CN115927366A - 一种提高植物耐镉性能的VvMT1S和VvMT2S双基因及其应用 - Google Patents

Abstract

一种提高植物耐镉性能的VvMT1S和VvMT2S双基因及其应用，利用基因合成法将源于葡萄的VvMT1S和VvMT2S基因进行了改造，得到了核苷酸序列如SEQ ID No 1所示的VvMT1S基因，和SEQ ID No 3所示的VvMT2S基因并构建了重组表达载体，将耐镉基因VvMT1S和VvMT2S成功导入水稻中，得到的转基因水稻植株都具有很强的抗镉能力。经30mM镉溶液处理后，转基因株系生长良好，且转基因株系中的镉含量只有对照株系的17%‑48%，表明本发明改造合成的VvMT1S和VvMT2S基因具有提高植物抗镉并减少富集的能力，可用于培育耐镉作物。

Description

一种提高植物耐镉性能的 VvMT1S和 VvMT2S双基因及其应用

技术领域

本发明属于培育耐镉且低富集镉植物技术领域，具体涉及来源于葡萄的耐镉双基因 VvMT1S和 VvMT2S及其应用。

背景技术

镉（Cd）是生物毒性最强的重金属元素，在环境中的化学活性强，移动性大，毒性持久，容易通过食物链的富集作用危及人类健康，对人体具有致病、致癌、致突变作用，能诱发肾衰变、关节炎、癌症等病。

镉易通过农作物途径进入人体造成毒害。世界卫生组织(2003)和美国环保局(1994)规定人体Cd的最大允许摄入量(ADI值)均为1μg·kg^－1·d^－1。镉是一种积累性的剧毒元素，人体某些器官中的Cd含量随着年龄的增长而增加，对Cd的环境行为、污染防治等方面的研究一直受到广泛关注。

重金属污染不仅会导致土壤生产能力的下降，而且还可以通过根部的吸收，迁移转化到农作物根茎叶及果实中去，经过食物链最后累积到人的体内，从而危害到人的身体健康。自20世纪70年代中期，我国开始有关农田土壤Cd污染的调查工作。

水稻( Oryza sativa L.)是全球约一半人口的主粮，也是人体摄入Cd的主要来源。人体长期摄入Cd，会对肾脏、骨骼、肺部等多个器官造成损害。因此，解决稻米Cd超标问题对实现水稻安全生产、保障粮食安全具有重大意义。

培育出含镉量低的作物有两种途径，一是保障生态系统，降低土壤环境中镉含量，减少对农作物产品的污染；二是培育耐镉且低富集镉的作物。培育并推广Cd低积累水稻品种是解决这一问题最经济、有效的方法。

金属硫蛋白（metallthioneins，MTs）MTs是一类低分子质量( Mr＜10 ka) 、富含半胱氨酸（Cys）( 20%～30%)的蛋白质。根据Cys残基的排列方式，MTs可以分为3类( I、II和III) : I类MTs具有20个保守的Cys残基，仅在哺乳动物和脊椎动物中发现【Cobbett等，Annual Review of Plant Biology，2002,53（1）：159-182】；II类包含来自植物、真菌和无脊椎动物的MTs，并显示出Cys残基的灵活排列方式；III类MTs由植物螯合素（PCs）组成，它们是酶促合成肽。植物MTs属Ⅱ类，其氨基酸数量从45～87不等，Cys含量在10～17个残基，芳香族氨基酸的数量从0到几个不等，组氨酸( His)含量低。植物中发现的4种MTs及亚型都能与金属结合，因而发挥着金属螯合剂或“储存库”的作用【Memon等，Turkish Journal ofBotany，2001，25（3）：111-121】。空间结构分析显示，植物MTs 的构象为哑铃状，具有两个独立的α结合域和β结构域，其核心簇中包含几个四面体的金属-半胱氨酸( Metal-Cys)单位。N端( β结构域) 参与必需金属离子的稳态，而C末端( α结构域)紧密螯合过量/或有毒金属离子，两个结构域对不同金属的反应性和亲和力促使两个金属簇发挥不同的功能。至于连接α和β结构域的间隔区，可能有助于MTs蛋白的稳态或亚细胞定位【Domenech等，Biochemistry，2006,88（6）：583-593】，也是MT金属解毒功能所必需的。

