CN113584046A - 二色补血草基因LbWER及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供二色补血草基因LbWER及其应用。本发明从二色补血草中克隆获得基因LbWER的cDNA序列全长789bp，编码262个氨基酸。经过基因克隆、生信分析、载体构建、侵染转化、表型观察等实验，可以观察到对野生型二色补血草敲除LbWER基因后其盐腺发生了明显改变，在DIC观察下盐腺由野生型的四个发光点变为三个或两个发光点，说明盐腺组成细胞数目变少，即LbWER基因可能与盐腺的发育有关，野生型二色补血草缺失LbWER基因会导致盐腺畸形，说明LbWER基因调控了盐腺的发育过程。本发明为进一步探究揭示盐腺的发育机制奠定基础。

Description

二色补血草基因LbWER及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及二色补血草基因LbWER及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是一个全球性的环境问题，影响着地球表面6.5％左右的土地。在大约2.3亿公顷的灌溉农田中，有20％左右的土地面积受到盐渍化的影响，由于不适当的灌溉习惯，这一比例每年都在增加(Munns and Tester,2008；王宝山,2010)。要扩大耕地面积必须改造和充分利用大面积的盐碱地。极少有农作物可以在盐渍化严重的地区生存，这导致农产量大幅下降，还会导致土壤退化和荒漠化(Flowers&Colmer 2008)。因此，为了应对盐渍化对农业的挑战，有必要通过用耐盐基因转化非盐生植物来提高其耐盐性。盐生植物具有耐盐的关键特性，可以在≥200mM NaCl的环境中生存并完成其生命周期，并在生态保护和盐渍土壤的恢复中发挥重要作用。了解盐生植物的耐盐机理可能有助于我们探索抗盐基因，以增强作物等非盐生植物对高盐度环境的适应性(Cuin and Shabala 2007)，这不仅对于盐碱地的开发和利用有重要意义，对农业生产和环境的可持续发展也起着至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供二色补血草基因LbWER及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供二色补血草基因LbWER，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明从二色补血草中克隆获得基因LbWER的cDNA序列全长789bp(SEQ ID NO:2)，编码262个氨基酸。经分析，LbWER属于R2R3-MYB类转录因子。原位杂交结果将基因LbWER特异性定位到盐腺上，提示该基因可能与盐腺的发育有关。

第二方面，本发明提供二色补血草基因LbWER启动子，其序列为：

i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供含有所述基因LbWER或所述启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第四方面，本发明提供所述启动子在调控下游基因表达中的应用，所述下游基因包括但不限于基因LbWER，报告基因GUS、GFP等。

第五方面，本发明提供所述基因LbWER、所述启动子或含有所述基因LbWER或所述启动子的生物材料在制备转基因植物中的应用。

第六方面，本发明提供所述基因LbWER或含有基因LbWER的生物材料的以下任一应用：

(1)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；

(2)用于植物品种改良和改良盐碱地。

优选地，所述植物为二色补血草。

所述调控为正调控，例如正调控盐腺细胞数目等。

第七方面，本发明提供一种使二色补血草盐腺细胞数目减少、盐腺发育异常的方法，利用基因工程手段，弱化二色补血草基因LbWER，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

优选地，所述基因工程手段可选自诱变、定点突变、同源重组等中的一种。

进一步地，针对二色补血草中的目标基因LbWER设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化二色补血草，进而获得该基因功能缺失的转基因植株。

优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GGAAAAGAAAGCTACAAGA-3’，5’-TGGACTATGTGAACTGTCA-3’。

第八方面，本发明提供一种促进植物盐腺发育(如盐腺细胞数目增加)的方法，所述方法选自如下①或②：

①使植物表达所述基因LbWER编码的蛋白；

②在植物中过表达所述基因LbWER。

优选地，所述植物为泌盐盐生植物，更优选二色补血草。

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

5)通过导入增强子。

第九方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因植物的以下任一应用：

i.用于植物育种；

ii.用于盐碱地种植。

所述育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

本发明首次从二色补血草中克隆得到基因LbWER，经过基因克隆、生信分析、载体构建、侵染转化、表型观察等一系列实验，可以明显观察到对野生型二色补血草敲除LbWER基因后其盐腺发生了明显改变，在DIC观察下盐腺由原先的四个发光点变为三个或两个发光点，说明盐腺数目变少，即LbWER基因可能与盐腺的发育有关，野生型二色补血草缺失LbWER基因会导致盐腺畸形。由于盐腺最主要的功能是将多余盐分排出体外，也说明LbWER基因可能参与到二色补血草的泌盐过程。本发明为进一步探究揭示盐腺的发育机制奠定基础。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中LbWER蛋白二级结构分析结果。

