UA74535C2 - Dna comprising promotor sequence (variants), and transgenic plant transformed with use thereof - Google Patents
Dna comprising promotor sequence (variants), and transgenic plant transformed with use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- UA74535C2 UA74535C2 UA2001053608A UA2001053608A UA74535C2 UA 74535 C2 UA74535 C2 UA 74535C2 UA 2001053608 A UA2001053608 A UA 2001053608A UA 2001053608 A UA2001053608 A UA 2001053608A UA 74535 C2 UA74535 C2 UA 74535C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- expression
- gene
- plant
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 101
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 64
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 39
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 11
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 11
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 10
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims description 8
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000209082 Lolium Species 0.000 claims description 2
- 241001668545 Pascopyrum Species 0.000 claims description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 101150064672 sugA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims 3
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 51
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 20
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 18
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 17
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 17
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 13
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 9
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000574138 Ozothamnus diosmifolius Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 6
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- HUTDUHSNJYTCAR-UHFFFAOYSA-N ancymidol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(O)(C=1C=NC=NC=1)C1CC1 HUTDUHSNJYTCAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 3
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 2
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007152 anther development Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 2
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- 235000017261 Fritillaria camtschatcensis Nutrition 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 101000777488 Heteractis magnifica DELTA-stichotoxin-Hmg2b Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 240000004296 Lolium perenne Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- FKIGOUKDKBOZID-ZDUSSCGKSA-N N(6)-[(indol-3-yl)acetyl]-L-lysine Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)=CNC2=C1 FKIGOUKDKBOZID-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 235000005044 Oryza sativa Indica Group Nutrition 0.000 description 1
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 1
- 235000005043 Oryza sativa Japonica Group Nutrition 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020001991 Protoporphyrinogen Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241000271569 Rhea Species 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- -1 TYKE-13 Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 description 1
- 235000002636 Zizania aquatica Nutrition 0.000 description 1
- 240000000300 Zizania aquatica Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 101150008083 ant gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N atrazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 101150064029 bi gene Proteins 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- WWAABJGNHFGXSJ-UHFFFAOYSA-N chlorophenol red Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=CC=C1C1(C=2C=C(Cl)C(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 WWAABJGNHFGXSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 238000006138 lithiation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002231 mosquitocidal effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 101150082349 pmi gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Даний винахід стосується галузі генної інженерії рослин. 2 Насамперед, він стосується нових послідовностей ДНК, що функціонують як промотори специфічної для пиляка транскрипції кодувальних послідовностей ДНК у рекомбінантних або химерних послідовностях ДНК.This invention relates to the field of genetic engineering of plants. 2 Primarily, it refers to novel DNA sequences that function as promoters of anther-specific transcription of DNA coding sequences in recombinant or chimeric DNA sequences.
Даний винахід також стосується рекомбінантних або химерних послідовностей ДНК, що специфічно експресуються в пиляку рослини. Ці рекомбінантні чи химерні послідовності ДНК можуть застосовуватися для створення трансгенних рослин, але насамперед, трансгенних рослин з чоловічою стерильністю.The present invention also relates to recombinant or chimeric DNA sequences that are specifically expressed in plant anthers. These recombinant or chimeric DNA sequences can be used to create transgenic plants, but primarily transgenic plants with male sterility.
Створення рослин з чоловічою стерильністю має важливе економічне значення для одержання гібридного насіння. Чоловіча стерильність попереджає самозапилення, яке у противному випадку відбувається в багатьох видів рослин і заважає селекції й одержанню гібридного насінного матеріалу. Пиляк являє собою чоловічий репродуктивний орган квіткових рослин, що складається з декількох тканин, таких як тапетум, ендотецій, сполучні тканини, судинні тканини і т.ін., і він відповідає за виробництво пилка. Розвиток пиляка можна 12 розділити на дві загальні фази. Під час фази 1 відбувається розвиток морфологічних особливостей пиляка і клітини материнської мікроспори піддаються мейозу, що приводить до утворення тетрад мікроспор. Під час фази 2 відбувається диференціювання пилкових зерен і пиляків, і відбувається дегенерація тканини, розкриття пиляка і вивільнення пилкового зерна. Серед численних різних генів, що беруть участь у цих процесах розвитку, тільки невелика частина представлена специфічними для пиляка генами.The creation of plants with male sterility is of great economic importance for the production of hybrid seeds. Male sterility prevents self-pollination, which otherwise occurs in many plant species and interferes with selection and production of hybrid seed material. Anther is the male reproductive organ of flowering plants, consisting of several tissues such as tapetum, endothecium, connective tissue, vascular tissue, etc., and it is responsible for the production of pollen. Anther development can be divided into two general phases. During phase 1, the morphological features of the anther develop and the cells of the mother microspore undergo meiosis, which leads to the formation of microspore tetrads. During phase 2, differentiation of pollen grains and anthers occurs, and tissue degeneration, anther opening, and pollen grain release occur. Among the many different genes involved in these developmental processes, only a small part is represented by anther-specific genes.
Відомі дотепер специфічні для пиляка гени включають гени О5с4, Овсб, УМ1 і Ум2 |Ніпага У, та ін., РіапіKnown so far specific genes for anther include genes O5c4, Ovsb, UM1 and UM2 | Nipaga U, et al., Riapi
Мої. Віої., 30:1181-1193(1996); Твиспіуа Т., та ін., Ріапі Мої. Віо!., 26:1737-1747 (1994)), гени ТА29 і ТАЗ2 тютюну (КойКипом/ А.М. та ін., Ріапі СеїІ, 2:1201-1224 (19903), гени 5Е2 і 5Е18 соняшнику |Оотоп С. та ін.,My. Vioi., 30:1181-1193 (1996); Twispiua T., et al., Riapi Moi. Vio!., 26:1737-1747 (1994)), TA29 and TAZ2 genes of tobacco (KoiKipom/ A.M. et al., Riapi SeiI, 2:1201-1224 (19903), 5E2 and 5E18 genes of sunflower |Ootop S . etc.,
Ріапі Мої. ВіоїЇ., 15:643-646 (1990)), гени 108 томату |Зтйй А.О. та ін. МоЇ. Сеп. Сепеї., 222:9-16 (19903), МТМ 19 тютюну |ОІдеппої М.Т. та ін. Ріапі Мої. Віо! 31:213-225 (1996)| і гени ВА42, ВА112 і АЗ9 с 29 Вгаввіса париз |Зсой К. та ін., Ріапі Мої. Віоії., 17:195-207 (1991); Зпеп, 9У.В. таїн., МоїЇ. Сеп. Сепеї, Ге) 234:379-389 (1992)|.Riapi Moi. VioiYi., 15:643-646 (1990)), genes 108 of tomato | Ztyi A.O. etc. My. Sept. Sepei., 222:9-16 (19903), MTM 19 of tobacco |Oideppoi M.T. etc. Riapi Moi. Vio! 31:213-225 (1996)| and genes BA42, BA112 and AZ9 p 29 Vgavvisa paris | Zsoi K. et al., Riapi Moi. Bioii., 17:195-207 (1991); Zpep, 9U.V. Mysteries. Sept. Sepei, Ge) 234:379-389 (1992)|.
Деякі з цих генів виявлені виключно в спорофітних тканинах пиляків, інші є специфічними для пилка або присутні і в спорофітних і в гаметофітних тканинах пиляків.Some of these genes are found exclusively in sporophytic tissues of anthers, others are specific for pollen or are present in both sporophytic and gametophytic tissues of anthers.
Рис являє собою приклад рослини, що розмножується шляхом самозапилення. Це утруднює одержання о гібридних сортів рису тільки за допомогою алогамії. З відомого рівня техніки відомий метод, призначений для со полегшення одержання гібридних сортів рису за допомогою алогамії, відповідно до якого пиляки видаляють із квіток рису для одержання рослин рису з чоловічою стерильністю, а потім на них переносять пилок з іншої о рослини рису. Однак недоліком цього методу є те, що для його здійснення потрібно багато часу, і він є «І трудомістким.Rice is an example of a plant that reproduces by self-pollination. This makes it difficult to obtain hybrid varieties of rice only with the help of allogamy. A method is known from the prior art to facilitate the production of hybrid rice varieties by means of allogamy, according to which anthers are removed from rice flowers to produce rice plants with male sterility, and then pollen from another rice plant is transferred to them. However, the disadvantage of this method is that it takes a long time to implement and is "And labor intensive.
Зо Таким чином, з метою одержання рослини рису або іншого виду самозапильної рослини, яка - характеризується чоловічою стерильністю, що не мають описаних вище недоліків, при створенні даного винаходу зроблено спробу розробити спосіб, базований на застосуванні гена, який індукує аномальний розвиток пиляка. «Thus, with the aim of obtaining a rice plant or another type of self-pollinated plant, which is characterized by male sterility, which does not have the above-described disadvantages, in the creation of this invention, an attempt was made to develop a method based on the application of a gene that induces abnormal anther development. "
Таким чином, у винаході запропоновано: З 50 Молекули ДНК і способи специфічної експресії цікавої для винаходу кодувальної ділянки в тапетумі, с ендотеції, сполучних тканинах пиляка, але не в мікроспорах або пилку, причому експресія цікавої для винаходуThus, the invention proposes: With 50 DNA molecules and methods of specific expression of the coding region interesting for the invention in the tapetum, endothecia, connective tissues of the anther, but not in microspores or pollen, and the expression of the interesting for the invention
Із» кодувальної послідовності починається на стадії утворення тетради і досягає максимального рівня на стадії вакуолізованого пилка. Зокрема, подано молекули ДНК і способи, які відрізняються тим, що: - ДНК має нуклеотидну послідовність, ідентичну щонайменше на 5095, оптимально на 6595, більш оптимально на 8095 і найбільш оптимально на 9095 чи більше, послідовності, наведеній у ЗЕО ІЮ МО:1 це. - ДНК за винаходом включає нуклеотидну послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО:1 «» - молекули ДНК специфічно конструюють таким чином, щоб кодувальна послідовність мала антизначеннєву орієнтацію. У винаході також запропоновані молекули ДНК і і-й способи, які відрізняються тим, що кодувальна послідовність кодує поліпептид, здатний порушувати формування со 20 життєздатного пилка при експресії в клітинах пиляка. Відповідно до конкретного варіанта здійснення кодувальна послідовність кодує поліпептид, вибраний із групи, що включає РНКазу, ОТА, ТИКЕ-13, пектатліазу, сл діп-рекомбіназу, іаа! і токсин сугА.Iz" of the coding sequence begins at the stage of tetrad formation and reaches its maximum level at the stage of vacuolated pollen. In particular, DNA molecules and methods are presented, which differ in that: - the DNA has a nucleotide sequence that is identical for at least 5095, optimally for 6595, more optimally for 8095 and most optimally for 9095 or more, the sequence given in ZEO IU MO:1 it. - DNA according to the invention includes the nucleotide sequence given in ZEO IU MO:1 "" - DNA molecules are specifically designed in such a way that the coding sequence has an antisense orientation. In the invention, DNA molecules and other methods are also proposed, which differ in that the coding sequence encodes a polypeptide capable of disrupting the formation of CO 20 viable pollen when expressed in anther cells. According to a specific embodiment, the coding sequence encodes a polypeptide selected from the group consisting of RNase, OTA, TYKE-13, pectate lyase, sl dip-recombinase, iaa! and sugA toxin.
Винахід також стосується зазначених вище молекул ДНК і способів, які відрізняються тим, що послідовністьThe invention also relates to the above-mentioned DNA molecules and methods, which differ in that the sequence
ДНК за винаходом ідентична більш ніж на 8095, оптимально на 9095 і більш оптимально на 9595, фрагменту, 52 складеному з 30 послідовних основ, розташованому в будь-якій ділянці ЗЕО ІЮ МО:1.The DNA according to the invention is identical for more than 8095, optimally for 9095 and more optimally for 9595, a fragment 52 composed of 30 consecutive bases, located in any area of ZEO IU MO:1.
ГФ) У винаході також запропоновані молекули ДНК, що включають промоторну послідовність, здатну забезпечувати експресію зв'язаної кодувальної послідовності специфічно в тапетумі, ендотеції і сполучній о тканині пиляка, але не в мікроспорах або пилку, причому експресія кодувальної послідовності починається на стадії утворення тетради і досягає максимального рівня на стадії вакуолізованого пилка. 60 Зокрема в даному винаході зазначені раніше способи і молекули ДНК, які відрізняються тим, що - промоторна послідовність ідентична на 5095, оптимально на 6595, більш оптимально на 8095 і найбільше оптимально на 9095 чи більше, нуклеотидній послідовності, представленій у ЗЕО ІЮ МО:З - промоторна послідовність має нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:З - промоторна послідовність включає додаткову послідовність, що може бути функціонально зв'язана з бо цікавою для винаходу кодувальною послідовністюGF) The invention also offers DNA molecules that include a promoter sequence capable of ensuring the expression of a linked coding sequence specifically in the tapetum, endothecia and connective tissue of an anther, but not in microspores or pollen, and the expression of the coding sequence begins at the stage of tetrad formation and reaches its maximum level at the stage of vacuolated pollen. 60 In particular, in this invention, the previously mentioned methods and DNA molecules differ in that - the promoter sequence is identical to the nucleotide sequence presented in ZEO IU MO:Z - the promoter sequence has the nucleotide sequence presented in ZEO IU MO:Z - the promoter sequence includes an additional sequence that can be functionally linked to the coding sequence that is interesting for the invention
- додаткова послідовність включає послідовність, ідентичну на 5095, оптимально на 6595, більш оптимально на 8095 і найбільше оптимально на 9095 чи більше, послідовності, представленій у ЗЕО ІЮ МО:10 - додаткова послідовність включає ЗЕО ІЮ МО:10 - промоторна послідовність і додаткова послідовність ідентичні на 5095, оптимально на 6595, більш оптимально на 8055 і найбільше оптимально на 9095 чи більше, послідовності, наведеній у ЗЕО ІЮ МО:2 - промоторна послідовність і додаткова послідовність характеризуються нуклеотидною послідовністю, наведеною в ЗЕО ІЮ МО:2. 70 Крім того, запропоновано молекули ДНК, у яких промотор включає фрагмент, що його можна отримати з ЗЕО- the additional sequence includes a sequence that is identical by 5095, optimally by 6595, more optimally by 8095 and most optimally by 9095 or more, the sequence presented in ZEO IU MO:10 - the additional sequence includes ZEO IU MO:10 - a promoter sequence and an additional sequence identical by 5095, optimally by 6595, more optimally by 8055 and most optimally by 9095 or more, of the sequence given in ZEO IU MO:2 - the promoter sequence and the additional sequence are characterized by the nucleotide sequence given in ZEO IU MO:2. 70 In addition, DNA molecules have been proposed in which the promoter includes a fragment that can be obtained from ZEO
ІЮ МО:2, оптимально фрагмент, здатний забезпечувати експресію зв'язаної кодувальної послідовності специфічно в тапетумі, ендотеції і сполучній тканині пиляка, але не в мікроспорах чи пилку, причому експресія кодувальної послідовності починається на стадії утворення тетради і досягає максимального рівня на стадії вакуолізованого пилка.IU MO:2, an optimal fragment, is able to provide expression of the linked coding sequence specifically in the tapetum, endothecia and connective tissue of the anther, but not in microspores or pollen, and the expression of the coding sequence begins at the stage of tetrad formation and reaches a maximum level at the stage of vacuolated pollen .
