CN112899286B - Lrx功能基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了PbrLRX.A2.1和PbrLRX.A2.2功能基因及其应用，本发明利用植物基因克隆技术从‘鸭梨’花粉中克隆得到两个新基因PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2，其核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示；其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。本发明体外表达的PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2重组蛋白在促进梨花粉生长，抵抗S‑RNase作用，减少劳动力，提高授粉效率方面提供了广阔的应用前景。

Description

LRX功能基因及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从‘鸭梨’花粉中鉴定、克隆得到2个可以促进花粉管生长的EXTs家族成员PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2，本发明克隆得到的PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因，将其分三段进行体外原核表达，重组蛋白具有促进梨花粉管生长的功能。
背景技术
自交不亲和(SI)是植物体防止自花受精，保护遗传多样性的一种机制，它阻止基因型相同的花粉管在花柱中正常生长，完成受精(McClure,Cruz-Garcia,&Romero,2011)。根据花粉不亲和表型的不同遗传方式，自交不亲和的类型可分为孢子体自交不亲和SSI(sporophytic self-incompatibility)与配子体自交不亲和GSI(gametophytic self-incompatibility)，前者如十字花科、旋花科、菊科植物等，后者主要有蔷薇科、茄科、罂粟科、车前草科植物等(McClure et al.,2011；Scalone&Albach,2014)。
梨是蔷薇科物种，属于典型的配子体自交不亲和型植物(Sassa,Hirano,&Ikehashi,1993)。其自交不亲和反应由S位点复等位基因控制：在花柱通道组织中特异表达的S-RNase基因和花粉特异表达的花粉S决定基因F－box基因(SLF或SFB)(De Franceschiet al.,2011；Sassa,Kakui,&Minamikawa,2010)。自交不亲和中的花柱特异性决定因子是一种S糖蛋白，且具有RNA酶的活性，因此一般称之为S-RNase(Franklintong&Franklin,1992)。蔷薇科果树S-RNase具有C1-C5五个保守区域和一个高变区域RHV，其位于C2与C3之间(Ishimizu et al.,1998)，可能与特异蛋白识别相关，是碱基序列的插入、删除以及核苷酸序列的替换等经常发生的区域。自交不亲和花粉决定因子是两种F-box基因：SFB(S-haplotype-specific F-box)具有很高的多态性，SLF(S-locus F-box)的序列多态性较低(Ushijima et al.,2001)。花粉SFB/SLF是一种分子量为43～60kD的亲水性非分泌蛋白，其基因序列具有1个F-box框和两个高变区域(Ushijima et al.,2001)。花粉F-box基因的C端能够接收目的蛋白，合成SCFSFB复合体，通过E3连接酶泛素化，然后被26S蛋白激酶降解(Ushijima et al.,2004)。此外，花柱S-RNase基因与花粉F-box基因紧密连锁(Entani etal.,2003；Romero et al.,2004)，这也是配子体型自交不亲和的必要条件之一，它可以有效抑制两基因组间的重组。
除了花柱、花粉当中的S因子决定自交不亲和之外，还有很多其他因素影响到植物自交亲和性，近年来陆陆续续被发掘。HT-B蛋白是一种小分子的富含阿拉伯半乳糖蛋白，在花柱发育后期表达，研究发现缺少HT-B基因的烟草表现出自交亲和性(Goldraij et al.,2006)。120k是一种在花柱基质中大量表达的蛋白，可以与S-RNase结合，通过抑制120k的表达可以阻止自花花粉的识别从而导致自交亲和性(Hancock,Kent,&McClure,2005)。NastEP是一种蛋白酶抑制剂，其可以在烟草自交不亲和反应过程中进入花粉管并稳定HT-B的含量以确保不亲和反应(Jimenez-Duran et al.,2013)。
LRX基因隶属于EXTs基因家族，其N端富含亮氨酸重复序列(LRR),而其C端是一段EXT延伸结构域(Liu et al.,2016)。拟蓝芥中，AtLRX8-11在花粉中特异性表达，且在维持花粉管细胞壁完整性方面具有协同作用，促进花粉萌发和花粉管生长(Wang et al.,2018)。本研究获得了梨花粉中表达与拟蓝芥LRX8-11同源性较高的相关基因，探索其对梨花粉管生长的影响和在梨自交不亲和过程中所起到的作用。研究非S因子参与自交不亲和过程的机制，将其应用到实际中可以很大程度上降低生产上的相关授粉工作，对农业生产也具有相当重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于从梨中(Pyrusbretschneideri)分离得到的促进花粉管生长的PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因，此基因属于EXTs家族基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
本发明的另一个目的是从梨(Pyrusbretschneideri)中鉴定克隆得到的基因PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2在授粉过程中促进花粉管生长的应用。通过原核表达的方法，分段纯化表达PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2蛋白，然后体外处理梨花粉进行其生物学功能的验证。表明本专利克隆的PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因具有促进花粉管生长的功能。
为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
申请人利用基因克隆技术从梨中克隆得到两个与拟蓝芥LRX基因同源的基因PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2。PbrLRX.A2.1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，包含2559bp的开放阅读窗，编码852个氨基酸，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，等电点为6.27，分子量为91.66kDa，1-23是信号肽的位置(图1)。PbrLRX.A2.2核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，包含2577bp的开放阅读框，编码858个氨基酸，其编码的氨基酸序列如序列表SEQID No.4所示，等电点为6.87，分子量92.24kDa，1-23是信号肽的位置(图2)。
申请人设计克隆上述基因PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2的cDNA序列引物对，其碱基序列如下所示：
PbrLRX.A2.1(2.2)F1:5’-ATGCAGGCCTATGGCTGCTTTC-3’,即SEQ ID No.5
PbrLRX.A2.1(2.2)R1:5’-TTAGTAGCCTGGGAACATTGGTGG-3’，即SEQ ID No.6
