JPH11262390A - 植物の形態を変化させる転写因子の遺伝子およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】植物の形質を変化させ得る転写因子をコードす
る遺伝子、当該遺伝子の導入により植物の形質が変化し
た植物を作出する方法、および当該方法により作出され
た植物を提供する。 【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のDNAを含む遺
伝子： （ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第９０位
から第７２８位までの塩基配列を有するDNA；または
（ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードするDNA。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードする遺伝子およびその利用に
関する。本発明は、特に、ペチュニア由来の新規遺伝子
であるPetSPL3遺伝子、およびその関連遺伝子、ならび
にそれらの利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物の形質、例えば、花の形態形成の制
御機構を解明するため、シロイヌナズナ(Arabidopsis t
haliana)、キンギョソウ(Antirrhinum majus)、および
ペチュニア(Petunia hybrida)などを用いて、分子生物
学的および分子遺伝学的に研究が行われている。特に、
ペチュニアは、研究材料として好んで使用されている。
その理由として、ペチュニアは、園芸植物として価値が
高く多種多様な品種が存在すること、形質転換し易いこ
と、花が大きくて見やすいこと、および遺伝学的な知見
の蓄積が豊富であることが挙げられる（高辻博志、「植
物の形を決める分子機構」、細胞工学、植物細胞工学シ
リーズ（秀潤社）、96〜106頁）。

【０００３】上記の植物の花の器官が変化した突然変異
体から、その変異の原因となる遺伝子が単離されてい
る。その結果、花の分化および形態形成の制御には、転
写因子が重要な役割を果たしていることが明らかになっ
てきた。例えば、シロイヌナズナのSUPERMANは、DNA結
合ドメインとしてジンクフィンガーモチーフを有する転
写因子である。その遺伝子に変異が生じているSUPERMAN
変異体では、雄しべの数が著しく増加し、雌しべが退化
することが知られている(遺伝、1997年４月号(51巻４
号）、34〜38頁)。

【０００４】植物の形質の制御に関与する新規な転写因
子を同定することは、その制御の機構を理解するために
重要である。遺伝子工学的手法を用いれば、花の形態形
成などを制御する転写因子の遺伝子を植物に導入するこ
とができる。遺伝子導入により、従来の交配による手法
では得られないか、または得ることが困難である新規な
形質を花を有する植物に付与できる可能性がある。この
ような新規な形質を有する植物は、園芸上の価値が高い
と考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題の
解決を意図するものである。本発明の目的は、植物の形
質を変化させ得る転写因子をコードする遺伝子を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、遺伝子の導入によ
り植物の形質が変化した植物を作出する方法を提供する
ことにある。本発明のさらなる目的は、植物の形質が変
化した植物を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の（ａ）
または（ｂ）のDNAを含む遺伝子に関する： （ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第９０位
から第７２８位までの塩基配列を有するDNA；または
（ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードするDNA。

【０００７】本発明はまた、以下の（i）または（ii）
の転写因子をコードする遺伝子に関する： （i）配列番号２によって示されるアミノ酸配列の第１
位から第２１３位までのアミノ酸配列を含む転写因子；
または（ii）アミノ酸配列（i）において、１またはそ
れ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を有し、かつ植物の形質を変化させ得る転写因
子。

【０００８】１つの実施態様においては、上記の植物の
形質は、花の形態、花の着色、植物の大きさ、および枝
数からなる群より選択される。

【０００９】本発明はさらに、上記の遺伝子のいずれか
を植物細胞に導入する工程、およびこの遺伝子が導入さ
れた植物細胞を植物体に再生する工程を含む、植物の形
質が変化した植物を作出する方法に関する。

【００１０】１つの実施態様においては、上記の植物は
双子葉植物である。好ましくは、双子葉植物はナス科植
物であり、より好ましくは、ペチュニア属植物である。

【００１１】１つの実施態様においては、上記の遺伝子
は植物発現ベクターに組み込まれている。

【００１２】本発明はさらに、上記の方法のいずれか１
つに記載の方法により作出された、植物の形質が変化し
た植物に関する。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳しく説明する。

【００１４】「転写因子」は、遺伝子の調節領域のDNA
に結合してmRNAの合成を制御するタンパク質をいう。あ
る種の転写因子は、そのDNA結合ドメインにジンクフィ
ンガーモチーフと呼ばれる保存性の高いアミノ酸配列を
有することが知られている。

