MXPA01004336A - Adn que comprende un gen especifico de antera de arroz y planta transgenica transformada con el mismo - Google Patents

Abstract

Esta invención describe novedosas secuencias de ADN que funcionan como promotoras de la transcripción específica de la antera de secuencias de ADN de codificación en secuencias de ADN recombinantes o quiméricas. La invención también describe secuencias de ADN recombinantes o quiméricas, que se expresan específicamente en la antera de la planta. Estas secuencias de ADB recombinantes o quiméricas se pueden utilizar para crear plantas transgénicas, pero especialmente plantas transgénicas con esterilidad masculina.

Description

ADN QUE COMPRENDE UN GEN ESPECIFICO DE ANTERA DE ARROZ Y PLANTA TRANSGÉNICA TRANSFORMADA CON EL MISMO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está en el campo de ingeniería genética de plantas. Se refiere primariamente a novedosas secuencias de ADN que funcionan como promotoras de la transcripción especifica de la antera de las secuencias de ADN de codificación en secuencias de ADN recombinantes o quiméricas. La presente invención también se refiere a secuencias de ADN recombinantes o quiméricas, que se expresan específicamente en la antera de una planta. Estas secuencias de AND recombinantes o quiméricas se pueden utilizar para crear plantas transgénicas, pero especialmente plantas transgénicas con esterilidad masculina. La creación de plantas con esterilidad masculina es de interés económico en la producción de semillas híbridas. La esterilidad masculina impide la auto-polinización, que se presenta de otra manera en muchas especies de plantas, y obstaculiza la reproducción y la producción de semillas híbridas. La antera es un órgano reproductor masculino de las plantas que florecen, que se compone de varios Rsf: 128790 tejidos, tales como el tapeto, endotecio, tejidos conectivos,, tejidos vasculares, etcétera, y es responsable de la producción de polen. El desarrollo de la antera se puede dividir en dos fases generales. Durante la fase 1, se establece la morfología de la antera, y las células madre de microesporas sufren meyosis para generar tetrads de microesporas. Durante la fase 2, se diferencian los granos de polen y las anteras, y se presenta degeneración del tejido, dehiscencia, y liberación del grano de polen. Entre muchos genes diversos involucrados en estos desarrollos, solo una pequeña fracción es específica de la antera. Los genes específicos de la antera, que se han reportado hasta ahora, incluye los genes Osc4, Osc6, YY1 e YY2 de arroz [Hihara Y, colaboradores., Plant Mol. Bio., 30:1181-1193 (1996); Tsuchiya T., y colaboradores., Plant Mol. Bio., 26:1737-1747 (1994), los genes TA29 y TA32 de tabaco [Koltunow, A.M. y colaboradores., Plant Cell, 2:1201-1224 (1990)], los genes SF2 y SF18 de girasol [Domon, C. Y colaboradores., Plant Mol. Bio., 15:643-646 (1990)], los genes 108 de jitomate [Smith, A.G., y colaboradores., Mol. Gen. Genet., 222:9-16(1990)], NTM 19 de tabaco (Oldenhof M.T. y colaboradores. Plant Mol. Biol. 31:213-225 (1996)], y los genes BA42, BA112 y A9 de Brassica napus [Scott, R. Y colaboradores, Plant Mol., Biol., 17:195-207 (1991); Shen, J.B. y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 234:379-389 (1992)]. Algunos de estos genes de encuentras exclusivamente en los tejidos de las anteras, otros son específicos del grano de polen, o están presentes tanto en los tejidos esporofíticos como gametofílicos de las anteras. El arroz es un ejemplo de una planta que se propaga en una forma de auto-polinización. Es difícil desarrollar arroz hídrico solamente mediante alogamia. Para facilitar la producción de arroz hídrico mediante alogamia, se describe un método en la técnica anterior, en donde se suprimen las anteras de las flores de arroz para producir arroz con esterilidad masculina, y luego se transfiere el polen desde otra planta de arroz a las mismas. Sin embargo, existe el problema de que este método requiere de una gran cantidad de tiempo y esfuerzo. Por consiguiente, con el objeto de producir arroz o cualquier otra planta de auto-polinización que tenga un carácter de esterilidad masculina sin los problemas anteriores como se describen previamente, los presentes inventores hicieron cada vez más un esfuerzo por desarrollar un método que utilizara un gen que inducirá un desarrollo anormal de la antera. Por consiguiente, la invención proporciona: Moléculas de ADN y métodos para la expresión específica de una región de codificación de interés en el tapeto, endotecio, y tejidos conectivos de las anteras, pero no en las microesporas o polen , en donde la expresión de la secuencia de codificación de interés empieza en la etapa tetrad, y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolada. En particular, se proporcionan molécula de ADN y métodos en donde: • el ADN comprende una secuencia de nucleótidos que tienen cuando menos el 50 por ciento, particularmente el 65 por ciento, más particularmente el 80 por ciento, y de una manera muy particular el 90 por ciento o más de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:l; • el ADN de acuerdo con la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1; • las moléculas de ADN están específicamente diseñadas de tal manera que la secuencia de codificación está en una orientación de anti-sentido .

La invención proporciona además moléculas de ADN y métodos en donde la secuencia de codificación codifica un polipéptido que alterará formación de polen viable cuando se exprese en las células de la antera. En una modalidad específica de la invención, la secuencia de codificación codifica un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en ARNsa, DTA, TURF-13, liasa de pectato, recombinasa de jengibre, iaaL, y toxinas cytA. La invención proporciona además moléculas de ADN y métodos como se mencionaron anteriormente, en donde la secuencia de ADN de la invención tiene más del 80 por ciento, particularmente el 90 por ciento, y muy particularmente el 95 por ciento de identidad de secuencia en las 30 bases consecutivas de cualesquiera sitios de la SEQ ID NO:l. La invención proporciona además moléculas de ADN que comprende una secuencia promotora capaz de impulsar la expresión de una secuencia de codificación asociada específicamente en el tapeto, endotecio, y tejidos conectivo de las anteras, pero no en las microesporas o el polen, en donde la expresión de la secuencia de codificación empieza en la etapa tetrad, y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolado.

En particular, proporcionamos en la presente métodos y moléculas de ADN como se mencionaron anteriormente, en donde: • la secuencia promotora tienen el 50 por ciento, particularmente el 65 por ciento, más particularmente el 80 por ciento, y de una manera muy particular el 90 por ciento o más de identidad de secuencia, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3; • la secuencia promotora tienen la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3; • la secuencia promotora comprende una secuencia adicional que se puede enlazar operativamente con una secuencia de codificación de interés; • la secuencia adicional comprende una secuencia que tiene el 50 por ciento, particularmente el 65 por ciento, más particularmente el 80 por ciento, y de una manera muy particular el 90 por ciento o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10; • la secuencia adicional comprende la SEQ ID NO: 10; • la secuencia promotora y la secuencia adicional tienen el 50 por ciento, particularmente el 65 por ciento, más particularmente el 80 por ciento, y de una manera particular el 90 por ciento o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; • la secuencia promotora y la secuencia adicional se caracterizan por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; En adición, se proporcionan moléculas de ADN en donde el promotor comprende un fragmento que se puede obtener a partir de la SEQ ID NO: 2, de preferencia un fragmento capaz de impulsar la expresión de una secuencia de codificación asociada específicamente en el tapeto, endotecio, y tejido conectivo de las anteras, pero no en las microesporas o el polen, en donde la expresión de la secuencia de codificación empieza en la etapa en la etapa tetrad, y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolado. La invención también proporciona moléculas de ADN que comprende un marco de lectura abierta que codifica una proteína caracterizada por una secuencia de aminoácidos que tienen el 50 por ciento, particularmente el 65 por ciento, más particularmente el 80 por ciento, y de una manera muy particular el 90 por ciento o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: .

En una modalidad especifica de la invención, el marco de lectura abierta codifica una proteína caracterizada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. en todavía otra modalidad específica, la molécula de ADN como se describe anteriormente en la presente, se caracteriza por la SEQ ID NO: 7. En adición, se proporcionan vectores de expresión que comprenden un primer cásete de expresión que comprende un ADN de la invención para su expresión en un organismo huésped, tal como un microorganismo o una planta, y opcionalmente, un segundo cásete de expresión que comprende un gen de interés. En una modalidad específica de la invención, es segundo cásete de expresión comprende un gen marcador. La invención proporciona además la proteína codificada por el marco de lectura abierta como se mencionó anteriormente en la presente. En adición, se proporcionan plantas transgénicas y material de planta, y la progenie sexual y/o asexual de las mismas, que se hayan transformando con una secuencia de ADN de acuerdo con la invención. En particular, la invención proporciona: • una planta transgénica con esterilidad masculina que se ha transformado con una secuencia de ADN de la invención; • una planta transgénica o material de planta de acuerdo con la invención, en donde la planta de arroz, trigo, maíz, Sorgh um bi col or, o pasto de huerto . La invención proporciona además un proceso para la producción de una planta transgénica que comprende un ADN que comprende una secuencia promotora y la secuencia de codificación asociada, en donde la secuencia promotora impulsa la expresión de la secuencia de codificación específicamente en el tapeto, endotecio, y tejidos conectivos de las anteras, pero no en la microesporas o el polen, y en donde la expresión de la secuencia de codificación empieza en la etapa tetrad, y alcanza un nivel máximo en la etaipa de polen vacuolado. En particular, un proceso en donde la planta es arroz, trigo, maíz, Sorgh um bi col or o pasto de huerto.