由于Cd等重金属具有高毒性和水溶性，在相对较低浓度下就会对动物、植物和微生物造成影响，因而被认为是非常不利的污染物。植物通过吸收和转运等一系列机制控制金属含量，实现解毒。MTs的合成是植物进行重金属解毒的策略之一，它通过Cys形成巯基簇结合金属离子，形成硫醇键( -SH-M)，随后结合金属的MTs与液泡膜上的金属转运蛋白相互作用，被区隔至液泡，从而降低过量金属对胞质中重要分子或细胞器的攻击【Cobbett等，Annual Review of Plant Biology，2002,53（1）：159-182】。值得注意的是，MTs对重金属解毒不只是将胞质中螯合的金属区隔到低代谢活性的液泡中。研究发现，拟南芥AtMT2a 和AtMT3 在蚕豆保卫细胞中的过表达增强其对Cd²⁺的抗性【Perfus等，The Plant Journal，2002，32（4）：539-548】，一方面是由AtMT2a和AtMT3对Cd²⁺的鳌合，另一方面则间接阻止Cd^2+,与胞质其他成分的相互作用或进入细胞器，因而减少由Cd²⁺诱导的活性氧产生。

因此挖掘植物MTs的潜在功能，探索重金属解毒、生物及非生物抗性中发生的调控机制，利用基因工程手段提高生物的胁迫抗性和生物修复能力，仍然是今后研究的重要内容。

发明内容

本发明的目的在于提供来源于葡萄的耐镉双基因 VvMT1S和 VvMT2S及其应用，可在水稻中高效表达，将该耐镉双基因 VvMT1S和 VvMT2S转化至水稻中，能提高转基因水稻的抗镉能力，对于培育提高镉抗性和低富集性作物品种有重要的理论意义和现实意义。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种来源于葡萄的耐镉基因 VvMT1S和 VvMT2S，其核苷酸序列如SEQ ID No 1和No2所示。

含有所述耐镉基因 VvMT1S和 VvMT2S的重组表达载体。

优选地，所述重组表达载体还包括有双35S启动子、GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因。

本发明提供所述来源于葡萄的耐镉基因 VvMT1S和 VvMT2S在培育耐镉植物中的应用。

优选地，所述耐镉植物为水稻。

一种将所述来源于葡萄的耐镉基因 VvMT1S和 VvMT2S转入水稻中的方法，包括以下步骤：

1)扩增耐镉基因

按耐镉基因 VvMT1和 VvMT2的序列，设计引物，内侧引物分别为1.5ng，外侧两个引物分别为30ng，进行PCR，分别扩增出 VvMT1S和 VvMT2S片段；

2)构建重组表达载体

PCR扩增结束后，回收产物，与T/A克隆载体相连，得到DNA连接产物，高效转化DH5α感受态细胞中；

利用 BamHI和 SacI进行双酶切PCR产物后，分别回收 VvMT1S和 VvMT2S基因片段，通过T4 DNA连接酶将回收的 VvMT1S和VvMT2S基因与含有双35S启动子的植物表达载体1301连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因 VvMT1S和 VvMT2S基因的重组质粒AH781，该表达载体还包含GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因；

3)转化水稻

利用电击法将上述重组质粒AH781导入根癌农杆菌EHA105中，将构建好的含 VvMT1S和 VvMT2S基因的农杆菌EHA105转化水稻愈伤组织，利用潮霉素进行转化筛选，在潮霉素培养基上分化成苗，进行移载，收种，进行阳性苗鉴定。

本发明的耐镉基因 VvMT1S和 VvMT2S来源于葡萄，其编码的蛋白属于金属硫蛋白，将该双基因改造后转化水稻中，进行植物耐镉研究，提高植物的耐镉性能，降低镉在水稻中的积累，并验证了其提高植物镉抗性和降低积累的功能。

将本发明的 VvMT1S和 VvMT2S基因转入水稻，自交纯合2代后，获得纯合转化株，收取种子播种后，用镉水溶液连续浇灌，分别测定转基因株系和对照株系中镉含量，对照株系中镉含量是转基因株系的2-6倍，大大降低了水稻中镉的含量。连续浇灌三次后，转基因植株仍生长稳定，叶片大而绿。但野生对照株系生长受到严重影响，已经死亡。表明转入本发明 VvMT1S和 VvMT2S基因的转基因水稻对镉的抗性明显提高，含量大大降低。