У винаході також описано молекули ДНК, що включають відкриту рамку зчитування, яка кодує протеїн, характеризований амінокислотною послідовністю, ідентичною на 5095, оптимально на 6595, більш оптимально на 8095 і найбільше оптимально на 9095 чи більше, послідовності, наведеній у ЗЕО ІЮ МО:4. Відповідно до іншого конкретного варіанта здійснення винаходу відкрита рамка зчитування кодує протеїн, характеризований амінокислотною послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮ МО:4. Відповідно до конкретного варіанта здійснення винаходу зазначена раніше молекула ДНК характеризується послідовністю, наведеною в ЗЕО ІЮ МО:7.The invention also describes DNA molecules comprising an open reading frame that encodes a protein characterized by an amino acid sequence identical at 5095, optimally at 6595, more optimally at 8095, and most optimally at 9095 or more, of the sequence given in ZEO IU MO:4 . According to another specific embodiment of the invention, the open reading frame encodes a protein characterized by the amino acid sequence shown in 5EO IU MO:4. According to a specific embodiment of the invention, the aforementioned DNA molecule is characterized by the sequence given in ZEO IU MO:7.
Крім того, у винаході описано експресійні вектори, що включають першу касету експресії, яка містить ДНК за винаходом для експресії в організмі-хазяїні, такому як мікроорганізм або рослина, і необов'язково другу касету експресії, що містить цікавий для винаходу ген. Відповідно до конкретного варіанта здійснення винаходу друга касета експресії містить маркерний ген. счIn addition, the invention describes expression vectors that include a first expression cassette that contains DNA according to the invention for expression in a host organism, such as a microorganism or a plant, and optionally a second expression cassette that contains a gene of interest to the invention. According to a specific embodiment of the invention, the second expression cassette contains a marker gene. high school
Винахід також стосується протеїну, кодованого описаною вище відкритою рамкою зчитування.The invention also relates to a protein encoded by the open reading frame described above.
Крім того, винахід стосується трансгенних рослин і рослинного матеріалу і їхнього потомства, отриманого і) статевим і/або безстатевим шляхом, що були трансформовані послідовністю ДНК за винаходом. Зокрема, у винаході описано - трансгенну рослину з чоловічою стерильністю, трансформовану послідовністю ДНК за винаходом ю зо - трансгенні рослину або рослинний матеріал за винаходом, де рослина являє собою рис, пшеницю, кукурудзу, Зогоапит бБісоЇог або грястицю збірну. оIn addition, the invention relates to transgenic plants and plant material and their offspring obtained i) sexually and/or asexually, which have been transformed by the DNA sequence according to the invention. In particular, the invention describes - a transgenic plant with male sterility, transformed by the DNA sequence according to the invention, and - a transgenic plant or plant material according to the invention, where the plant is rice, wheat, corn, Zogoapyt bBisoYog or wheatgrass. at
Крім того, у винаході запропоновано спосіб одержання трансгенної рослини, яка містить ДНК, що включає ю промоторну послідовність і зв'язану з нею кодувальну послідовність, причому промоторна послідовність забезпечує експресію кодувальної послідовності специфічно в тапетумі, ендотеції і сполучних тканинах, але не « зв В мікроспорах чи пилку, причому експресія кодувальної послідовності починається на стадії утворення тетради і ї- досягає максимального рівня на стадії вакуолізованого пилка. Спосіб насамперед придатний для рослин рису, пшениці, кукурудзи, Зогапит бБісоїог чи грястиці збірної.In addition, the invention proposes a method of obtaining a transgenic plant that contains DNA that includes a promoter sequence and an associated coding sequence, and the promoter sequence ensures the expression of the coding sequence specifically in the tapetum, endothecia, and connective tissues, but not in microspores or pollen, and the expression of the coding sequence begins at the stage of tetrad formation and reaches its maximum level at the stage of vacuolated pollen. The method is primarily suitable for plants of rice, wheat, corn, Zogapyt bBisoiog or common wheat.
Відповідно до конкретного варіанта здійснення даний винахід стосується специфічного для пиляка гена рису (Огула заїма І.), що має послідовність основ, представлену в 5ЗЕО ІЮ МО/:1, і гена, ідентичного більш ніж на « 8095, ЗО послідовним основам у будь-якій ділянці цього гена. з с Крім того, цей винахід стосується специфічної для пиляка регуляторної послідовності, що включає . промоторну послідовність і додаткову послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:2, яка відповідає послідовності и?» основ між положеннями -1196 і 240 зазначеного гена, яка представлена нуклеотидами (пі) з 1 по 1436 5ЕО ІAccording to a specific embodiment, the present invention relates to an anther-specific gene of rice (Ogula zaima I.), which has the sequence of bases represented in 5ZEO IYU MO/:1, and a gene identical by more than 8095, ZO to consecutive bases in any which part of this gene. with c In addition, this invention relates to an anther-specific regulatory sequence comprising . the promoter sequence and the additional sequence presented in ZEO IU MO:2, which corresponds to the sequence y?" bases between positions -1196 and 240 of the specified gene, which is represented by nucleotides (pi) from 1 to 1436 5EO I
МО.Mo.
Даний винахід також стосується промотору, що забезпечує специфічну для пиляка експресію, який має -І послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:3З, яка відповідає послідовностям основ у положеннях від -1196 до -1 зазначеного гена, відповідним для пі 1 - пі 1196 5ЕО ІЮ МО:1. ве Визначення с Щоб полегшити розуміння опису і формули винаходу нижче наведено такі визначення:The present invention also relates to a promoter providing anther-specific expression, which has the -I sequence presented in ZEO IU MO:3Z, which corresponds to the base sequences in positions from -1196 to -1 of the specified gene, corresponding to pi 1 - pi 1196 5EO IU MO:1. Definitions To facilitate the understanding of the description and claims, the following definitions are given below:
Химерний: поняття використовують для того, щоб указати, що послідовність ДНК, така як вектор або ген, і включає більше від однієї послідовності ДНК різного походження, злитих за допомогою методів рекомбінатної сп ДНК з утворенням послідовності ДНК, яка не зустрічається в природних умовах, і яка зокрема не зустрічається в рослині, що підлягає трансформації.Chimeric: A term used to indicate that a DNA sequence, such as a vector or gene, comprises more than one DNA sequence of different origins fused by recombinant DNA techniques to form a DNA sequence that does not occur naturally, and which in particular is not found in the plant to be transformed.
Експресія: означає транскрипцію і/або трансляцію ендогенного гена чи трансгена в рослинах. У випадку, дв Наприклад, антизначеннєвих конструкцій поняття "експресія" може стосуватися транскрипції тільки антизначеннєвої ДНК.Expression: means the transcription and/or translation of an endogenous gene or transgene in plants. In the case of, for example, antisense constructions, the term "expression" may refer to the transcription of only antisense DNA.
Ф) Ген: означає кодувальну послідовність і зв'язану з нею регуляторну послідовність, причому кодувальна ка послідовність транскрибується з утворенням РНК, такої як мРНК, рРНК, тРНК, зпРНК (М.я.РНК), значеннєва РНК і антизначеннєва РНК. Прикладами регуляторних послідовностей є промоторні послідовності, 5- і бо З-нетрансльовані послідовності і термінувальні послідовності. Можуть бути присутні додаткові елементи, наприклад, інтрони.F) Gene: means a coding sequence and an associated regulatory sequence, and the coding sequence is transcribed to form RNA, such as mRNA, rRNA, tRNA, zpRNA (mRNA), sense RNA and antisense RNA. Examples of regulatory sequences are promoter sequences, 5- and 3-untranslated sequences and termination sequences. Additional elements, such as introns, may be present.
Маркерний ген: означає ген, що кодує селектовану ознаку або ознаку, яку можна відібрати в результаті скринінгу. пі являє собою скорочення для "нуклеотиду". 65 Поняття функціонально зв'язана з/з'єднана з: кажуть, що регуляторна послідовність ДНК, "функціонально зв'язана з" або "з'єднана з" послідовністю ДНК, що кодує РНК чи протеїн, якщо дві послідовності розташовані так, що регуляторна послідовність ДНК впливає на експресію кодувальної послідовності ДНК.Marker gene: means a gene encoding a selectable trait or a trait selectable by screening. pi is short for "nucleotide". 65 The concept of functionally linked to/connected to: a regulatory DNA sequence is said to be "functionally connected to" or "connected to" an RNA or protein-coding DNA sequence if the two sequences are arranged such that the regulatory DNA sequence affects the expression of the coding DNA sequence.
Рослина: означає будь-яку рослину, зокрема насінний матеріал рослин.Plant: means any plant, including seed material of plants.
Рослинний матеріал: означає листя, стебла, коріння, квітки або частини квіток, плоди, пилок, пилкові трубки, насінні бруньки, зародкові мішки, яйцеклітини, зиготи, зародки, насіння, відсадки, культури клітин або тканин, чи будь-яку іншу частину або продукт рослини.Plant material: means leaves, stems, roots, flowers or parts of flowers, fruits, pollen, pollen tubes, seed buds, embryo sacs, ovules, zygotes, embryos, seeds, cuttings, cell or tissue cultures, or any other part or a plant product.
Промотор: означає послідовність ДНК, що ініціює транскрипцію зв'язаної з нею послідовності ДНК.Promoter: means a DNA sequence that initiates the transcription of an associated DNA sequence.
Промоторна ділянка також може включати елементи, що діють як регулятори експресії генів, такі як активатори, енхансери і/або репресори. 70 Молекула рекомбінантної ДНК; означає комбінацію послідовностей ДНК, що з'єднані разом за допомогою методу рекомбінатної ДНК.The promoter region may also include elements that act as regulators of gene expression, such as activators, enhancers and/or repressors. 70 Recombinant DNA molecule; means a combination of DNA sequences joined together by recombinant DNA technology.
Метод рекомбінатної ДНК: процедури, застосовувані для з'єднання разом послідовностей ДНК, описані, наприклад, у (Затьгоок та ін., 1989, Сода Зргіпд Нагрог, МУ: Соїа Зргіпд Нагбог І арогагу Ргезві.Recombinant DNA method: procedures used to join together DNA sequences are described, for example, in (Zatgook et al., 1989, Soda Zrgipd Nagrog, MU: Soia Zrgipd Nagbog I arogag Rgezvi.
Маркерний ген, який можна відібрати в результаті скринінгу: означає ген, експресія якого не дає трансформованій клітині вибіркової переваги, але експресія якого робить трансформовану клітину фенотипійно відмінною від нетрансформованих клітин.Screenable marker gene: means a gene whose expression does not confer a selective advantage to the transformed cell, but whose expression renders the transformed cell phenotypically different from non-transformed cells.
Селектований маркерний ген: ген, експресія якого в клітині рослини дає клітині вибіркову перевагу.Selectable marker gene: A gene whose expression in a plant cell gives the cell a selective advantage.
Вибіркова перевага, що її мають клітини, трансформовані селектованим маркерним геном, може полягати в їхній здатності рости в присутності негативного агента селекції, такого як антибіотик або гербіцид, у порівнянні з 2о ростом нетрансформованих клітин. Вибіркова перевага, що її мають трансформовані клітини в порівнянні з нетрансформованими клітинами, може полягати в їхній посиленій новонабутій здатності використовувати додану сполуку як живильну речовину, фактор росту або енергетичне джерело. Поняття "селектований маркерний ген" також стосується гена або комбінації генів, експресія яких у рослинній клітині дає клітині як негативну, так і позитивну вибіркову перевагу. счA selective advantage possessed by cells transformed with a selected marker gene may be their ability to grow in the presence of a negative selection agent, such as an antibiotic or herbicide, compared to the 20 growth of untransformed cells. A selective advantage that transformed cells have over non-transformed cells may be their enhanced, newly acquired ability to utilize the added compound as a nutrient, growth factor, or energy source. The term "selectable marker gene" also refers to a gene or combination of genes, the expression of which in a plant cell gives the cell both a negative and a positive selective advantage. high school
Ідентичність послідовностей: відсоток ідентичності послідовностей визначають за допомогою комп'ютерних програм, базованих на алгоритмах динамічного програмування. Комп'ютерні програми, оптимальні згідно з і) даним винаходом, включають ВІ АЗТ (Вазвіс І оса! АїІйдптепі Зеагсп Тсоої), набір пошукових програм, створених для дослідження всіх доступних баз даних послідовностей безвідносно до того, що аналізується, протеїн чи ДНК.Sequence identity: the percentage of sequence identity is determined using computer programs based on dynamic programming algorithms. Computer programs optimal according to i) the present invention include VI AZT (Vazvis I osa! AiIidptepi Zeagsp Tsooi), a set of search programs created to explore all available sequence databases, regardless of what is analyzed, protein or DNA.
Версія ВІ А5Т 2.0 (Сарреа ВІ А5Т) цього інструмента пошуку доступна науковій громадськості через Інтернет ю зо (сучасна адреса ПЕр:/Лимлу.побрі.піт.пін.дом/ВІАЗТ/. Вона базується на евристичному алгоритмі локального пошуку на відміну від глобального порівняльного аналізу і тому придатна для виявлення зв'язку між о послідовностями на основі тільки виділених ділянок. Бали, приписувані при пошуку з використанням програм юVersion ВИ А5Т 2.0 (Sarrea ВИ А5Т) of this search tool is available to the scientific community via the Internet yuzo (current address ПЕр:/Lymlu.pobri.pit.pin.dom/VIAZT/. It is based on a heuristic local search algorithm, as opposed to a global comparative analysis and is therefore suitable for detecting the relationship between o sequences on the basis of selected regions only.
ВІАБЗТ, мають добре визначену статистичну інтерпретацію. Ці програми оптимально здійснювати з необов'язковими параметрами, приписуваними до відсутніх даних. -VIABZT, have a well-defined statistical interpretation. These programs are optimally implemented with optional parameters assigned to missing data. -
Трансформація: означає процес інтродукції нуклеїнової кислоти в клітину. Зокрема, поняття стосується ї- стабільної інтеграції молекули ДНК у геном цікавого для винаходу організму.Transformation: means the process of introducing a nucleic acid into a cell. In particular, the concept refers to the stable integration of a DNA molecule into the genome of an organism interesting for invention.
