GT- und AT-Sequenzen am 5'- bzw. 3'-Ende. Die 5'-flankierende Sequenz der RA8-codierenden Region enthält eine CAAT-Box-Sequenz, CAAT an der Basenposition –82 bis –79, entsprechend nt 1116 bis nt 1119 von SEQ ID NO: 1, und eine TATA-Box-Sequenz, TATAATA, an der Basenpositon –53 bis –47, entsprechend nt 1145 bis nt 1151 von SEQ ID NO: 1.
Das 2,9 kb SacI-Fragment wird in den Plasmid pBluescript SK(–)-Vektor kloniert, und dieses Plasmid wird als pGA1173-9 bezeichnet. Dieses Plasmid wird beim Korea Research Institute of Bioscience und Biotechnology, der angegliederten Organisation des Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), unter der Hinterlegungs-Nr. KCTC 8899P am 29. Juli 1998 hinterlegt.
Die Basensequenzen des genomischen DNA-Fragments, die in das Plasmid pGA1173-9 kloniert sind, werden unter Verwendung des Verfahrens von Sanger et al. anylsiert, und eine etwa 2,5 kb-Promotorregion wird im Vergleich mit cDNA bestimmt.
Zur Untersuchung der genomischen Komplexität des RA8-Klons wird die aus Blättern von 2 Wochen alten Reissämlingen isolierte genomische DNA mit EcoRI, HindIII oder PstI gespalten und dann dem DNA-Blotting mit der RA8-cDNA unterworfen. Die RA8-cDNA-Sonde hybridisiert mit einer einzelnen Bande der genomischen Reis-DNA, und somit existiert das RA8-Gen als eine einzelne Kopie im Reisgenom.
Beispiel 2: Produktion von Pflanzenexpressionvektor
Der binäre Vektor, der ein Reportergen, GUS, und ein Selektionsgen, hph (Hygromycinphosphotransferase), enthält, wird wie folgt konstruiert.
Ein Plasmid pGA748 (G. An, Binary Ti plasmid vectors, Agrobacterium protocols, Humana Press, S. 47–58) wird mit BamHI und HindIII gespalten, und der CaMV35S-Promotor (Benfey et al., Science, 250, 959–966 (1993)) wird dann darin inseriert. Ein Hygromycin-Resistenzgen (Hygromycinphosphotransferase, hph) (Gritz et al. (1983)) wird am BglII-Ort des so erhaltenen Plasmids inseriert. Dieses Plasmid wird mit HindIII und ClaI gespalten, abgestumpft und dann ligiert. Das so erhaltene Plasmid wird mit SacI gespalten, um ein Fragment mit ca. 0,5 kb zu entfernen, und dann erneut ligiert. Am BamHI-Ort dieses Plasmids wird ein synthetischer Adapter mit BamHI-, HindIII-, XbaI-, SacI-, HpaI-, KpnI-, ClaI- und BglII-Spaltorten inseriert, um ein Plasmid pGA1182 zu konstruieren.
PCR wird unter Verwendung des Plasmids pGA1182 als Matrize, 5'-TTGGCATGCACATAC-3' (SEQ ID NO: 5) als Primer 1 und 5'-CGGGATCCGTGTTTGACAGG-3' (SEQ ID NO: 6) als Primer 2 durchgeführt. Das erhaltene Fragment mit ca. 120 bp wird mit BamHI und SphI gespalten und dann in ein Fragment mit ca. 9 kb ligiert, das durch Spalten des Plasmids pGA1182 mit den gleichen Restriktionsenzymen erhalten wird. Zwischen die BamHI- und ClaI-Orte des so erhaltenen Plasmids wird das GUS-Gen (Jefferson et al., EMBO J, 6, 3901–3907 (1987)) inseriert, um den binären Vektor pGA1633 zu konstruieren.
pGA1173-9, das 2,9 kb genomische RA8-DNA enthält, wie in Schritt 3 aus Beispiel 1 konstruiert, wird der PCR mit synthetischen Oligomerprimern von SEQ ID NO: 8 (AATTAACCCTCACTAAAGGG) und SEQ ID NO: 9 (GCGGATCCAGGTTGAACCAC) unterworfen. Das in SEQ ID NO: 9 gezeigte synthetische Oligomer erzeugt einen BamHI-Ort in Exon 2 des RA8-Gens.