图2为本发明较佳实施例中LbWER三级结构预测结果。

图3为本发明较佳实施例中LbWER基因进化树。

图4为本发明较佳实施例中LbWER在不同发育时期、二色补血草的不同部位以及不同盐处理时间下的表达量。盐处理时所用NaCl溶液浓度是300mM、6-BA溶液浓度为0.04mg/L、ABA溶液浓度为0.1mg/L。

图5为本发明较佳实施例中LbWER基因的原位杂交实验定位在盐腺上。

图6为本发明较佳实施例中LbWER启动子PCR结果。其中，M1：DNA Marker 5000 1：LbWER启动子。

图7为本发明较佳实施例中二色补血草敲除载体菌落PCR结果。

图8为本发明较佳实施例中LbWER启动子转化拟南芥后GUS染色的结果。

图9为本发明较佳实施例中野生型二色补血草叶片的表型观察。

图10为本发明较佳实施例中敲除载体转化补血草新生小芽(2周)的表型观察，盐腺发光点为2-3个。

图11为本发明较佳实施例中敲除载体转化补血草新生小芽(10周)的表型观察，盐腺发光点为2-3个。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 LbWER基因的克隆及生物信息学分析

本发明利用二色补血草叶片发育早期数据库，与目前所有已经注释的物种进行了比对注释后，筛选到在二色补血草叶片发育stage A与stage B时期均高表达的LbWER基因。通过转录组测序发现，定位在2号染色体上的Lb5G29157基因(即LbWER)，属于R2R3-MYB类转录因子。

1植物材料

二色补血草的种子于2016年11月采自中国中东部的山东省东营市黄河三角洲内陆的盐碱地。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia-0生态型，于4℃保存。

先将二色补血草种子置于70％乙醇进行表面消毒，充分震荡5分钟。然后，用6％次氯酸钠(有效氯)震荡消毒15-20分钟。最后无菌水冲洗5-6遍，室温静止20分钟后，再用无菌水冲洗3-4次，将消毒的种子均匀的播散在MS培养基(Murashige and Skoog,1962)中。将播种后的种子置于光照培养室中，光周期为16h/8h(昼/夜)，光照强度为200μmol·m^-2·s^-1，温度设为25℃，培养30天后植株生长到六叶期。

2LbWER基因克隆

2.1盐腺发育时期总RNA的提取

将二色补血草的种子消毒后播种于1/2MS培养基上，取生长4-5天的无菌苗的第一片真叶，富集于液氮中，用Takara RNA提取试剂盒进行RNA提取，并用乙醇/醋酸钠法对所提取RNA进行纯化。具体步骤如下：

(1)加入500μl Buffer KB平衡液至柱子内，室温下13,000rpm离心1min，使平衡液完全流过柱子。

(2)在2mL EP管中按1mL KL_Plant裂解液和10μl巯基乙醇的比例加入，利用涡旋仪进行混匀。

(3)取200mg相同发育时期和叶位的叶片，放于盛有液态氮的研钵中研磨，反复3次。

(4)将研磨的材料放入2mL EP管中，然后将裂解液加入到1.5mL EP管中，利用涡旋仪进行涡旋，室温下放置15min，每隔5min充分涡旋一次。

(5)4℃，13,000rpm离心15min。

(6)EP管内液体会分为3层，小心吸取中间层到新的2mL EP管中，重复步骤(4)；

(7)再次将EP管内中间层液体转到新的2mL EP管内，再添加等量的-20℃预冷的异丙醇，充分混匀，然后转移到已经平衡了的吸附柱内，4℃，13,000rpm离心30s(如混合液体积过大，可以分成两次上柱，确保每次上样量不会超过700μl)。

(8)倒掉EP管内的过滤液，保留吸附柱。

(9)加入700μl Buffer KW，4℃，13,000rpm；离心1min。

(10)重复步骤(8)。

(11)为清除吸附柱内的剩余漂洗液，将得到的空吸附柱放到新收集管内，4℃，13,000rpm离心2min。

(12)将空吸附柱放到新的1.5mL EP管内，添加65℃预热的DEPC水30μl，放置2min(室温)，4℃，13,000rpm离心1min，以收集提取的总RNA。