La constitución y función de la invención En una modalidad específica, la presente invención proporciona un gen específico de anteras de arroz ( Oryza sa t i va L.) que tiene la secuencia base mostrada en la SEQ ID NO:l, y un gen que tiene más del 80 por ciento de identidad de secuencias en las 30 bases consecutivas de cualesquiera sitios sobre el gen.

En adición, la presente invención proporciona el regulador de expresión específico de la antera que comprende una secuencia promotora y una secuencia adicional que tiene la SEQ ID NO: 2, que corresponde a las secuencias base entre-1196 y 240 en el gen, representadas por el nucleótido 1 al nucleótido 1436 de la SEQ ID NO: 1. La presente invención también proporciona el promotor de expresión específico de la antera que tiene la SEQ ID NO: 3, que corresponde a las secuencias base entre el -1196 y el -1 en el gen, representadas por el nucleótido 1 al nucleótido 1196 de la SEQ ID NO: 1.

DEFINICIONES Con el objeto de asegurar un entendimiento claro y consistente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones : Quimérico : Se utiliza para indicar que una secuencia de ADN, tal como un vector o un gen, está comprendida de más de una secuencia de ADN de distinto origen, que se fusionan entre sí mediante técnicas de ADN recombinante, dando como resultado una secuencia de ADN, que no se presenta naturalmente, y que particularmente no se presenta en la planta que se va a transformar. Expresión : Se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno o un transgen en plantas. En el caso de construcciones anti-sentido, por ejemplo, la expresión puede referirse a la transcripción del ADN anti-sentido solamente. Gen : Se refiere a una secuencia de codificación y la secuencia reguladora asociada en donde la secuencia de codificación se transcribe al ARN, tal como ARNm, ARNr, ARNt, ARNsn, ARN en sentido, o ARN anti-sentido. Los ejemplos de las secuencias reguladoras son secuencias promotoras, secuencias no traducidas 5' y 3', y secuencias de terminación. Otro elementos que pueden estar presentes son, por ejemplo, intrones. Gen marcador: Se refiere a un gen que codifica un rasgo seleccionable o clasificable ; nt es la abreviatura para "nucleótido' . Operativamente enlazado a/asociado con: Se dice que una secuencia de ADN reguladora está "operativamente enlazada a" o "asociada con" una secuencia de ADN que codifica para un ARN o una proteína si las dos secuencias están situadas de tal manera que la secuencia de ADN reguladora afecta la expresión de la secuencia de ADN de codificación.

Planta : se refiere a cualquier planta, particularmente a plantas de semillas. Material de Planta : Se refiere a hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutas, polen, tubos polínicos, sacos embrionarios, células de huevo, cigotos, embriones, semillas, recortes, cultivos de células o tejidos, o cualquier otra parte o producto de una planta . Promotora : Se refiere a una secuencia de ADN que indica la transcripción de una secuencia de ADN asociada. La región promotora también puede incluir elementos que actúen como reguladores de la expresión genética, tales como activadores, mejoradores, y/o represores . Molécula de ADN recombinante: Una recombinación de secuencias de ADN que se unen entre sí utilizando tecnología de ADN recombinante. Tecnología de ADN recombinante : procedimientos utilizados para unir entre sí secuencias de ADN como se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gen marcador clasificable: se refiere a un gen cuya expresión no confiere una ventaja selectiva a una célula transformada, pero cuya expresión hace que la célula transformada sea fenotípicamente distinta de las células no transformadas. Gen marcador seleccionable: se refiere a un gen cuya expresión en una célula de planta da a la célula una ventaja selectiva. La ventaja selectiva poseída por las células transformadas con el gen marcador seleccionable, se puede deber a su capacidad para crecer en la presencia de un agente selectivo negativo, tal como un antibiótico o un herbicida, comparándose con el crecimiento de las células no transformadas. La ventaja selectiva poseída por las células transformadas, comparándose con las células no transformadas, también pueden deberse a su capacidad mejorada o novedosa para utilizar un compuesto agregado como un nutriente, factor de crecimiento, o fuente de energía. El gen marcador seleccionable también se refiere a un gen o una combinación de genes cuya expresión en una célula de planta da a la célula tanto una ventaja selectiva negativa como positiva. Identidad de secuencia: el porcentaje de identidad de secuencia se determina utilizando programas de computación que se basan en algoritmos de programación dinámica. Los programas de computación que son los preferidos dentro del alcance de la presente invención incluyen los programas de búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico), diseñados para explorar todas las bases de datos de secuencia disponibles, independientemente de si se pide proteína o ADN. La versión BLAST 2.0 (Gapped BLAST) de esta herramienta de búsqueda se ha puesto a disposición del público en Internet (actualmente http: //www, ncbi . nim.nih. gov/BLAST/) . Utiliza un algoritmo heurístico, que busca alineamientos locales opuestamente a globales, y por consiguiente, puede detectar relaciones entre las secuencias que compartan solamente regiones aisladas. Las calificaciones asignadas en una búsqueda BLAST tienen una interpretación estadística bien definida. Estos programas de preferencia se ejecutan con parámetros opcionales establecidos en los valores por omisión. Transformación: Se refiere a la introducción de un ácido nucleico en una célula. En particular, se refiere a la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS EN EL LISTADO DE SECUENCIA SEQ ID NO: 1 secuencias de nucleótidos del gen RA8 de arroz .

SEQ ID NO: 2 regulador de expresión especifico de la antera que comprende al promotor RA8 más el primer exón, el primer intrón, parte del exón 2. SEQ ID NO: 3 promotor RA8. SEQ ID NO:: 4 secuencia de aminoácidos deducida de la proteína codificada por el gen RA8 de arroz. SEQ ID NO: 5 cebador 1 SEQ ID NO: 6 cebador 2 SEQ ID NO: 7 secuencia de ADNc de RA8. SEQ ID NO: 8 cebador de reacción en la cadena de polimerasa . SEQ ID NO: 9 cebador de reacción en la cadena de polimerasa . SEQ ID NO: 10 secuencia de nucleótidos de primer exón, el primer intrón, y parte del exón 2 del gen RA8 de arroz.