【００１５】本発明の遺伝子は、植物の形質を変化させ
得る転写因子をコードする遺伝子である。この遺伝子
は、以下のDNAのいずれかを含み得る： （ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第９０位
から第７２８位までの塩基配列を有するDNA；および
（ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードするDNA。

【００１６】好ましくは、本発明の遺伝子は（ａ）のDN
Aを含み得る。

【００１７】本発明の遺伝子はまた、以下の転写因子の
いずれかをコードし得る： （i）配列番号２によって示されるアミノ酸配列の第１
位から第２１３位までのアミノ酸配列を含む転写因子；
および（ii）アミノ酸配列（i）において、１またはそ
れ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を有し、かつ植物の形質を変化させ得る転写因
子。

【００１８】好ましくは、本発明の遺伝子は（i）の転
写因子をコードし得る。

【００１９】本発明において特に好ましい遺伝子は、Pe
tSPL3遺伝子である。この遺伝子のcDNA配列（配列番号
１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を図１に示
す。

【００２０】「植物の形質」の変化とは、植物の形態お
よび着色の少なくとも１つについての任意の変化をい
う。具体的には、花の形態、花の着色、および植物の大
きさ、および枝数の少なくとも一つについての任意の変
化をいう。この変化は、本発明の遺伝子を導入して得ら
れた植物の形質を、遺伝子導入前の植物（野生種または
園芸品種）の形質と比較することにより評価される。

【００２１】花の形態および/または花の着色の変化
は、植物の形質の好ましい変化の例である。以下におい
て、「花」とは、特に指示されない限り花弁のことをい
う。

【００２２】変化した花の形態としては、個々の花弁の
形状の変化によって生じ得る形態（大輪、小輪、鋸歯状
咲、丸弁、波状咲など）、花弁の数の変化によって生じ
得る形態（八重咲、一重咲など）、および花弁の展開異
常によって生じ得る形態（星型など）が挙げられるが、
これらに限定されない。

【００２３】変化した花の着色としては、白、緋赤、サ
ーモン、ローズ、ピンク、青紫、紫、薄紫、空色、紫
紅、および黄白色などの単色、ならびに２色またはそれ
以上の多色模様（例えば、絞り咲、斑紋、覆輪、および
花弁の外縁の着色）が挙げられるが、これらに限定され
ない。

【００２４】変化した植物の大きさとしては、矮性およ
び半矮性などが挙げられるが、これらに限定されない。
矮性は、好ましくは、遺伝子導入前の植物の標準的な大
きさの約1/2以下、より好ましくは約1/3以下の大きさを
いう。変化した枝数としては、分枝が挙げられるが、こ
れに限定されない。

【００２５】好ましくは、変化した植物の形質は、花弁
の展開異常による形態、二色模様、矮性、または分枝で
あり、より好ましくはその組合せ（例えば、花弁の展開
異常による形態と二色模様との組合せ、および/または
矮性と分枝との組合せ）である。さらに好ましくは、星
型の形態、花弁の外縁の着色、矮性、または分枝であ
り、さらにより好ましくは、その組合せ（例えば、星型
の形態と花弁の外縁の着色との組合せおよび/または矮
性と分枝との組合せ）である。

【００２６】本発明の遺伝子は、例えば、公知の転写因
子の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の保存領域
に対応するデジェネレートプライマー対を用いて、植物
のゲノミックDNAを鋳型としてPCRを行い、その後、得ら
れた増幅DNA断片をプローブとして用いて同じ植物のゲ
ノミックライブラリーをスクリーニングすることにより
単離され得る。そのようなプライマー対の例として、5'
-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3'（配列番号３）または5'-YTNGG
NGGNCAYATGAAY-3'（配列番号４）と5'-ARNCKNARYTCNARR
TC-3'（配列番号５）との組合せが挙げられる。ここ
で、Nはイノシンであり、RはGまたはAであり、YはCまた
はTであり、そしてKはTまたはGである。

【００２７】PCRは、市販のキットおよび装置の製造者
の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い得
る。遺伝子ライブラリーの作製法、プローブとのハイブ
リダイゼーションに使用するストリンジェントな条件、
および遺伝子のクローニング法も当業者に周知である。
例えば、マニアティスらのMolecular Cloning, A Labor
atory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laborator
y Press, Cold SpringHarbor, New York（1989）を参照
のこと。