RNA质量检测：

(1)电泳检测：分别配置1×TAE电泳缓冲液和1％琼脂糖凝胶，120V电泳检测RNA条带是否发生降解。

(2)分光光度计检测：利用NanoDrop 2000核酸蛋白检测仪，取1μl RNA检测提取的总RNA浓度及纯度。如果提取的总RNA满足浓度≥1000ng/μl，OD_260/280＝2.0-2.2，说明可以利用此RNA进行后续实验。

总RNA的纯化：提取RNA后，如果发现RNA浓度较低，可以进行沉淀浓缩，步骤如下：

(1)向提取的总RNA中添加3倍体积的无水C₂H₅OH和1/4体积的CH₃COONa溶液，充分混匀后，置于-80℃冰柜中沉淀至少24h。

(2)4℃，13,000rpm离心40min。

(3)弃上清，保留沉淀，然后用DEPC水配制的75％乙醇200μl漂洗所得沉淀。

(4)4℃，13,000rpm离心10min，重复步骤(3)。

(5)4℃，13,000rpm离心10min，弃上清，吸干剩余液体。

(6)将沉淀放入冰盒中使乙醇充分挥发，然后加入20μl DEPC水溶解沉淀，得到RNA溶液。

2.2RNA反转录及PCR扩增

利用反转录试剂盒ReverTra

qPCR RT Kit进行逆转录，合成cDNA。方法如下：

反转录体系：

将反应体系混匀后，置于PCR仪内，按照如下程序进行反应：37℃15min，85℃5min，4℃保存。

2.3基因全长的克隆

(1)PCR反应体系(25μl)：

PCR扩增仪参数设置：95℃3min；95℃15s，57℃20s，72℃1min，32个循环；72℃10min，12℃保存。

(2)回收目的基因片段；

①DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。

②加入等倍体积Buffer GDP。50～55℃水浴7-10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀两次加速溶胶。

Buffer GDP加入1-3倍体积不影响DNA回收率。若回收小于或等于100bp DNA片段时，加入3倍体积Buffer GDP，水浴溶胶后，再加入1倍凝胶体积异丙醇，混匀后再按第③步进行操作。

③短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2mL收集管中，将≤700μl溶胶液转移至吸附柱中，12000g离心30-60sec。若溶胶体积大于700μl，将吸附柱置回收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12000g离心30-60sec。

④弃滤液，将吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000g离心30-60sec。

⑤弃滤液，将吸附柱置于收集管中。加入700μl Bufer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000g离心30-60sec。

沿吸附柱壁四周加入Buffer GW，或加入Buffer GW后盖盖颠倒混匀2-3次有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

⑥重复步骤⑤。两次使用BufferGW冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。

⑦弃滤液，把吸附柱置回收集管中。12,000g离心2min。

⑧将吸附柱置于在1.5mL灭菌的离心管中，加入20-30μl Elution Buffer至吸附柱中央，放置2min。12,000g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。

要想获得最高产量，建议将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复第⑧步进行二次洗脱。回收大于3kb的片段时，建议将Elution Buffer预热至55℃以提升回收效率。

基因LbWER的cDNA序列见SEQ ID NO:2。LbWER编码蛋白的氨基酸序列见SEQ IDNO:1。

设计引物进行全长基因LbWER克隆：

Sense:5-ATGGAAGCAGAGGGAAAAGAAAGCTAC-3

Antisense:5-TTATAGATAATCCCAATCAAGATCAAAAGAATGTCC-3

3生信分析

对LbWER基因进行一、二、三级结构分析，氨基酸序列的信号肽预测，LbWER蛋白亚细胞定位预测、跨膜分析以及NCBI对比，并对其结构域进行分析，为了进一步了解LbWER基因对其作了qRT-PCR分析表达量、构建进化树以及原位杂交，并进行了启动子克隆及元件分析和GUS染色。

3.1一级结构分析

利用EXPASY的ProtParam对其进行生物信息学分析。可知，此基因编码核苷酸序列789bp(包括终止密码子)，编码262个氨基酸，蛋白质相对分子质量为63384.96，等电点(pI)为5.17，其编码的蛋白质分子式C₂₃₆₈H₃₉₄₉N₇₈₉O₉₈₂S₁₃₁，原子总数8219个。

编码氨基酸序列中带负电的氨基酸残基(Asp+Glu)总数为0，带正电的氨基酸残基(Arg+Lys)总数为0。计算得出的不稳定性指数(II)为42.59，这将蛋白质分类为不稳定的。脂肪指数：34.85，亲水性的平均值(GRAVY)：0.775。利用ExPASy软件中的ProtScale工具对蛋白的亲水性和疏水性进行分析，根据氨基酸总体分值越低它的亲水性越强，分值越高它的疏水性越强的规律，从图可以看出，LbWER蛋白的疏水区域占比比亲水区域多，整个多肽链部分区域表现出疏水性，少部分区域表现出亲水性，整体呈疏水性。