利用大肠杆菌体外原核表达纯化PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2蛋白，获得蛋白后体外处理‘鸭梨’和‘砀山酥梨’花粉生长，验证其具有促进‘鸭梨’和‘砀山酥梨’花粉生长，削减S-RNase对花粉生长抑制作用的功能。
含有上述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
上述的基因或上述的蛋白在促进梨花粉管生长方面的应用。
上述的蛋白在制备提高花粉授粉效率的授粉试剂中的应用。
一种提高花粉授粉效率的授粉试剂，该授粉试剂中包含上述的蛋白。
一种提高花粉授粉效率的氨基酸水溶性药剂，该氨基酸水溶性药剂中包含上述的蛋白。
上述的氨基酸水溶性药剂在提高花粉授粉效率方面的应用。
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及从‘鸭梨’花粉中鉴定、克隆得到的功能基因PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2在促进‘鸭梨’和‘砀山酥梨’花粉管生长方面的应用。申请人利用植物基因克隆技术从‘鸭梨’花粉中克隆得到两个新基因PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2。PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因属于EXTs基因家族成员，N端富含亮氨酸重复序列(LRR)，C端是一段EXT延伸结构域，并且在花粉中特异性表达。通过构建原核表达载体，对PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因根据其蛋白结构分成三段，进行体外表达纯化重组蛋白。PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2重组蛋白体外处理‘鸭梨’和‘砀山酥梨’花粉生长，结果显示其可以促进‘鸭梨’和‘砀山酥梨’花粉生长。此外，PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2重组蛋白和‘鸭梨’S-RNase同时处理‘鸭梨’花粉生长，可以削减S-RNase对花粉生长的抑制作用。本发明体外表达的PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2重组蛋白在促进梨花粉生长，抵抗S-RNase作用，减少劳动力，提高授粉效率方面提供了广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有优点和效果：
(1)PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因的发现，为提高梨体外授粉效率提供了新的思路，降低劳动成本，为实施绿色农业提供新途径。
(2)通过原核表达纯化的方法，获得的体外表达的蛋白，经生物学功能验证，表明本发明克隆的基因具有促进梨花粉生长的功能。
附图说明：
图1为本发明中SEQ ID No.2信号肽预测。
图2为本发明中SEQ ID No.4信号肽预测。
图3为PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因在梨各个组织中表达情况图。
图4为7个植物LRX基因编码蛋白的系统进化树；
其中‘Pb’代表白梨，‘Pp’代表桃，‘Fv’代表草莓，‘Cs’代表柑橘，‘Cp’代表番木瓜，‘Alt’代表拟蓝芥，‘Vv’代表葡萄。
图5为PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因在‘金坠’中相对于‘鸭梨’的相对表达量；
其中‘YL’代表‘鸭梨’，‘JZ’代表金坠。
图6为PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因氨基酸序列分段示意图；
其中‘N’代表氨基酸N端LRR序列，‘M’代表氨基酸中间段，‘C’代表氨基酸C端EXT结构。
图7为PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因分段重组蛋白处理‘鸭梨’和‘砀山酥梨’花粉生长的统计图；
其中‘YL’代表‘鸭梨’，‘DS’代表‘砀山酥梨’。
图8为不同浓度‘鸭梨’S-RNase处理‘鸭梨’花粉生长统计图。
图9为‘鸭梨’S-RNase在PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因重组蛋白同时处理下对‘鸭梨’花粉生长影响的统计图。
具体实施方案
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1 PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因的组织定位
提取‘鸭梨’的根、茎、叶、花柱、花粉、果实不同组织的RNA，然后经反转录得到第一链cDNA用于检测PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2的表达部位。
RNA提取使用植物总RNA提取试剂盒(购自北京天根生物技术有限公司，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)。RNA反转录到cDNA则使用的是TransScript One-Step RT-PCR SuperMix(购自北京全式金生物技术有限公司，按照该试剂盒提供的说明书操作)。扩增基因引物对为：
PbrLRX.A2.1(2.2)F1:5’-ATGCAGGCCTATGGCTGCTTTC-3’
PbrLRX.A2.1(2.2)R1:5’-TTAGTAGCCTGGGAACATTGGTGG-3’
克隆基因的高保真酶使用的是PhantaMax高保真PCR酶(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，50μL PCR的反应体系包括100ng cDNA，2.5μM上述引物，25ul 2×PhantaMaxBuffer，1ul dNTP Mix(10mM each)，1ul PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase，其余用灭菌水补足。PCR反应在Veriti扩增仪上按以下程序完成:94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2.5分钟，35个热循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。
PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因在花粉中表达较为明显，叶片中少量表达，其他部位不表达(图3)。除此之外，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)回收DNA片段，步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与pEASY-Blunt Zero载体(购自北京全式金生物技术有限公司)进行连接反应，按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是5μL，其中包括4.5μL纯化的PCR产物，0.5μL pEASY-Blunt Zero载体。25℃连接20分钟。取5μL连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有100mg/L卡纳霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海生工生物科技有限公司完成)。测序结果得到两个同源性很高的核苷酸序列，分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，BLAST的结果分析证明这两个基因都属于EXTs基因家族成员，N端富含亮氨酸重复序列(LRR)，C端是一段EXT延伸结构域。构建了7个植物LRX基因编码蛋白的系统进化树(图4)，结果表明，两基因高度同源，可划分到同一类型A2中，将其分别命名为PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2。