DEPÓSITOS Material depositado Número de acceso Fecha de depósito Plásmido pGA1173-9 KCTC 8899p 29 de julio de 1998 EL depósito se hace en el Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, la organización anexa del Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Posteriormente en la presente, se describirá la presente invención con detalle. El gen de la presente invención se aisla a partir de arroz ( Oryza sa t i va L.), se expresa específicamente en la antera, y su secuencia genómica está representada en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de ADNc del gen RA8 se muestra en la SEQ ID NO: 7. La comparación del ADNc y las secuencias genómicas revela la presencia de 2 intrones y 3 exones en la secuencia de codificación del gen RA8. El intrón 1 de 134 pares de bases se localiza entre los 14° y 15° codones, correspondientes a los nucleótidos nt 1289 a nt 1422 de la SEQ ID NO: 1, y correspondientes a los nucleótidos nt 1556 a nt 2149 de la SEQ ID NO: 1, y el intrón 2 de 594 pares de bases se localizan en el 59° codón de la región de codificación de aminoácidos que se deduce a partir de las secuencias bases, correspondiente a los nucleótidos nt 1556 a nt 2149 de la SEQ ID NO: 1. Ambos intrones contienen las secuencias GT y AG en consenso en los extremos 5' y 3', respectivamente. Con respecto a la SEQ ID NO: 1, los 3 exones se localizan como sigue: exón 1: nucleótidos nt 1247 a nt 1288; exón 2: nucleótidos nt 1423 a nt 1555; exón 3 : nucleótidos nt 2150 a nt 2766. En la secuencia de flanqueo no codificadora 5' de esta región de codificación, se localiza una secuencia de cuadro CAAT, CAAT, en la posición base -82 a -79, correspondientemente a los nucleótidos nt 1116 a nt 1119 de la SEQ ID NO: 1, y se localiza una secuencia de cuadro TATA, TATAATA, en la posición base -53 a -47, correspondiente a los nucleótidos nt 1145 a nt 1151 de la SEQ ID NO: 1. La cola poli (A) se localiza en la 164a base (nucleótido 2932 de la SEQ ID NO: 1) corriente abajo desde el codón de terminación de traducción TGA. En la región no codificadora 3', está presente la secuencia de señal de poliadenilación en consenso ATA. La secuencia que rodea al primer ATG se ajusta bien con la secuencia de consenso de inicio de traducción de las monocotiledóneas, como se reporta en la literatura [Joshi, C.P. y colaboradores Plant Mol. Biol.., 35:993-1001 (1997)]. Un marco de lectura abierta de esta región de codificación consiste en 264 residuos de aminoácidos, y tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. Una proteína deducida a partir de este marco de lectura abierta, tiene una masa molecular de 26.4 kDa, y un pl de 6.1. Los aminoácidos mayores que constituyen la proteína son alanina (21.9 por ciento), glicina (9.9 por ciento), y prolina (10.2 por ciento), y su secuencia de aminoácidos contiene una región N-terminal hidrofóbica que puede estar involucrada en la dirección de la proteína hacia una fracción de membrana a hacia un espacio extracelular, un motivo SPPPPPP de tipo de extensina, y una región rica en glicina. De acuerdo con un análisis de homología con las bases de datos GeneBank, estas secuencias de aminoácidos es novedosa, y no muestra una identidad de secuencia significativa con cualquiera genes reportados hasta ahora. La expresión del gen de acuerdo con la presente invención se caracteriza por ser regulada de una manera temporal y especial. El patrón de expresión espacial incluye que el gen se expresa solamente en el órgano de la antera de la flor de arroz, pero no en otros órganos florales diferentes de la antera, hojas y raíces, etcétera, y especialmente entre el órgano de la antera, se expresa solamente en tapeto, endotecio, y tejidos conectivos, pero no en los tejidos vasculares. El patrón de expresión temporal incluye que los niveles de expresión del gen se incrementan a medida que maduran las flores, en donde el gen se expresa escasamente en la etapa previa a la meyosis, pero su expresión se puede detectar primero en el momento en que se liberan las microesporas desde los tetrads. Se observan los niveles máximo en la etapa de polen vacuolado, y disminuyen agudamente en la etapa de polen maduro inmediatamente antes del florecimiento . El gen de la presente invención se puede obtener por medio de métodos de hibridación diferencial. Por ejemplo, mediante un método que comprende hibridar una biblioteca de ADNc de antera con una biblioteca de ADNc que no sea de origen de antera, tal como de hojas, raíces, o plántulas, y después se obtienen el clon de ADNc de un gen específico de la antera que reacciona negativamente con la biblioteca de ADNc que no es de origen de antera. En adición, el clon de ADNc obtenido se utiliza como una sonda para hibridarlo con un biblioteca genómica, y aislar un clon que reacciona positivamente con la misma, y para subclonarlo y obtener un clon genómico del gen específico de la antera. Otro método para obtener el gen incluye un método en donde las secuencias base de la SEQ ID NO: 1 se utilizan para sintetizar en cebador apropiado para un método de reacción en la cadena de polimerasa convencional. En una modalidad específica de la invención, el gen obtenido se clona en un vector pBluescript SK ( - ) , y se designa como el plásmido pGA1173-9. Este plásmido esta depositado en el Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, la organización anexa del Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) bajo el número de depósito KCTC 8899p el 29 de julio de 1998. La región que contiene al promotor RA8 se muestra en la SEQ ID NO: 3, que corresponde a los nucleótidos nt 1 a nt 1196 de la SEQ ID NO: 1. Los nucleótidos transcritos del gen RA8 empiezan en la posición 1197 de la SEQ ID NO: 1. Un elemento que regula la expresión específica de la antera del gen de la presente invención se localiza en la región que contiene al promotor, al exón 1, al intrón 1, y parte del exón 2, y esta región se puede representar como la SEQ ID NO: 2, que corresponde a la secuencia base entre los nucleótidos nt 1 y nt 1436 en la secuencia base de dicha SEQ ID NO: 1. Este elemento regulador se puede obtener mediante un método de clonación convencional a partir de la ADN genómico de arroz o del plásmico pGA1173-9, por ejemplo, en donde la secuencia base de la SEQ ID NO: 2 se utiliza para sintetizar el cebador apropiado, y posteriormente se realiza un método de reacción en la cadera de polimerasa convencional. El vector de expresión en plantas de la presente invención contiene, por ejemplo, el elemento regulador como se muestra en la SEQ ID NO: 2, en donde el regulador de expresión especifica de la antera se fusiona con otro gen de interés. Como el gen deseado, se puede utilizar un gen reportero, tal como beta-glucuronidasa (GUS), y para el propósito de incluir un desarrollo anormal de las anteras del arroz, se puede utilizar DTA (un gen tóxico que altera las células) el gen de ARNsa, etcétera (ver más adelante), pero el gen de interés no debe limitarse a los mismos. El vector de expresión en plantas puede contener un segundo cásete de expresión que comprende un gen marcador, para permitir la selección de transformantes. Los ejemplos de los genes marcadores seleccionables o clasificables se describen más adelante. Para ciertas especies objetivo, se pueden preferir diferentes marcadores de selección de antibiótico o herbicida. Los marcadores de selección utilizados rutinariamente en la transformación incluyen al gen nptll que confiere resistencia a la Kanamicina, paromocina, geneticina, y antibióticos relacionados (Vieira y Messing, 1982, Gene 19: 259- 268; Bevan y colaboradores., 1983, Nature 304:184-187) el gen bacteriano aadA ( Goldschimidt-Clermont , 1991, Nucí. Acids Res. 19:4083-4089), se codifica 3'-adenililtransferasa de aminoglicósido, y que confiere resistencia a la estreptomicina o espect inomicina ; el gen hph que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochlinger y Diggel-mann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4_: 2929-2931 ) , y el gen dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Bourouis y Jarry, 1983, EMBO J. 2_: 1099-1104). Otros marcadores que se van a utilizar incluyen un gen de acet iltransferasa de fosfinotricina, que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White y colaboradores., 1990, Nucí. Acids Res. 1_8_: 1062; Spencer colaboradores 1990, Theor. Appl. Genet. 7_9: 625-631), un gen de sintasa de EPSP mutante que codifica resistencia al glifosato (Hinchee y colaboradores, 1988, Bio/Technology 6_: 915-922), un gen de sintasa de acetolactato (ALS) mutante que confiere resistencia a la imidazolina o urea sulfonílica (Lee y colaboradores, 1988, EMBO J. 7_: 1241-1248), en gen psbA mutante que confiere resistencia a la atrazina ( Smeda y colaboradores 1993, Plant Physiol. 103 : 911-917), o un gen de oxidasa de protoporfirinógeno mutante, como se describe en la EP-0, 769, 059. También se utilizan marcadores de selección que dan como resultado positiva, tales como gen de isomerasa de fosfomanosa, como se describe en la Solicitud de Patente Número WO 93-05163. La identificación de las células transformadas también se puede realizar a través de la expresión de genes marcadores clasificables , tales como genes que codifiquen para acetil transferasa de cloranfenicol (CAT), ß-glucuronidasa (GUS), luciferaza, y proteína fluorescente verde (GFP), o cualquier otra proteína que confiera un rasgo fenot ípicamente distinto a las célula transformada. El vector de expresión se puede construir fusionando el regulador de expresión específico de la antera con el gen deseado y posteriormente ligándolo a un vector de expresión en plantas apropiado. Por ejemplo, el elemento regulador se fusiona con GUS sin cambios de marco- de lectura, y el producto fusionado se liga entonces a un vector binario pGA1633 capaz de expresarse en plantas para construir un vector de expresión pGA1647. Las secuencias de ADN recombinante de la invención se pueden introducir en la célula de planta mediante un número de métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica apreciarán que la elección del método podría depender del tipo de planta que se dirija para la transformación, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea. Los métodos para la transformación de células de plantas incluyen microinyección (Crossway y colaboradores, 1986, Bio Techniques 4:320-334), electroporación (Riggs y Bates, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 83:5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee y colaboradores, 1988, Bio/Technology 6:915-922; EP-0,853,675), transferencia genética directa (Paszkowski y colaboradores, 1984, EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración de partículas balísticas utilizando dispositivos disponibles en Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin y Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 4,945,050, y MeCabe y colaboradores, 1988, Bio/techonology 6:923-926). Las células que se van a transformar pueden ser células de hoja diferenciadas, células embriogénicas , o cualquier otro tipo de célula. En la transformación directa de protoplastos, la recuperación del material genético exógeno en un protoplasto se puede mejorar mediante la utilización de un agente químico o un campo eléctrico. El material exógeno se puede integrar entonces en el genoma nuclear. El trabajo anterior se conduce en plantas de tabaco dicotiledóneas, que dan como resultado que se incorpore el ADN extraño, y se transfiera a las plantas de la progenie (Paszkowski y colaboradores, 1984, EMBO J. 3:2712-2722; Potrykus y colaboradores, 1985, Mol. Gen. Genet 199:169-177). Los protoplastos de monocotiledóneas, por ejemplo, de Triticum monococcum, Lolium multiflorum (pasto de centeno italiano) , maíz, y maíz dulce mexicano negro, se transforman mediante este procedimiento. Una modalidad preferida adicional es el método de transformación del protoplasto para maíz, como se da a conocer en la EP-0,092,435, así como en la EP 0,846,771. Para la transformación del maíz, también ver Koziel y colaboradores, 1993, Bio/Technology 11:194-200. La transformación del arroz se puede realizar mediante técnicas de transferencia genética directa, utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por el protoplasto se describe para los tipos japónica y los tipos Indica (Zhang y colaboradores, 1988, Plant Cell Rep., 7:379-384; Shimamoto y colaboradores, 1989, Nature 338:274-276; Datta y colaboradores, 1990, Bio/technology 8:726-740) . Ambos tipos anteriores también se pueden transformar de una manera rutinaria utilizando el bombardeo de partículas (Christou y colaboradores, 1991, Bio/Technology 9:957-962). La solicitud de Patente Número EP 0,332,581 describe técnicas para la generación transformación, y regeneración de protoplastos de Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de todas las plantas Pooideae, incluyendo Dactilis y trigo. Además, la transformación de trigo se describe en la Solicitud de Patente Número Ep 0,674,715, y en Weeks y colaboradores, 1993 (Plant Physiol. 102:1077-1084). EL vector de expresión en plantas así construido, por ejemplo, se puede introducir en los callos de arroz de acuerdo con el método de transformación de plantas convencionales, y se induce la diferenciación de las raíces y hojas a partir de los mismos, y luego se puede transferir a una maceta para su cultivo, obteniendo de esta manera el arroz transformado . EL método preferido para transformar plantas es la transformación mediada por Agroba c t eri um . De acuerdo con la trasformación mediada por Agrobacterium como por ejemplo representativo, el vector de expresión PGA1647 se trasfiere a Agroba c teri um t umefa ci en s que lleve el plásmido Ti binario, utilizando el método de congelación-descongelación (An, G. Y colaboradores (editores) Plant Molecular Biology Manual, páginas. A3/1-A3/19, Kluwer Academic Plublishers, Dprdrecht (1998)), y luego se cultivan en un medio líquido AB complementado con los antibióticos apropiados (Chilton, M-D, Pro. Nati. Acad. Sci. EUA, 71, 3672-3676 (1974)), y el producto así obtenido se co-cultiva con callos sobre un medio 2N6-As complementado con betaína 1 mM (Hiei, Y. y colaboradores, Plant J., 6,271-282 (1994)) en la oscuridad a 25°C durante 2 a 3 días. Los callos co-cultivados se lavan con agua estéril que contengan cefotaxima, y nuevamente se incuban sobre un medio N6 que contenga un antibiótico apropiado y cefotaxima, durante 3 a 4 semanas, para obtener callos en crecimiento activo. Estos callos se transfieren a un medio de selección apropiado, por ejemplo un medio MS (Life Technolgies) complementado con 0.2 miligramos/litro de NAA (ácido naftalenacético ) , 2 miligramos /litro de cinetina, sorbitol a 2 por ciento, fitagar aL 1.6 por ciento (Gibco), el antibiótico apropiado, y 250 miligramos /litro de cefotaxima, y luego se cultivan durante 2 s 3 semanas bajo condición de luz continua de 30-60 µmol m"2 seg-1, de preferencia 40 µmol m"2 seg"1, para obtener plántulas. Estas plántulas se ponen en macetas, y se cultivan en una cámara de cultivo bajo la condición de 10 horas de luz/14 horas de oscuridad, para obtener el arroz transgénico. En el caso de que el vector utilizado en este método contenga el gen fusionado del elemento regulador de la presente invención, y genes DTA o ARNsa, etcétera, la planta transformada con el vector tiene el carácter de esterilidad masculina. La secuencia de ADN de codificación de la presente invención puede ser cualquier secuencia de ADN que codifique un polipéptido deseado. Sin embargo, se prefieren especialmente para utilizarse en la presente invención las secuencias de ADN de codificación que codifique un producto de polipéptido que, cuando se exprese en el tejido de la antera, haga que la planta no produzca polen viable. Los ejemplos de estas secuencias de ADN de codificación incluyen los genes que se describen en las siguientes referencias, cuyas divulgaciones se incorporan completamente a la presente como referencia: a) El gen de cadena A de toxinas de difteria (DTA), que inhibe la síntesis de proteína (Greefield y colaboradores, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 80:6853; Palmiter y colaboradores, 1987, 1987, Cell 50:435-443) ; b) El gen de liasa de pectato pelE de Erwinia chrysanthemi EC16, que degrada la pectina, ocasionando lisis celular (Keen y colaboradores, 1986, J. Bacteriology 168:595); c) El gen T-urfl3 (TURF-13) a partir de genomas de mitocondrias de maíz cms-T: este gen codifica un polipétido designado como URF-13 que altera las membranas mitocondriales o del plasma (Braun y colaboradores, 1990, Plant Cell 2: 153; Dewey y colaboradores, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 84:5374 y Dewey y colaboradores, 1986, Cell 44:439); di El gen de recombinasa de jengibre a partir del gen Mu del fago, que codifica una recombinasa de ADN específica del sitio, que ocasiona reconfiguraciones del genoma, y pérdida de vialidad celular cuando se expresa en células de plantas (Maeser y colaboradores, 1991, Mol Gen Genet 230:170-176); e) El gen de ácido indolacético-sintetasa de lisina (iaaL) de Pseudomonas syringae, que codifica un enzima que conjuga la lisina con el ácido indolacético (IAA) . Cuando se expresa en las células de plantas, ocasiona un desarrollo alterado debido a la remoción de iAA de la célula mediante conjugación (romano y colaboradores, 1991, Genes y Development 5:438-446; Spena y colaboradores, 1991, Mol Gen Genet 227:205-212; Roberto y colaboradores, 1990, Pro Nati Acad Sci EUA, 87:5795-5801); f) El gen de toxina CytA a partir de Bacillus thuringiensis israeliensis , que codifica una proteína mosquitocida y hemolítica. Cuando se expresa en células de plantas, ocasiona la muerte de la célula debido a la alteración de la membrana celular (McLean y colaboradores, 1987, J. Bacteriology 169:1017-1023; Ellar y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,918,006, 1990).