3.2二级结构分析

利用prabi对其进行二级结构预测。由图1可知此蛋白含有α-螺旋、延伸链和无规卷曲。二级结构各元件在其中所占比例分别为α螺旋14.12％、延伸链27.86％和无规卷曲58.02％。

3.3氨基酸序列的信号肽预测

利用SignalP-5.0软件检测信号肽，分析预测该蛋白拥有信号肽的概率为0.06％，无信号肽为非跨膜蛋白。

3.4三级结构预测

利用Swiss-Model在线软件对LbWER蛋白进行了3D结构的预测。如图2所示，从该预测结果可知，该蛋白含有α-螺旋、延伸链和无规卷曲。

3.5LbWER蛋白亚细胞定位预测

通过WoLF PSORT工具基于氨基酸序列预测蛋白质亚细胞定位点，预测结果显示该蛋白极大可能定位在植物细胞核内。

3.6Blast结果显示，LbWER很可能为MYB转录因子，且与拟南芥基因WER有一定的序列同源性。

3.7跨膜分析结果显示，LbWER蛋白为非跨膜蛋白。

3.8LbWER保守结构域分析

用SMART软件预测LbMYB59的保守结构域，发现在氨基酸序列中有2个SANT(Myb)结构域(10-60，63-111)和2段低复杂序列(137-149，159-173)。属于R2R3-MYB类转录因子。

3.9LbWER基因进化树的构建，如图3所示。

3.10对LbWER基因进行qRT-PCR

由图4可看出LbWER基因在A、B时期高表达，对盐处理有所响应。

3.11LbWER原位杂交结果

对LbWER进行以地高辛为探针的原位杂交实验，如图5显示LbWER基因是特异性定位到盐腺上。

实施例2基因LbWER启动子的克隆及组织化学分析

1LbWER基因启动子的克隆及GUS染色

1.1LbWER启动子元件分析

启动子中的顺式作用元件分析可以预先了解基因可能起的作用及调控因子，为研究基因功能提供帮助。利用PlantCARE数据库分析基因启动子的顺式作用调控元件。表1结果显示，LbWER基因的启动子中含有核心启动子元件，启动子和增强子区域中常见的顺式作用元件(CAAT-box)，多个光响应顺式作用元件，对低温响应必不可少的顺式调节元件(LTR)，生长素反应的顺式作用调控元件(AuxRR-core、TGA-element)，激发子介导的最大激活元件(AT-rich sequence)，赤霉素反应元件(TATC-box)，水杨酸反应元件(TCA-element)。

表1 LbWER基因启动子顺式作用元件分析

1.2启动子的克隆

将LbWER启动子序列设计引物进行PCR，结果见图6。启动子大小为2000bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

1.3将启动子连入pCAMBIA3301-35S-GUS载体

将PCR产物进行胶回收使用上述方法连入pCAMBIA3301-35S-GUS表达载体，并转化DH5α感受态细胞进行菌落PCR验证。挑取菌落，过夜培养，提取质粒进行测序。

1.4将连接好过表载体的启动子转化拟南芥

将5号质粒转入GV3101农杆菌侵染拟南芥，收到T0代种子后用除草剂进行筛选。

1.5组织化学染色

使用有LbWER promoter的pCAMBIA3301表达载体侵染拟南芥，获得纯合株系后做组织化学染色实验，操作步骤如下：

(a)GUS染色液配制：

X-gluc染色液为50×浓缩液，使用前用GUS染色缓冲液稀释50倍即配成GUS染色液。如0.1mLX-gluc染色液加入到5mL GUS染色缓冲液中，即配成5mL GUS染色溶液。该染色溶液最好现用现配，短期贮存可以20℃保存2-3天。

(b)GUS染色步骤：

①将准备好的材料浸泡在GUS染色液中，于25-37℃保温1小时至过夜。

②叶片等绿色材料转入70％乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。

③肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。

实验结果表明，植株的茎、叶部位为蓝色，根部是白色。说明LbWER基因在植株的叶片、茎部位表达。

注：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片1-3mm)。当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。LbWER启动子转化拟南芥后GUS染色的结果见图8。

实施例3 LbWER CRISPR敲除载体及转基因植物的构建

1连接两个载体pHEC401、pCBC-DT1T2。载体pHEC401、pCBC-DT1T2均由华南农业大学刘耀光教授惠赠。有关载体pHEC401、pCBC-DT1T2可参见Ma X,Zhu Q,Chen Y,etal.CRISPR/Cas9 Platforms for Genome Editing in Plants:Developments andApplications[J].Molecular Plant,2016,9(7).

