CN104711262B - 玉米花药特异性启动子及其应用 - Google Patents

玉米花药特异性启动子及其应用 Download PDF

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本发明公开了一种玉米花药特异性表达启动子，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明所述的启动子用于在水稻花药中特异性表达目的基因的用途。本发明包含所述的玉米花药特异性表达启动子的植物表达载体。所述植物表达载体是用所述玉米花药特异性表达启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体。本发明能在转基因水稻的花药中特异性表达，该启动子能够控制目的基因特异表达于花药，用于外源基因在花药中的特异表达，在其他器官组织中不表达，从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响。

Description

玉米花药特异性启动子及其应用
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种玉米花药特异性启动子及其应用。
背景技术
高等植物花的结构主要包括：花托、子房、胚珠、萼片、花丝、花瓣、花药、和花柱等。花药是花丝顶端膨大呈囊状的部分，是雄蕊的重要组成部分，是种子植物的微小孢子堆，成熟的花药粒实为其小配子体，能产生配子。花药内有花粉囊，其内有花粉粒，花粉粒成熟即可进行传粉，受精，进而形成新的个体。高等植物发育过程花器官的形成是一个十分复杂的过程，它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化，同时伴随大量基因的协同表达。启动子是重要的顺式作用元件，调控基因的转录和表达，根据启动子的转录模式不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。选择何种启动子来驱动基因的表达，是当前基因工程研究的热点。
组织特异性启动子亦称器官特异性启动子，在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限定某些特定的器官和和组织部位，并表现发育调节等特性。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。
花药特异性启动子，可用于外源基因在花药中的特异表达，从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物花药生长发育相关基因的功能分析和鉴定；也可以用于花粉败育实验中，从而避免由转基因漂移或花粉逃逸所带来的生物安全问题，对植物雄性不育系和恢复系的创造具有重要意义。
目前，缺乏一种能够控制目的基因特异性表达的玉米花药特异性启动子及其应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了能够控制目的基因特异性表达的玉米花药特异性启动子及其应用。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明提供了一种玉米花药特异性表达启动子，是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明所述的启动子用于在水稻花药中特异性表达目的基因的用途。
本发明含所述的玉米花药特异性表达启动子的植物表达载体。
进一步地，所述植物表达载体是用所述玉米花药特异性表达启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体。
本发明所述的启动子或所述的植物表达载体在制备转基因水稻中的应用。
本发明包含所述的启动子、所述的植物表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为根癌农杆菌宿主细胞。
本发明一种转基因植物的制备方法，包括：
(a)将权利要求1所述的启动子、或权利要求3所述的植物表达载体导入水稻组织细胞，
(b)在促进植物生长的条件下培养所述水稻组织细胞。
有益效果：本发明能在转基因水稻的花药中特异性表达，该启动子能够控制目的基因特异表达于花药，用于外源基因在花药中的特异表达，在其他器官组织中不表达，从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响,如：转基因漂移；花粉逃逸所带来的生物安全问题。本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明的玉米花药特异性表达启动子为PZmC2H2，其来源于玉米属玉米Zeamays L.B73自交系，该启动子片段大小为2267bp，所述的启动子具有以下特点(a)位于GRMZM2G359589基因的5’端及其上游；(b)碱基长度为2267bp；(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；(d)在玉米的花药中特异性表达。