实施例2 PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因的相对表达量
提取‘鸭梨’和其自交亲和芽变品种‘金坠’的花粉RNA，经反转录得到第一链cDNA，用于PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因的qRT-PCR实验。RNA提取和反转录按照实施例1进行。设计PbrLRX.A2.1的特异性定量引物：
PbrLRX.A2.1 F2:5’-CCAAAGACACCAAAGCCTTCACC-3’
PbrLRX.A2.1 R2:5’-CCTTTATTGGTGGCTCCTCTTTGG-3’
和PbrLRX.A2.2的特异性定量引物：
PbrLRX.A2.2 F2:5’-AGAATGCGTGCCAGGATCTCG-3’
PbrLRX.A2.2 R2:5’-GGTGGTTGTTTGGGTTGTTCTGTC-3’
以梨Tubulin基因作为内参，其特异性定量引物为：
PbTUB-F:GGCATCAACCTTCATTGGGAACTC
PbTUB-R:ACCAGATCGTTCATGTTGCTCTCG
qRT-PCR实验采用LC480 SYBR Green Mix试剂盒(购自罗氏公司)，按照试剂盒说明书操作。20μL qRT-PCR反应体系包括：10μL 2×SYBR Green Mix，0.4uM正向引物和反向引物，20ng cDNA，其余用灭菌水补足。使用96孔qRT-PCR板(购自Roche公司)，运用qRT-PCR仪(型号：LightCycler 480，Roche公司)进行PCR。qRT-PCR反应程序为：95℃预变性10分钟；95℃变性3秒，62℃退火10秒，72℃延伸30秒，45个循环。每个cDNA设置三个生物学重复和三个技术重复，计算出每个cDNA样品的平均Ct值，通过计算2-ΔΔCt得出PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因的相对表达量。再将‘鸭梨’和‘金坠’花粉中PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因相对表达量作比较，两个基因在‘金坠’花粉中表达量都明显高于‘鸭梨’花粉(图5)。
实施例3 PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因蛋白表达载体的构建
将PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因根据N端LRR结构，C端EXT结构，以及中间段，分成三部分构建到pCold-TF(购自TakaRa公司)蛋白表达载体上(图6)。
根据pCold-TF载体的序列和酶切位点分析，选择BamHI和XbaI作为内切酶，分析并去除PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因的信号肽区域，分别如图1、图2所示。按照一般设计引物的原则用Primer Primer 5.0软件设计引物，并在引物5’端加上载体同源臂序列(小写字母碱基序列部分)，得到PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2基因N端引物：
PbrLRX.A2.1(2.2)-N-F:ctcggtaccctcgagggatccATGCTGACTGATGCGGAAGC
PbrLRX.A2.1(2.2)-N-R:agcagagattacctatctagaCTGGCTCGGTTTAGACGGACPbrLRX.A2.1基因中间段引物：
PbrLRX.A2.1-M-F:ctcggtaccctcgagggatccATGCCTGAACAAAAGTCGGC
PbrLRX.A2.1-M-R:agcagagattacctatctagaAGGGCGGATTGGAACGACPbrLRX.A2.2基因中间段引物:
PbrLRX.A2.2-M-F:ctcggtaccctcgagggatccATGCCGGTGGATTGCGATAAAG
PbrLRX.A2.2-M-R:agcagagattacctatctagaAATCTGGATCACCGGAGACTGAPbrLRX.A2.1基因C段引物：
PbrLRX.A2.1-C-F:ctcggtaccctcgagggatccATGTTTGGGCAAAGATCTGTCGTT
PbrLRX.A2.1-C-R:agcagagattacctatctagaGTAGCCTGGGAACATTGGTGGPbrLRX.A2.2基因C段引物：
PbrLRX.A2.2-C-F:ctcggtaccctcgagggatccATGATTCAGATCCACCCGCAGC
PbrLRX.A2.2-C-R:agcagagattacctatctagaGTAGCCCGGAAACATCGGC
以上引物由上海生工生物科技有限公司合成，通过PCR反应扩增目的片段、胶回收目的条带，操作和PCR反应程序同实施例1。使用BamHI和XbaI内切酶(购自NEB公司)对pCold-TF载体质粒进行酶切反应，反应体系为50ul：1ug pCold-TF载体质粒，5ul 10×Cutsmart Buffer，1ul BamHI内切酶，1ul XbaI内切酶，其余用灭菌水补足，37℃反应4小时。双酶切产物纯化使用DNA纯化试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，按照说明书操作得到纯化后的线性载体。
使用一步法快速克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)对上述胶回收DNA片段和双酶切纯化线性载体进行重组连接反应，反应体系20ul：160ng pCold-TF线性载体，40ng基因片段，4ul 5×CE II Buffer，2ul ExnaseII，其余用灭菌水补足，37℃反应30分钟。使用大肠杆菌感受态DH5α对连接产物进行转化实验，在含有100μg/ml氨苄霉素的LB固体平板中筛选出阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海生工生物科技有限公司完成)。
挑测序成功的菌接种到20ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，使用南京诺唯赞生物科技有限公司的快速质粒小提取试剂盒将成功重组表达的载体质粒提取出来。取100ng重组表达的载体质粒与大肠杆菌BL21感受态做转化，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素平板上筛选重组基因。随机选取1个单菌落进行划线培养，取少量长出的划线培养菌接种于4ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，然后按700μl菌液加入300μl 50％灭菌甘油，混匀后用液氮速冻贮存于﹣80℃冰箱，得到重组表达菌株。5个重组表达载体均按照上述方法操作获得，除此之外，将pCold-TF质粒与大肠杆菌BL21感受态做转化，作为对照。
实施例4 PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2重组蛋白的表达与纯化