Dann wird Plasmid pGA1639, das die amplifizierte Sequenz wie oben enthält, konstruiert. Das Plasmid pGA1639 enthält das 2,7 kb-SacI-BamHI-Fragment, das die 5'-flankierende Region, Exon 1, Intron 1 und einen Teil von Exon 2 des RA8-Gens umfaßt.
Dieses Fragment wird mit der beta-Glucuronidase-codierenden Sequenz im pGA1633 verbunden, um den Pflanzenexpressionsvektor pGA1647 zu konstrieren. Im Vektor pGA1647 ist die oben beschriebene, aus dem RA8-Gen stammende Sequenz am neu eingeführtem BamHI-Ort innerhalb von Exon 2 mit dem GUS-Gen ohne Veränderungen des Leserasters fusioniert. Somit wird eine Translationsfusion zwischen einem Teil des RA8-Gens und der beta-Glucuronidase-codierenden Sequenz durchgeführt.
Beispiel 3: Produktion des transgenen Reis
Der in Beispiel 2 konstruierte Expressionsvektor pGA1647 wird in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al., Nature, 303, 179–181 (1983)), das das binäre Ti-Plasmid pAL4404 trägt, unter Verwendung des Gefrier-Auftau-Verfahrens transformiert (G. An et al. (Hrsg.) Plant Molecular Biology Manual, S. A3/1–A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988)).
Das transformierte Agrobacterium tumefaciens LBA4404 wird für 3 Tage im AB-Flüssigmedium, das mit 30 mg/l Hygromycin B und 3 mg/l Tetracyclin ergänzt ist, kultiviert, und es wird mit 3 Wochen alten Kalli co-kultiviert, die aus dem Skutellum von reifen Samen in N6-Medium (C. C. Chu, et al., Sci. Sin., 18, 659–668 (1975)), das 2 mg/l 2,5-D enthält, auf dem 2N6-As-Medium, ergänzt mit 1 mM Betain (Y. Hiei et al., Plant. J. 6, 271–282 (1994)) in der Dunkelheit bei 25°C für 2–3 Tage induziert werden. Die co-kultivierten Kalli werden mit sterilem Wasser gewaschen, das 100 mg/l Cefotaxim enthält, und erneut auf einem N6-Medium, das 40 mg/l Hygromycin und 250 mg/l Cefotacim enthält, für 3 Wochen inkubiert. Aktiv wachsende Hygromycin-resistente Kalli werden auf das Selektionsmedium überführt [z.B. MS-Medien (Life Technologies) + 0,2 mg/l NAA (Naphthalinessigsäure) + 2 mg/l Kinetin + 2% Sorbit + 1,6% Phytagar (Gibco) + 50 mg/l Hygromycin B + 250 mg/l Cefotaxim] und dann für 2–3 Wochen unter kontinuierlicher Lichtbedingung mit 40 μmol/m²/s kultiviert. Die so erhaltenen Pflänzlinge werden ausgetopft und in einer Wachstumskammer unter einer Bedingung von 10 h Licht/14 h Dunkelheit kultiviert, um insgesamt 22 transgene Reispflanzen zu erhalten.
Zur Selektion einer Pflanzenlinie mit der höchsten Expressionsstärke in den Staubbeuteln unter den zweiundzwanzig (22) transgenen Reispflanzen wird eine histochemische GUS-Anfärbung für den Blütenteil des transgenen Reis gemäß dem Verfahren von Dai et al. durchgeführt [Z. Dai et al., Plant Mol. Biol. 32, 1055–1065 (1996)], das modifiziert wird, so daß es 20% Methanol in der Anfärbungslösung enthält, und dann in einer Fixierungslösung fixiert (50% Ethanol, 5% Essigsäure und 3,7% Formaldehyd). Die Proben werden unter einem Präpariermikroskop (7,5-fache Vergrößerung) beobachtet. Aus diesem Ergebnis wird der Reis, der die höchste GUS-Expressionsstärke in den Staubbeuteln aufweist, selektiert und als transgene Pflanzenlinie A11279 bezeichnet.