【００２８】得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で
公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自
動シーケンサーにより決定し得る。

【００２９】本発明の遺伝子は、天然から単離されたも
のに限定されず、合成ポリヌクレオチドも含み得る。合
成ポリヌクレオチドは、例えば、上記のようにして配列
決定された遺伝子を、当業者に周知の手法によって改変
することにより入手し得る。

【００３０】本発明の遺伝子は、当業者に周知の方法を
用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺
伝子組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入
された遺伝子は、植物細胞中のDNAに組み込まれて存在
する。なお、植物細胞中のDNAとは、染色体のみなら
ず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミ
トコンドリア、葉緑体など）に含まれるDNAを含む。

【００３１】「植物」は、単子葉植物および双子葉植物
のいずれも含む。好ましい植物は、双子葉植物である。
双子葉植物は、離弁花亜綱および合弁花亜綱のいずれも
含む。好ましい亜綱は、合弁花亜綱である。合弁花亜綱
は、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバ
コ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツム
シソウ目、およびキク目のいずれも含む。好ましい目
は、ナス目である。ナス目は、ナス科、ハゼリソウ科、
ハナシノブ科、ネナシカズラ科、およびヒルガオ科のい
ずれも含む。好ましい科は、ナス科である。ナス科は、
ペチュニア属、チョウセンアサガオ属、タバコ属、ナス
属、トマト属、トウガラシ属、ホオズキ属、およびクコ
属などを含む。好ましい属は、ペチュニア属、チョウセ
ンアサガオ属、およびタバコ属であり、より好ましく
は、ペチュニア属である。ペチュニア属は、P.hybrida
種、P.axillaris種、P.inflata種、およびP.violacea種
などを含む。好ましい種は、P.hybrida種である。「植
物」は、特に他で示さない限り、花を有する植物体およ
び植物体から得られる種子を意味する。「植物細胞」の
例としては、葉および根などの植物器官の細胞、カルス
ならびに懸濁培養細胞が挙げられる。

【００３２】「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子
の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメ
ントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されて
いる核酸配列をいう。好適には、植物遺伝子プロモータ
ー、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、およびエンハン
サーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用され
る調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得
ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる
植物発現ベクターは、さらにT-DNA領域を有し得る。T-D
NA領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質
転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。

【００３３】「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発
現するプロモーターを意味する。構成的プロモーター、
および花を含む植物体の一部において選択的に発現する
プロモーターが好ましい。プロモーターの例としては、
カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモータ
ー、およびノパリン合成酵素のプロモーターが挙げられ
るが、これらに限定されない。

【００３４】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、DNAがmRNAに転写
される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与
する配列である。ターミネーターは、mRNAの安定性に寄
与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知ら
れている。ターミネーターの例としては、CaMV35Sター
ミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネ
ーター（Tnos）が挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００３５】「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選
抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシ
ン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼII（NPTII)遺伝子、およびハイグロマイシ
ン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォト
ランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、
これらに限定されない。

【００３６】「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効
率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとして
は、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエン
ハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植
物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。

【００３７】本発明における植物発現ベクターは、当業
者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植
物発現ベクターの構築には、例えば、pBI系のベクター
またはpUC系のベクターが好適に用いられるが、これら
に限定されない。

【００３８】植物細胞への植物発現ベクターの導入に
は、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウム
を介する方法、および直接細胞に導入する方法が用いら
れ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例
えば、Nagelらの方法(Microbiol. Lett., 67, 325(199
0))が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベク
ターで（例えば、エレクトロポレーションによって）ア
グロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換され
たアグロバクテリウムをリーフディスク法等の周知の方
法により植物細胞に導入する方法である。植物発現ベク
ターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポ
レーション法、パーティクルガン、リン酸カルシウム
法、およびポリエチレングリコール法などがある。これ
らの方法は、当該分野において周知であり、形質転換す
る植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得
る。

【００３９】植物発現ベクターを導入された細胞は、例
えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選
択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生
され得る。

【００４０】再生した植物体においては、当業者に周知
の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確
認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析
を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全RNAを
抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメン
ブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の
一部分と相補的な標識したRNAプローブをハイブリダイ
ズさせることにより、本発明の遺伝子のmRNAを検出し得
る。