将实施例3得到的重组表达菌株按1:50接种到10ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，活化重组表达菌株。将活化的重组表达菌株再按1:50转至300mlLB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中培养，培养条件为37℃，200rpm，振荡培养至OD600为0.4～0.6时后，置于15℃静置40分钟，最后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，15℃、220rpm诱导表达24小时。
表达完成后4℃、12000rpm离心10分钟后弃上清，收集菌体沉淀，用20ml裂解液重悬菌体后超声波破碎，功率240W，条件为：开启3s，停7s，反复多次进行，直至溶液澄清。超声破碎完成后，于4℃下12000rpm离心15分钟，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤去除杂质。利用德国Merck Millipore公司的Ni-NTA琼脂糖亲和层析填料纯化分段构建的PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2重组蛋白，具体操作为：采用10倍填料体积的PBS缓冲液(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾，PH为7.4)平衡上述填料，控制流速为1ml/min；经滤膜过滤后的重组蛋白上清样经过纯化柱，控制流速为0.5ml/min；20倍填料体积含20mM咪唑的清洗液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，20mM咪唑，pH7.4)冲洗柱子，控制流速为1ml/min；10倍填料体积含200mM咪唑的洗脱冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，300mM咪唑，pH7.4)洗脱纯化柱，控制流速为1ml/min，收集洗脱液得纯化蛋白。使用超滤管(截流量为30kDa)于4℃下6000rpm进行浓缩、脱盐。使用花粉培养基(5mM 2吗啉乙磺酸(MES),440mM蔗糖，0.55mM硝酸钙，1.60mM硫酸镁，1.60mM硼酸，1.00mM硝酸钾，pH6.5，用Tris来调节pH)对纯化的蛋白按照1：1000的比例在4℃下流动旋转透析24小时，之后放入-80℃备用。
实施例5 PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2重组蛋白对花粉管生长的鉴定
将上述透析过的PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2分段重组蛋白设置不同的浓度梯度来处理‘鸭梨’花粉，依次为对照(0)，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml，同时用同样浓度梯度的pCold-TF蛋白做阴性对照。具体实验操作如下：首先用6ml的梨花粉培养基预培养砀山酥梨花粉1小时，花粉的培养条件为25℃，100rpm，使其达到水合状态。花粉培养基的配方如实施例4。之后将预培养的花粉按计算的相应体积分别分装到2ml的EP管子中，重组蛋白和花粉总体积200μl，设置三次生物学重复，之后继续在25℃，100rpm的摇床上培养花粉2小时。使用NiKON ECLIPSE E100显微镜对培养过的花粉进行拍照。采用IPWin32软件统计花粉管的长度，每个浓度梯度统计大约50根左右的花粉管，计算平均值和标准误。使用同样方法，设置同样的浓度梯度，用PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2分段重组蛋白处理‘砀山酥梨’花粉。
实验结果表明，PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2分段重组蛋白都具有促进‘鸭梨’和‘砀山酥梨’花粉管生长的作用，比较不同浓度的作用效果，最终统一使用0.2mg/ml重组蛋白处理效果作为结果展示(图7)。
实施例6 PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2重组蛋白对S-RNase影响的鉴定
使用不同浓度‘鸭梨’花柱提取得到的S-RNase去处理‘鸭梨’花粉管生长，设置蛋白浓度梯度为对照(0)，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml，操作方法同实施例5。结果表明，S-RNase对花粉生长具有明显的抑制作用，其中0.2mg/ml S-RNase浓度效果较为明显，以此浓度作为最佳处理浓度。(图8)使用0.2mg/ml浓度S-RNase处理‘鸭梨’花粉管生长，与此同时，加入PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2分段重组蛋白(使其浓度为0.3mg/ml)，以同样浓度pCold-TF蛋白处理的花粉和不加重组蛋白的花粉分别作空白对照和阴性对照，操作方法同实施例，测定PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2分段重组蛋白对于S-RNase抑制花粉生长的影响。实验结果表明，PbrLRX.A2.1、PbrLRX.A2.2分段重组蛋白对于S-RNase抑制花粉生长具有缓解作用(图9)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> LRX功能基因及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2559
<212> DNA
<213> 梨(Pyrusbretschneideri)
<400> 1
atgcaggcct atggctgctt tctagttagc ttttttattt tctctttatt ttcctcctcc 60
tcttctgccc taaccgatgc cgaagtgtcc tttcttgcac atcgccagtt tgtaagcctc 120
ccagaaggtg gtgacattcc tgacaactat gaatttgagg ttgagcttga tctaaagttt 180
cccaacacca ggcttcgacg tgcatacatt gggcttcagg ctctaaaaaa ggccgtgtac 240
tcggaccctc tcaaaacaac cgagaactgg gttggcgaga atgtatgtgc ttacaacgga 300
gtcttctgcg caccggctct cgatgatccg gaacttgagg tggtggcagg cattgatatc 360
aaccatgcag acatcgctgg acaccttcct gcggaattag ggttgttgac ggacatggcg 420
ttgttccata tcaactctaa taggttttgt ggaatcatcc ccaagagctt tagaaggcta 480
actcttctcc acgagcttga tgttagcaat aaccgctttg tgggatcgtt tcccgacgtt 540
gtcctagaaa ttcataacct caagtacctc gacctaaggt tcaacgattt tgaggggaag 600
ctgcctcatg agcttttcaa caaggaactt gatgctttgt tcttgaatga caacaggttc 660
acatccacca ttcctgaaaa tctcggcaac tcccccgtat cagttcttgt cgtcgccaac 720
aaccatctcg agggctgcat ccccaacagc attggaaaaa tggttaaaac tttaaatgag 780
gctgtattct ccaacaacaa gtttactgga tgtctgcctc ctgaaatcgg acaacttgca 840
aacgtgacgg tgttcgatat tagttcaaac acattcagtg ggattatgtc gaaaactttc 900