Короткий опис послідовностей, поданих у переліку послідовностейA brief description of the sequences presented in the sequence list
ЗЕО ІЮ МО:1 нуклеотидна послідовність гена КА8 рисуZEO IU MO:1 nucleotide sequence of the KA8 gene of rice
ЗЕО ІЮО МО:2 регулятор специфічної для пиляка експресії, який включає промотор КАВ8 плюс перший екзон, « перший інтрон і частину екзона 2 з с ЗЕО ІЮО МО:З промотор КАВZEO IYUO MO:2 regulator of anther-specific expression, which includes the KAV8 promoter plus the first exon, the first intron and part of exon 2 with ZEO IYUO MO:Z KAV promoter
ЗЕО ІЮ МО:4 виведена амінокислотна послідовність протеїну, кодованого геном КАВ8 рису ;» ЗЕО ІЮ МО:5 праймер 1 5ЕО ІЮО МО:6 праймер 2ZEO IU MO:4 deduced amino acid sequence of the protein encoded by the KAV8 gene of rice;" ZEO IYU MO:5 primer 1 5EO IYUO MO:6 primer 2
ЗЕО ІО МО:7 послідовність КДНК КАВ8 -І 5ЕО ІЮО МО:8 ПЦР-праймер 5ЕО ІО МО:9 ПЦР-праймер ве ЗЕО ІЮ МО:10 нуклеотидна послідовність першого екзона, першого інтрона і частини екзона 2 гена КАВ8 рису 1 о слZEO IU MO:7 cDNA sequence KAV8 -I 5EO IUO MO:8 PCR primer 5EO IU MO:9 PCR primer ve ZEO IU MO:10 nucleotide sequence of the first exon, the first intron and part of exon 2 of the KAV8 gene of rice 1 o sl
Депонування здійснене в Корейському науково-дослідному інституті біології і біотехнології (Когеа КезеагспThe deposit was made at the Korea Research Institute of Biology and Biotechnology (Kogea Kezeagsp
Іпвійше ої Віозсіепсе апа ВіоїесппоЇоду), філії Корейського інституту перспективних досліджень у сфері 59 науки і технології (Когеа Адуапсеа Іпзійше ої Зсіепсе апа Тесппоіоду) (КАТ).Ipwiyshe oi Wiozsiepse apa WioyespppoYodu), a branch of the Korea Institute for Advanced Research in the Field of 59 Science and Technology (Kogea Aduapsea Ipziyshe oi Zsiepse apa Thesppoiodu) (KAT).
ГФ) Ген за даним винаходом виділяють з рису (Огулга заїма І.), він специфічно експресується в пиляку і його т геномна послідовність представлена в БЕО ІЮО МО:1. Послідовність КДНК гена КА8 наведено в ЗЕО ІЮ МО:7.GF) The gene according to this invention is isolated from rice (Ogulga zaima I.), it is specifically expressed in the anther, and its genomic sequence is presented in BEO IYUO MO:1. The cDNA sequence of the KA8 gene is given in ZEO IU MO:7.
Шляхом порівняння послідовності кКДНК і геномної послідовності встановлена присутність 2 інтронів і З екзонів у послідовності кодувального гена КАВ. Інтрон 1 завдовжки 134 пари основ локалізований між 14 і 15 кодонами, 60 що відповідають пі 1289 - пі 1422 5ЕО ІЮО МО/1, і пі 1556 - пі 2149 5ЕО ІЮО МО/1, а інтрон 2 завдовжки 594 пари основ локалізований на 59 кодоні в ділянці амінокислотної кодувальної послідовності виведеної з цієї послідовності основ, що відповідає пі 1556 - пі 2149 5ЕО 0 МО:1. Обидва інтрони містять консенсусні послідовності СТ і АС на 5- і 3і-концах відповідно. У ЗЕО ІЮО МО:1 три екзони локалізовані в такий спосіб: екзон 1: пі 1247 - пі 1288; екзон 2: пі 1423 - 1555; екзон 3: пі 2150 - пі 2766. У 5'-некодувальній бо фланкувальній послідовності цієї кодувальної ділянки послідовність СААТ-бокса, СААТ, локалізована на основах у положеннях від -82 до -79, що відповідає пі 1116 - пі 1119 5ЕО ІО МО:1, а послідовність ТАТ А-бокса,By comparing the cDNA sequence and the genomic sequence, the presence of 2 introns and 3 exons in the sequence of the KAV coding gene was established. Intron 1 with a length of 134 base pairs is localized between codons 14 and 15, 60 corresponding to pi 1289 - pi 1422 5EO IYUO MO/1, and pi 1556 - pi 2149 5EO IYUO MO/1, and intron 2 with a length of 594 base pairs is localized on 59 codons in the area of the amino acid coding sequence deduced from this sequence of bases, which corresponds to pi 1556 - pi 2149 5EO 0 MO:1. Both introns contain consensus sequences of ST and AC at the 5- and 3-ends, respectively. In ZEO IYUO MO:1, three exons are localized as follows: exon 1: pi 1247 - pi 1288; exon 2: pi 1423 - 1555; exon 3: pi 2150 - pi 2766. In the 5'-non-coding bo flanking sequence of this coding region, the SAAT box sequence, SAAT, is localized on the bases in positions from -82 to -79, which corresponds to pi 1116 - pi 1119 5EO IO MO: 1, and the sequence of TAT A-box,
ТАТААТА, локалізована на основах у положеннях від -53 до -47, що відповідає пі 1145 - пі 1151 5ЕО ІЮ МО.TATAATA, localized on bases in positions from -53 to -47, corresponding to pi 1145 - pi 1151 5EO IYU MO.
Полі-(А)-хвіст локалізований на 164-ій основі (нуклеотид 2932 5ЕО ІЮО МО:1) по ходу транскрипції від кодона термінації трансляції ТА. У 3-некодувальній ділянці присутня консенсусна послідовність сигналу поліаделювання ААТАА. Послідовність, що оточує перший АТС, практично відповідає консенсусній послідовності ініціації трансляції одночасткових рослин, відомій з літератури Юозпі СР. та ін., Ріапі Мої. Віо|., 35:993-1001 (1997).The poly-(A) tail is localized on the 164th base (nucleotide 2932 5EO IYUO MO:1) in the course of transcription from the TA translation termination codon. The consensus polyadelation signal sequence AATAA is present in the 3-noncoding region. The sequence surrounding the first ATS practically corresponds to the consensus sequence of the initiation of the translation of unicellular plants, known from the literature of Juozpi SR. etc., Riapi Moi. Bio|., 35:993-1001 (1997).
Відкрита рамка зчитування цієї кодувальної ділянки складається з 264 амінокислотних залишків і має 70 амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО 4.The open reading frame of this coding region consists of 264 amino acid residues and has the 70 amino acid sequence presented in ZEO IU MO 4.
Виведений з цієї відкритої рамки зчитування протеїн має молекулярну масу 26,4кДа і значення рі 6.1.The protein derived from this open reading frame has a molecular weight of 26.4 kDa and an ri value of 6.1.
Основні амінокислоти, що входять до складу протеїну, представлені аланіном (21,995), гліцином (9,990) і проліном (10,295), а його амінокислотна послідовність включає гідрофобну М-кінцеву ділянку, яка може брати участь у спрямованому переносі протеїну в мембранну фракцію або в позаклітинний простір, екстенсинподібний /5 МОТИВ ЗРРРРРР і багату на гліцин ділянку. Відповідно до аналізу гомології з використанням бази данихThe main amino acids that make up the protein are represented by alanine (21,995), glycine (9,990) and proline (10,295), and its amino acid sequence includes a hydrophobic M-terminal region that can participate in the directed transfer of the protein to the membrane fraction or to the extracellular space. space, extensin-like /5 MOTIF ZRRRRRR and glycine-rich area. According to homology analysis using a database
Сепебапк, така амінокислотна послідовність є новою і не має істотної ідентичності з жодною з послідовностей генів, відомих у даний час.Sepebapk, such an amino acid sequence is new and has no significant identity with any of the currently known gene sequences.
Експресія гена за даним винаходом відрізняється тим, що вона регулюється тимчасовими і просторовими факторами. Просторова схема експресії включає експресію гена тільки в такому органі квітки рису, як пиляк, го але при цьому експресії немає в інших органах квітки, відмінних від пиляка, у листі, корінні і т. ін, а в пиляку експресія, насамперед, відбувається в тапетумі, ендотеції і сполучних тканинах, але не в судинних тканинах. Тимчасова схема експресії відрізняється тим, що рівні експресії гена зростають у міру дозрівання квіток, причому слабка експресія гена починається на стадії, що передує мейозу, але його експресію вперше можна виявити в той час, коли мікроспори вивільняються з тетрад. Максимальні рівні виявляються на стадії сч ов вакуолізованого пилка, і вони різко знижуються на стадії зрілого пилка безпосередньо перед цвітінням.Gene expression according to this invention differs in that it is regulated by temporal and spatial factors. The spatial scheme of expression includes the expression of the gene only in such an organ of the rice flower as the anther, go, but at the same time there is no expression in other organs of the flower other than the anther, in the leaf, root, etc., and in the anther the expression primarily occurs in the tapetum , endothecia and connective tissues, but not in vascular tissues. The temporal pattern of expression differs in that the expression levels of the gene increase as flowers mature, with weak expression of the gene beginning at the stage preceding meiosis, but its expression being first detectable at the time when the microspores are released from the tetrads. The maximum levels are found at the stage of vacuolated pollen, and they decrease sharply at the stage of mature pollen just before flowering.
Ген за даним винаходом можна отримати за допомогою різних методів гібридизації. Наприклад, за (8) допомогою методу, що передбачає гібридизацію бібліотеки кКДНК пиляка з бібліотекою кДНК, яка має походження не з пиляка, наприклад, з листя, коріння або проростків, з одержанням у результаті цього клонуThe gene according to the present invention can be obtained using various hybridization methods. For example, by (8) using a method involving the hybridization of an anther cDNA library with a cDNA library of non-anther origin, such as leaves, roots, or seedlings, resulting in a clone
КДНК, специфічного для пиляка гена, що дає негативну реакцію з бібліотекою кДНК, яка походить не з пиляка. ю зо Крім того, отриманий клон кКДНК застосовують як зонд для гібридизації з геномною бібліотекою і виділяють клон, що дає позитивну реакцію, і його субклонують для одержання геномного клону, специфічного для пиляка гена. і,cDNA of an anther-specific gene that reacts negatively with a non-anther-derived cDNA library. In addition, the cDNA clone obtained is used as a probe for hybridization with a genomic library, and a clone that gives a positive reaction is isolated and subcloned to obtain a genomic clone specific for the anther gene. and,
Інший метод одержання гена включає метод, відповідно до якого послідовності основ 5ЕО ІЮ МО 1 ю використовують для синтезу відповідного праймера для загальноприйнятого методу ГЦР. Відповідно до конкретного варіанта здійснення винаходу отриманий ген клонують у векторі рВіезсгірі ЗК (-) і продукт «Another method of obtaining a gene includes a method according to which the sequence of bases 5EO IU MO 1 u is used for the synthesis of the appropriate primer for the generally accepted HCR method. According to a specific embodiment of the invention, the obtained gene is cloned in the rViezsgiri ZK vector (-) and the product "
Зв позначено як плазміда рОА1173-9. Ця плазміда депонована в Когеа Кезеагсп Іпвійше ої Віозсіепсе апа ї-Zv is designated as plasmid pOA1173-9. This plasmid is deposited in Kogea Kezeagsp Ipviyshe oi Viozsiepse apa i-
ВіоїесппоІоду, анексованій організації Когеа Айдмуапсей Іпвзійше ої Зсіепсе апа Тесппоіоду (КАЇІЗТ) під реєстраційним номером КСТС 8899Р 29 липня 1998р.VioyesppoIod, the annexed organization of Kogea Aidmuapse Ipvziyshe oi Zsiepse apa Tesppoiodu (KAIIZT) under the registration number KSTS 8899R on July 29, 1998.
Ділянка, що містить промотор КА8, наведена в 5ЕО ІЮ МО:З3, відповідає пі 1 - 1196 5ЕО ІЮ МО.The site containing the KA8 promoter, shown in 5EO IU MO:Z3, corresponds to pi 1 - 1196 5EO IU MO.