EJEMPLOS Ahora se describirá la presente invención con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos, pero no debe interpretarse como una limitación sobre el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1: Aislamiento del gen específico de la antera de arroz, RA8 Paso 1: Aislamiento del gen RA8 Las flores de arroz ( Oryza sa t i va L. Nakdong) en la etapa vacuolada tardía, se seccionan cruzadas en tres partes. La porción media que contiene anteras intactas y partes de la palea y lemma, se utiliza como una muestra enriquecida en antera. De esta porción, se aisla el ARNm enriquecido con antera utilizando el estuche de aislamiento de ARNm poli (A) Quick (Stragene, EUA). Se construyen bibliotecas de ADNc de antera con el estuche de clonación ZAP-cDNA Gigapack 2 Gold (Stragene), que utiliza el ARNm como plantilla. Se aplica el mismo proceso a las hojas, que se cosechan de plántulas de arroz de 6 días de edad, para construir bibliotecas de ADNc de hoja. A partir de las bibliotecas de ADNc de antera construidas, se seleccionan aleatoriamente 33 clones de ADNc, y después, se marcan regiones de ADNc que se obtienen mediante disociación del ADN del clon respectivo con EcoRi, con un isótopo radioactivo 32P, y se hibridan con placas a partir de la biblioteca de ADNc de la hoja. Como un resultado de esto, 6 clones de ADNc de antera no reaccionan positivamente con las placas de la biblioteca de ADNc de hoja, y entre estos clones, se selecciona un clon, que está más abundantemente presente en la biblioteca de ADNc de antera, y se designe como RA8. A partir de este clon RA8, se utiliza el fago auxiliar de fl, R408 (Stratagene) para obtener un plásmido recombinante pGA1173-4 (RA8), en donde se inserta el fragmento de ADNc mediante separación en vivo, y se determinan las secuencias base del ADNc de RA8 que se clonan en el plásmido anterior, mediante el método de (Sanger, F. Y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 74, 5463-5467 (1977)). Estas secuencias base está representadas por la SEQ ID NO: 7. Como se muestra en la SEQ ID NO: 7 la secuencia base del ADNc de Ra8 es de un tamaño de 1008 pares de bases. Esta presente un marco de lectura abierta en los nucleótidos nt 51 a nt 842 de la SEQ ID NO: 7, que consisten en 264 residuos de aminoácido. La proteína deducida a partir de este marco de lectura abierta tiene una masa molecular de 26.4 kDa, y un pl de 6.1. La secuencia que rodea el primer ATG se ajusta bien con la secuencia en consenso de inicio de traducción de las monocotiledóneas, como se reporta en la literatura [Joshi, C.P. y colaboradores, Plant Mol. Biol.., 35:993-1001 (1997)], la cola poli (A) se localiza en la 164a secuencia base corriente abajo desde el codón de terminación de traducción TGA. En la región no codificadora 3', está presente la secuencia de señal de poliadenilación en consenso AATAA. Los residuos de aminoácidos mayores que constituyen la secuencia de aminoácidos anterior son alanina (21.9 por ciento), glicina (9.9 por ciento), y prolina (10.2 por ciento), y la secuencia de aminoácidos contiene una región N-terminal hidrofóbica que puede estar involucrada en la dirección de la proteína hacia una fracción de membrana o espacio extracelular, un motivo SPPPPPP de tipo de extensina, y una región rica en glicina. De acuerdo con un análisis de homología con las bases de datos GeneBank, se confirma que esta secuencia de aminoácidos es un gen novedoso, que no muestra una identidad de secuencia significativa con cualesquiera genes reportados hasta ahora.

Paso 2: Análisis de mancha de ARN Para confirmar si el gen RA8 obtenido del paso 1 anterior se expresa específicamente en las anteras, se aisla ARN total de las hojas, raíces, flores jóvenes, flores maduras, y paleas /lemmas , pistilos, y estamenos de las flores de arroz, se pasa por electroforesis, y luego se trasfiera una membrana de nylon. El ADNc de RA8 marcado con 32P se utiliza como una sonda para realizar la mancha de ARN. EL ARNm de RA8 está presente solamente en las flores en diferentes etapas de desarrollo, pero no en las hojas y raíces. El nivel de expresión del gen RA8 se incrementa durante el desarrollo de la flor, alcanzando el nivel más alto en las flores maduras. Con el objeto de determinar la especificidad del órgano adentro de una flor, se conduce un experimento de mancha de ARN con el ARN total aislado a partir de diferentes órganos florales. Cada uno de los órganos florales se disecta bajo un microscopio de disección para minimizar la contaminación cruzada. El resultado reveló que el ARNm de RA8 está presente en las anteras, pero no en el carpelo o el palea/lemma.