2设计引物：

构建二色补血草基因LbWER敲除载体所用的引物(5′-3′)：

LbW-BsF：ATATATGGTCTCGATTGGGAAAAGAAAGCTACAAGAGTT

LbW-F0：TGGGAAAAGAAAGCTACAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

LbW-R0：AACTGACAGTTCACATAGTCCACAATCTCTTAGTCGACTCTAC

LbW-BsR：ATTATTGGTCTCGAAACTGACAGTTCACATAGTCCAC

sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GGAAAAGAAAGCTACAAGA-3’，5’-TGGACTATGTGAACTGTCA-3’。

3PCR扩增：

先以pCBC-DT1T2中间载体为模板进行四引物PCR扩增，得到包含两个靶位点序列的中间载体pCBC-DT1T2，片段长626bp，获得CRISPR-Cas9表达载体片段。在微量离心管中加入下列组分，组成50μl体系。

反应体系：

反应条件：

4纯化回收PCR产物。

PCR产物序列(626bp)如下：

ATATATGGTCTCGATTGGGAAAAGAAAGCTACAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTGCAAAATTTTCCAGATCGATTTCTTCTTCCTCTGTTCTTCGGCGTTCAATTTCTGGGGTTTTCTCTTCGTTTTCTGTAACTGAAACCTAAAATTTGACCTAAAAAAAATCTCAAATAATATGATTCAGTGGTTTTGTACTTTTCAGTTAGTTGAGTTTTGCAGTTCCGATGAGATAAACCAATATTAATCCAAACTACTGCAGCCTGACAGACAAATGAGGATGCAAACAATTTTAAAGTTTATCTAACGCTAGCTGTTTTGTTTCTTCTCTCTGGTGCACCAACGACGGCGTTTTCTCAATCATAAAGAGGCTTGTTTTACTTAAGGCCAATAATGTTGATGGATCGAAAGAAGAGGGCTTTTAATAAACGAGCCCGTTTAAGCTGTAAACGATGTCAAAAACATCCCACATCGTTCAGTTGAAAATAGAAGCTCTGTTTATATATTGGTAGAGTCGACTAAGAGATTGTGACAGTTCACATAGTCCAGTTTAGAGACCAATAAT

5连接pHEC401载体，建立单酶切-连接体系。

使用BsaI(NEB)进行酶切，使用T4连接酶(NEB)将含两个靶位点序列的中间载体pCBC-DT1T2与pHEC401连接，构建pHEC401-2gR-LbWER表达载体，反应体系如下：

反应体系：

反应条件：37℃5h；50℃5min；80℃10min。

6质粒转化大肠杆菌：

(1)将感受态细胞DH5α从-80℃冰箱中取出，放在冰上解冻20min；

(2)移液枪吸取5-10μl的连接产物加到30-50μl感受态细胞中，吹打混匀后冰上静止30min；

(3)42℃水浴加热45s，立即置于冰上2min；

(4)移液枪吸取900μl的LB液体培养基(不添加抗生素)加入混合物中，37℃摇床摇1h(转速200-250rpm)；

(5)在摇菌的1h中倒板，LB固体培养基在微波炉里加热融化，冷却至60℃左右，加入Kana(终浓度50μg/mL)，混匀倒入平皿；

(6)摇菌1h后，离心机中5000rpm离心5min，弃掉上清，剩余一点液体培养基用移液枪轻轻吹打将菌体重悬，吸取20μl重悬菌体到固体培养基中(剩余的菌体可以暂时保存到4℃冰箱)，用无菌涂布棒在平板上轻轻涂匀(涂布过程中，涂布棒要朝一个方向旋转)；