Транскрибовані нуклеотиди гена КА8 починаються в положенні 1197 ЗЕСО ІЮ МО:1. Елемент, що регулює « специфічну для пиляка експресію гена за даним винаходом, локалізований в ділянці, що містить промотор,екзон па) с 1, інтрон 1 і частину екзона 2, і цю ділянку можна подати у вигляді з«ЕО ІЮ МО:2, що відповідає послідовності основ між пі 1 їі пі 1436 послідовності основ, наведеній у ЗЕО ІЮ МО:1. Цей регуляторний елемент можна ;» отримати звичайним методом клонування з геномною ДНК рису або плазміди рОАЇ 173-9, наприклад, коли послідовність основ ЗЕО ІЮО МО:2 застосовують для синтезу відповідного праймера і після цього здійснюють звичайну ПЦР. -І Рослинний експресійний вектор за даним винаходом містить, наприклад, регуляторний елемент, наведений уThe transcribed nucleotides of the KA8 gene start at position 1197 of ZESO IU MO:1. The element that regulates the anther-specific expression of the gene according to the present invention is localized in the region containing the promoter, exon p) c 1, intron 1 and part of exon 2, and this region can be presented in the form of "EO IU MO:2, which corresponds to the sequence of bases between pi 1 and pi 1436 of the sequence of bases given in ZEO IU MO:1. This regulatory element can;" obtained by the usual method of cloning from the genomic DNA of rice or the plasmid rOAI 173-9, for example, when the sequence of the bases of ZEO IYUO MO:2 is used for the synthesis of the corresponding primer and then ordinary PCR is carried out. -I The plant expression vector according to the present invention contains, for example, the regulatory element listed in
ЗЕО ІЮ МО:2, причому, регулятор специфічної для пиляка експресії злитий з іншим цікавим для винаходу геном. ве Як потрібний ген може застосовуватися репортерний ген, такий як ген Д-глюкуронідази (505), а для цілей с індукції аномального розвитку пиляків рису може застосовуватися ЮОТА (ген токсичного продукту, що руйнуєZEO IU MO:2, moreover, the anther-specific expression regulator is fused with another gene interesting for the invention. As the desired gene, a reporter gene, such as the D-glucuronidase gene (505), can be used, and for the purpose of inducing the abnormal development of rice anthers, UOTA (a gene for a toxic product that destroys
Клітини), ген РНКази і т.ін. (див. нижче), але цікавий для винаходу ген не обмежений ними. о Рослинний експресійний вектор може містити другу касету експресії, яка включає маркерний ген, що дає 4 можливість здійснювати добір трансформантів. Приклади селектованих маркерних генів або маркерних генів, що їх можна відібрати в результаті скринінгу, наведено нижче. Для певних видів-мішеней кращими можуть виявитися різні маркери для селекції за ознакою стійкості до антибіотика або гербіциду. ЗвичайноCells), RNase gene, etc. (see below), but the gene of interest for the invention is not limited to them. o The plant expression vector can contain a second expression cassette, which includes a marker gene, which makes it possible to select transformants. Examples of selectable marker genes or marker genes that can be selected as a result of screening are given below. For certain target species, different markers for selection for resistance to an antibiotic or herbicide may be better. Of course
Застосовувані для трансформації селектувальні маркери включають ген прі, який дає стійкість до канаміцину, паромоміцину, генетицину і споріднених антибіотиків (Мівіга і Меззвіпд, Сепе, 19: 259-268 (1982); Вемап та іФ) ін., Маїшге 304: 184-187 (1983)), бактеріальний ген аад, що кодує спектиноміциндетоксикувальний фермент ко аміноглікозид-3--аденілтрансферазу і зумовлює стійкість до стрептоміцину або спектиноміцинуSelection markers used for transformation include the pri gene, which confers resistance to kanamycin, paromomycin, geneticin, and related antibiotics (Miviga and Mezzvipd, Sepe, 19: 259-268 (1982); Vemap et al., Maishge 304: 184-187 (1983)), the bacterial gene aad, which encodes the spectinomycin detoxifying enzyme co-aminoglycoside-3-adenyltransferase and causes resistance to streptomycin or spectinomycin
ІСоїдзсптіаєСІегтопі М., Мисі. Асідз Кез. 19: 4083-4089 (1991)), ген при, що дає стійкість до антибіотика бо пігроміцину (Віоспіпдег і Оіддеітапп, Мої. Сеї/ Віоі., 4: 2929-2931 (1984)), і ген ант, що дає стійкість до метотрексату |Воцгоціз та ін, ЕМВО .3., 2: 1099-1104 (1983)). Інші маркери, що їх можна використати, включають ген фосфінотрицинацетилтрансферази, що зумовлює стійкість до гербіциду фосфінотрицину |(М/пйе та ін., Мисі. Асідз Кев. 17: 106,2 (1990); Зрепсег та ін., Тпеог. Аррі. Сепеї. 79: 625-631 (1990)), мутантний ген ЕРБР-синтази, що кодує стійкість до гліфосату |ІНіпспее й ін., Віоїесппоіоду 6: 915-922 (1988)), мутантний дб Ген ацетолактатсинтази (АГ 5), що зумовлює стійкість до імідазоліону або сульфонілсечовини | ее та ін.,, ЕМВОISoidzsptiaeSIegtopi M., Mysi. Asidz Kez. 19: 4083-4089 (1991)), the pri gene conferring resistance to the antibiotic bo pygromycin (Viospipdeg and Oiddeitapp, Moi. Seii/ Vioi., 4: 2929-2931 (1984)), and the ant gene conferring resistance to of methotrexate | Votsgotsiz et al., EMVO .3., 2: 1099-1104 (1983)). Other markers that can be used include the phosphinothricin acetyltransferase gene, which confers resistance to the herbicide phosphinothricin (M/pie et al., Mysi. Asidz Kev. 17: 106.2 (1990); Zrepseg et al., Tpeog. Arry. Sepei. 79: 625-631 (1990)), a mutant ERBR-synthase gene encoding resistance to glyphosate |Inipspee et al., Bioespoiodu 6: 915-922 (1988)), a mutant db Gene of acetolactate synthase (AG 5), which causes resistance to imidazolion or sulfonylurea | ee and others, EMVO
У., 7: 1241-1248 (1988)), мутантний ген реб, що зумовлює стійкість до атразину |Зтеаа та ін., Ріапі Рпузіо|.U., 7: 1241-1248 (1988)), mutant gene reb, which causes resistance to atrazine |Zteaa et al., Riapi Rpuzio|.
103: 911-917 (1993)), або мутантний ген протопорфіриногеноксидази, описаний в ЕР 769059. Можна також застосовувати селектувальні маркери, що дозволяють здійснювати позитивний добір, такі як ген фосфоманозоізомерази, описаний у заявці на патент УУО 93/05163.103: 911-917 (1993)), or the mutant protoporphyrinogen oxidase gene described in EP 769059. It is also possible to use selection markers that allow for positive selection, such as the phosphomannose isomerase gene described in patent application UUO 93/05163.
Ідентифікацію трансформованих клітин також можна здійснити за допомогою експресії придатних для скринінгу маркерних генів, таких як гени, що кодують хлорамфеніколацетилтрансферазу (САТ), р-глюкуронідазу (55), люциферазу і зелений флуоресцентний протеїн (СЕР), чи будь-які інші протеїни, що зумовлюють фенотипійно помітні ознаки в трансформованих клітин.Identification of transformed cells can also be accomplished by expression of screenable marker genes, such as those encoding chloramphenicol acetyltransferase (CAT), p-glucuronidase (55), luciferase, and green fluorescent protein (CEP), or any other protein that cause phenotypically visible signs in transformed cells.
Експресійний вектор можна сконструювати злиттям зазначеного регулятора специфічного для пиляка 7/0 експресії з потрібним геном і наступного вмонтовування його шляхом лігування у відповідний рослинний експресійний вектор. Наприклад, регуляторний елемент зливають з 55 без змін рамки зчитування і потім злитий продукт лігують з бінарним вектором роА1633, що має здатність експресуватися в рослинах, одержуючи експресійний вектор рОоА1647.The expression vector can be constructed by fusing the specified regulator of anther-specific 7/0 expression with the desired gene and then inserting it by ligation into the appropriate plant expression vector. For example, the regulatory element is fused to 55 without changing the reading frame and then the fused product is ligated with the binary vector pOA1633, which has the ability to be expressed in plants, obtaining the expression vector pOoA1647.
Рекомбінантні послідовності ДНК за винаходом можуть інтродукуватися в рослинну клітину за допомогою 7/5 численних добре відомих методів. Фахівцям у даній сфері має бути ясно, що вибір способу визначається типом рослини, яка підлягає трансформації, а саме одночастковою чи двочастковою рослиною. Придатні методи трансформації рослинних клітин включають мікроін'єкцію |Стозву/лау та ін., ВіоТесппідцез 4: 320-334 (1986)|, електропорацію ІКідроз та ін., Ргос. Маї). Асад. сі, ЮОБА 83: 5602-5606 (1986), опосередковувану Адгорасіегіит трансформацію (Ніпспее та ін., ВіоїесппоІоду 6: 915-921 (1988), безпосередній перенос гена (Раз2Комузкі та ін. ЕМВО 3. 3: 2717-2722 (1984), і спосіб балістичного прискорення часток з використанням пристроїв, що випускаються фірмами Аадгасейшв, Іпс., Медисон, штат Висконсин і Юиропі, Іпс., Вілмінгтон, штат Делавар (див., наприклад, патент США 4945050; і МсСабре та ін., ВіоїСесппоіоду 6: 923-926 (1988)). Підлеглі трансформації клітини можуть являти собою диференційовані клітини листя, ембріогенні клітини або будь-який інший тип клітин.Recombinant DNA sequences according to the invention can be introduced into a plant cell using 7/5 numerous well-known methods. It should be clear to those skilled in the art that the choice of method is determined by the type of plant to be transformed, namely a monocot or dicot plant. Suitable methods of transformation of plant cells include microinjection |Stozvu/lau et al., VioTesppidcez 4: 320-334 (1986)|, electroporation Ikidroz et al., Rgos. Mai). Asad si, UOBA 83: 5602-5606 (1986), Adhorasiegiit-mediated transformation (Nipspee et al., Bioespoiodu 6: 915-921 (1988), direct gene transfer (Raz2Komuzki et al. EMVO 3. 3: 2717-2722 (1984) , and a method of ballistic particle acceleration using devices manufactured by Adgassew, Ips., of Madison, Wis., and Europe, Ips., of Wilmington, Delaware (see, e.g., US Pat. No. 4,945,050; and McSabre et al., Violations, Inc., 6 : 923-926 (1988)).Transformable cells can be differentiated leaf cells, embryogenic cells, or any other cell type.
Для безпосередньої трансформації протопластів поглинання екзогенного генетичного матеріалу с протопластом можна посилити застосуванням хімічного агента або електричного поля. Раніше проведено дослідження з використанням двочасткової рослини тютюну, що дозволило здійснити включення чужорідної ДНК і) і трансформацію потомства рослин (Раз2Комувкі та ін., ЕМВО 4. 3: 2717-2722 (1984); РоїгуКиз та ін., 1985, Мої.For the direct transformation of protoplasts, absorption of exogenous genetic material with the protoplast can be enhanced by using a chemical agent or an electric field. Previously, a study was carried out using a bipartite tobacco plant, which made it possible to carry out the inclusion of foreign DNA and) and the transformation of plant offspring (Raz2Komuvki et al., EMVO 4. 3: 2717-2722 (1984); RoiguKiz et al., 1985, Moi.
Сеп. Сепеї 199: 169-177). За допомогою цієї методики трансформують протопласти одночасткових рослин, наприклад, Тийісцт топососсут, Гойцт тиКШогит (райграс італійський), кукурудзи і чорної мексиканської МУ зо солодкої кукурудзи. Додатковим оптимальним варіантом здійснення є метод трансформації протопласта кукурудзи, описаний в ЕР 0292435, а також в ЕР 0846771. Методи трансформації кукурудзи також описано в і.Sept. Sepei 199: 169-177). With the help of this technique, protoplasts of unicellular plants are transformed, for example, Tiyist toposossut, Hoyst tiKShogit (Italian ryegrass), corn and black Mexican MU from sweet corn. An additional optimal implementation option is the method of corn protoplast transformation, described in EP 0292435, as well as in EP 0846771. Corn transformation methods are also described in and.
ІКолгієї та ін., Віо/Гесппоіоду 11:194-200 (1993)). Трансформацію рису можна здійснити за допомогою методик мМ безпосереднього переносу генів з використанням протопластів або за допомогою бомбардування частками.Icolgiei et al., Bio/Hesppoiodu 11:194-200 (1993)). Rice transformation can be carried out using direct gene transfer techniques using protoplasts or particle bombardment.
Опосередковувана протопластом трансформація описана для японських і індійських типів рису (папа та ін., в 3з5 Ріапі Се! Кер. 7: 379-384 (1988); Зпітатоїю та ін., Майте 338: 274-277 (1989); Оаца та ін., Віоїесппоюсду р 8: 736-740 (1990). Обидва типи рису також трансформують стандартними методами з використанням бомбардування частками |СНгізіои та ін., ВіоФесппоіоду 9: 957-962 (1991)). У заявці на патент ЕР 0332581 описані методи одержання, трансформації і регенерації протопластів рослин род. тонконогових (Рооідеаеє). Ці методи дають можливість здійснювати трансформацію всіх видів грястиці (Оасіуіїз зрр.) і пшениці. Крім того, « трансформація пшениці описана в ЕР 0674715 і в МУеекез зі співавторами, 1993 |Ріапі Рпузіо!. 102: 1077-1084ї1.. 5 с Сконструйований у такий спосіб рослинний експресійний вектор можна, наприклад, інтродукувати у калюси рису й за допомогою загальноприйнятого методу трансформації рослин, при цьому індукується диференціювання "» коріння й листя і потім рослини можна перенести в квітковий горщик для культивування, одержуючи тим самим трансформовані рослини рису.Protoplast-mediated transformation has been described for Japanese and Indian rice types (Papa et al., in 3z5 Riapi Se! Ker. 7: 379-384 (1988); Zpitatoiu et al., Mayte 338: 274-277 (1989); Oatsa et al. ., Viojesppoyusdu p 8: 736-740 (1990). Both types of rice are also transformed by standard methods using particle bombardment |SNgizoioi et al., VioFesppoyusdu 9: 957-962 (1991)). The patent application EP 0332581 describes the methods of obtaining, transforming and regenerating protoplasts of plants of the genus thin-legged (Rooideae). These methods make it possible to carry out the transformation of all types of ryegrass and wheat. In addition, "transformation of wheat is described in EP 0674715 and in Muekez et al., 1993 | Riapi Rpuzio!. 5 p cultivation, thereby obtaining transformed rice plants.
Оптимальним методом трансформації рослин є опосередковувана Адгорасіегішт трансформація. Як -і репрезентативний приклад опосередковуваної Адгорасіегішт трансформації експресійний вектор РОА1647 переносять у Адгорасіегіт (Шпіеїтасіеєп5, що несе бінарну Ті-плазміду, використовуючи метод ть заморожування-відтавання |Ап (3. та ін. (ред.) Ріапі Моїіесшаг Віоіоду Мапиаї, стор.АЗ/1-АЗ/19, Кішмег с Асадетіс Рибіїзпеге, Юогагесні (1998)), а потім вирощують у рідкому АВ-середовищі, доповненому відповідними 5ор антибіотиками (Спійоп М-О, Рго. Май. Асад. Зсі. ОБА, 71: 3672-3676 (1974)), і отриманий у такий спосіб о продукт спільно культивують з калюсами на середовищі 2М6-Ав, доповненому 1мМ бетаїну |Нівї У. та ін., Ріапі 4 у., 6: 271-282 (1994))| у темноті при 2523 протягом 2-3 днів. Спільно культивовані калюси промивають стерильною водою, що містить цефотаксим, і знову інкубують у Мб-середовищі, що містить відповідний антибіотик і цефотаксим, протягом 3-4 тижнів, одержуючи активнорослі калюси. Ці калюси переносять у відповідне середовище для селекції, наприклад, М5-середовище (фірма ІМїе ТесппоІодіез), доповнене О2мг/л. НОК о (нафталіноцтова кислота), 2мг/л кінетину, 2905 сорбіту, 1,695 фітагару (фірма бірсо), що відповідає антибіотиком і 250мг/л цефотаксиму, а потім культивують протягом 2-3 тижнів в умовах безперервного освітлення з іме) інтенсивністю 30-ббмкмолів м'7с, оптимально 4Омкмолів м'с, одержуючи проростки. Ці проростки висаджують і вирощують у вегетаційній камері в умовах 1Огод світло/14год темноти, одержуючи трансгенні 60 рослини рису.The optimal method of plant transformation is Adhorasiegisht-mediated transformation. As a representative example of Adhorasiegist-mediated transformation, the expression vector ROA1647 is transferred to Adgorasiegit (Spieitasieip5, which carries a binary Ti-plasmid, using the freezing-thawing method |Ap (3. et al. (ed.) Riapi Moiiesshag Viiodu Mapiai, p. AZ /1-AZ/19, Kishmeg s Asadetis Rybiizpege, Juogagesni (1998)), and then grown in a liquid AB medium supplemented with appropriate 5or antibiotics (Spiyop M-O, Rgo. May. Asad. Zsi. OBA, 71: 3672 -3676 (1974)), and the product obtained in this way is co-cultivated with calli on 2M6-Av medium supplemented with 1 mM betaine | Nivy U. et al., Riapi 4 u., 6: 271-282 (1994))| in the dark at 2523 for 2-3 days. Co-cultivated calli are washed with sterile water containing cefotaxime and incubated again in Mb-medium containing the appropriate antibiotic and cefotaxime for 3-4 weeks, obtaining actively growing calli. These calli are transferred to a suitable medium for selection, for example, M5 medium (IMie TesppoIodiez company), supplemented with O2 mg/l. NOK o (naphthalene acetic acid), 2 mg/l kinetin, 2905 sorbitol, 1.695 phytagar (Birso company), corresponding to the antibiotic and 250 mg/l cefotaxime, and then cultured for 2-3 weeks under conditions of continuous illumination with an intensity of 30-bbmmol m'7s, optimally 4Ommol m's, obtaining seedlings. These seedlings are planted and grown in a vegetative chamber under conditions of 1 hour of light/14 hours of darkness, obtaining transgenic 60 rice plants.