aagggcttgg aaaaggtgga ggagctgaat atcgcacaca acatgctaac tgggtttgtt 960
cctgatagta tatgtatgtt gccaaacttg ggaaacttca cgttctcgta caactacttc 1020
aatggagaga cccaagaatg cgtgccagga tctcggaagg acgttgtgtt tgatgatgtg 1080
agcaattgtt taccagacag gcctgaacaa aagtcggcaa aagaatgtca tgctgtggtg 1140
agcaagccag tggattgcag taaggcaaag tgtggcgttg gacatgggcc gttgaaacct 1200
tctcagcctc tggttgaaaa gccaaagaca ccagagacag aacaacccaa acaaccacca 1260
ccacaaccta agccacaacc accaaaacca tcacctgaac cggttcaaac acctcataca 1320
ccagaaccac aaccacaacc acccaaggag gagcaaccca tggaacaacc tcccaaggag 1380
gagcaaccca aggaacaacc tgccaaggag gagccacccc aagaacaacc tcctagagat 1440
gagccaccaa aggtgcaacc tcccaaagaa gagctaccaa aggtgcaacc tcctaaagag 1500
gagctaccca aagaacaacc ttcaaaagag gaaccaccca aggcacaacc gcctcaagta 1560
gaagcacctg ctccagagcc ggttttagaa accccatcac ctacaccatc accatcacct 1620
aaagacatag gtcctaaggt tccaattttc cctccaccaa ttgttgacgc tcctccacca 1680
gcaccctttg ggcaaagatc tgtcgttcca atccgccctc acccaccacc agttcactcc 1740
cctccaccag cagtagtagc gcaaccacca ccaatgagct cgcaaccacc tccggttcac 1800
tctcctccac caccagtcca ttcaccccca ccaccaatcc actcttctcc accaccagtg 1860
gactcacccc caccacccgt ccagtcgcct ccaccaccgg tgcactcacc cccaccacct 1920
gtccattcgc ctccaccacc ggttcactca cccccaccac cagtccactc tcctcctcca 1980
cctgtgcact cacctcctcc accaccacca cctgtgcact cacctcctcc accaccacca 2040
cctgtgcact ctcctccacc acccgtccac tctcctcctc caccagtcca ctctcctcct 2100
ccacctgtgc actcacctcc accacctgtg cactcacctc caccaccggt ccactcaccc 2160
ccaccaccag tacactcacc cccaccacct gtacactcac ccccaccacc tgtacactca 2220
ccgccgccgc cagtgcactc acctccacca cctgtgcact cacctccacc accggtacac 2280
tcacctccac caccggtcca ctcgccgccg ccgccagtgc actcgccacc gccaccagca 2340
ccagtccact caccaccacc tccagtccaa tcatcaccac caccagtacc ggtccactca 2400
ccaccacctc cagtccaatc accaccacca ccttctccat ctttatcacc tcctcctccc 2460
gtttcctcat caccccctcc agtatatgac ttcgtattgc cacctaccat cgggttccaa 2520
tactcatctc cacctccacc aatgttccca ggctactaa 2559
<210> 2
<211> 852
<212> PRT
<213> 梨(Pyrusbretschneideri)
<400> 2
Met Gln Ala Tyr Gly Cys Phe Leu Val Ser Phe Phe Ile Phe Ser Leu
1 5 10 15
Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ala Leu Thr Asp Ala Glu Val Ser Phe Leu
20 25 30
Ala His Arg Gln Phe Val Ser Leu Pro Glu Gly Gly Asp Ile Pro Asp
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Glu Val Glu Leu Asp Leu Lys Phe Pro Asn Thr Arg
50 55 60
Leu Arg Arg Ala Tyr Ile Gly Leu Gln Ala Leu Lys Lys Ala Val Tyr
65 70 75 80
Ser Asp Pro Leu Lys Thr Thr Glu Asn Trp Val Gly Glu Asn Val Cys
85 90 95
Ala Tyr Asn Gly Val Phe Cys Ala Pro Ala Leu Asp Asp Pro Glu Leu
100 105 110
Glu Val Val Ala Gly Ile Asp Ile Asn His Ala Asp Ile Ala Gly His
115 120 125
Leu Pro Ala Glu Leu Gly Leu Leu Thr Asp Met Ala Leu Phe His Ile
130 135 140
Asn Ser Asn Arg Phe Cys Gly Ile Ile Pro Lys Ser Phe Arg Arg Leu
145 150 155 160
Thr Leu Leu His Glu Leu Asp Val Ser Asn Asn Arg Phe Val Gly Ser
165 170 175
Phe Pro Asp Val Val Leu Glu Ile His Asn Leu Lys Tyr Leu Asp Leu
180 185 190
Arg Phe Asn Asp Phe Glu Gly Lys Leu Pro His Glu Leu Phe Asn Lys
195 200 205
Glu Leu Asp Ala Leu Phe Leu Asn Asp Asn Arg Phe Thr Ser Thr Ile
210 215 220
Pro Glu Asn Leu Gly Asn Ser Pro Val Ser Val Leu Val Val Ala Asn
225 230 235 240
Asn His Leu Glu Gly Cys Ile Pro Asn Ser Ile Gly Lys Met Val Lys
245 250 255
Thr Leu Asn Glu Ala Val Phe Ser Asn Asn Lys Phe Thr Gly Cys Leu
260 265 270
Pro Pro Glu Ile Gly Gln Leu Ala Asn Val Thr Val Phe Asp Ile Ser
275 280 285