Paso 3: Aislamiento del clon genómico de RA8 Se transfieren placas de bibliotecas genómicas de arroz (las cuales se construyen mediante métodos convencionales, y se obtienen en Steve Kay y Nam-Hi Chua de la Universidad de Rockefeller, en la forme de ADN de fago lambda EMBL, en donde se inserta el ADN genómico de arroz), a una membrana de nylon (Hybond, Amersham), y se hibridan mediante la utilización del ADNc de RA8 marcado con el isótopo radioactivo 32P, como una sonda de hibridación. La membrana de nylon híbrida se expone a película de rayos X, y se obtienen clones de fago a partir de placas que se muestran positivamente. El ADN del fago lambda se aisla a partir de estos clones de fago, se disocia con BamHl para obtener un fragmento genómico de 13.7 kb, y entre éste se subclona un fragmento Sacl-EcoRI de 4.3 kb . El fragmento Sacl de 2.9 kb obtenido a partir del fragmento Sacl-EcoRI de 4.3 kb que contiene la secuencia de flanqueo 5' y la región de codificación 5', mientras que el fragmento Sacl-EcoRI de 1.5 kb adyacente contiene la región de codificación restante, así como la secuencia de flanqueo 3'. Hay dos intrones (intrón 1 e intrón 2) y 3 exones presentes en la región de codificación. Con respecto a la SEQ ID NO: 1, los tres exones se localizan como sigue: exón 1: nucleótidos nt 1247 a nt 1288; exón 2: nucleótidos nt 1423 a nt 1555; exón 3: nucleótidos nt 2150 a nt 2766. El intrón 1 es de un tamaño de 134 pares de bases y se localizan entre los 14 y 15 codones, correspondientes a los nucleótidos nt 1289 a nt 1422 de la SEQ ID NO: 1, el intrón 2 es de un tamaño de 594 pares de bases, y se localiza en- el 59 codón, correspondiente a los nucleótidos nt 1556 a nt 2149 de la SEQ ID NO: 1. Ambos intrones contienen las secuencias de GT y AT en consenso en los extremos 5' y 3' respectivamente. La secuencia de flanqueo 5' de la región de codificación de RA8 contiene la secuencia de cuado CAAT, CAAT, en la posición base -82 a 79, correspondiente a los nucleótidos nt 1116 a nt 1119 de la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de cuadro TATA, TATAATA, en la posición base -53 a -47, correspondiente a los nucleótidos nt 1145 a nt 1151 de la SEQ ID NO: 1. El fragmento Sacl de 2.9 kb se clona en el vector del plásmido pBluescript SK(-) y este plásmido se designa como pGA1173-9. Este plásmido está depositado en el Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, la organización anexa del Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) bajo el número de depósito KCTC 8899P el 29 de julio de 1998. Las secuencias base del fragmento de ADN genómico, que se clonan en el plásmido pGA1173-9, se analizan utilizando el método de Sanger y colaboradores, y se determina una región promotora aproximada de 2.5 kb en comparación con el ADNc. Para estudiar la complejidad genómica del clon RA8, el ADN genómico aislado de las hojas de plántulas de arroz de dos semanas de edad se disocia con EcoRI, HindIII, o PstI, y luego se somete a mancha de ADN con el ADNc de RA8. La sonda de ADNc de RA8 se híbrida con una sola banda del ADN genómico de arroz, y por lo tanto, el gen RA8 existe en una sola copia en el genoma de arroz.

Ejemplo 2 : Producción del vector de expresión en plantas El vector binario, que contiene un gen reportero, GUS, y un gen de selección, hph ( fosfotransferasa de higromicina), se construye como sigue . Un plásmido pGA748 (An, G. Binary Ti plasmid vectors, Agrobacterium protocols, Humana Press. Páginas 47-58) se disocia con BamHl y HindIII, y luego se inserta en el mismo el promotor 35S de CaMV (Benfey y colaboradores, Science, 250, 959-966 (1993)) . Se inserta un gen resistente a la higromicina ( fosfotransferasa de higromicina hph) (Gritz y colaboradores, (1983)) en el sitio BglII del plásmido así obtenido. Este plásmido se disocia con HindIII y Clal, se hace de extremos rombos, y luego se liga. El plásmido así obtenido se disocia con Sacl para remover un fragmento de aproximadamente 0.5 kb, y luego se liga nuevamente. En el sitio BamHl de este plásmido, se inserta un adaptador sintético que tiene los sitios de disociación BamHl, HindIII, Xbal, Sacl, Hpal, kpnl, Clal y BglII para construir un plásmido pGA1182. La reacción en cadena de polimerasa se realiza utilizando el plásmido PGA1182 con un plantilla, 5'-TTGGCATGCACATAC-3' (SEQ ID NO: 5) como el cebador 1, y 5' -CGGGATCCGTGTTTGACAGG-3' (SEQ ID NO: 6) como el cebador 2. El fragmento de aproximadamente 120 pares de bases obtenido, se disocia con BamHl y Sphl, y luego se liga en un fragmento de aproximadamente 9 kb, el cual se obtiene disociado el plásmido pGA1182 con las misma enzimas de restricción. Entre los sitios BamHl y Clal del plásmido así obtenido, se inserta el gen GUS (Jefferson y colaboradores, EMBO J, 6, 3901-3907 (1987))para construir el vector binario pGA1633. El pGA1173-9 que contiene el ADN genómico de RA8 de 2.9 kb como se construye en el paso 3 del Ejemplo 1 se somete a reacción en la cadena de polimerasa con cebadores de oligómero sintético de la SEQ ID NO: 8 (AATTAACCCTCACTAAAGGG) y de la SEQ ID NO: 9 (GCGGATCCAGGTTGAACCAC) . El oligómero sintético mostrado en SEQ ID NO : 9 genera un sitio BamHl en el exón 2 del gen RA8. Luego se construye el plásmido pGA1639, que contiene la secuencia amplificada como anteriormente. El plásmido pGA1639 contiene el fragmento Sacl-BamHI de 2.7 kb que comprende la región de flanqueo 5', el exón 1, el intrón 1, y una parte del exón 2 del gen RA8.

Este fragmento se conecta con la secuencia de codificación de beta-glucuronidasa en el pGA1633, para construir el vector de expresión en plantas pGA1647. En el vector pGA1647, se fusiona la secuencia derivada del gen RA8 anteriormente descrita en el sitio BamHl recién introducido adentro del exón 2 con el gen GUS sin cambios del marco de lectura. Por consiguiente, se hace una fusión de traducción entre parte del gen RA8 y la secuencia de codificación de beta-glucuronidasa.

Ejemplo 3: Producción del arroz transgénico El vector de expresión pGA1647 construido en el Ejemplo 2, se transforma en Agroba c t eri um t umefa ci e n s LBA4404 (Hoekema y colaboradores, Nature, 303, 179-181 (1983)) que lleva el plásmido Ti Binario pAL4404 utilizando el método de congelación-descongelación (An, G. Y colaboradores, (editores) Plant Molecular Biology Manual, páginas A3/1-A3/19, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988)) . El agrobacterium tumefaciens LBA4404 transformado se cultiva durante 3 días en el medio AB complementado con 30 miligramos/ 1 i tro de higromicina B, y 3 miligramos/litro de tetraciclina, y se co-cultiva con callos de 3 semanas de edad, que se induce a partir del escutelo de las semillas maduras en el medio N6 (Chu, C.C. y colaboradores, Sci, Sin., 18, 659-668 (1975)) conteniendo 2 mg/litro de 2,5-D, sobre el medio 2N6-As complementado con betaína 1 mM (Hiei, y. y colaboradores, Plant J., 6, 271-282 (1994)) en la oscuridad a 25°C durante 2 a 3 días. Los callos co-cultivados se lavan con agua estéril conteniendo 100 miligramos /litro de cefotaxima, y nuevamente se incuban sobre un medio N6 conteniendo 40 miligramos /litro de higromicina, y 250 miligramos/litro de cefotaxima durante 3 semanas. Los callos resistentes a la higromicina en crecimiento activo se transfiere al medio de selección [por ejemplo, medio MS (Life Technologies) +0.2 miligramos /litro de NAA (ácido naf alenacético) + 2 miligramos /litros de cinetina +sorbitol al 2 por ciento + fitagar al 1.6 por ciento (Gibco) + 50 miligramos /litro de higromicina B + 250 miligramos/litro de cefotaxima], luego se cultivan durante 2 a 3 semanas bajo condición de luz continua de 40 µmol m"2 s"1. Las plántulas así obtenidas se ponen en macetas, y se cultivan en una cámara de cultivo bajo una condición de 10 horas de luz/14 horas de oscuridad, para obtener un total de 22 plantas de arroz transgénicas.