(2)本发明的花药特异表达启动子PZmC2H2的重组表达载体，可以用作花药特异表达基因的启动子，在重组表达载体的花药特异表达启动子PZmC2H2调控下使下游基因定位于花药表达，为植物基因工程领域研究基因在花药特异表达提供了工具，具有广泛的应用前景；本发明的一种花药特异性表达的载体，转入了花药特异性表达的启动子，并在水稻中进行验证。利用前述的玉米花药特异性表达启动子取代植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pCAM–PZmC2H2。
(3)通过农杆菌介导法转化水稻，获得了14株转基因植株，PCR检测有8株阳性株。并对阳性植株的的不同组织部位都进行了GUS组织化学染色。GUS组织化学染色鉴定证实PZmC2H2启动子为花药特异性表达启动子，pCAM–PZmC2H2为一种花特异性表达的载体。
附图说明
图1 PZmC2H2启动子分子检测结果图；
图2为本发明的表达载体PZmC2H2的T-DNA区图谱；
图3为本发明的GUS基因的组织化学染色结果图；
其中：1幼叶；2幼茎；3幼根；4成熟叶；5成熟茎；6成熟根；7颖壳；8花药；9胚乳。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
如图1至图3所示，图1为PZmC2H2启动子分子检测结果图。A为PCR结果；B为双酶切结果。M：DL-5000 1：条带大小为2267bp 2：BamHI和BglII双酶切条带
图2为本发明的表达载体PZmC2H2的T-DNA区图谱；LB和RB分别表示为T-DNA的左边界和右边界；Hyg表示潮霉素抗性基因；Mcs表示多克隆位点；Nos表示基因的终止子；BamHI和BglII分别表示限制性内切酶BamHI和BglII的酶切位点；
图3为本发明的GUS基因的组织化学染色结果图；其中：1幼叶；2幼茎；3幼根；4成熟叶；5成熟茎；6成熟根；7颖壳；8花药；9胚乳。
本发明提供了一种玉米花药特异性表达启动子，是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明所述的启动子用于在水稻花药中特异性表达目的基因的用途。
本发明含所述的玉米花药特异性表达启动子的植物表达载体。
所述植物表达载体是用所述玉米花药特异性表达启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体。
本发明所述的启动子或所述的植物表达载体在制备转基因水稻中的应用。
本发明包含所述的启动子、所述的植物表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为根癌农杆菌宿主细胞。
本发明一种转基因植物的制备方法，包括：
(a)将所述的启动子、或所述的植物表达载体导入水稻组织细胞，
(b)在促进植物生长的条件下培养所述水稻组织细胞。
所用引物均由深圳华大生物工程有限公司合成，上海生工公司测序；pTEAY-T1、Taq酶、Trans5α感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶BamHI和BglII,T4连接酶购自TaKaRa公司；相应的抗生素来自上海生工和SIGMA公司；其余试剂均为国产分析纯。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
玉米花药特异性启动子PZmC2H2的克隆
根据NCBI网站上公布的PZmC2H2启动子全长序列，设计PCR扩增该片段的引物，上游引物加BamHI的CGGGATCC酶切位点，下游引物加BglII的GAAGATCT酶切位点。
引物序列如下：
引物1(上游引物)：5’-CGGGATCC TACATGGTTCGCATTCGGTT-3’
引物2(下游引物)：5’-GAAGATCT CATCTTCGTGGAGATGAGAG-3’
以全式金公司植物基因组试剂盒提取的玉米B73基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示：
表1
PCR反应条件为：预变性：98℃10min；变性：98℃10s；退火：62℃5s；延伸：72℃2min30s，36个循环；总延伸：72℃10min。
反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。回收并纯化2267bp的目的片段；将全式金生物技术有限公司的回收片段与pEASY T1Cloning Vector连接，转化到全式金生物技术有限公司的大肠杆菌感受态Trans5α细胞中；PCR和酶切检测筛选阳性克隆；