У випадку, коли застосовуваний відповідно до цього методу вектор містить злитий ген регуляторного елемента за даним винаходом і гени ОТА чи РНкКази і т.ін., трансформована вектором рослина має ознаку чоловічої стерильності.In the case when the vector used in accordance with this method contains a fused gene of the regulatory element according to the present invention and genes of OTA or RNkKase, etc., the plant transformed by the vector has a sign of male sterility.
Кодувальна послідовність ДНК за даним винаходом може являти собою будь-яку послідовність ДНК, що 65 кодує потрібний поліпептид. Однак особливо бажаними згідно з даним винаходом є кодувальні послідовностіThe DNA coding sequence of the present invention can be any DNA sequence that encodes the desired polypeptide. However, coding sequences are particularly preferred according to the present invention
ДНК, що кодують поліпептидний продукт, при експресії якого в тканині пиляка рослина не може утворювати життєздатний пилок. Приклади таких кодувальних послідовностей ДНК включають гени, описані в наведених нижче посиланнях, повністю включених у даний опис як посилання: а) ген ланцюга А дифтерійного токсину (ОТА), що інгібує синтез протеїнів (СгеепіїєЇїд та ін., Ргос. Маї).DNA encoding a polypeptide product, when expressed in the anther tissue, the plant cannot form viable pollen. Examples of such DNA coding sequences include the genes described in the following references, which are fully incorporated herein by reference: a) the diphtheria toxin (OTA) chain A gene, which inhibits protein synthesis (Sgeepieliid et al., Rgos. Mai).
Асад. зсі., ОА, 80: 6853 (1983); РаїгтЦег та ін., Сеї! 50: 435-443(1987)); б) ген пектат-ліази ре! Егміпіа спгузапіпеті ЕС 16, що розщеплює пектин, викликаючи лізис клітин І(Кееп та ін., У. Васіегіоїоду 168: 595 (1986)); в) ген Т-опІЗ (ТОКЕ-13) з ств-Т мітохондрійних геномів кукурудзи: цей ген кодує поліпептид, позначений як ОКЕ13, що руйнує мітохондрійні чи плазматичні мембрани |(|Вгацшп та ін., Ріапі СеїІ 2: 153 (1990); Осуеу та 7/0. ін. Ргос. Май). Асад. зсі., ОА, 84: 5374 (1987) і Оемеу та ін., Сеї! 44: 439 (1986)); г) ген діп-рекомбінази гена Мі фага, що кодує сайтспецифічну ДНК-рекомбіназу, яка може викликати реаранжування генома і зниження життєздатності клітин при експресії в рослинних клітинах |Маезег та ін., Мої.Asad zsi., OA, 80: 6853 (1983); RaigtTseg and others, Sei! 50: 435-443 (1987)); b) pectate lyase gene re! Egmipia spguzapipeti ES 16, which cleaves pectin, causing lysis of cells I (Keep et al., U. Vasiegioiodu 168: 595 (1986)); c) the T-opIZ gene (TOKE-13) from the st-T mitochondrial genomes of corn: this gene encodes a polypeptide designated as OKE13, which destroys mitochondrial or plasma membranes |(|Vgatsshp et al., Riapi SeiI 2: 153 (1990) ; Osueu and 7/0. others. Rgos. May). Asad zsi., OA, 84: 5374 (1987) and Oemeu et al., Sei! 44: 439 (1986)); d) the dip-recombinase gene of the Mi phage gene, which encodes a site-specific DNA recombinase, which can cause genome rearrangement and a decrease in cell viability when expressed in plant cells |Maezeg et al., Moi.
Сеп. Сепеї. 230: 170-176(1991)); д) ген синтетази індолоцтова кислота-лізин (іааі) Рзейдотопаз зугіпдае, що кодує фермент, який забезпечує 7/5 Кон'югацію лізину з індолоцтовою кислотою (ІА). При експресії в клітинах рослин він спричиняє порушення розвитку внаслідок видалення ІАА із клітин у результаті кон'югації |Котапо та ін., Сепез апа ЮОемеіортепі 5: 438-446 (1991); Зрепа та ін. Мої. Сеп. Сепеї. 227: 205-212 (1991); Корепо та ін., Рго Май! Асай сі О5А, 87: 5795-5801 (1990)|; і е) ген токсину Суї Васійив (пПигіпдіепзіз ізгаєЇйепвії, що кодує москітоцидний (токсичний для комарів) і гемолітичний протеїн. При експресії в рослинних клітинах він викликає загибель клітин через руйнування клітинної мембрани (|Мс! еап та ін., У. Васіегіоїоду 169: 1017-1023 (1987); ЕПІаг та ін., патент США 4918006, 19901.Sept. Sepoys 230: 170-176 (1991)); e) the indoleacetic acid-lysine (iaai) synthetase gene Rzeidotopase zugipdae, which encodes an enzyme that provides 7/5 Conjugation of lysine with indoleacetic acid (IA). When expressed in plant cells, it causes developmental disorders due to the removal of IAA from cells as a result of conjugation. Zrepa and others. My. Sept. Sepoys 227: 205-212 (1991); Korepo and others, Rho Mai! Asai Si O5A, 87: 5795-5801 (1990)|; and f) the Sui Vasiyiv toxin gene (pPigyepsis izgaeYiepvia), which encodes a mosquitocidal (toxic to mosquitoes) and hemolytic protein. When expressed in plant cells, it causes cell death due to the destruction of the cell membrane (|Ms! eap et al., U. Vasigioiodu 169: 1017-1023 (1987); EPIag et al., US patent 4918006, 19901.
ПрикладиExamples
Нижче даний винахід описано докладніше з посиланням на приклади, які жодним чином не спрямовані на обмеження обсягу даного винаходу. Приклад 1: Виділення специфічного для пиляка рису гена КА8 счBelow, the present invention is described in more detail with reference to examples, which are in no way intended to limit the scope of the present invention. Example 1: Isolation of the KA8 gene specific for rice anther
Стадія 1: Виділення гена КА8Stage 1: Isolation of the KA8 gene
Квітки рису (Огула займа |. МаКдопо) на стадії пізньої вакуолізованої поперечно розрізають на три і) частини. Як зразок з високим умістом пиляків використовують середню ділянку, яка містить інтактні пиляки і частини верхньої і нижньої квіткової луски. З цієї ділянки з високим умістом пиляків виділяють мРНК, використовуючи набір для виділення мРНК "роїу (А) Оціск тАМА Ізоїайоп" (фірма бігаїадепе, США). ю Конструюють бібліотеки КДНК за допомогою набору "7АР-СДНК Сідараск 2 Соїд Сіопіпо" (фірма 5ігагадепе), у яких як матрицю використовують мРНК. оRice flowers (Ogula zay |. MaKdopo) at the late vacuolated stage are transversely cut into three i) parts. As a sample with a high content of anthers, the middle section, which contains intact anthers and parts of the upper and lower flower scales, is used. From this area with a high content of anthers, mRNA is isolated using a kit for the isolation of mRNA "roiu (A) Otsisk tAMA Izoyayop" (bigaiadepe company, USA). cDNA libraries are constructed using the "7AR-SDNK Sidarask 2 Soid Siopipo" kit (5igadape company), in which mRNA is used as a matrix. at
Цю ж методику застосовують для листя, що збирають у б-денних проростків рису для конструювання ю бібліотек КДНК листа.The same technique is used for leaves collected from b-day seedlings of rice for the construction of leaf cDNA libraries.
Зі сконструйованих бібліотек КДНК пиляка довільно відбирають 33 клони кДНК і після цього ділянки кКДНК, що - одержують розщепленням відповідного клону ДНК за допомогою Есокі, мітять радіоактивним ізотопом З2р і - гібридизують із бляшками з бібліотеки кДНК листа.33 cDNA clones are arbitrarily selected from the constructed cDNA libraries of anthers and after that the cDNA sections obtained by cleavage of the corresponding DNA clone using Esoki, labeled with the radioactive isotope Z2p and - hybridized with plaques from the leaf cDNA library.
У результаті цього 6 клонів КДНК пиляка, що не дають позитивної реакції з бляшками з бібліотеки КДНК листа, і серед цих клонів відбирають один клон, що найчастіше присутній у бібліотеці кКДНК пиляка, і « позначають як КАВ.As a result, 6 anther cDNA clones that do not give a positive reaction with plaques from the leaf cDNA library, and among these clones, one clone, which is most often present in the anther cDNA library, is selected and designated as CAV.
Фаг-хелпер її К408 (фірма бігаїадепе) застосовують для одержання рекомбінантної плазміди рОАїЇ 173-4 - с (КАВ8) з цього клону КА8, у який фрагмент кДНК вмонтовують шляхом вирізання іп уімо, і послідовності основ ц КДНК КАВ, які клонують у вищевказаній плазміді, визначають методом Запдег та ін. |(Запдег КЕ. та ін., Ргос. "» Май. Асай. Зсі. ОА, 74: 5463-5467 (1977)|.Its K408 phage helper (Bigaiadepe company) is used to obtain the recombinant plasmid pOAiY 173-4 - s (KAV8) from this KA8 clone, into which the cDNA fragment is inserted by cutting the ip uimo, and the sequence of the bases of the cDNA of KAV, which is cloned in the above-mentioned plasmid , determined by the method of Zapdeg et al. |(Zapdeg KE. et al., Rgos. "» May. Asai. Zsi. OA, 74: 5463-5467 (1977)|.
Ці послідовності основ представлені в ЗЕО ІЮ МО:7. Як видно з БЕО ІЮО МО:7, нуклеотидна послідовністьThese base sequences are presented in ZEO IU MO:7. As can be seen from the BEO IYUO MO:7, the nucleotide sequence
КДНК КАВ складається з 1008 пар основ. Відкрита рамка зчитування простягається від пі 51 до пі 842 5ЕО Ір -І МО:7,. що складається з 264 амінокислотних залишків. Протеїн, виведений з цієї відкритої рамки зчитування, має молекулярну масу 26,4кДа і рі 6,1. Послідовність, що оточує перший АТО, добре відповідає консенсусній е послідовності ініціації трансляції одночасткових рослин, відомій з літератури (овзпі С.Р. та ін., Ріапі Мої. ос Віоі., 35:993-1001 (1997)), полі-а-хвіст локалізований у положенні 164 послідовності основ, розташованої по ходу транскрипції щодо кодона термінації трансляції ТА. У 3'-некодувальній ділянці присутня консенсусна о послідовність сигналу полідделювання ААТАА. сл Основні амінокислоти, що входять до складу зазначеної вище амінокислотної послідовності, представлені аланіном (21,9965), гліцином (9,995) і проліном (10,290), а їхня амінокислотна послідовність включає гідрофобнуKAV cDNA consists of 1008 base pairs. The open reading frame extends from pi 51 to pi 842 5EO Ir -I MO:7,. consisting of 264 amino acid residues. The protein deduced from this open reading frame has a molecular weight of 26.4 kDa and an ri of 6.1. The sequence surrounding the first ATO corresponds well to the consensus sequence for the initiation of the translation of unicellular plants known from the literature (see S.R. et al., Riapi Moi. os Vioi., 35:993-1001 (1997)), poly-a -the tail is located at position 164 of the sequence of bases, located along the course of transcription relative to the TA translation termination codon. In the 3'-non-coding region there is a consensus sequence of the cleavage signal AATAA. The main amino acids that make up the above amino acid sequence are represented by alanine (21.9965), glycine (9.995) and proline (10.290), and their amino acid sequence includes a hydrophobic
М-кінцеву ділянку, яка може брати участь у спрямованому переносі протеїну в мембранну фракцію або в позаклітинний простір, екстенсинподібний мотив 5РРРРРР і багату на гліцин ділянку. Відповідно до аналізу гомології з використанням бази даних Сепебрапк, така амінокислотна послідовність є новою і її послідовність не іФ) є в значній мірі ідентичною до жодної з відомих дотепер послідовностей генів. ко Стадія 2: Аналіз РНК методом блотингуThe M-terminal region, which can participate in the directed transfer of the protein to the membrane fraction or to the extracellular space, the extensin-like motif 5RRRRRR and the glycine-rich region. According to the homology analysis using the Sepebrapk database, such an amino acid sequence is new and its sequence is not substantially identical to any of the known gene sequences. co Stage 2: RNA analysis by blotting
Для підтвердження того, що отриманий на наведеній вище стадії 1 ген КА8 специфічно експресується в бор пиляку, загальну РНК виділяють з листя, коріння, молодих квіток, зрілих квіток і верхньої/нижньої квіткової луски, маточок і тичинок квіток рису, піддають електрофорезу і потім переносять на нейлонову мембрану. Для здійснення блотингу РНК як зонд використовують мічену за допомогою З2Р-КДНК РАВ.In order to confirm that the KA8 gene obtained in the above stage 1 is specifically expressed in anther borer, total RNA is isolated from leaves, roots, young flowers, mature flowers and upper/lower flower scales, pistils and stamens of rice flowers, subjected to electrophoresis and then transferred on a nylon membrane. To carry out RNA blotting, a probe labeled with 32P cDNA RAV is used.
МРНК КАВ8 присутня тільки в квітках на різних стадіях розвитку, але відсутня у листі й корінні. Рівень експресії гена КА8 зростає в міру розвитку квітки, досягаючи максимуму в зрілих квітках. Для того, щоб 65 визначити специфічність експресії щодо певного органа квітки, експеримент із блотуванням РНК здійснюють з використанням загальної РНК, виділеної з різних органів квітки. Кожний з органів квітки розсікають під препарувальною лупою для того, щоб мінімізувати забруднення іншими органами. Результат свідчить про те, щоKAV8 mRNA is present only in flowers at different stages of development, but is absent in leaves and roots. The expression level of the KA8 gene increases as the flower develops, reaching a maximum in mature flowers. In order to 65 determine the specificity of expression for a certain flower organ, an RNA blotting experiment is performed using total RNA isolated from different flower organs. Each of the organs of the flower is dissected under a dissecting magnifying glass in order to minimize contamination by other organs. The result shows that
МРНК КАЗВ присутня в пиляках, але відсутня у плодолистку або верхній/нижній квітковій лусці.KAZV mRNA is present in anthers but absent in carpel or upper/lower floral scales.