Con el objeto de seleccionar una linea de planta que tenga el más alto nivel de expresión en las anteras entre las veintidós (22) plantas de arroz transgénicas, se realiza teñido con GUS histoquímico para la porción floral del arroz transgénico de acuerdo con el método de Dai y colaboradores, [Dai, Z. Y colaboradores, Plant Mol. Biol.., 32, 1055-1065 (1996)], el cual se modifica para contener metanol al 20 por ciento en la solución de teñido, y luego se fija en una solución fijadora (etanol al 50 por ciento, ácido acético al 5 por ciento, y formaldehído al 3.7 por ciento) . Las muestras se observan bajo un microscopio de disección (amplificación x7.5) . A partir de este resultado, se selecciona el arroz que exhiba el más alto nivel de expresión de GUS en las anteras, y se designa como una línea de planta transgénica A11279.

Ejemplo 4: Análisis de GüS histoquímico del arroz transgénico Para estudiar los patrones de expresión espacial y temporal del gen RA ( , las flores jóvenes, las flores en la etapa de polen vacuolado temprana, las flores maduras, las hojas, y las raíces del arroz transgénico A11279 producido en el Ejemplo 3, se analiza histoquímicamente para determinar la actividad de GUS, como se describe en el Ejemplo 3, y luego se observan bajo un microscopio. Como un control, se utiliza una flor de arroz no transformado. La expresión de GUS impulsada por el promotor RA8 se detecta solamente en la antera de las flores de arroz, pero no en otros órganos florales o en las hojas o raices. En adición, el nivel de expresión del gen reportero GUS se incrementa a medida que maduran las flores, y el gen no se expresa para nada en las flores jóvenes en la etapa antes de la meyosis. Para estudiar los patrones de expresión específica de la antera del arroz de la construcción del gen promotor-reportero RA8 , después de teñir y fijar 4 anteras de arroz en diferentes etapas de desarrollo de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo 3, se empotra en un Paraplast (Sigma), y se seccionan hasta un espesor de 10 mieras. Las secciones se observan bajo un microscopio óptico (amplificación xlOO) utilizando iluminación de campo oscuro. En la etapa antes de la meyosis, no se detecta actividad de GUS en ninguna parte de la antera. La expresión de GUS se puede detectar primeramente en el momento en que se liberen las microesporas desde los tetrads. Se observa la más alta cantidad de actividad de GUS en las anteras en la etapa de polen vacuolado. En las anteras, en la etapa de polen maduro, justo antes o después de la dehiscencia, sin embargo, la actividad de GUS disminuyó de una manera repentina. Se observa que el teñido de GUS se restringe al tapeto, y a los tejidos conectivos y del endotecio.

Ejemplo 5: Producción de maíz transgénico La transformación de maíz con un gen novedoso preparado de acuerdo con el método anterior, se logra mediante bombardeo de microproyectiles de embriones cigóticos inmaduros, o bien de callo embriogénico Tipo I propagable en serie. Se inician cultivos de callo de maíz embriogénico Tipo I (Green y colaboradores, Miami Winter Symposium 20,1983) a partir de embriones inmaduros, de 1.5 a 2.5 milímetros de longitud, de material cultivado en el invernadero. Los embriones se separan asépticamente de las mazorcas esterilizadas superficialmente aproximadamente 14 días después de la polinización. Se pueden colocar embriones sobre medio de iniciación de callo D con sacarosa al 2 por ciento y 5 miligramos/litro de clorambeno (Duncan y colaboradores, Planta 165: 322-332, 1985) o sobre medio de iniciación de callo KM con sacarosa al 3 por ciento y 0.75 miligramos /litro de 2,4-D (Kao y Michayluk, Planta 126:105-110, 1975) . Los embriones y los cultivos embriogénicos subsecuentemente se cultivan en la oscuridad. Se remueven las respuestas embriogénicas de los explantes después de aproximadamente 14 días. Las repuestas embriogénicas a partir del medio de iniciación de callo D se colocan sobre medio de mantenimiento de callo D con sacarosa al 2 por ciento y 0.5 miligramos /litro de 2,4-D, mientras que aquellos del medio de iniciación de callo KM se colocan sobre medio de mantenimiento de callo KM con sacarosa al 2 por ciento y 5 miligramos/litro de Dicamba. Después de 3 a 8 semanas de subcultivo semanalmente selectivo hacia un medio de mantenimiento fresco, se establece cultivos embriogénicos compactos de alta calidad. Las piezas de callo embriogénico que crecen activamente de alta calidad. Las piezas de callo embriogénicos que crecen activamente se seleccionan como el tejido objetivo para el suministro del gen. Las piezas de callo se recubren sobre placas objetivo que contienen medio de mantenimiento con sacarosa el 12 por ciento aproximadamente 4 horas antes del suministro del gen. Las piezas de callos se configuran en círculos, con radio de 8 a 10 milímetros desde el centro de la placa objetivo.

Eí ADN del plásmido se precipita sobre microportadores de oro, como se describe en el manual de DuPont Biolistics. Se utilizan de 2 a 3 microgramos de cada plásmido en cada preparación de microportador de 6 disparos. Los genes se suministran a las células de tejido objetivo utilizando el dispositivo PDS-lOOHe Biolistics. Los establecimientos en el dispositivo son como sigue: 8 milímetros entre el disco de ruptura y el macroportador, 10 milímetros entre el macroportador y la malla de paro, y 7 centímetros entre la malla de paro y el objetivo. Cada placa objetivo se dispara dos veces utilizando discos de ruptura de 45.5 Kg/cm2. Se coloca una malla de acero inoxidable 200 x 200 (McMaster-Carr , New Brunswick, NJ) entre la malla de paro y el tejido objetivo. Siete días después del suministro del gen, las piezas de tejido objetivo se transfieren desde el medio altamente osmótico hasta el medio de selección. Para la selección utilizando el gen BAR, las piezas de tejido objetivo se colocan sobre el medio de mantenimiento que contiene 100 miligramos/litro de glufosinato de amino (BastaR) , o 20 miligramos/litro de bialafos (HerbiaceR) . Todos los aminoácidos se remueven del medio de selección. Después de 5 a 8 semanas sobre estos medios de selección de alto nivel, cualquier callo en crecimiento se subcultiva en un medio que contiene de 3 a 20 miligramos/litro de BastaR. Para la selección utilizando el gen de Isomerasa de Fosfato de Mañosa, los cultivos objetivo se colocan sobre su medio de mantenimiento respectivo que no contiene sacarosa y contiene mañosa al 1 por ciento. Los aminoácidos no se remueven de estos medios. Después de 5 a 8 semanas, el callo de crecimiento se subcultiva en un medio de mantenimiento de callo D que no contiene sacarosa y contiene mañosa al 1.5 por ciento, o medio de mantenimiento de callo KM que contiene sacarosa al 1 por ciento y mañosa al 0.5 por ciento. El cayo embriogénico que crece sobre el medio ele selección se subcultiva cada dos semanas durante 4 a 8 semanas, hasta que se produce suficiente callo para generar de 10 a 20 plantas. El tejido que sobrevive a la selección a partir de una pieza de tejido objetivo original, se subcultiva como una sola colonia, y se designa como un evento de transformación independiente. En ese punto, las colonias seleccionadas sobre BastaR se transfieren a un medio MS modificado (Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15: 473-497, 1962) conteniendo sacarosa al 3 por ciento (MS3S), sin agente de selección, y se colocan en la luz. Se agregan 0.25 miligramos/litro de ancimidol y 0.5 miligramos /litro de cinetina a este medio para inducir la germinación del embrión, o bien, se agregan 2 miligramos /litro de adenina bencilina. Las colonias seleccionadas utilizando mañosa se transfieren a un medio MS modificado que contiene sacarosa al 2 por ciento y mañosa al 1 por ciento (MS2S + 1M) , con las adiciones de ancimidol y cinetina descrita anteriormente, o un medio MS modificado que contiene sacarosa al 2 por ciento y mañosa al 0.5 por ciento (MS2S + 0.5), con la adición de adenina bencílica descrita anteriormente. Las colonias en regeneración a partir de la selección con BastaR se trasfiere al medio MS3S sin ancimidol o adenina bencílica después de dos semanas. Las colonias en regeneración a partir de la selección con mañosa se transfiere a un medio MS2S +1M y MS2S + 0.5M, respectivamente, sin hormonas, después de dos semanas. Los retoños en regeneración con o sin raíces de todas las colonias, se trasfieren a cajas Magenta que contiene medio MS3S, y eventualmente se recuperan plantas pequeñas con raíces, y se transfieren a la tierra en el invernadero. Las plantas se prueban para determinar la expresión del gen PMI utilizando un ensayo de rojo de clorofenol de 48 cavidades modificado, en donde el medio no contiene sacarosa y contiene mañosa al 0.5 por ciento. Se colocan muestras de hoja (de aproximadamente 5 milímetros) sobre este medio de ensayo, y se cultivan en la oscuridad durante aproximadamente 72 horas. Si la planta está expresando el gen PMI, puede metabolizar la mañosa, y el medio se hará amarillo. Sino, el medio permanecerá rojo. También se han creado eventos de trasformación utilizando callo Tipo I obteniendo a partir de embriones cigóticos inmaduros, utilizando técnicas de cultivo convencionales. Para el suministro del gen, se preparan aproximadamente 300 miligramos del callo Tipo I, mediante el subcultivo en medio fresco de 1 a 2 días antes del suministro del gen, seleccionando las piezas de tejido objetivo, y colocándolas en un patrón de anillo a 10 milímetros desde el centro de la placa objetivo, sobre un medio que contiene nuevamente sacarosa al 12 por ciento. Después de aproximadamente a 4 horas, el tejido se bombardea utilizando el dispositivo PDS-1000/He Biolistic de DuPont. Los plásmidos de interés se precipitan sobre partículas de oro de una miera, utilizando el protocolo convencional de DuPont.. Los genes se suministran utilizando dos disparos por placa objetivo a 45.5 kg/cm2.