本发明至少具有如下有益效果：

本发明采用基因合成法合成了来源于葡萄的耐镉基因 VvMT1S和 VvMT2S，可成功转化到水稻中，并在水稻中高效表达，得到转基因水稻；转入 VvMT1S和 VvMT2S基因的水稻植株和野生型水稻植株在镉抗性上有明显的差异，转基因拟南芥可耐受30mM以内镉水溶液的连续浇灌处理，以30mM镉水溶液连续浇灌3次后，对照株系中镉含量是转基因株系的2-6倍，转基因水稻生长正常，表型明显优于野生型水稻，表明对照株系中镉含量是转基因株系的2-6倍，基因的转入提高了水稻植株抗镉和低吸收镉的能力。

附图说明

图1为本发明含有目的基因的植物重组质粒AH781的构建示意图。

图2为本发明实施例4中转基因水稻阳性苗的PCR扩增结果图，其中，M为DNA mark，CK为野生型对照植株，781-6、781-7、781-9分别为转基因水稻的三个株系。

图3为本发明实施例5中浇灌镉后转 VvMT1S和 VvMT2S基因水稻与对照水稻的抗镉表型图，其中：CK为野生型对照水稻，781-6、781-7、781-9分别为转基因水稻的三个株系。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明所用的试验材料及其来源包括：

野生型水稻（中花11），26℃人工气候室培养，16 h光照培养；大肠杆菌（ Escherichia coli）DH5α由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存；克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司，所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买，ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》（Molecular Cloning. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）。

实施例1

基因合成法合成来源于葡萄的耐镉基因 VvMT1S和 VvMT2S

利用基因合成法（Xiong et al.，Nucl Acids Res，2004，32: e98）克隆来源于葡萄的金属硫蛋白基因 VvMT1S和 VvMT2S，在保持 VvMT1S和 VvMT2S基因的氨基酸序列不变的基础上，按照水稻偏爱密码重新合成编码金属硫蛋白基因 VvMT1S和 VvMT2S。

基因合成设计原则包括：按拟南芥偏爱密码子，避免基因中出现ATTTA等PolyA加尾信号；避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40~60%，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins，避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸（CG在植物中易造成甲基化）。

分别利用PCR进行扩增 VvMT1S和 VvMT2S片段，在50μl反应体系中，内侧的引物分别为1.5ng，外侧的两个引物分别为30ng，1μl KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），5μl 10×PCR buffer，4μl dNTP，加无菌水定容至50μl；扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1min，共25个循环。

PCR结束后，用1%琼脂糖凝胶回收，取10μl回收产物直接与pMD-18-Simple T克隆载体相连，4℃连接过夜，得到DNA连接产物，高效转化到DH5α感受态细胞中。

从DH5α转化子细胞中抽提质粒，以抽提质粒为模板分别进行PCR扩增，分别得到了252bp和246bp的片段，经测序和BLAST比对，表明PCR法合成的基因与 VvMT1S和 VvMT2S基因的氨基酸序列完全一致，即为本发明来源于葡萄的 VvMT1S和 VvMT2S基因， VvMT1S的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示； VvMT2S的核苷酸序列如SEQ ID No 3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No 4所示。

实施例2构建含 VvMT1S和 VvMT2S基因的双基因表达载体

分别用 BamHI和 SacI进行双酶切PCR产物，用1%琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将实施例1中回收的 VvMT1S和 VvMT2S基因片段与含有双35S启动子1301质粒连接，经酶切鉴定和序列分析测定，获得含有金属硫蛋白基因 VvMT1S和 VvMT2S的重组表达载体AH781，该表达载体还包含GUS 报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，如图1所示。

实施例3 转化至水稻将实施例2获得的上述重组表达载体经电击法导入农杆菌中。

1.制备感受态细胞

挑取根癌农杆菌EHA105单菌到25mL YEB培养基（50mg/L利福平）培养过夜，取5mL菌液转接到100mL YEB培养基（50mg/L利福平），培养至OD600 = 0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000g离心10min，4℃，收集菌体，加入100mL无菌双蒸水清洗两次；加入4mL10%甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500g离心10min，4℃；收集菌体，加入500µL10%甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管，得到农杆菌感受态细胞。