Beispiel 4: Histochemische GUS-Analyse des transgenen Reis
Zur Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster des RA8-Gens werden junge Blüten, Blüten im frühen vakuolisierten Pollenstadium, reife Blüten, Blätter und Wurzeln aus dem in Beispiel 3 erzeugten transgenen Reis A11279 histochemisch auf GUS-Aktivität wie in Beispiel 3 beschrieben analysiert und dann unter einem Mikroskop beobachtet. Als Kontrolle wird eine Blüte von untransformiertem Reis verwendet.
Die durch den RA8-Promotor angetriebene GUS-Expression wird nur im Staubbeutel von Reisblüten detektiert, aber nicht in anderen Blütenorganen oder in den Blättern oder Wurzeln. Zusätzlich nahm die Expressionsstärke des GUS-Reportergens zu, als die Blüten reiften, und das Gen wird überhaupt nicht in den jungen Blüten im Prä-Meiose-Stadium exprimiert.
Zur Untersuchung von staubbeutelspezifischen Expressionsmustern des RA8-Promotor-Reporter-Genkonstrukts, nach Anfärben und Fixieren von vier Reisstaubbeuteln zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben, werden sie in Paraplast (Sigma) eingebettet und auf 10 μm Dicke geschnitten. Die Schnitte werden unter einem Lichtmikroskop (100-fache Vergrößerung) und Dunkelfeldbeleuchtung beobachtet. Im Prä-Meiose-Stadium wird keine GUS-Aktivität in irgendeinem Teil des Staubbeutels detektiert. Die GUS-Expression ist zuerst zum Zeitpunkt detektierbar, wenn Mikrosporen aus Tetraden freigelassen werden. Der höchste Betrag an GUS-Aktivität wird in Staubbeuteln im vakuolisierten Pollenstadium beobachtet. In Staubbeuteln im reifen Pollenstadium gerade vor oder nach dem Aufplatzen nahm jedoch die GUS-Aktivität plötzlich ab. Es wird beobachtet, daß die GUS-Anfärbung auf das Tapetum, Bindegewebe und Endothezium beschränkt ist.
Beispiel 5: Produktion von transgenem Mais
Die Transformation von Mais mit einem gemäß dem obigen Verfahren hergestellten neuen Gen wird durch Mikroprojektilbombardierung mit entweder unreifen zygotischen Embyos oder seriell vermehrungsfähigem embyrogenem Kallus vom Typ I erreicht.
Kulturen von embryogenem Maiskallus Typ I (Green et al., Miami Winter Symposium 20, 1983) werden aus unreifen Embryos mit einer Länge von 1,5–2,5 mm aus im Gewächshaus kultiviertem Material begonnen. Die Embryos werden aseptisch aus oberflächensterilisierten Kolben ca. 14 Tage nach der Bestäubung ausgeschnitten. Die Embryos werden auf D-Kallus-Startmedien mit 2% Saccharose und 5 mg/l Chloramben (Duncan et al., Planta 165: 322–332, 1985) oder auf KM-Kallus-Startmedien mit 3% Saccharose und 0,75 mg/l 2,4-D (Kao und Michayluk, Planta 126: 105–110, 1975) gegeben. Embryos und embryogene Kulturen werden anschließend in der Dunkelheit kultiviert. Embryogene Reaktionen werden aus den Explantaten nach ca. 14 Tagen entfernt. Embryogene Reaktionen aus D-Kallus-Startmedien werden auf D-Kallus-Erhaltungsmedien mit 2% Saccharose und 0,5 mg/l 2,4-D gegeben, während die aus KM-Kallus-Startmedien auf KM-Kallus-Erhaltungsmedien mit 2% Saccharose und 5 mg/l Dicamba gegeben werden. Nach 3 bis 8 Wochen einer wöchentlichen selektiven Subkultur auf frische Erhaltungsmedien sind hochqualitative kompakte embryogene Kulturen etabliert. Aktiv wachsende embryogene Kallusstücke werden als Zielgewebe für die Genübertragung ausgewählt. Die Kallusstücke werden auf Zielplatten, die Erhaltungsmedium mit 12% Saccharose enthalten, ca. 4 Stunden vor der Genübertragung plattiert. Die Kallusstücke sind in Kreisen mit Radien von 8 und 10 mm vom Zentrum der Zielplatte angeordnet.