Стадія З: Виділення геномного клону КАВStage C: Isolation of the KAV genomic clone
Бляшки геномних бібліотек рису (які конструюють стандартними методами й одержують від Зіеме Кау іPlaques of rice genomic libraries (constructed by standard methods and obtained from Zieme Kau and
Мат-нНі Спца з Університету Рокфеллера у формі ДНК фага лямбда ЕМВІ, у яку вмонтовують геномну ДНК рису) переносять на нейлонову мембрану (типу Нуропа, фірма Атегзпаті і гібридизують з радіоактивноміченою за допомогою ЗР кКДНК КАВ як зонди для гібридизації. Гібридизовану нейлонову мембрану експонують на рентгенівську плівку й одержують клони фата з бляшок, що дають позитивну реакцію. ДНК фага лямбда 70 виділяють з цих клонів фата, розщеплюють за допомогою Ватні, одержуючи геномний фрагмент завдовжки 13,7т.п.н. і в ньому субклонують Засі-ЕсоКІ-фрагмент завдовжки 4,3т.п.н.Mat-nNi Sptsa from the Rockefeller University in the form of EMVI lambda phage DNA, into which the genomic DNA of rice is inserted) is transferred to a nylon membrane (Nuropa type, Ategzpati company and hybridized with radioactively labeled with the help of ZR cDNA KAV as probes for hybridization. The hybridized nylon membrane is exposed to X-ray film and phage clones are obtained from plaques that give a positive reaction. Phage lambda 70 DNA is isolated from these phage clones, cleaved with the help of Watney, obtaining a genomic fragment of 13.7 kb in length, and the Zasi-EsoKI fragment is subcloned into it 4.3 t.p.n. long
Засі-фрагмент завдовжки 2,9т.п.н. з Басі-ЕсоКІ-фрагмента завдовжки 4,Зт.п.н. містить 5--фланкувальну послідовність і 5'-кодувальну ділянку, у той час як примикальний Засі-ЕсоКІ-фрагмент завдовжки 1,5т.п.н. містить іншу кодувальну ділянку і 3'-рланкувальну послідовність. Два інтрони (інтрон 1 і інтрон 2) і З екзона 75 присутні в кодувальній ділянці. Щодо ЗЕО ІЮО МО:1 ці З екзони локалізовані в такий спосіб: екзон 1: пі 1247 - пі 1288; екзон 2: пі 1423-1555; екзон З: пі 2150 - пі 2766. Інтрон 1 складається з 134 пар основ і локалізований між 14-им і 15-им колонами, що відповідає пі 1289 - пі 1422 ЗЕО ІО МО-1, а інтрон 2 складається з 594 пар основ і локалізований на 59-ому кодоні, що відповідає пі 1556 - пі 2149 5ЕО ІЮО МО. Обидва інтрони містять консенсусні послідовності СТ і АТ на 5- і З-кінцях відповідно. 5-фланкувальна послідовність Кодувальної ділянки КА8 містить послідовність СААТ-бокса, СААТ простягається від основи -82 до -79, що відповідає пі 1116 - пі 1119 БЕО ІО МО:1, а послідовність ТАТА-бокса, ТАТААТА простягається від положення від -53 до -47, що відповідає пі 1145 - пі 1151 5ЕО ІЮ МО:1.Zasi-fragment length 2.9 t.p.n. from Basi-EsoKI-fragment length 4,Zt.p.n. contains a 5--flanking sequence and a 5'-coding region, while the adjacent Zasi-EsoKI fragment of 1.5 kb in length. contains another coding region and a 3'-linking sequence. Two introns (intron 1 and intron 2) and C of exon 75 are present in the coding region. Regarding ZEO IYUO MO:1, these Z exons are localized as follows: exon 1: pi 1247 - pi 1288; exon 2: pi 1423-1555; exon C: pi 2150 - pi 2766. Intron 1 consists of 134 base pairs and is localized between the 14th and 15th columns, corresponding to pi 1289 - pi 1422 of ZEO IO MO-1, and intron 2 consists of 594 base pairs and localized on the 59th codon corresponding to pi 1556 - pi 2149 5EO IYUO MO. Both introns contain consensus sequences ST and AT at the 5- and 3-ends, respectively. The 5-flanking sequence of the KA8 coding region contains the CAAT box sequence, CAAT extends from base -82 to -79, corresponding to pi 1116 - pi 1119 of BEO IO MO:1, and the TATA box sequence, TATAATA extends from position -53 to -47, which corresponds to pi 1145 - pi 1151 5EO IYU MO:1.
Засі-фрагмент завдовжки 2,От.п.н. клонують у плазмідному векторі рВіцезсгірі ЗК (-), і цю плазміду позначають як роАї 173-9. Ця плазміда депонована в |Когеа Кезеагсі Іпзійше ої Віозсіепсе апа ВіоФесппоіоду, ГаZasi-fragment length 2, Ot.p.n. cloned in the plasmid vector rVicezsgiri ZK (-), and this plasmid is designated as roAi 173-9. This plasmid has been deposited in |Kogea Kezeagsi Ipziyshe oi Viozsiepse apa VioFesppoiodu, Ga
Філії Когеа Адмапсеа Іпзійше ої Зсіепсе апа Тесппоіоду (КАІЗТ), 29 липня 1998р. під реєстраційним номеромBranches of Kogea Admapsea Ipziyshe oi Zsiepse apa Tesppoiodu (KAIZT), July 29, 1998. under the registration number
КСте 8899Р1І. і)KSte 8899R1I. and)
Послідовності основ фрагмента сгеномної ДНК, що клонують у плазміді роОА1173-9, аналізують, використовуючи метод Запдег та ін. і визначають промоторну ділянку завдовжки приблизно 2,5т.п.н.. у порівнянні з КДНК. юThe base sequences of the sgenomic DNA fragment cloned in the roOA1173-9 plasmid are analyzed using the method of Zapdeg et al. and determine the promoter region of approximately 2.5 tbp in length compared to cDNA. yu
Для вивчення геномної варіабельності клону КА8 геномну ДНК, виділену з листя 2-тижневих проростків рису, розщеплюють за допомогою Есокі, Ніпаїй чи Реї і потім піддають ДНК-блотингу з КДНК КА8. кДНК-зонд КАВ8 і. гібридизується з однією смугою геномної ДНК рису, що доводить, що ген КА8 існують в одній копії в геномі рису. юTo study the genomic variability of the KA8 clone, the genomic DNA isolated from the leaves of 2-week-old rice seedlings is digested using Esoka, Nipai, or Rhea and then subjected to DNA blotting with KA8 cDNA. KAV8 cDNA probe and. hybridizes with one strand of rice genomic DNA, which proves that the KA8 gene exists in one copy in the rice genome. yu
Приклад 2: Одержання рослинного експресійного вектораExample 2: Obtaining a plant expression vector
Бінарний вектор, що містить репортерний ген 5И5 і ген для селекції прі (гігроміцин-фосфотрансфераза), М Конструюють у такий спосіб. чаA binary vector containing a reporter gene 5І5 and a gene for selection at (hygromycin-phosphotransferase), M is constructed as follows. Cha
Плазміду рОА748 |Ап 0., Віпагу Ті ріазтій месіогв, Адгобасіегішт ргоїосоЇїв. Нитапа Ргезв, стор.47-58) розщеплюють за допомогою Ватні і Ніпайі, і потім у неї вмонтовують промотор Самуз55 |Вепгеу та ін., зсіепсе, 250: 959-966 (1993)). Ген, що зумовлює стійкість до гігроміцину (гігроміцин-фосфотрансфераза, прі) (Оггі: та « ін., (1983))| вмонтовують у сайт Ва отриманої в такий спосіб плазміди. Цю плазміду розщеплюють за допомогоюPlasmid pOA748 |Ap 0., Vipagu Ti riaztiy mesiogv, Adgobasiegisht rgoiosoyiv. Nytapa Rgezv, pp. 47-58) is cleaved with the help of Vatni and Nipai, and then the Samuz55 promoter is inserted into it | Vepgeu et al., zsiepse, 250: 959-966 (1993)). The gene causing resistance to hygromycin (hygromycin-phosphotransferase, pri) (Oggi: et al., (1983))| plasmids obtained in this way are inserted into the Ba site. This plasmid is cleaved with
Ніпай ї Сіаім, "затуплюють" кінець і потім лигують. Отриману в такий спосіб плазміду розщеплюють за ей с допомогою Зас для видалення фрагмента завдовжки приблизно 0,5т.п.н. і потім повторно лигують. У сайт Ватні ц цієї плазміди вмонтовують синтетичний адаптер, що несе сайти розщеплення Ватні, Ніпайїйй, Хваї, Зас, Нраї, "» Крпі, Сіаї і Ваоїїї, створюючи плазміду рОА1182.Nipai and Siaim, they "blunt" the end and then ligate. The plasmid obtained in this way is cleaved by EI with the help of Zas to remove a fragment approximately 0.5 t.p.n. long. and then religated. A synthetic adapter carrying Watni, Nipaiyi, Khwai, Zas, Nrai, Krpi, Siai, and Waoi cleavage sites is inserted into the Watni site of this plasmid, creating plasmid pOA1182.
Здійснюють ПЦР, використовуючи плазміду РОА1182 як матрицю, 5-ТТООСАТОСАСАТАС-3' (5ЕО ІЮО МО:5) у функції праймера 1 і 5-СООСБАТССОТОТТТОАСАСО-3 (5ЕО ІЮ МО:6) у функції праймера 2. -І Отриманий фрагмент завдовжки приблизно 120 пар основ розщеплюють за допомогою Ватні і зр, а потім умонтовують шляхом літування у фрагмент завдовжки приблизно 9т.п.н., що одержують шляхом розщеплення е плазміни роАЇ 182 за допомогою цих же рестриктаз. Між сайтами Ватні і СіаІ отриманої в такий спосіб плазміди ос вмонтовують ген (35 ШеПегзоп та ін., ЕМВО )/, 6: 3901-3907 (1987)), створюючи бінарний вектор рОоА1633.PCR is carried out using plasmid POA1182 as a template, 5-TTOOSATOSASATAS-3' (5EO IJU MO:5) in the function of primer 1 and 5-COOSBATSSOTTTTOASASO-3 (5EO IJU MO:6) in the function of primer 2. -I The resulting fragment is approximately 120 base pairs are cleaved with the help of Vatny and zr, and then mounted by lithiation into a fragment approximately 9 kb long, which is obtained by cleaving e plasmin roAI 182 with the help of the same restriction enzymes. Between the sites of Watni and SiaI, the plasmid obtained in this way mounts a gene (35 ShePegzop et al., EMVO )/, 6: 3901-3907 (1987)), creating a binary vector pOoA1633.
Плазміду рОА1173-9, що містить геномну ДНК КАВ8 завдовжки 2,9т.п.н., сконструйовану на стадії З прикладу о 1, піддають ПЦР із використанням синтетичних олігомерних праймерів, представлених у 5ЕО ІЮ МО:68 с (ААТТААСССТСАСТАДАСОС) і ЗЕБЕО 0 МО (ССОСБАТССАССТІ-СДАССАС). Синтетичний олігомер, послідовність якого наведена в ЗЕО ІЮ МО:9, забезпечує створення сайта Ватні в екзоні 2 гена КАВ8.Plasmid pOA1173-9, containing genomic DNA KAV8 2.9 kb in length, constructed at stage C of example 1, is subjected to PCR using synthetic oligomeric primers presented in 5EO IYU MO:68 s (ААТТААСССТСТАДАСОС) and ZEBEO 0 MO (SSOSBATSSASSTI-SDASSAS). The synthetic oligomer, the sequence of which is given in ZEO IU MO:9, ensures the creation of the Watni site in exon 2 of the KAV8 gene.
Потім конструюють плазміду рОА1639, що містить ампліфіковану послідовність, зазначену вище. Плазміда рОА1639 містить Засі-ВатНІ-фрагмент завдовжки 2,7т.п.н., що включає 5'-фланкувальну ділянку екзона 1, інтрон 1 і частину екзона 2 гена КАВ8.Then construct the pOA1639 plasmid containing the amplified sequence indicated above. Plasmid pOA1639 contains a Zasi-WatNI fragment 2.7 kb long, which includes the 5'-flanking region of exon 1, intron 1 and part of exon 2 of the KAV8 gene.
Ф, Цей фрагмент з'єднують з кодувальною послідовністю р-глюкуронідази в рОА1633, створюючи рослинний ко експресійний вектор рОзА1647. У векторі рОА1647, описану вище походженням з гена КА8 послідовність зливають у ново-інтродукованому сайті Ватні в екзоні 2 з геном БИ без якого-небудь розщеплення відкритої 60 рамки зчитування. У такий спосіб одержують трансляційне злиття між частиною гена КА8 і кодувальною послідовністю р-глюкуронідази.F, This fragment is combined with the p-glucuronidase coding sequence in pOA1633, creating the plant co-expression vector pOzA1647. In the pOA1647 vector, the sequence described above originating from the KA8 gene is merged in the newly introduced Watni site in exon 2 with the BI gene without any cleavage of the open 60 reading frame. In this way, a translational fusion between part of the KA8 gene and the p-glucuronidase coding sequence is obtained.
Приклад 3: Одержання трансгенної рослини рисуExample 3: Obtaining a transgenic rice plant
Експресійним вектором роОА1647, сконструйованим відповідно до способу, описаного в прикладі 2; трансформують штам Аадгобасіегіит (Штегасіепз І ВА4404 |Ноекета та ін., Майиге, 303: 179-181 (1983)) який несе 65 бінарну Ті-плазміду рА! 4404, використовуючи метод заморожування-відтавання |Ап 0. та ін., (ред.) РіапіThe expression vector roOA1647, designed according to the method described in example 2; transform the Aadgobasiegiit strain (Stegasiepz I BA4404 | Noeketa et al., Mayige, 303: 179-181 (1983)) which carries the 65 binary Ti-plasmid pA! 4404, using the freeze-thaw method | Ap 0. et al., (ed.) Riapi
Моїіесшіаг Віоіоду Мапиаї, стор. АЗ/1-АЗ/19, Кішмег Асадетіс Рибіїзпегв, Юогагесні (1988).Moiiesshiag Vioiodu Mapiai, p. AZ/1-AZ/19, Kishmeg Asadetis Rybiizpegv, Juogagesni (1988).