对检测结果初步判断正确的连接片段，送去上海生工公司进行测序，测序结果如:序列表中SEQ ID NO:1的DNA序列所示，由2267bp个碱基组成，将其与NCBI上报道的序列比对，结果完全一致。
实施例2
pZmC2H2基因启动子表达载体的建立
将已连接到pEASY T1Cloning Vector上的小片段的PZmC2H2片段与农杆菌双元载体pCAMBIA1301上的大片段的CaMV35S启动子用BamHI和BglII酶进行双酶切，于37℃水浴锅中，3h，酶切20uL体系如表2所示：
表2
将上述大小片段用T4DNA连接酶连接，25℃连接2～12h，连接体系如表3所示：
表3
取5～10μL的构建好的载体pCAM–PZmC2H2质粒轻轻打入到200μL EHA105农杆菌感受态细胞中，冰浴5min，液氮速冻1min，37℃水浴5min后，加入200μL YEP液体培养基，28℃，220rpm预表达4～5h；10000rpm离心30s，弃上清，加入100μL YEP液体培养基，重新悬浮细胞，涂布于含100μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEP固体平板上，28℃培养约24～48h；挑取平板上长出的微黄色的单菌落，接种于含100μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEP液体培养液中，摇菌24～48h；待菌液浑浊，显示为橙黄色，提取质粒；分别用PCR和双酶切验证。
实施例3
农杆菌介导水稻转化
通过根癌农杆菌Agrobacterum一mediated农杆菌介导法将含pCAM–PZmC2H2表达载体的农杆菌导入水稻中。水稻遗传转化的过程为：诱导；侵染；选择；分化；生根和移栽。
1.水稻愈伤组织诱导培养基
将100mL N6大量；10mLN6微量；10mLVitamin，所述10mLVitamin为1L加0.1g肌醇粉末；10mLFe盐；300mg/L脯氨酸；600mg/L水解酪蛋白CH；30g/L蔗糖；加dd H2O定容到700mL，用KOH调pH值至5.9，加3.0g/L琼脂粉，煮沸，加入2,4-D储备溶液，用dd H2O定容至1000mL，再分装到组培瓶中，所述组培瓶为25mL/瓶，高压蒸汽灭菌；待用。
2.侵染培养基
将50mL lN6max；5mL N6min；10mLFe盐；10mL Vitamin，所述10mLVitamin为1L加0.1g肌醇粉末；800mg水解酪蛋白；20g/L蔗糖；加dd H2O定容至1000mL，用KOH调pH值至5.6，加3ml/l2,4-D储备溶液，6.0个/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌，待培养基冷却到40℃～60℃，加入20mL Glucose葡萄糖储备溶液和1000mL AS储备溶液，倒平板。
3.选择培养基
将100mL N6大量；10mLN6微量；10mLVitamin，所述10mLVitamin为1L加0.1g肌醇粉末；10mLFe盐；600mg/L水解酪蛋白CH；30g/L蔗糖；加dd H2O定容到1000mL，用KOH调pH值至5.9，加3.0g/L琼脂粉，加入2,4-D储备溶液，煮沸，再分装到组培瓶中，所述组培瓶为25mL/瓶，高压蒸汽灭菌；将培养基冷却到40℃～60℃，再加入5mL/L羧苄储备溶液、1mL/L潮霉素储备溶液、1mL/L头孢储备溶液。在超净工作台上分装到组培瓶中。
4.分化培养基
将100mL MSmax；10mLMsmin；10mLFe盐；10mL Vitamin，所述10mL Vitamin为1L加0.1g肌醇粉末；1000mg/L水解酪蛋白CH；30g/L蔗糖；2mL/L NAA储备溶液；2mL/L 6-BA储备溶液；0.200uL/L KT储备溶液；200uL/L IAA储备溶液加入dd H2O定容至1000mL,用KOH调pH值至6.0，加3g/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌；待培养基冷却到40℃～60℃，加入5mL/L羧苄储备溶液和2,5mL/L潮霉素储备溶液，在超净工作台上分装到组培瓶中。
5.生根培养基
将50mlMSmax；5mLMsmin；10mL Fe盐；10mLVitamin，所述10mL Vitamin为1L加0.1g肌醇粉末；20g/L蔗糖加入dd H2O定容至700mL,用KOH调pH值至5.8；煮沸，加02ml/LIBA储备溶液，再加入dd H2O定容至1000mL，倒入生根瓶。
上述步骤所用到的一些热不稳定性化合物如抗生素、AS、6-BA及KT细菌滤器除菌后于培养基温度降至50℃左右时加入。
6.培养基相关溶液的配制和抗生素溶液配制
(1)Msmax储备溶液(10X)：
用ddH2O定容至1000mL，室温保存；
(2)MSmin储备溶液(100X)：
Na2MoO4要单独溶解，再加入到混合液中，用ddH2O定容至1000mL，室温保存；
(3)N6max储备溶液(10X)：