Plasmid-DNA wird auf Goldmikroträger wie im DuPont Biolistics Handbuch beschrieben präzipitiert. 2 bis 3 μg jedes Plasmids werden in 6 Schuß-Mikroträgerzubereitung verwendet. Die Gene werden auf das Zielgewebe unter Verwendung der PDS-1000He Biolistics-Vorrichtung übertragen. Die Einstellungen an der Biolistics-Vorrichtung sind wie folgt: 8 mm zwischen der Berstscheibe und dem Makroträger, 10 mm zwischen dem Makroträger und dem Stoppschirm und 7 cm zwischen dem Stoppschirm und dem Ziel. Jede Zielplatte wird zweimal unter Verwendung von Berstscheiben mit 650 psi beschossen. Ein 200 × 200 Gitter aus rostfreiem Stahl (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) wird zwischen dem Stoppschirm und dem Zielgewebe plaziert.
7 Tage nach der Genübertragung werden Zielgewebestücke aus dem hochosmotischen Medium aus Selektionsmedien übertragen. Zur Selektion unter Verwendung des BAR-Gens werden Zielgewebestücke auf Erhaltungsmedium plaziert, das 100 mg/l Glufosinatammonium (Basta^®) oder 20 mg/l Bialaphos (Herbiace^®) enthält. Alle Aminosäuren werden aus den Selektionsmedien entfernt. Nach 5 bis 8 Wochen auf diesen hochgradigen Selektionsmedien wird etwaiger wachsender Kallus auf Medien subkultiviert, die 3–20 mg/l Basta^® enthalten.
Zur Selektion unter Verwendung des Mannosephosphatisomerase-Gens werden Zielgewebe auf ihre jeweiligen Erhaltungsmedien plaziert, die keine Saccharose und 1% Mannose enthalten. Die Aminosäuren werden aus diesen Medien nicht entfernt. Nach 5 bis 8 Wochen wird wachsender Kallus entweder auf D-Kallus-Erhaltungsmedium, das keine Saccharose und 1,5% Mannose enthält, oder auf KM-Kallus-Erhaltungsmedium, das 1% Saccharose und 0,5% Mannose enthält, subkultiviert. Embryogener Kallus, der auf Selektionsmedien wächst, wird alle 2 Wochen für 4 bis 8 Wochen subkultiviert, bis genügend Kallus produziert ist, um 10–20 Pflanzen zu erzeugen. Gewebe, das die Selektion aus einem ursprünglichen Zielgewebestück überlebt, wird als einzelne Kolonie subkultiviert und als unabhängiges Transformationsereignis bezeichnet.
Zu diesem Punkt werden auf Basta^® selektierte Kolonien auf ein modifiziertes MS-Medium (Murashige und Skoog, Physiol. Plant, 15: 473–497, 1962), das 3% Saccharose (MS3S) ohne Selektionsmittel enthält, übertragen und in das Licht gestellt. Entweder 0,25 mg/l Ancymidol und 0,5 mg/l Kinetin werden zu diesem Medium hinzugegeben, um die Embryokeimung zu induzieren, oder 2 mg/l Benzyladenin werden hinzugegeben. Unter Verwendung von Mannose selektierte Kolonien werden auf ein modifiziertes MS-Medium, das 2% Saccharose und 1% Mannose (MS2S + 1 M) mit den oben beschriebenen Ancymidol- und Kinetinzugaben enthält, oder auf ein modifiziertes MS-Medium, das 2% Saccharose und 0,5% Mannose (MS2S + 0,5 M) mit der oben beschriebenen Benzyladenin-Zugabe enthält, übertragen.