2.电击转化

取70µL上述置备好的农杆菌感受态细胞，加入1µL重组表达载体AH781用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7 KV，2.5F，电击后立即加入800µL SOC培养液【参见《分子克隆实验指南》，Sambrook and Russell, 2001】。

培养1小时后，取100µL涂抗性板筛选转化子，29℃培养，筛选出成功导入重组表达载体AH781的菌株。

实施例4 农杆菌侵染转化水稻愈伤组织

含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌在含对应抗生素的5mL 液体LB培养基中，28℃培养2天。将5mL菌液转到500mL的液体LB培养基中28℃培养16-24小时（OD=1.5-2.0），液体可以在4℃保存30天。室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟。用等体积液体AAM培养基悬浮。加入25mg/L的乙酰丁香酮溶液混匀后转移到三角瓶中，即得转化菌液。

挑选大小合适生长饱满的水稻愈伤浸入转化菌液在摇床，90转每分钟，29℃震荡培养8分钟。侵染后将愈伤用无菌滤纸吸干后，转移至含有25mg/L乙酰丁香酮的MS培养基，24℃，暗培养2天。共培养结束后，将愈伤用无菌水洗净后吸干，转移至含有50µg/mL潮霉素、250mg/L羧苄青霉素的N6培养基进行筛选。4周后，将阳性愈伤转移至分化培养基分化成苗。

待苗生长至3周左右，取叶片抽提RNA，反转录为cDNA，利用PCR进行扩增 VvMT1S和 VvMT2S片段，在50μl反应体系中，特异性引物2µg，1μl KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），5μl 10×PCR buffer，4μl dNTP，加无菌水定容至50μl。扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，1min。共30个循环。

进行PCR扩增目的基因，结果如图2所示，图2中，M为DNA mark，CK为野生型对照植株，781-6、781-7、781-9分别为转基因水稻。从图2中可知，野生型植株中没有检测到目的基因片段，而转入 VvMT1S和 VvMT2S基因植物中都有很亮的长度约为250bp的条带，证明 VvMT1S和 VvMT2S基因已成功导入水稻并在转录水平表达。

实施例5合成的 VvMT1S和 VvMT2S基因转化植物后对镉的抗性鉴定

将上述已成功转入 VvMT1S和 VvMT2S基因的转基因水稻自交纯合2代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，26℃生长4周，同时培养非转基因水稻作为对照实验，将对照株系和转基因株系分别套袋灌溉30mM镉水溶液，每7天浇灌一次，浇灌三次观察转基因水稻和对照株系对镉的抗性作用。

连续浇灌三周后进行镉含量测定，发现镉在转基因株系中的含量明显低于对照株系，如表1所示。

表1 浇灌镉后转 VvMT1S和 VvMT2S基因水稻株系与对照株系的镉含量

编号	镉含量（mg/kg）
		WT	1638
781-6	784.7
		781-7	273.3
781-9	280.4

 第三次浇灌30mM镉水溶液10天后，统计对照株系与转基因株系性状如图3所示。

实验结果表明，对照株系和转基因型水稻对镉的抗性差异明显，转基因水稻对镉抗性明显提高，说明本发明合成的 VvMT1S和 VvMT2S基因可提高植物抗镉和低吸收镉的性能。

综上所述，本发明利用基因合成法将来源于葡萄的的金属硫蛋白基因 VvMT1S和 VvMT2S，进行了重新改造，得到了其核苷酸序分别如SEQ ID No 1所示的 VvMT1S基因和SEQID No 3所示的 VvMT2S基因。同时并将 VvMT1S和 VvMT2S基因成功导入水稻中，检测发现得到的转基因植株都具有很强的抗镉和低吸收镉能力，表明本发明改造合成的 VvMT1S和 VvMT2S基因具有提高植物抗镉和低富集镉的能力，可用于培育低吸收镉的作物的技术领域。

以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.来源于葡萄的耐镉双基因VvMT1S和VvMT2S，其核苷酸序列如SEQ ID No 1和SEQ IDNo3所示。

2.含有权利要求1所述耐镉基因VvMT1S和VvMT2S的重组表达载体。

3.如权利要求1所述来源于葡萄的耐镉基因VvMT1S和VvMT2S在培育耐镉并低富集植物中的应用。

4.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述耐镉植物为水稻。

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