Трансформований штам Аадгорасіегішт (Шптеїасіепе І ВА4404 вирощують протягом З днів у рідкомуThe transformed strain Aadhorasiegisht (Shpteiasiepe I BA4404 is grown for 3 days in liquid
АВ-середовищі, доповненому ЗОмг/л гігроміцину В і Змг/л тетрацикліну, і його спільно культивують із тритижневими калюсами, ріст яких індукують зі скутелуму зрілого насіння у середовищі Мб (Спи С.С. та ін.,AB medium, supplemented with 3 mg/l of hygromycin B and 3 mg/l of tetracycline, and it is co-cultured with three-week-old calli, the growth of which is induced from the scutellum of mature seeds in Mb medium (Spy S.S. et al.,
Зсі, біп., 18: 659-668 (1975)), що містить 2мг/л 2,5-Д, у середовищі 2М6-Аз, доповненому 1мМ бетаїну |Ніеї У. та ін., Ріапі у., 6: 271-282 (1994)| у темноті при 252 протягом 2-3 днів. Спільно культивовані калюси промивають стерильною водою, що містить 10Омг/л цефотаксиму, і знову інкубують у Мб-середовишд, що містить 4Омг/л гігроміцину і 25О0мг/л цефотаксиму, протягом 3-х тижнів. Активнорослі, стійкі до гігроміцину калюси переносять у середовище для селекції |наприклад, М5-середовище (фірма І Те Тесппоіодіев) ї- 0,2мг/л НОК (нафталіноцтова 7/0 Кислота) ж 2мг/л кінетика ж 296 сорбіту - 1,695 фітагару (фірма сСірсо) ї- Б5Омг/л гігроміцину В ж-- 25Омг/л цефотаксиму), а потім культивують протягом 2-3 тижнів в умовах безперервного освітлення з інтенсивністю 40 /мкмолів м'7с7. Отримані в такий спосіб проростки висаджують і вирощують у вегетаційній камері в умовах 10год світла/14год темноти, одержуючи в цілому 22 трансгеннії рослини рису.Zsi, bip., 18: 659-668 (1975)), containing 2 mg/l 2,5-D, in 2M6-Az medium supplemented with 1 mM betaine | Nieyi U. et al., Riapi U., 6: 271 -282 (1994)| in the dark at 252 for 2-3 days. The co-cultivated calli are washed with sterile water containing 10mg/l cefotaxime and incubated again in Mb medium containing 4mg/l hygromycin and 2500mg/l cefotaxime for 3 weeks. Actively growing, hygromycin-resistant calli are transferred to the medium for selection | for example, M5 medium (I Te Tesppoiodiev company) i- 0.2 mg/l NOK (naphthalene acetic acid 7/0) and 2 mg/l kinetics and 296 sorbitol - 1.695 phytagar ( company sSirso) i- B5Omg/l of hygromycin V z-- 25Omg/l of cefotaxime), and then cultivated for 2-3 weeks under conditions of continuous lighting with an intensity of 40 /μmol m'7s7. The seedlings obtained in this way are planted and grown in a vegetative chamber under conditions of 10 hours of light/14 hours of darkness, obtaining a total of 22 transgenic rice plants.
Для добору лінії рослини з найбільш високим рівнем експресії в пиляках серед цих двадцяти двох (22) 75 трансгенних рослин рису, здійснюють гістохімічне фарбування на 5И5 квітковій ділянці трансгенної рослини рису відповідно до методу Юаї та ін. |(Оваі 7. та ін., Ріапі Мої. ВіоЇ., 32; 1055-1065 (1996)), з тією модифікацією, що в розчині для фарбування міститься 2095 метанолу, і потім фіксують у фіксаційному розчині (5095 етанолу, 595 оцтової кислоти і 3,790 формальдегіду). Дослідження зразків проводять за допомогою препарувальної лупи (х7,5-кратне збільшення). На основі цих результатів відбирають рослину рису з найбільш високим рівнем експресії 65 у пиляках і позначають як трансгенна лінія рослини А11279,To select the plant line with the highest level of expression in anthers among these twenty-two (22) 75 transgenic rice plants, perform histochemical staining on the 5І5 flower area of the transgenic rice plant according to the method of Yuai et al. |(Ovai 7. et al., Riapi Moi. Viol., 32; 1055-1065 (1996)), with the modification that the staining solution contains 2095 methanol, and then fixed in a fixative solution (5095 ethanol, 595 acetic acid and 3.790 formaldehyde). Samples are examined using a dissecting magnifier (x7.5-fold magnification). Based on these results, a rice plant with the highest expression level of 65 in anthers is selected and designated as transgenic plant line A11279,
Приклад 4: Гістохімічний аналіз СО м трансгенних рослинах рисуExample 4: Histochemical analysis of CO in transgenic rice plants
Для вивчення просторової і тимчасової схем експресії гена КА8, молоді квітки, квітки на ранній стадії вакуолізованого пилка, зрілі квітки, листя і коріння трансгенної лінії рису АН279, отриманої в прикладі З, піддають гістохімічному аналізу щодо активності 35 відповідно до методики, описаної в прикладі З,і потім СМ обстежують під мікроскопом. Як контроль використовують квітку нетрансформованої рослини рису. (5)To study the spatial and temporal patterns of expression of the KA8 gene, young flowers, flowers in the early stage of vacuolated pollen, mature flowers, leaves and roots of the transgenic rice line AN279, obtained in example C, are subjected to histochemical analysis for the activity of 35 according to the method described in example C , and then the CM is examined under a microscope. A flower of an untransformed rice plant is used as a control. (5)
Експресія 55 під контролем промотору КАЗВ8 виявлена тільки в пиляках квіток рису, але не виявлена в інших органах квітки або в листі чи корінні. Крім того, рівень експресії репортерного гена ОЗ підвищувався в міру дозрівання квіток і експресія зовсім не відбувалася в молодих квітках на стадії, що передує мейозу.Expression of 55 under the control of the KAZV8 promoter was detected only in anthers of rice flowers, but not in other flower organs or in leaves or roots. In addition, the expression level of the reporter gene OZ increased as the flowers matured, and expression did not occur at all in young flowers at the stage preceding meiosis.
Для вивчення схем специфічної для пиляка експресії конструкції промотор КАВ8 - репортерний ген після І в) фарбування і фіксації 4 пиляки з квіток рису на різних стадія розвитку, відповідно до методики, описаної в с прикладі З, занурюють у парапласт (фірма Зідта) і роблять зрізи завтовшки 1Омкм. Зрізи обстежують за допомогою світлового мікроскопа (х100-кратне збільшення), використовуючи темнопільне освітлення. На стадії, Іо) що передує мейозу, активність ОЗ не виявлена в жодній з частин пиляка. Експресія 505 уперше виявлена в « момент часу, коли мікроспори вивільняються з тетрад. Найбільш високий рівень активності ЗОЗ виявлений у пиляках на стадії вакуолізованого пилка. Однак у пиляках на стадії зрілого пилка безпосередньо перед - розкриттям чи після нього активність (35 різко знижується. Установлено, що фарбування щодо (35 обмежено тапетумом, сполучною тканиною і тканиною ендотецію.To study the patterns of expression of the anther-specific construct, the KAV8 promoter - reporter gene after I c) staining and fixation 4 anthers from rice flowers at different stages of development, according to the method described in example C, are immersed in paraplast (Zidt company) and sections are made 1 Ohm thick. Sections are examined with a light microscope (x100 magnification) using dark-field illumination. At the stage, Io) preceding meiosis, the activity of OZ was not detected in any of the parts of the anther. The expression of 505 was first detected at the time when microspores are released from tetrads. The highest level of ZOH activity was found in anthers at the vacuolated pollen stage. However, in anthers at the stage of mature pollen, immediately before - opening or after it, the activity of (35) decreases sharply. It was established that the staining with respect to (35) is limited to the tapetum, connective tissue and endothecium tissue.
Приклад 5: Одержання трансгенної рослини кукурудзи «Example 5: Obtaining a transgenic corn plant "
Трансформацію кукурудзи за допомогою нового гена, отриманого за допомогою описаного вище способу, здійснюють шляхом бомбардування мікроснарядами або незрілих зиготичних зародків, або розмножуваного ші с серійно ембріогенного калюса типу І. м З незрілих зародків завдовжки 1,5-2,5мм, отриманих з вирощеного в теплиці матеріалу, ініціюють розвиток я культур ембріогенного калюса типу | кукурудзи |Сгееп та ін., Міаті МУіпіег Зутрозішт 20, 1983). Зародки виділяють в асептичних умовах з качанів зі стерилізованою поверхнею приблизно Через 14 днів після запилення.Maize transformation with the help of a new gene obtained using the method described above is carried out by bombarding with microprojectiles either immature zygotic embryos, or propagated by serially embryogenic callus type I. m From immature embryos 1.5-2.5 mm long, obtained from grown in greenhouses of the material, initiate the development of cultures of embryogenic callus type | corn | Sgeep et al., Miati MUipieg Zutrozisht 20, 1983). Embryos are isolated in aseptic conditions from cobs with a sterilized surface approximately 14 days after pollination.
Зародки або поміщають на Ю-середовище для ініціації розвитку калюса, що містить 2956 сахарози і Б5мг/л - хлорамбену |Оипсап та ін., Ріапіа 165: 322-332 (1985)), або в КМ-середовище для ініціації розвитку калюса, що їз містить Зо сахарози і 0,75мг/л 2,4-Д |Као 14 МіснауїшК, Ріапіа 126: 105-110 (1975)). Потім зародки і ембріогенний калюс культивують у темноті. З експлантатів приблизно через 14 днів виділяють зародки, що о дають ембріогенну реакцію. Зародки з О-середовища, ініціатора розвитку калюса, які дають ембріогенну реакцію, сю 50 поміщають у О-середовище для підтримання розвитку калюса, що містить 295 сахарози і 0,5мг/л 2,4-Д, а ті, що дають ембріогенну реакцію зародки з Км-середовища, яке ініціює розвиток калюса, поміщають у Км-середовище сл для підтримання розвитку калюса, що містить 295 сахарози і 5мг/л Дикамба. Після інкубації протягом 3-8 тижнів із щотижневим пересіванням у свіже середовище для підтримання розвитку калюса, одержують компактні ембріогенні культури високої якості. Шматочки активнорослого ембріогенного калюса відбирають як тканину-мішень для введення гена. Шматочки калюса поміщають на пластині-мішені, що містять підтримувальнеEmbryos are either placed on U-medium for the initiation of callus development, containing 2956 sucrose and B5mg/l - chloramben (Oipsap et al., Riapia 165: 322-332 (1985)), or in KM-medium for the initiation of callus development, which iz contains 2 sucrose and 0.75 mg/l 2,4-D | Kao 14 MisnauishK, Riapia 126: 105-110 (1975)). Then the embryos and embryogenic callus are cultivated in the dark. After approximately 14 days, embryos are released from the explants, which give an embryogenic reaction. Embryos from O-medium, the initiator of callus development, which give an embryogenic reaction, are placed in O-medium for maintaining the development of callus containing 295 sucrose and 0.5 mg/l 2,4-D, and those that give an embryogenic reaction embryos from Km-medium, which initiates callus development, are placed in Km-medium sl for maintaining callus development, containing 295 sucrose and 5mg/l Dicamba. After incubation for 3-8 weeks with weekly transplanting into fresh medium to support callus development, compact embryogenic cultures of high quality are obtained. Pieces of actively growing embryogenic callus are selected as target tissue for gene introduction. Pieces of callus are placed on a target plate containing a supporting medium
Ге! середовище, з 1295 сахарози, приблизно за 4год до введення гена. Шматочки калюса розміщають по колах радіусами 8 і 10мм від центра пластини-мішені. Плазмідну ДНК осаджують на золоті мікроносії відповідно до іме) інструкції фірми ЮиРопі Віоїївііс. Два-три мкг кожної плазміди використовують для обробки 6 використовуваних як снаряди мікроносіїв. Гени вводять у клітини тканини-мішені за допомогою пристрою типу РОБ-ІЮООНе 60 Віоїївіісв. Пристрій типу Віоїївісз має такі параметри настроювання: відстань між диском, що руйнується, і макроносієм мм, відстань між макроносієм і затримувальним екраном 1Омм і відстань між затримувальним екраном і мішенню 7см. Кожну пластину-мішень обстрілюють двічі, використовуючи диски, що руйнуються при тиску залпу ббОфунтів/кв.дюйм. Між затримувальним екраном і тканиною-мішенню поміщають екран з нержавкої сталі розміром 200х200меш |МеМавіег-Саїт, Нью-Брунсвік, штат Нью ДжерсіЇ. 65 Через 7 днів після введення гена шматочки тканини-мішені переносять із середовища з високим осмотичним тиском у середовище для добору. Для добору з використанням гена ВАК шматочки тканини-мішені поміщають у підтримувальне середовище, що містить 7ООмг/л глуфосинату амонію (ВазіаФ) чи 2Омг/л біалафосу (Негріасеф). Всі амінокислоти видаляють із середовища для селекції. Через 5-8 тижнів вирощування в цьому середовищі з високим тиском добору будь-який калюс у стані росту пересівають у середовище, що містить 3-20мг/л Вавзіаф).Gee! environment, with 1295 sucrose, approximately 4 hours before the introduction of the gene. Pieces of callus are placed in circles with radii of 8 and 10 mm from the center of the target plate. Plasmid DNA is deposited on gold microcarriers in accordance with the instructions of the company Yury Ropi Wioiwiis. Two to three μg of each plasmid is used to treat 6 microcarriers used as projectiles. Genes are injected into the cells of the target tissue with the help of a device of the ROB-IIUONe 60 Vioiiviisv type. The Wioivisz type device has the following tuning parameters: the distance between the collapsing disk and the macrocarrier mm, the distance between the macrocarrier and the retarding screen 1 Ohm, and the distance between the retarding screen and the target 7cm. Each target plate is fired twice, using discs that collapse at a burst pressure of bbOpsi. A 200 x 200 mesh stainless steel screen is placed between the retention screen and the target fabric |Mavieg Site, New Brunswick, NJ. 65 7 days after gene injection, pieces of target tissue are transferred from a medium with high osmotic pressure to a selection medium. For selection using the VAK gene, pieces of target tissue are placed in a medium containing 700mg/l glufosinate ammonium (VaziaF) or 2Omg/l bialaphos (Negriacef). All amino acids are removed from the breeding medium. After 5-8 weeks of growing in this medium with high selection pressure, any callus in a growing state is transplanted into a medium containing 3-20mg/l Vavziaf).
Для добору з використанням гена манозофосфат-ізомерази тканини-мішені поміщають у відповідні середовища, які не містять сахарози, але містять 1956 манози. З цих середовищ амінокислоти не видаляють.For selection using the mannose phosphate isomerase gene, target tissues are placed in appropriate media that do not contain sucrose, but contain 1956 mannose. Amino acids are not removed from these media.