Regenerierende Kolonien aus der Basta^®-Selektion werden auf MS3S-Medien ohne Ancymidol und Kinetin oder Benzyladenin nach 2 Wochen übertragen. Regenerierende Kolonien aus der Mannoseselektion werden auf MS2S + 1 M bzw. MS2S + 0,5 M Medien ohne Hormone nach 2 Wochen übertragen. Regenerierende Schößlinge mit oder ohne Wurzeln aus allen Kolonien werden auf Magenta-Boxen übertragen, die MS3S-Medium enthalten, und kleine Pflanzen mit Wurzeln werden schließlich gewonnen und in den Boden im Gewächshaus überführt.
Pflanzen werden auf Expression des PMI-Gens unter Verwendung eines modifizierten Chlorphenolrot-Assays mit 48 Vertiefungen getestet, wobei die Medien keine Saccharose und 0,5% Mannose enthalten. Blattproben (ca. 5 mm × 5 mm) werden auf diese Testmedien gegeben und in der Dunkelheit für ca. 72 Stunden kultiviert. Falls die Pflanze das PMI-Gen exprimiert, kann sie die Mannose metabolisieren, und das Medium wird gelb werden. Falls nicht, wird das Medium rot bleiben.
Transformationsereignisse wurden auch unter Verwendung von Kallus Typ I geschaffen, der aus unreifen zygotischen Embryos unter Verwendung von Standardkulturtechniken erhalten wurde. Für die Genübertragung werden ca. 300 mg des Typ I-Kallus durch Subkultivieren auf frische Medien 1 bis 2 Tage vor der Genübertragung, Selektieren von Zielgewebestücken und Plazieren in einem Ringmuster 10 mm vom Zentrum der Zielplatte auf Medium, das wieder 12% Saccharose enthält, hergestellt. Nach ca. 4 Stunden wird das Gewebe unter Verwendung der PDS-1000/He Biolistic-Vorrichtung von DuPont bombardiert. Plasmide von Interesse werden auf 1 μm Goldpartikel unter Verwendung des Standardprotokolls von DuPont präzipitiert. Gene werden unter Verwendung von zwei Schüssen pro Zielplatte mit 650 psi übertragen. Ca. 16 Stunden nach der Genübertragung wird der Kallus auf Standardkulturmedium übertragen, das 2% Saccharose ohne Selektionsmittel enthält. 12 oder 13 Tage nach der Genübertragung werden Zielgewebestücke auf Selektionsmedien übertragen, die 40 mg/l Phosphinotricin als entweder Basta oder Bialaphos enthalten. Der Kallus wird auf Selektion für 12 bis 16 Wochen subkultiviert, worauf überlebender und wachsender Kallus auf Standardregenerationsmedium, das 3 mg/l Phosphinothricin als Basta enthält, für die Produktion von Pflanzen übertragen wird.
Beispiel 6: Transformation von Weizen
Eine bevorzugte Technik zur Weizentransformation beinhaltet die Partikelbombardierung von unreifen Weizenembryos und schließt entweder einen Schritt mit hoher Saccharose- oder hoher Maltose-Konzentration vor der Genübertragung ein. Vor der Bombardierung wird eine beliebige Anzahl von Embryos (mit einer Länge von 0,75–1 mm) auf MS-Medium mit 3% Saccharose (Murashige und Skoog, 1962) und 3 mg/l 2,4-D zur Induzierung von somatischen Embryos ausplattiert, was man in der Dunkelheit fortschreiten läßt. Am gewählten Tag der Bombardierung werden die Embryos aus dem Induktionsmedium entfernt und auf das Osmotikum plaziert (d.h. Induktionsmedium mit Saccharose oder Maltose, die in der gewünschten Konzentration, typischerweise 15%, hinzugegeben werden). Man läßt die Embryos für 2–3 h plasmolysieren, und sie werden dann bombardiert. 20 Embryos pro Zielplatte sind typisch, obwohl nicht kritisch. Ein geeignetes Gen-tragendes Plasmid wird auf Goldpartikel von Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Jede Platte mit Embryos wird mit der DuPont Biolistics-Heliumvorrichtung unter Verwendung eines Berstdrucks von ca. 1000 psi und unter Verwendung eines Standardgitters mit 80 mesh beschossen. Nach der Bombardierung werden die Embryos zur Erholung für ca. 24 h zurück in die Dunkelheit gegeben (noch auf dem Osmotikum). Nach 24 h werden die Embryos aus dem Osmotikum entfernt und zurück auf Induktionsmedium gegeben, wo sie für ca. 1 Monat vor der Regeneration bleiben.