(7)菌液涂匀后平皿用封口膜封好，放到37℃培养箱中倒置培养12-16h，筛选阳性克隆；

(8)培养后，转化的平板上会长出单克隆产物(此时若无菌落长出可以用剩余的菌液进行二次涂布)，挑取单菌落进行划线扩繁；

(9)用U626-IDF、U629-IDR两种引物进行菌落PCR，选取条带正确的菌落测序。

用U626-IDF、U629-IDR两个引物进行测序的726bp序列如下：

TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGGAAAAGAAAGCTACAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTGCAAAATTTTCCAGATCGATTTCTTCTTCCTCTGTTCTTCGGCGTTCAATTTCTGGGGTTTTCTCTTCGTTTTCTGTAACTGAAACCTAAAATTTGACCTAAAAAAAATCTCAAATAATATGATTCAGTGGTTTTGTACTTTTCAGTTAGTTGAGTTTTGCAGTTCCGATGAGATAAACCAATATTAATCCAAACTACTGCAGCCTGACAGACAAATGAGGATGCAAACAATTTTAAAGTTTATCTAACGCTAGCTGTTTTGTTTCTTCTCTCTGGTGCACCAACGACGGCGTTTTCTCAATCATAAAGAGGCTTGTTTTACTTAAGGCCAATAATGTTGATGGATCGAAAGAAGAGGGCT

7敲除载体转化农杆菌：

(1)测序后经过对比，选取对应的没有错配的菌落摇菌，提取质粒。

(2)从-80℃冰箱取出农杆菌感受态放在冰上解冻20min，待其完全融化；

(3)移液枪吸取5μl的质粒加到30-50μl感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打混匀，冰上静止30min；

(4)将混合物放入液氮中速冻5min；

(5)从液氮中取出后，立即放入37℃水浴锅中温浴5min；

(6)超净台中用移液枪吸取900μl YEB液体培养基，加到混合物中，轻轻吹打混匀，放在28℃摇床中，200r/min，3h；

(7)固体YEB培养基在微波炉里融化，冷却至60℃左右，加入50μg/mL卡那霉素(Kana)及50μg/mL利福平(Rif)，混匀倒板；

(8)摇好的菌液放入离心机中5000rpm，离心1min，富集菌体；

(9)弃上清，剩余一点液体培养基用移液枪轻轻吹打将菌体重悬，吸取20μl重悬菌体到固体培养基中(剩余的菌体可以暂时保存到4℃冰箱)，用无菌涂布棒在平板上轻轻涂匀(涂布过程中，涂布棒要朝一个方向旋转)；

(10)倒置放在28℃培养箱进行培养，筛选阳性克隆，约48h后，选取单克隆菌落(此时若无菌落长出可以用剩余的菌液进行二次涂布)，划线进行繁殖；

(11)进行菌落PCR，选取条带明亮且正确的菌落，摇菌保存。

8二色补血草的侵染与筛选LbWER突变体的方法：

(1)将摇好的菌液倒入50mL离心管中，4℃6000rpm离心10min；

(2)弃上清，用MS液体悬浮，之后转移到50mL液体培养基中，加入10μl 20μM的AS。使菌液OD值在0.7左右(λ＝600nm)；

(3)无菌苗培养30d；

(4)用镊子除去侧根和主根附着的培养基，把根切成1cm长；

(5)置于配置好的菌液侵染17min，期间不断摇晃，加速侵染；

(6)将侵染后的根组织吸干后放入加了一层滤纸的MS+0.4mg/L 6-BA+10g/LGlucose培养基上，暗培养4天；

(7)转移到加入哌拉，潮霉素，赤霉素的MS固体培养基上，潮霉素浓度50mg/mL、派拉浓度0.25mg/L，光下培养；

(8)待长出丛芽之后，掰芽转移到生根培养基上，同时取叶片观察盐腺发育情况。

9敲除株系DNA水平鉴定：

PCR鉴定突变体位点，在所选位点的基因两侧设计引物扩增，测序比对。

Wlb鉴-S：5’-ATGGAAGCAGAGGGAAAAGAAAGCTAC-3’

Wlb鉴-A：5’-CAATGACCACCTATTACCCAGAA-3’

二色补血草敲除载体菌落PCR结果见图7。将二色补血草敲除载体测序结果与敲除载体进行序列对比。敲除载体中19个“N”处为引物序列，测序结果中的引物与设计的一致。

10敲除株系表型分析：

用潮霉素筛选敲除载体转化的二色补血草幼苗，当其生长到15天左右时取叶片作为观察材料，用乙醇和乙酸的混合物(3:1，体积比)固定，然后用70％乙醇漂洗以脱色，然后用透明液(在30mL水中加入1g阿拉伯树胶，100g水合氯醛，5mL甘油)进行透明，然后将清洗干净的叶片固定在载玻片上用DIC显微镜观察盐腺变化，根据实验结果对LbWER参与二色补血草盐腺发育的功能进行分析。