Ser Asn Thr Phe Ser Gly Ile Met Ser Lys Thr Phe Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Lys Val Glu Glu Leu Asn Ile Ala His Asn Met Leu Thr Gly Phe Val
305 310 315 320
Pro Asp Ser Ile Cys Met Leu Pro Asn Leu Gly Asn Phe Thr Phe Ser
325 330 335
Tyr Asn Tyr Phe Asn Gly Glu Thr Gln Glu Cys Val Pro Gly Ser Arg
340 345 350
Lys Asp Val Val Phe Asp Asp Val Ser Asn Cys Leu Pro Asp Arg Pro
355 360 365
Glu Gln Lys Ser Ala Lys Glu Cys His Ala Val Val Ser Lys Pro Val
370 375 380
Asp Cys Ser Lys Ala Lys Cys Gly Val Gly His Gly Pro Leu Lys Pro
385 390 395 400
Ser Gln Pro Leu Val Glu Lys Pro Lys Thr Pro Glu Thr Glu Gln Pro
405 410 415
Lys Gln Pro Pro Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Pro Lys Pro Ser Pro
420 425 430
Glu Pro Val Gln Thr Pro His Thr Pro Glu Pro Gln Pro Gln Pro Pro
435 440 445
Lys Glu Glu Gln Pro Met Glu Gln Pro Pro Lys Glu Glu Gln Pro Lys
450 455 460
Glu Gln Pro Ala Lys Glu Glu Pro Pro Gln Glu Gln Pro Pro Arg Asp
465 470 475 480
Glu Pro Pro Lys Val Gln Pro Pro Lys Glu Glu Leu Pro Lys Val Gln
485 490 495
Pro Pro Lys Glu Glu Leu Pro Lys Glu Gln Pro Ser Lys Glu Glu Pro
500 505 510
Pro Lys Ala Gln Pro Pro Gln Val Glu Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val
515 520 525
Leu Glu Thr Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Asp Ile Gly
530 535 540
Pro Lys Val Pro Ile Phe Pro Pro Pro Ile Val Asp Ala Pro Pro Pro
545 550 555 560
Ala Pro Phe Gly Gln Arg Ser Val Val Pro Ile Arg Pro His Pro Pro
565 570 575
Pro Val His Ser Pro Pro Pro Ala Val Val Ala Gln Pro Pro Pro Met
580 585 590
Ser Ser Gln Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser
595 600 605
Pro Pro Pro Pro Ile His Ser Ser Pro Pro Pro Val Asp Ser Pro Pro
610 615 620
Pro Pro Val Gln Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro
625 630 635 640
Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His
645 650 655
Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val
660 665 670
His Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro
675 680 685
Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His
690 695 700
Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro
705 710 715 720
Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro
725 730 735
Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val
740 745 750
His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser
755 760 765
Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Ala Pro Val His Ser
770 775 780
Pro Pro Pro Pro Val Gln Ser Ser Pro Pro Pro Val Pro Val His Ser
785 790 795 800
Pro Pro Pro Pro Val Gln Ser Pro Pro Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ser
805 810 815
Pro Pro Pro Pro Val Ser Ser Ser Pro Pro Pro Val Tyr Asp Phe Val
820 825 830
Leu Pro Pro Thr Ile Gly Phe Gln Tyr Ser Ser Pro Pro Pro Pro Met
835 840 845
Phe Pro Gly Tyr
850
<210> 3
<211> 2577
<212> DNA
<213> 梨(Pyrusbretschneideri)
<400> 3
atgcaggcct atggctgctt tctagttagt tttttccttt tctcttattt ttcctctttt 60
tcctccgccc taaccgatgc cgaagtgtca tttattgcac atcgccagct cgtcagtctc 120
ccagagggcg gcgacattcc tgacaactat gaatttgagg ttgagcttga tctgaagttt 180
ccaaatacca ggcttcgacg cgcatacatt gggcttcaag ctttgaaaaa ggccgtgtac 240
tcggaccctt tgaaaacaac ccaaaactgg gttggcaaga atgtatgtgc ttacactgga 300
gttttctgcg ctccggctcc tgatgatccg gaaattgagg tggtggcagg cattgatctc 360
aaccacgcag acatcgccgg acaccttcct gcggaattag ggttgttgac ggacatggcc 420
ttgttccaca tcaactccaa caggttttgt ggaatcatcc ccaagagctt tagaaggcta 480
actcttctcc acgagtttga tgttagcaac aaccgcttcg tgggatcatt ccccgacgtt 540