用ddH2O定容至1000mL，室温保存；
(4)N6min储备溶液(100X)：
用ddH2O定容至1000mL，室温保存；
(5)Fe2+-EDTA(100X)：
待两者全部溶化后，相混溶，70℃水浴中保温2h,用ddH2O定容至1000mL，4℃储存；
(6)Vitamin(100X):
用ddH2O定容至1000mL，4℃储存；
(7)1mg/mL的2,4-D储备溶液:
称取5.61g 2,4-D加入1.0mL 1N KOH，点振5min后加入10mL H2O，再晃动直至2,4-D全部溶解，再用ddH2O定容至100mL，室温保存；
(8)1mg/mL的6-BA储备溶液：
称取0.1g 6-BA，加入1.0mL 1N KOH，晃动直至6-BA全部溶解，用ddH2O定容至100mL，室温保存；
(9)1mg/mL的NAA储备溶液：
称取0.1g NAA萘乙酸，加入1.0mL 1N KOH，晃动直至NAA全部溶解，用ddH2O定容至100mL，室温保存；
(10)1mg/mL的IAA储备溶液：
称取0.1g IAA吲哚乙酸，加入1.0mL 1N KOH，晃动直至IAA全部溶解，用ddH2O定容至100mL；
(11)抗生素储液配
实施例4
转基因水稻的的鉴定
1.转基因水稻的PCR分子检测
为了检测转基因水稻，以提取的转基因水稻总DNA为模板，用目的基因PZmc2H2启动子片段和表达载体上所含的潮霉素基因和GUS基因为检测对象，设计引物，扩增片段，用以初步鉴定转基因植株。
用目的基因检测的引物序列如下：
引物1(上游引物)：5’-CGGGATCC TACATGGTTCGCATTCGGTT-3’
引物2(下游引物)：5’-GAAGATCT CATCTTCGTGGAGATGAGAG-3’
PCR反应体系和反应条件与玉米花药特异性启动子PZmC2H2的克隆条件相同；
用于检测潮霉素抗性基因的引物序列如下：
引物3(上游引物)：5’-TAGGAGGGCGTGGATATGGC-3’
引物4(下游引物)：5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’
PCR反应体系参照PZmC2H2的克隆，反应条件如下：PCR反应条件为：预变性：94℃10min；变性：94℃30s；退火：60℃30s；延伸：72℃1min，34个循环；总延伸：72℃10min。
用于检测GUS基因的引物序列如下：
引物5(上游引物)：5’-GTGAATCCGCACCTCTGGCAAC-3’
引物6(下游引物)：5’-ATCGCCGCTTTGGACATACCAT-3’
PCR反应体系参照PZmC2H2的克隆，反应条件如下：PCR反应条件为：预变性：94℃10min；变性：94℃30s；退火：55℃30s；延伸：72℃1min，34个循环；总延伸：72℃10min。
2.GUS基因的组织化学染色
分子检测结果，初步鉴定为转基因株后，分别对转PZmC2H2启动子植株不同部位进行GUS组织化学染色。具体操作步骤如下：取转基因水稻不同的组织：幼根、幼茎、幼叶、成熟根、成熟茎、成熟叶、颖壳、花药、胚乳，将各部位移入试管中，加入适量的GUS缓冲液浸没组织块，再加入GUS染色液，混匀后37℃下保存4-12h，结束后，将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再用50％和20％乙醇各侵泡20min以上，直到材料呈白色；肉眼或显微镜下观察，组织上有蓝色小点即为GUS表达部位。染色结果如图2所示，GUS基因只在水稻的花药中表达，从而证明了启动子pZmC2H2仅在水稻的花药中特异性表达。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种玉米花药特异性表达启动子，其特征在于是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的启动子用于在水稻花药中特异性表达目的基因的用途。
3.包含如权利要求1所述的玉米花药特异性表达启动子的植物表达载体。
4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是用所述玉米花药特异性表达启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体。
5.权利要求1所述的启动子或权利要求3所述的植物表达载体在制备转基因水稻中的应用。
6.包含权利要求1所述的启动子、权利要求3或4所述的植物表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为根癌农杆菌宿主细胞。
7.一种转基因植物的制备方法，包括：
(a)将权利要求1所述的启动子、或权利要求3所述的植物表达载体导入水稻组织细胞，
(b)在促进植物生长的条件下培养所述水稻组织细胞。
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