Aproximadamente 16 horas después del suministro del gen, el callo se transfiere a un medio de cultivo convencional que contiene sacarosa al 2 por ciento, sin agente de selección. A los 12 ó 13 días después del suministro del gen, las piezas de tejido objetivo se transfiere al medio de selección que contiene 40 miligramos/litro de fosfinotricina, ya sea como Basta o bialafos. El callo se subcultiva sobre selección durante 12 a 16 semanas, después de lo cual el callo sobreviviente y en crecimiento se transfiere a un medio de regeneración convencional que contiene 3 miligramos/litro de fosfinotricina como Basta, para la producción de plantas.

Ejemplo 6: Transformación de trigo Una técnica preferida para la transformación de trigo implica bombardeo de partículas de embriones de trigo inmaduros, e incluye un paso alto en sacarosa o bien alto en maltosa antes del suministro del gen. Antes del bombardeo, cualquier número de embriones (de 0.75 a 1 milímetro de longitud) se recubren sobre un medio MS con sacarosa al 3 por ciento (Murashige y Skoog, 1962), y 3 miligramos/litro de 2,4-D para la inducción de embriones somáticos, la cual se permite proceder en la oscuridad. En el día elegido del bombardeo, se remueven los embriones del medio de inducción, y se colocan sobre el osmótico (es decir, medio de inducción con sacarosa o maltosa agregada en la concentración deseada, normalmente al 15 por ciento) . Los embriones se dejan plasmolizar durante 2 a 3 horas, y luego se bombardean. Es típico 20 embriones por placa objetivo, aunque no es crítico. Se precipita un plásmido portador del gen apropiado sobre partículas de oro de un tamaño en mieras utilizando procedimientos convencionales. Cada placa de embriones se dispara con el dispositivo de helio DuPont Biolistics, utilizando una presión de ráfaga de aproximadamente 70 kg/cm2, y utilizando una malla 80 estándar. Después del bombardeo, los embriones se colocan de regreso en la oscuridad para recuperarse durante aproximadamente 24 horas (todavía sobre el osmótico) . Después de 24 horas, los embriones se remueven del osmótico, y se colocan de regreso sobre el medio de inducción, en donde se quedan durante aproximadamente 1 mes antes de la regeneración. Aproximadamente 1 mes después, los explantes de embrión con callo embriogénico en desarrollo, se transfieren al medio de regeneración (MS + 1 miligramo/litro de NAA, 5 miligramos /litro de GA) , conteniendo además el agente de selección apropiado. Después de aproximadamente 1 mes, los retoños desarrollados se transfieren a recipientes estériles más grandes conocidos como GA7s, que contiene MS a media concentración, sacarosa al 2 por ciento, y la misma concentración de agente de selección. La transformación estable del trigo se describe con detalle en la Solicitud de Patente Número EP 0, 674, 715. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Novartis AG <120> Gen especifico de antera de arroz <130> S-30723A <140> <141> <150> KR 98-46973 <151> 1998-11-03 <150> KR 98-50126 <151> 1998-11-19 <160> 10 <170> Patentln Ver. 2.2 <210> 1 <211> 3003 <212> AND <213> Oryza sativa <400> 1 cattcagaat catctccagc ctacaatgta ctctctccca aatacaagt gtctc atga 60 ttcaaaattt gtcctacaat ataaacattt ccagcatgaa atccatacat taattttcag 120 ctaatca?rat gcttggaggg aaaaatctaa gcgattcaat atgcaaaaat tgatcactga 180 agaact?raa agagaatatc tcgtttaac at agtgcta gtatttatta aacaactaaa 240 aaattgt ta tattttagta caaatcgagt agtagcagta gcagagctag cgtaagatcg 300 tgttccgatc acctgagaaa ccgtcaggtg gtttgtctgt gccgtccagc cgatcagaat 360 tcggagatcc gccgtcgttt ctttcctgaa atctgcaag cccagcagca gcagcagcag 420 agcaagacica atggcgtgca gggagtttga tactttgatg cactagctag cactaggcg 480 ttcgttccat gtcgctctca cgccgtgcga atgtgccatg atcctgcatg catcatcgcc 540 aagattatat tcctcacatt ttttcttcct atcgctccta gtcgtctgt tgggagctta 600 aaattatcraa aagcagctgc tgagaagcta gctggtgaga atctgaagaa tttgagttct 660 acgttcattc tccagattct acaattacag attcttataa tttaggtaaa aagctggact 720 gtttgggaigc ttctgtcagc cggagattct gtgagaagct gcagctgcta gaagcttccc 780 caaacagaicc cctagttgta ctctagctga tcgattcact ctattttaa tacaccttgc 840 tctctagctt atcaaacgta gccaagactt gaattttaaa gcttaaattg attttgatgt 900 tcttttcatc gaattcact taccgacctt agtcggcatt tgaattttta aaaataattt 960 ttagagctga ttttgatttt tttttcagcg gaatttattt tcacgtatgt aaaagtttta 1020 cctataaatt attaattttc agcggagtaa gcattagtgt tatgggttat aatcatctgg 1080 tatgcttaaa tctctttact tggacttagt tgggacaatt cgtaatgcat tctcgtgcca 1140 tctctataat acggcctgct agctttgctc ttgtatctgc acacaagaac tagctggcaa 1200 agtcctcaag gcgaaccgcc tccatcttct ccttccagct cctcccatgg cgtccctcgt 1260 cgccatcgcc atcgccatgg ctctcatggt gcagagatat ccagcatgct gaaattaact 1320 tgacgcatat catctcatca tcacttgcat ttcaacttct ggattgtgca gacatgttta 1380 gctgatcagt aaacgttgcc gtgttgaatt ggtccttatc aggtggttca acctggccgg 1440 cagatgactg cctttgctgc tcggacgtcg ccggcggcgg cggcggaggc gttctggcgc 1500 gccgccatgc ccggcgctcc catgccggac gccatcgtcg agctcctcca ccatggtgaa 1560 tccgtgaact taattgtgta cactacttta aatgatacta gtattagtga tggtcactac 1620 tagaaaacaa gtttttgcag gcagctagta aatatttcgc cggtaggcta aggcctgcga 1680 aagtcgttga tttttgcagg cggagctcta tccgcttgcg cagacggcat ccttgtatca 1740 cccacttgca aaaagttttt gggggcaaaa aagaaaaaga ttaaaaaaaa agcaatttcc 1800 actacatgca aagcatccta ttcaaatcaa atcagattca ttcaacaaga aacacatcga 1860 acagcagcta caatcagatg cactagaata aacactataa gctgacatgt aagatcctca 1920 catatatgaa tgcttttgct gttatatatc tatttttttt aacgacggtt atatatctaa 1980 ttaactaact atactataaa cttatctttt gttttttgct tttatctttt ataatatccg 2040 ttgcaacgca cgaatcttta gctactgatc ataaaatgaa cagaaataag agattatgtt 2100 tttatacgtg gagcctctct tacatgcgta gctgcatgcg tgcatgcaga gcacggcgtt 2160 gctagcgccg gcggcaaggc caacggcggc ggcgacggtc caccgccgcc gatgaacttc 2220 aactacgacg actacagggc cctgcctcgg agcgacgccc cttccccgga tgcattgaac 2280 cgcgtcgccg ccgtacagaa cgccgacgag aacggcgtgt cctcgccgcc gccgccgccg 2340 ccgacggtgt tcttcctcga ggacgccgtg cgcgtcggcg agagcctgcc cctaccgcga 2400 ccggcggccg acgcaaccgc cgccggcgca gcggcggcca cggcgttgcc gccgctgcgg 2460 ctgtacaccg tccggtcggt gagggcaatc gaggggtcca gcttcgtcgt gtgccgcggc 2520 gagaccacgg cgggcgccgg cgtgtacggg tgccgccatg ccgccaccgg cccggcgagg 2580 gcgtacgcgg tggacgcggc cggcggcggc ggcggggacg cggtgatcgc cgccgtcgtg 2640 tgccacgccg acacgtcccg ctgggacccg gaccacgccg cgttccggct gctcggcgtc 2700 aggcccggcg gcgccgccgt ctgccgcgcc gtcgccgacg cgcacatcct cccgacgaac 2760 aaggattgag tacttctcgc catgatcgag gactcctcga tcgattagtg ctcgatcgat 2820 cttaatctta ttgccatgca taattagtgt gttaattacg tgcttaattg tatgtgtgaa 2880 gtgtgcatta gtcacagttt gtaatgtaat aatgtttcgc ttgttcgact gtatgatctc 2940 gatttgggt?j atatatacgt tgataaaata aaggaaaaag tttgtgttgg ttcatatgca 3000 cga 3003 <210> 2 <211> 1436 <212> AND <213> Oryza sativa <400> 2 cattcagaat catctccagc ctacaatgta ctctctccca taatacaagt gtctctatga 60 ttcaaaattt gtcctacaat ataaacattt ccagcatgaa atccatacat 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ttagagctga ttttgatttt tttttcagcg gaatttattt tcacgtatgt aaaagtttta 1020 cctataaatt attaattttc agcggagtaa gcattagtgt tatgggttat aatcatctgg 1080 tatgcttaaa tctctttact tggacttagt tgggacaatt cgtaatgcat tctcgtgcca 1140 tctctataat. acggcctgct agctttgctc ttgtatctgc acacaagaac tagctggcaa 1200 agtcctcaa?r gcgaaccgcc tccatcttct ccttccagct cctcccatgg cgtccctcgt 1260 cgccatcgcc atcgccatgg ctctcatggt gcagagatat ccagcatgct gaaattaact 1320 tgacgcata catctcatca tcacttgcat ttcaacttct ggattgtgca gacatgttta 1380 gctgatcagt aaacgttgcc gtgttgaatt ggtccttatc aggtggttca acctgg 1436 <210> 3 <211> 1196 <212> AND <213> Oryza sativa <400> 3 cattcagaat catctccagc ctacaatgta ctctctccca taatacaagt gtctctatga 60 ttcaaaattt: gtcctacaat ataaacattt ccagcatgaa atccatacat taattttcag 120 ctaatcagat gcttggaggg aaaaatctaa gcgattcaat atgcaaaaat tgatcactga 180 agtaactgaa agagaatatc tcgttttaac attagtgcta gtatttatta aacaactaaa 240 aaattgttta tattttagta caaatcgagt agtagcagta gcagagctag cgtaagatcg 300 tgttccgatc acctgagaaa 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Ala Ala Thr Gly Pro Ala Arg Ala Tyr Ala Val Asp Ala 195 200 205 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Asp Ala Val He Ala Ala Val Val Cys His 210 215 220 <210> 5 <211> Ala Asp Thr Ser Arg Trp Asp Pro Asp His Ala Ala Phe Arg Leu Leu 225 230 235 240 <212> ADN Gly Val Arg Pro Gly Gly Ala Ala Val Cys Arg Ala Val Ala Asp Ala 245 250 255 His He Leu Pro Thr Asn Lys Asp 260 <210> 5 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 5 ttggcatgca catac 15 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 6 cgggatccgt. gtttgacagg 20 <210> 7 <211> 1008 <212> ADN <213> Oryza sativa <400> 7 gcaaagtcct caaggcgaac cgcctccatc ttctccttcc agctcctccc atggcgtccc 60 tcgtcgccat cgccatcgcc atggctctca tggtggttca acctggccgg cagatgactg 120 cctttgctgc tcggacgtcg ccggcggcgg cggcggaggc gttctggcgc gccgccatgc 180 ccggcgctcc catgccggac gccatcgtcg agctcctcca ccatgagcac ggcgttgcta 240 gcgccggcgg caaggccaac ggcggcggcg acggtccacc gccgccgatg aacttcaact 300 acgacgacta cagggccctg cctcggagcg acgccccttc cccggatgca ttgaaccgcg 360 tcgccgccgt acagaacgcc gacgagaacg gcgtgtcctc gccgccgccg ccgccgccga 420 cggtgttctt cctcgaggac gccgtgcgcg tcggcgagag cctgccccta ccgcgaccgg 480 cggccgacgc aaccgccgcc ggcgcagcgg cggccacggc gttgccgccg ctgcggctgt 540 acaccgtccg gtcggtgagg gceiatcgagg ggtccagctt cgtcgtgtgc cgcggcgaga 600 ccacggcggg cgccggcgtg tacgggtgcc gccatgccgc caccggcccg gcgagggcgt 660 acgcggtgga cgcggccggc ggcggcggcg gggacgcggt gatcgccgcc gtcgtgtgcc 720 acgccgacac gtcccgctgg gacccggacc acgccgcgtt ccggctgctc ggcgtcaggc 780 ccggcggcgc cgccgtctgc cgcgccgtcg ccgacgcgca catcctcccg acgaacaagg 840 attgagtact tctcgccatg atcgaggact cctcgatcga ttagtgctcg atcgatctta 900 atcttattgc catgcataat tagtgtgtta attacgtgct taattgtatg tgtgaagtgt 960 gcattagtca cagtttgtaa tgtaataatg tttcgcttgt tcgactgt 1008 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucl eótido <400> 8 aattaaccct cactaaagqg 20 <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucl eótido <400> 9 gcggatccag ?rttgaaccac 20 <210> <211> 240 <212> ADN <213> Oryza sativa <400> 10 gcaaagtcct caaggcgaac cgcctccatc ttctccttcc agctcctccc atggcgtccc 60 tcgtcgccat cgccatcgcc atggctctca tggtgcagag atatccagca tgctgaaatt 120 aacttgacgc atatcatctc atcatcactt gcatttcaac ttctggattg tgcagacatg 180 tttagctgat cagtaaacgt tgccgtgttg aattggtcct tatcaggtgg ttcaacctgg 240