gtcctggaaa ttcccaacct caagtacctc gacctcaggt tcaacaattt cgaagggaag 600
ttgcctcctg agcttttcaa caaggaactg gatgctttgt tcttgaatga caacagattc 660
acatccacca ttcctgaaaa tctcggcaac tcccccatct cggttcttgt cgttgctaac 720
aaccatcttg aaggctgcat ccccaatagc attggaaaaa tggtgaacac cttaaatgag 780
gtagtattat ccaacaacaa gtttaccgga tgcctgcctc ctgaaatcag acaacttgca 840
aacgtgacgg ttttcgatat tagttcaaac acattcagtg ggattatgtc gaaaacttta 900
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cctgagagta tatgtatgtt gccaaactta gggaacttca cgttctcgta caactacttc 1020
aatggaaagg cccaaaaatg cgtgccaggt tctttgaaag atgttgtgtt taatgacgcg 1080
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agcaagccag tggattgcga taaggcaaag tgtggcggtg gacatgggcc ttcgaaacct 1200
tctcagcctc cggttgagaa cccaaagaca ccaaagcctt cacctgaact ggttccaaca 1260
actcctacac ccaaaccgca accacccaaa gaagagacac ccaaggaaca accttcaaag 1320
gaggagccac caaaggtgca agcgcccaaa gaggagccac caaaagtgaa acctcccaaa 1380
gaggagccac caataaaggt acaacctccc aaggatgagc catcaacggt gcaacctccc 1440
aaagaggagt taccaaagga gcaacctcca aaagatgagc cacccaaaga acaacctcca 1500
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ccgccagtgc actcgcctcc accaccagtg cactcacctc caccagtagt ccattcacct 1860
ctaccaccag tgcactcgcc tccaccacca gtctattctc ctccaccacc agtgcactca 1920
cccccaccac ccgttcactc acctccacta ccagtgcact cacccccacc accagtccat 1980
tctccttcac caccagtaca ctcaccccca ccacccgtcc actcccctcc accaccagtg 2040
cactcaaccc caccacccgt tcactcccct ccactaccag tgcactcacc cccaccacca 2100
gtccattctc ctccaccacc agtacactca cccccaccac ccgtccactc ccctccacca 2160
ccagtgcact cacctccacc gcactcacct ccaccaccaa tacactcacc cccaccaccc 2220
gtccactccc ctccaccacc agtgcactca cccccaccac cagtccactt tcctccacca 2280
ccagtgcact cacccccacc accagttcac tcccctccac cacctgtcca ctcgccccca 2340
ccaccagtcc actcgccccc accaccagtc cattctcctc cgccaccagt gcactcaccc 2400
ccaccaccag caccgattca ctcaccgcca cctctagtcc aatcacctcc accagcttct 2460
ccatctttgt cacctcctcc tcccattttc tcaccacccc ctccagactt cgtcttgcca 2520
ccgaccatcg ggttccaata ctcatctcca cctccaccaa tgttcccagg ctactaa 2577
<210> 4
<211> 858
<212> PRT
<213> 梨(Pyrusbretschneideri)
<400> 4
Met Gln Ala Tyr Gly Cys Phe Leu Val Ser Phe Phe Leu Phe Ser Tyr
1 5 10 15
Phe Ser Ser Phe Ser Ser Ala Leu Thr Asp Ala Glu Val Ser Phe Ile
20 25 30
Ala His Arg Gln Leu Val Ser Leu Pro Glu Gly Gly Asp Ile Pro Asp
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Glu Val Glu Leu Asp Leu Lys Phe Pro Asn Thr Arg
50 55 60
Leu Arg Arg Ala Tyr Ile Gly Leu Gln Ala Leu Lys Lys Ala Val Tyr
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Ser Asp Pro Leu Lys Thr Thr Gln Asn Trp Val Gly Lys Asn Val Cys
85 90 95
Ala Tyr Thr Gly Val Phe Cys Ala Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Ile
100 105 110
Glu Val Val Ala Gly Ile Asp Leu Asn His Ala Asp Ile Ala Gly His
115 120 125
Leu Pro Ala Glu Leu Gly Leu Leu Thr Asp Met Ala Leu Phe His Ile
130 135 140
Asn Ser Asn Arg Phe Cys Gly Ile Ile Pro Lys Ser Phe Arg Arg Leu
145 150 155 160
Thr Leu Leu His Glu Phe Asp Val Ser Asn Asn Arg Phe Val Gly Ser
165 170 175
Phe Pro Asp Val Val Leu Glu Ile Pro Asn Leu Lys Tyr Leu Asp Leu
180 185 190
Arg Phe Asn Asn Phe Glu Gly Lys Leu Pro Pro Glu Leu Phe Asn Lys
195 200 205
Glu Leu Asp Ala Leu Phe Leu Asn Asp Asn Arg Phe Thr Ser Thr Ile
210 215 220
Pro Glu Asn Leu Gly Asn Ser Pro Ile Ser Val Leu Val Val Ala Asn
225 230 235 240
Asn His Leu Glu Gly Cys Ile Pro Asn Ser Ile Gly Lys Met Val Asn
245 250 255
Thr Leu Asn Glu Val Val Leu Ser Asn Asn Lys Phe Thr Gly Cys Leu