二色补血草CRISPR株系的表型分析结果见图9～图11。可以看出，盐腺发光点由原先正常的四个发光点变成三个、两个发光点。观察生长两周小芽的盐腺可看出，盐腺分布密集且绝大部分盐腺的发光点减少变为两个或三个发光点，观察生长十周叶片的盐腺可看出，随着叶片生长盐腺分布较稀疏，仍有发光点为三个的盐腺。经过基因克隆、生信分析、载体构建、侵染转化、表型观察等一系列实验，可以明显观察到对野生型二色补血草敲除LbWER基因后其盐腺发生了明显改变，在DIC观察下盐腺由原先的四个发光点变为三个或两个发光点，说明盐腺数目变少，即LbWER基因可能与盐腺的发育有关，野生型二色补血草缺失LbWER基因会导致盐腺畸形。由于盐腺最主要的功能是将多余盐分排出体外，也说明LbWER基因可能参与到二色补血草的泌盐过程。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东师范大学

<120> 二色补血草基因LbWER及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 262

<212> PRT

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 1

Met Glu Ala Glu Gly Lys Glu Ser Tyr Lys Lys Gly Leu Trp Thr Ala

1 5 10 15

Glu Glu Asp Lys Ile Leu Val Asp Tyr Val Asn Cys His Gly Lys Gly

20 25 30

Asn Trp Asn Ser Ile Ser Lys Arg Thr Gly Leu Lys Arg Cys Gly Lys

35 40 45

Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Ser Pro Ser Val Lys Lys

50 55 60

Gly Asn Phe Thr Glu Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Lys

65 70 75 80

Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Val Pro Gly Arg

85 90 95

Thr Asp Asn Gln Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys

100 105 110

Leu Gly Ile Lys Lys Lys Glu Thr Gly Arg Thr Arg Ile Leu Ser Leu

115 120 125

Ala His Ser Ala Lys Cys Asp His Ser Ser Met Thr Asn Ser Ser Leu

130 135 140

Glu Ser Ser Ser Ser Ile Glu Thr Asn Asn Arg Asn Lys Asn Ile Ser

145 150 155 160

Thr Thr Ser Ile Thr Thr Asp His Ile Asp Pro Ile His Cys Pro Gln

165 170 175

Ile Phe Asn Ser Asn Met Val Val Asp Asp Trp Lys Glu Asn Ser Asn

180 185 190

Leu Glu Leu Ile Thr Thr Thr Ala Glu Gly Glu Lys Arg Gln Gln Gln

195 200 205

Pro Thr Met Ile Asn Ile Gly Ser Glu Asn Tyr Gly Leu Asn Ser Ser

210 215 220

Ser Met Trp Val Ser Glu Phe Asp Gly Leu Leu His Gly Asn Ile Ser

225 230 235 240

Asn His Gly Ser Ser Phe Thr Glu Leu Ile Asp Gly His Ser Phe Asp

245 250 255

Leu Asp Trp Asp Tyr Leu

260

<210> 2

<211> 789

<212> DNA

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 2

atggaagcag agggaaaaga aagctacaag aagggtttat ggactgcgga agaagacaag 60

attctagtgg actatgtgaa ctgtcatggt aaaggaaatt ggaatagcat ttccaaaaga 120

acagggttaa agaggtgtgg gaagagttgc agattgagat ggatgaatta cttgagtcca 180

agtgtcaaga aaggtaactt cacagaggag gaagaggatc ttatcatcag actccacaaa 240

cttctgggta ataggtggtc attgatagct ggaagggttc ctggtagaac ggacaatcaa 300

gttaaaaact actggaatac ccatttgagc aaaaagcttg ggatcaaaaa gaaggaaaca 360

ggaagaacaa gaatactatc ccttgctcac agtgcaaagt gtgatcacag cagcatgacc 420

aattctagtc tagagagctc ttcatctata gagaccaaca acaggaacaa gaacatctcc 480

accaccagta tcaccactga tcatatcgac ccaattcact gcccacaaat tttcaatagc 540

aacatggtag ttgatgattg gaaggagaat agtaatttgg agctgatcac caccacagcg 600

gaaggggaga agcggcaaca acaaccaacg atgattaata ttggttctga aaactatggg 660

ttaaattctt cttcgatgtg ggtatctgaa tttgatggat tgttgcatgg taatatcagc 720

aatcatggta gtagctttac ggaactgatt gatggacatt cttttgatct tgattgggat 780

tatctataa 789

<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 3

gtcagtcgtt ttcattttca cactttgtac atattggtta ctaaaatact aattctttgt 60

ttccttccca tttcagtaca tcacagtacc atgtttaaag gaaaacaaaa cccatttacg 120

atgtgggttg tccaatgatt tcattttaac aactctagat atggggttat aaccacatag 180