【００４１】本発明の植物は、上記の手法によって作出
された、植物の形質が変化した形質転換植物である。変
化した植物の形質（すなわち、花の形態、花の着色、植
物の大きさ、および/または枝数）は、公知の野生種ま
たは園芸品種には存在しない形質であることが好まし
い。また、変化した植物の形質は、園芸上価値の高い形
質であることが好ましい。さらに、変化した花の形質
は、得られた植物の子孫にわたって、安定に保持される
ことが好ましい。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説
明する。この実施例で使用した制限酵素、プラスミドな
どは、商業的な供給源から入手可能である。

【００４３】（実施例１：PetSPL3遺伝子の単離）シロ
イヌナズナのSUPERMAN遺伝子にコードされるタンパク質
と、大豆の根粒に特異的に発現するGmN479遺伝子（河内
ら、私信）にコードされるタンパク質とを比較した。両
タンパク質に共通に存在するアミノ酸配列に基づいてPC
Rに用いるデジェネレート・プライマーを３種類作成し
た。遺伝子の５’側から３’側に向かう二つのプライマ
ーの塩基配列は、それぞれ5'-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3'
（プライマー１、アミノ酸配列QALGGHに対応する；配列
番号３）および5'-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3'（プライマー
２、アミノ酸配列LGGHMNに対応する；配列番号４）であ
り、３’側から５’側に向かうプライマーの塩基配列は
5'-ARNCKNARYTCNARRTC-3'（プライマー３、アミノ酸配
列DLELRLに対応する；配列番号５）である。ここで、N
はイノシンであり、YはCまたはTであり、RはGまたはAで
あり、そしてKはTまたはGである。

【００４４】Boutry,M. and Chua N.H.(1985) EMBO J.
4,2159-2165に記載の方法に従って抽出したペチュニア
（Petunia hybrida var.Mitchell）のゲノミックDNAを
鋳型とし、プライマー１およびプライマー３を用いて、
94℃／10分の後、94℃／30秒、50℃／30秒、72℃／60秒
を30サイクルした後、72℃／７分の条件で第一のPCRを
行った。さらに第一のPCR産物の一部を鋳型にし、プラ
イマー２およびプライマー３を用いて第２のPCRを行っ
た（反応条件は第一のPCRと同じ）。増幅されたDNA断片
をTAクローニングベクター（Invitrogen製）に挿入し、
常法に従って大腸菌に導入した。形質転換された大腸菌
からプラスミドを抽出し、DNA塩基配列を決定した。そ
の結果、得られたDNA断片においては、SUPERMANおよびG
mN479に共通に含まれるジンクフィンガーモチーフの一
部がコードされていることがわかった。このDNA断片が
由来した遺伝子を、PetSPL3遺伝子と名付けた。なお、
この実験において、PetSPL3と類似の塩基配列を含む３
つの他のDNA（PetSPL1、2および4遺伝子）の存在が示さ
れた。

【００４５】上記のPCR増幅されたDNA断片を含むプラス
ミドから、制限酵素EcoRIを用いてEcoRI-EcoRI断片を切
り出した。このDNA断片を、通常のランダムプライム法
（Sambrookら(1989)「Molecular Cloning:A Laboratory
Manual」(Cold Spring Harbor Laboratory刊))を用い
て[α-32P]dCTPで標識して、放射性標識プローブを作製
した。この標識プローブを用いて、EMBL3ベクター（Str
atagene製）中に作製されたペチュニア（Petunia hybri
da var.Mitchell）のゲノミックライブラリーをスクリ
ーニングした。得られたクローンに含まれる約3.2kbの
ゲノムDNA断片を、pBluescriptベクターのXbaIサイトに
サブクローニングした（pBS/PetSPL3）。このようにし
て、ペチュニア由来のPetSPL3遺伝子を単離した。

【００４６】（実施例２：PetSPL3遺伝子の塩基配列お
よびアミノ酸配列の解析）実施例１で得られたpBS/PetS
PL3ベクター中の、PetSPL3遺伝子のタンパク質コード領
域が含まれる領域（HindIIIおよびXbaIサイトの問）
を、さらにpBluescriptベクターにサブクローニングし
（pBS/PetSPL3-HX）、DNA塩基配列を決定した（配列番
号１）。得られたDNA塩基配列に含まれるオープンリー
ディングフレームから、タンパク質アミノ酸配列を推定
した（配列番号２）。