Ca. 1 Monat später werden die Embryoexplantate mit sich entwickelndem embryogenem Kallus auf Regenerationsmedium (MS + 1 mg/l NAA, 5 mg/l GA), das ferner das geeignete Selektionsmittel enthält, übertragen. Nach ca. 1 Monat werden entwickelte Schößlinge auf größere sterile, als GA7 bekannte Behälter übertragen, die halbkonzentriertes MS, 2% Saccharose und die gleiche Konzentration von Selektionsmittel enthalten. Die stabile Transformation von Weizen wird im Detail in EP 0 674 715 beschrieben.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Molekül, das eine Promotorsequenz und eine assoziierte codierende Sequenz umfaßt, worin die Promotorsequenz die Expression der codierenden Sequenz spezifisch im Tapetum, Endothezium und Bindegeweben von Staubbeuteln antreibt, aber nicht in Mikrosporen oder Pollen, und worin die Expression der codierenden Sequenz im Tetradenstadium beginnt und eine maximale Stärke im vakuolisierten Pollenstadium erreicht, worin die Promotorsequenz eine Nukleotidsequenz mit 50% oder mehr Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Sequenz umfaßt.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, worin die Promotorsequenz die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Nukleotidsequenz umfaßt.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die codierende Sequenz in antisense-Orientierung ist.
DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die codierende Sequenz ein Polypeptid codiert, das bei Expression in den Staubbeutelzellen die Bildung von lebensfähigen Pollen unterbrechen wird.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 4, worin die codierende Sequenz ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus RNase, DTA, TURF-13, Pectatlyase, Ginrekombinase, iaaL und cytA-Toxin besteht.
DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Promotorsequenz eine zusätzliche Sequenz umfaßt, die funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz von Interesse verbunden werden kann, worin die zusätzliche Sequenz eine Sequenz mit 50% oder mehr Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 10 umfaßt.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 6, worin die zusätzliche Sequenz SEQ ID NO: 10 umfaßt.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 6 oder 7, worin die Promotorsequenz und die zusätzliche Sequenz 50% oder mehr Sequenzidentität mit den jeweiligen Sequenzen von SEQ ID NO: 2 haben.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 8, worin die Promotorsequenz und die zusätzliche Sequenz durch die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 gekennzeichnet sind.
Expressionsvektor, der eine erste Expressionskassette, die eine DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Expression in einem Wirtsorganismus wie einem Mikroorganismus oder einer Pflanze umfaßt, und gegebenenfalls eine zweite Expressionskassette, die ein interessierendes Gen umfaßt, umfaßt.
Transgene Pflanze und geschlechtliche und/oder ungeschlechtliche Nachkommenschaft davon, die mit einer DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 transformiert wurde.
Transgene männlich-sterile Pflanze, die mit einer DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 transformiert wurde.
Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, worin die Pflanze Reis, Weizen, Mais, Sorghum bicolor oder Knaulgras ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, die eine DNA enthält, die eine Promotorsequenz und assoziierte codierende Sequenz umfaßt, worin die Promotorsequenz die Expression der codierenden Sequenz spezifisch im Tapetum, Endothezium und Bindegeweben der Staubbeutel antreibt, aber nicht in Mikrosporen oder Pollen und worin die Expression der codierenden Sequenz im Tetradenstadium beginnt und eine maximale Stärke im vakuolisierten Pollenstadium erreicht, wobei das Verfahren das Einführen einer DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 in eine Pflanzenzelle umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die Pflanzenzelle Reis, Weizen, Mais, Sorghum bicolor oder Knaulgras ist.