aactctattc atttttcact cacatcaagg aacttgtcta ctatatattg attcttaatt 240

gatattttac acattttttt aaatatctac aatatagtat atgtatttat gtagttacaa 300

aaactcttaa tacatgttat aaacatacaa gtactataat tatatttcat gattgaaagc 360

ttataataaa ttttaataat ttcatttgca tttcttttct gtagcaatta agttgttgtt 420

ataaaataca ttataatatc actaaaattt tatattttta atatgtagcc aagataaaat 480

attattggag aaatgatgat aaactataat ttttttgata ttttatttgt aagaaactaa 540

agtacaatta ttagtaatta aagattgtta cctatatgtt ttaattgaaa aagaaaagct 600

agtaaaactc acatttatgt tcgtccatga gaggtttttc accttcgtta ctccacctac 660

tactactttt gcacttttat tttcgtctga aaaccccact tagtaaaact ggtagtaata 720

atgcatctta tagttgaaaa aacaaataag cagtaaatat ctttccaaca aactacagta 780

agtatcttcc taaaatatcc tccatactca ataaatatca ataacactag aaaaaagatg 840

gaaggagcat ttactactaa tgtcatcttt cagctctcct accacagaac ttttgcagca 900

gaccgaaagg tccatgaatg aatgaatgcg cgagctgctc ttctctgctg ggatattaat 960

aaggcttacc ttttattccc ataatgcgcg agctgctctt ctctgctggg atattaataa 1020

ggcttacctt ttattcccat aatgaagtag ttataatttc acaacctgct ttaaaattga 1080

taggtggtct ggtactcatc aatcaatgca aatatgcaat gcagtgcagt ttggtcacca 1140

aatacaaatc taactgctaa ttatttatcc atcttaatct ttacttgagt tgatcagaca 1200

aacccccata taggaatcct atcactgaca gtgcgcaaca ctccttttca tctagaagcc 1260

ctaaaaaaag aatcatcttc cagttttcat aatgaacttg caataacaga ttaagtaact 1320

tattcctctc tagatactag tagcactgac ttttcatgat tttcttcaat tcttcagcgc 1380

cttgatggaa tgaaaagtca ttaatttctt cagcaacttg tggacagaaa cagaggtatt 1440

ctgctcctgc gattaataca cactactagt ctactatctt atcttattgg aggtggtgca 1500

cattttgcta cattaaatac cacaaggatt ggcttgcctt tcccgaataa tttactactt 1560

acagaaagga ggtctgtaaa taaaatacgg agtacttcaa caccgcccat caaactatta 1620

ctgactacta ttagaggtga tagctagcta ggctagccac aataatggac tcaatccctt 1680

tgaattgcgt gccctcaaaa caattcaatt caattcccca ttcacagcaa aaaaacaacc 1740

tcctaaggtg aagaccatat tcctccccgt gtgtcctcaa caaccaccat cacttcgatc 1800

gctctctgtt cgtattagtt acttctttct gtcccgtaga catactactt tgtagtaata 1860

ctctcctctc ctctcctctt tctcttcact accattttct tattctctcc tcttacattc 1920

cctcacatga gaaaaagaag ttttcactga ctagacagag gaaggagtga gtgtgagcaa 1980

agtccaaaag accgaagata 2000

Claims (10)

1.二色补血草基因LbWER，其特征在于，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

2.二色补血草基因LbWER启动子，其特征在于，其序列为：

i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

3.含有权利要求1所述基因LbWER或权利要求2所述启动子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

4.权利要求2所述启动子在调控下游基因表达中的应用，其特征在于，所述下游基因包括权利要求1所述基因LbWER，报告基因GUS、GFP。

5.权利要求1所述基因LbWER、权利要求2所述启动子或权利要求3所述生物材料在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述基因LbWER或含有基因LbWER的生物材料的以下任一应用：

(1)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；

(2)用于植物品种改良和改良盐碱地；

优选地，所述植物为二色补血草。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调控为正调控。

8.使二色补血草盐腺细胞数目减少、盐腺发育异常的方法，其特征在于，利用基因工程手段，弱化二色补血草基因LbWER，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；

所述二色补血草基因LbWER同权利要求1所述；

优选地，所述基因工程手段选自诱变、定点突变、同源重组中的一种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，针对二色补血草中的目标基因LbWER设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化二色补血草，进而获得该基因功能缺失的转基因植株。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GGAAAAGAAAGCTACAAGA-3’和5’-TGGACTATGTGAACTGTCA-3’。

Images