260 265 270
Pro Pro Glu Ile Arg Gln Leu Ala Asn Val Thr Val Phe Asp Ile Ser
275 280 285
Ser Asn Thr Phe Ser Gly Ile Met Ser Lys Thr Leu Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Lys Val Glu Glu Leu Asp Val Ser His Asn Met Leu Thr Gly Phe Val
305 310 315 320
Pro Glu Ser Ile Cys Met Leu Pro Asn Leu Gly Asn Phe Thr Phe Ser
325 330 335
Tyr Asn Tyr Phe Asn Gly Lys Ala Gln Lys Cys Val Pro Gly Ser Leu
340 345 350
Lys Asp Val Val Phe Asn Asp Ala Ser Asn Cys Leu Leu Gly Arg Pro
355 360 365
Lys Gln Lys Ser Ala Lys Glu Cys Tyr Ala Val Val Ser Lys Pro Val
370 375 380
Asp Cys Asp Lys Ala Lys Cys Gly Gly Gly His Gly Pro Ser Lys Pro
385 390 395 400
Ser Gln Pro Pro Val Glu Asn Pro Lys Thr Pro Lys Pro Ser Pro Glu
405 410 415
Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Pro Lys Pro Gln Pro Pro Lys Glu Glu
420 425 430
Thr Pro Lys Glu Gln Pro Ser Lys Glu Glu Pro Pro Lys Val Gln Ala
435 440 445
Pro Lys Glu Glu Pro Pro Lys Val Lys Pro Pro Lys Glu Glu Pro Pro
450 455 460
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485 490 495
Glu Gln Pro Pro Lys Asp Glu Pro Pro Lys Ala Gln Pro Pro Lys Glu
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Glu Ala Pro Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ile Phe Pro Pro Pro Ile
515 520 525
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565 570 575
Pro Pro Pro Pro Phe His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro
580 585 590
Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro
595 600 605
Pro Val His Ser Pro Pro Pro Val Val His Ser Pro Leu Pro Pro Val
610 615 620
His Ser Pro Pro Pro Pro Val Tyr Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser
625 630 635 640
Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Leu Pro Val His Ser Pro Pro
645 650 655
Pro Pro Val His Ser Pro Ser Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro
660 665 670
Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Thr Pro Pro Pro Val His
675 680 685
Ser Pro Pro Leu Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro
690 695 700
Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro
705 710 715 720
Pro Val His Ser Pro Pro Pro His Ser Pro Pro Pro Pro Ile His Ser
725 730 735
Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro
740 745 750
Pro Pro Val His Phe Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro
755 760 765
Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His
770 775 780
Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro Pro Pro Pro Val His Ser Pro
785 790 795 800
Pro Pro Pro Ala Pro Ile His Ser Pro Pro Pro Leu Val Gln Ser Pro
805 810 815
Pro Pro Ala Ser Pro Ser Leu Ser Pro Pro Pro Pro Ile Phe Ser Pro
820 825 830
Pro Pro Pro Asp Phe Val Leu Pro Pro Thr Ile Gly Phe Gln Tyr Ser
835 840 845
Ser Pro Pro Pro Pro Met Phe Pro Gly Tyr
850 855
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcaggcct atggctgctt tc 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagtagcct gggaacattg gtgg 24

Claims (1)

1.一种促进梨花粉管生长的方法，其特征在于，采用蛋白体外处理梨花粉管；所述蛋白是以PbrLRX.A2.1基因为模板，以PbrLRX.A2.1基因中间段引物或PbrLRX.A2.1基因C段引物为引物进行PCR扩增得到的目的基因片段所表达的蛋白；
所述PbrLRX.A2.1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述的PbrLRX.A2.1基因中间段引物：
PbrLRX.A2.1-M-F: ctcggtaccctcgagggatccATGCCTGAACAAAAGTCGGC
PbrLRX.A2.1-M-R: agcagagattacctatctagaAGGGCGGATTGGAACGAC；
所述的PbrLRX.A2.1基因C段引物：
PbrLRX.A2.1-C-F: ctcggtaccctcgagggatccATGTTTGGGCAAAGATCTGTCGTT
PbrLRX.A2.1-C-R: agcagagattacctatctagaGTAGCCTGGGAACATTGGTGG。
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