Через 5-8 тижнів калюс у стані росту або пересівають у середовище О для підтримання розвитку калюса, яке не містить сахарози і містить 1,595 манози, або в КМ-середовище для підтримання розвитку калюса, що містить 190 /о сахарози і 0,595 манози. Ембріогенний калюс, який росте в середовищі для селекції, пересівають кожні 2 тижні протягом 4-8 тижнів до одержання кількості калюсів, достатніх для регенерації 10-20 рослин. Тканину, що вижила після селекції з вихідного шматочка тканини-мішені пересівають у вигляді одиничної колонії і позначають як незалежний випадок трансформації.After 5-8 weeks, the callus in a state of growth is either transplanted into medium O for maintaining the development of callus, which does not contain sucrose and contains 1.595 mannose, or in CM-medium for maintaining the development of callus, which contains 190 /o sucrose and 0.595 mannose. Embryogenic callus, which grows in the medium for selection, is transplanted every 2 weeks for 4-8 weeks until obtaining the number of callus sufficient to regenerate 10-20 plants. The tissue that survived after selection from the original piece of target tissue is transplanted in the form of a single colony and is designated as an independent case of transformation.
У цей момент часу, колонії, відібрані в середовищі з додаванням Вазіа є, переносять у модифіковане 7/5 Мз-середовище |Мигазпіде і ЗКоод, Рпузіої. Ріапі 15: 473-497 1962), що містить З7о сахарози (М535), без селектувального агента і поміщають на світло. У це середовище додають або 0,25мг/л анцимідолу і 0,бмг/л кенетину для того, щоб індукувати розвиток зародка, або 2мг/л бензиладеніну. Колонії, відібрані за допомогою манози, переносять на модифіковане М5-середовище, що містить 295 сахарози і 196 манози (М525-41М) з описаними вище добавками анцимідолу і кінетика, або на модифіковане Мо5-середовище, що містить 290 2о сахарози і 0,570 манози (М525З'0,5М) з описаною вище добавкою бензиладеніну.At this point in time, the colonies selected in the medium with the addition of Vazia are transferred to the modified 7/5 Mz-medium |Mygazpide and ZKood, Rpuzioi. Riapi 15: 473-497 1962) containing 370 sucrose (M535), without a selection agent and placed in the light. Either 0.25mg/l ancymidole and 0.bmg/l kenetin are added to this medium to induce embryo development, or 2mg/l benzyladenine. Colonies selected using mannose are transferred to a modified M5 medium containing 295 sucrose and 196 mannose (M525-41M) with the above-described additions of ancymidol and kinetics, or to a modified Mo5 medium containing 290 20 sucrose and 0.570 mannose ( M525Z'0.5M) with the addition of benzyladenine described above.
Через 2 тижні регенерувальні колонії, відібрані на середовищі з додаванням Вавзіа ?, переносять на середовище М535 без анцимідолу і кенетину чи бензиладеніну відповідно. Регенерувальні колонії, відібрані за допомогою манози, через 2 тижні переносять на безгормональне середовище М5255-1М і М52550,5М відповідно. Регенерувальні паростки з корінням і без коріння з усіх колоній переносять у ящики Мадепіа, що сч об Містять середовище МЗЗ5, і зрештою одержують невеликі рослини з коренями, які переносять у грунт у о теплицю.After 2 weeks, the regenerating colonies selected on the medium with the addition of Vauzia? are transferred to the M535 medium without ancymidol and kenetin or benzyladenine, respectively. Regenerating colonies, selected with the help of mannose, after 2 weeks are transferred to hormone-free medium M5255-1M and M52550.5M, respectively. Rooted and non-rooted regenerating sprouts from all colonies are transferred to Madepia boxes containing MZZ5 medium and eventually produce small plants with roots that are transferred to soil in the greenhouse.
Рослини тестують щодо експресії гена РМІ на основі модифікованого аналізу в 48-ямкових планшетах із хлорфенолом червоним з використанням середовища, що не містить сахарози і містить 0,595 манози. Зразки листа (у5ммхомММм) поміщають на середовище для аналізу і вирощують у темноті протягом "72год. Якщо в ю рослині відбувається експресія гена РМІ, то воно може метаболізувати манозу, і середовище набуває жовтого забарвлення. Якщо експресія не відбувається, то середовище зберігає червоний колір. і.Plants are tested for PMI gene expression based on a modified assay in 48-well chlorophenol red plates using sucrose-free medium containing 0.595 mannose. Leaf samples (u5mmhomMMm) are placed on the medium for analysis and grown in the dark for 72 hours. If the RMI gene is expressed in the plant, it can metabolize mannose, and the medium acquires a yellow color. If the expression does not occur, the medium retains its red color. and.
Випадки трансформації також створюють з використанням калюса типу І, отриманого з незрілих зиготичних МЮУ зародків за допомогою стандартних методів культивування. Для введення гена приблизно З0Омг калюса типу одержують, пересіваючи на свіже середовище за 1-2 дні до введення гена, відбираючи шматочки тканини-мішені - | розміщаючи по колах радіусом 1Омм від центра пластини-мішені на середовище, що знову містить 1295 "ра сахарози. Приблизно через 4год тканину піддають бомбардуванню за допомогою пристрою типу РОБ-10О0ОНеTransformation cases are also generated using type I callus obtained from immature zygotic MJU embryos using standard culture methods. For the introduction of the gene, approximately 30 Omg of callus type is obtained by transplanting to a fresh medium 1-2 days before the introduction of the gene, selecting pieces of the target tissue - | placing in circles with a radius of 1 mm from the center of the target plate on the medium, which again contains 1295 g of sucrose. After approximately 4 hours, the tissue is subjected to bombardment using a device of the ROB-10О0ОНe type
Віоїївіїсв фірми ОЮишРопі. Цікаві для винаходу плазміди осаджують на золоті частки розміром мкм, використовуючи стандартний протокол фірми ЮОиРопі. Гени вводять, обстрілюючи пластину-мішень двічі, використовуючи диски, що руйнуються при тиску залпу б5Офунтів/кв.дюйм. «Vioiiviisv firm Oyuishropi. Plasmids of interest to the invention are precipitated on micron-sized gold particles using the standard protocol of the YuOyRopi company. Genes are injected by firing at a target plate twice using discs that break at a burst pressure of 50 pounds per square inch. "
Приблизно через 1бгод після введення гена калюс переносять на стандартне середовище для 8 с культивування, що містить 296 сахарози без селектувального агента. Через 12-13 днів після введення гена й шматочки тканини-мішені переносять на середовище для селекції, що містить 4Омг/л фосфінотрицину у вигляді «» або Вазіа, або біалафосу. Калюс пересівають на середовище для селекції протягом 12-16 тижнів, після чого калюс, що вижив і росте, переносять на стандартне середовище для регенерації, яке містить Змг/л фосфінотрицину у вигляді Вавіа для одержання рослин. -і Приклад 6: Трансформація пшениціApproximately 1bh after the introduction of the gene, the callus is transferred to a standard medium for 8 s of cultivation, containing 296 sucrose without a selection agent. 12-13 days after the introduction of the gene, pieces of the target tissue are transferred to a medium for selection containing 4Omg/l of phosphinothricin in the form of "" or Vazia or bialaphos. The callus is transplanted onto breeding medium for 12-16 weeks, after which the surviving and growing callus are transferred to standard regeneration medium containing Zmg/L of phosphinothricin as Vavia to produce plants. - and Example 6: Transformation of wheat
Оптимальний метод трансформації пшениці передбачає бомбардування частками незрілих зародків пшениці шк і включає перед уведенням гена стадію культивування на середовищі з високим умістом або сахарози, або з с високим умістом мальтози. Перед бомбардуванням будь-яку кількість зародків (завдовжки 0,75-1мм) поміщають 5р на М5-середовище з 395 сахарози |Мигазпіде апа зКосо, 1962) і Змг/л 2,4-д для індукції соматичних зародків і о витримують у темноті. У вибраний день, призначений для бомбардування, зародки видаляють із середовища 4 для індукції і переносять в осмотикум (тобто в середовище для індукції з додаванням необхідної концентрації сахарози або мальтози, як правило, 1595). Зародкам дають пройти стадію плазмолізу протягом 2-Згод і потім піддають бомбардуванню. На пластину-мішень поміщають, як правило, 20 зародків, хоча ця кількість не має Вирішального значення. Відповідну плазміну, яка несе ген, осаджують на золоті частки розміром близько мікрометра, використовуючи стандартні методики. Кожну пластину з зародками обстрілюють за допомогою іФ) пристрою на основі гелію типу ОиРопі Віоїїзіїсв, використовуючи тиск залпу «100Офунтів/кв.дюйм і стандартний ко екран з розміром пор ЗОмеш. Після бомбардування зародки знову переносять у темноту для відновлення протягом приблизно 24год (усе ще в осмотикумі). Через 24год зародки видаляють з осмотикуму і поміщають на бо середовище для індукції, де їх культивують протягом приблизно 1 місяця до регенерації. Приблизно через 1 місяць експлантати зародків із ембріогенним калюсом, який розвивається, переносять у середовище для регенерації (М5-імг/л НОК, Бмг/л СА), що додатково включає відповідний селектувальний агент. Приблизно через 1 місяць розвинені проростки переносять у великі стерильні контейнери, іменовані СА7, що містятьThe optimal method of wheat transformation involves the bombardment of immature wheat embryos with particles and includes, before the introduction of the gene, a stage of cultivation on a medium with a high content of either sucrose or with a high content of maltose. Before bombardment, any number of embryos (0.75-1 mm long) are placed 5p on M5 medium with 395 sucrose (Migazpide apa zKoso, 1962) and Zmg/l 2.4-d for the induction of somatic embryos and kept in the dark. On the selected day for bombardment, the embryos are removed from medium 4 for induction and transferred to an osmoticum (ie, medium for induction with the addition of the required concentration of sucrose or maltose, usually 1595). Embryos are allowed to go through the plasmolysis stage for 2 hours and then bombarded. As a rule, 20 embryos are placed on the target plate, although this number is not critical. The appropriate plasmin, which carries the gene, is deposited onto gold particles about a micrometer in size using standard techniques. Each seed plate is bombarded with a helium-based iF) device, using a burst pressure of 100 psi and a standard co-screen with a pore size of ZOmesh. After bombardment, the embryos are transferred back into the dark to recover for about 24 hours (still in the osmoticum). After 24 hours, the embryos are removed from the osmoticum and placed on bo medium for induction, where they are cultivated for about 1 month until regeneration. After approximately 1 month, embryo explants with developing embryogenic callus are transferred to a medium for regeneration (M5-img/l NOK, Bmg/l CA), which additionally includes a suitable selection agent. After about 1 month, the developed seedlings are transferred to large sterile containers, called CA7, containing
Мо5-середовище половинної міцності, 295 сахарози і таку ж концентрацію селектувального агента. Стабільна 65 трансформація пшениці описана докладно в ЕР 0674715.Mo5 medium of half strength, 295 sucrose and the same concentration of the selection agent. Stable 65 transformation of wheat is described in detail in EP 0674715.
Перелік послідовностейList of sequences
Claims (20)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019980046973A KR100301922B1 (en) | 1998-11-03 | 1998-11-03 | Rice anther specific gene, negulatory factor thereof, plant expression vector comprising same and process for preparing transgenic rice plant using same |
| PCT/EP1999/008360 WO2000026389A2 (en) | 1998-11-03 | 1999-11-02 | Dna comprising rice anther-specific gene and transgenic plant transformed therewith |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA74535C2 true UA74535C2 (en) | 2006-01-16 |
Family
ID=19557020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2001053608A UA74535C2 (en) | 1998-11-03 | 1999-02-11 | Dna comprising promotor sequence (variants), and transgenic plant transformed with use thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100301922B1 (en) |
| UA (1) | UA74535C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117721143A (en) * | 2023-12-19 | 2024-03-19 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | Gene editing method |
-
1998
- 1998-11-03 KR KR1019980046973A patent/KR100301922B1/en not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-02-11 UA UA2001053608A patent/UA74535C2/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100301922B1 (en) | 2001-11-05 |
| KR20000031106A (en) | 2000-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10285348B2 (en) | Simultaneous gene editing and haploid induction | |
| Ohno et al. | The Arabidopsis JAGGED gene encodes a zinc finger protein that promotes leaf tissue development | |
| Bechtold et al. | The maternal chromosome set is the target of the T-DNA in the in planta transformation of Arabidopsis thaliana | |
| US10519456B2 (en) | Simultaneous gene editing and haploid induction | |
| JP3102888B2 (en) | Plant transformation method and vector therefor | |
| MXPA06013287A (en) | Promotion of somatic embryogenesis in plants by pga37. | |
| RU2397250C2 (en) | Traceability of transgenic plant seeds during pre- and post-treatment | |
| RU2245921C2 (en) | Isolated dna representing promoter (variants), vector comprising this dna and method for preparing transgenic plant using this dna (variants) | |
| EP1382682A2 (en) | Modulating developmental pathways in plants | |
| WO1998013503A1 (en) | A plant and method of modification | |
| Heidmann et al. | A protocol for transformation and regeneration ofAntirrhinum majus. | |
| WO2009067398A1 (en) | Transformation of crambe abyssinica | |
| UA74535C2 (en) | Dna comprising promotor sequence (variants), and transgenic plant transformed with use thereof | |
| WO2008120410A1 (en) | Genes having activity of promoting endoreduplication | |
| KR102453800B1 (en) | Method for producing SlMS10 gene knock-out tomato plant using CRISPR/Cas9 system and male-sterile tomato plant produced by the same method | |
| WO2004042066A2 (en) | NtSM GENE | |
| Chahal | Evaluation of Phylogenetically Distant Baby Boom Genes for Their Ability to Induce Parthenogenesis in Rice | |
| KR20240018731A (en) | Preparation method of male sterility rice using Os09g03890 gene, composition for inducing male sterility of rice and male sterility rice | |
| KR100848430B1 (en) | Anther-specific genes derived from Malus x domestica promoters thereof and a method for preparing transformed plant using the same | |
| Modrusan | Molecular and genetic analyses of the Bel1 gene regulating ovule development in Arabidopsis thaliana | |
| OA19505A (en) | Simultaneous gene editing and haploid induction. | |
| Roberts | Controlling transpositon in the male gametophyte of transgenic plants | |
| Hall | Embryogenesis in Arabidopsis thaliana: mutant library construction and embryo mutant identification and characterization | |
| Ollram | The identification of potential factors involved in the transcriptional regulation of the phloem-specific gene ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT (APL) and the analysis of its role during embryogenesis in Arabidopsis thaliana | |
| Hawker | Genetic analysis of KANADI, Class III HD-ZIP, and DEFECTIVE EMBRYO AND MERISTEMS function in Arabidopsis thaliana |