Claims (26)

1. 52 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: L. ADN, caracterizado porque comprende una secuencia promotora y la secuencia de codificación asociada, en donde la secuencia promotora impulsa la expresión de la secuencia de codificación específicamente en el tapeto, endotecio, y tejidos conectivos de las anteras pero no en las microesporas o el polen, y en donde la expresión de la secuencia de codificación empieza en la etapa tetrad, y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolado.
2. 2. El ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia comprende una secuencia de nucleótidos que tiene el 50 por ciento o más de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en las SEQ ID NO. 1.
3. 3. El ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. 53
4. 4. El ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia de codificación está en una orientación anti-sentido .
5. 5. El ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia de codificación codifica un polipéptido que alterará la formación de polen viable cuando se exprese en las células de la antera.
6. 6. El ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de codificación codifica un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en ARNsa, DTA, TURF-13, liasa de pectato, recombinasa de jengibre, iaaL y toxina cytA.
7. 7. Una -secuencia de ADN, caracterizada porque tiene más del 80 por ciento de identidad de secuencia en las 30 bases consecutivas de cualesquiera sitios de la SEQ ID NO: 1.
8. 8. ADN, caracterizado porque comprende una secuencia promotora capaz de impulsar la expresión de una secuencia de codificación asociada específicamente 54 en el tapeto, endotecio, y tejidos conectivos de las anteras, pero no en las microesporas o el polen, en donde la expresión de la secuencia de codificación empieza en la etapa tetrad, y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolado.
9. 9. El ADN de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia promotora tiene el 50 por ciento o más de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.
10. 10. El ADN de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia promotora tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.
11. 11. El ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la secuencia promotora comprende una secuencia adicional que se puede enlazar operativamente con una secuencia de codificación de interés.
12. 12. El ADN de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la secuencia adicional comprende una secuencia que tiene el 50 por 55 ciento o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10.
13. 13. El ADN de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la secuencia adicional comprende la SEQ ID NO: 10.
14. 14. El ADN de conformidad con las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque la secuencia promotora y la secuencia adicional tiene el 50 por ciento o más de identidad de secuencia con las secuencias respectivas de la SEQ ID NO: 2.
15. 15. El ADN de conformidad con las reivindicaciones 9 a 13, en donde la secuencia promotora y la secuencia adicional se caracterizan por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.
16. 16. El ADN de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el promotor comprende un fragmento que se puede obtener a partir de la SEQ ID NO: 2.
17. 17. ADN que comprende un marco de lectura abierta que codifica una proteína, caracterizado por 56 una secuencia de aminoácidos que tiene el 50 por ciento o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4.
18. 18. El ADN de conformidad con la reivindicación 17, en donde el marco de lectura abierta codifica una proteína, caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
19. 19. El ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado por la SEQ ID NO: 7.
20. 20. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un primer cásete de expresión que comprende un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la expresión en un organismo, tal como un microorganismo o una planta, y opcionalmente, un segundo cásete de expresión que comprende un gen de interés.
21. 21. La proteína codificada por el marco de la lectura abierta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19. 57
22. 22. Una planta transgénica y la progenie sexual y/o asexual de la misma, caracterizada porque se ha transformado con una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
23. 23. Una planta transgénica con esterilidad masculina, caracterizada porque se ha transformado con una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
24. 24. Una planta transgénica de conformidad con las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizada porque la planta es arroz, trigo, maíz, Sorgh um bi col or, o pasto de huerto.
25. 25. Un proceso para la producción de una planta transgénica, caracterizado porque comprende un ADN que comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación asociada, en donde la secuencia promotora impulsa la expresión de la secuencia de codificación específicamente en el tapeto, endotecio, y tejidos conectivos de las anteras, pero no en las microesporas o el polen, y en donde la expresión de la secuencia de codificación 58 empieza en la etapa tetrad, y alcanza un nivel máximo en la etapa de polen vacuolado.
26. 26. Un proceso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la planta es arroz, trigo, maíz, Sorgh um bi col or, o pasto de huerto .