【００４７】塩基配列の解析により、PetSPL3遺伝子
の、SUPERMAN遺伝子、PetSPL1遺伝子、PetSPL2、および
PetSPL4遺伝子に対する塩基配列相同性は、それぞれ、2
9％、37％、25％および23％であることが示された。な
お、塩基配列の解析は、各遺伝子のコード領域のみで行
った。

【００４８】アミノ酸配列解析の結果、PetSPL3はSUPER
MANと類似のTFIIIAタイプのジンクフィンガーモチーフ
を１個含んでいた。このことから、PetSPL3は転写因子
であることが推定された。同時にクローニングされたPe
tSPL1およびPetSPL2は、SUPERMANに対して全アミノ酸配
列レベルで35％程度の相同性を示した。これに対して、
PetSPL3は、SUPERMANに対して全アミノ酸配列レベルで
約20％の相同性であった。

【００４９】また、ジンクフィンガーモチーフにおけ
る、PetSPL3のSUPERMANに対するアミノ酸配列相同性
（約20％）は、PetSPL1およびPetSPL2のSUPERMANに対す
る対応する相同性（それぞれ、約38％および約35％）と
比較して低いことが示された。表１は、SUPERMANおよび
各PetSPLのジンクフインガーモチーフにおけるアミノ酸
配列を比較する。表１はまた、SUPERMANおよび各PetSPL
のＣ末端疎水性領域の比較を示す。

【００５０】

【表１】

【００５１】上記の結果から、PetSPL3はSUPERMAN、Pet
SPL1およびPetSPL2とは別のクラスに属する、新規な転
写因子であると推定される。このことは発現パターンの
違いからも示された。以下の実施例８および９を参照。

【００５２】（実施例３：PetSPL3遺伝子をコードする
ポリヌクレオチドを含む植物発現ベクターの構築）プラ
スミドpBI221（Clontechから購入）中のCaMV 35Sプロモ
ーターを含むDNA断片（HindIII-XbaI断片）およびNOSタ
ーミネーターを含むDNA断片（SacI-EcoRI断片）を順次
プラスミドpUCAP（van Engelen,F.A.ら、Transgenic Re
s.4:288-290(1995）)のマルチクローニングサイトに挿
入し、pUCAP35Sを作製した。一方、PetSPL3を含むpBS/P
etSPL3-HXプラスミドをHindIIIサイト（０位）およびAc
cIサイト（258位）で切断し、両末端をKlenow酵素を用
いて平滑化したのち再び結合させることによって、翻訳
開始点上流の258bpのDNA領域を除いた。得られたプラス
ミドからPetSPL3をコードするDNA断片（KpnI-SacI断
片）を切り出して、上記プラスミドpUCAP35SのKpnIおよ
びSacIサイトの間に挿入した。さらにこの組換えプラス
ミドをAscIおよびPacIで切断し、PetSPL3をコードするD
NA断片を、バイナリーベクターpBINPLUS（van Engelen,
F.A.ら、(1995）,前出)のAscIおよびPacIサイトに導入
した。

【００５３】構築されたPetSPL3遺伝子高発現ベクター
(pBIN-35S-PetSPL3)は、図２ａに示されるように、CaMV
35Sプロモーター領域(P35S；0.9kb）、本発明のPetSPL
3をコードするポリヌクレオチド（PetSPL3；0.8kb）、
およびノパリン合成酵素のターミネーター領域（Tnos；
0.3kb）を含んで構成されている。図２のPnosは、ノパ
リン合成酵素のプロモーター領域、NPTIIはネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼII遺伝子を示す。LBおよび
RBは、それぞれT-DNA left borderおよびT-DNAright bo
rderを示す。

【００５４】（実施例４：PetSPL3遺伝子のペチュニア
細胞への導入） （１）（アグロバクテリウム・チュメファシエンスの形
質転換） アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4404株（C
lontechから購入）を250μg/mlのストレプトマイシンと
50μg/mlのリファンピシンを含むＬ培地中、28℃で培養
した。Nagelら（1990）（前出）の方法に従って、この
菌株の細胞懸濁液を調製した。実施例３で構築したPetS
PL3遺伝子高発現ベクターを、エレクトロポレーション
により、上記菌株に導入した。

【００５５】（２）（PetSPL3をコードするポリヌクレ
オチドのペチュニア細胞への導入） 上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チュメファ
シエンスLBA4404株を、YEB培地（D.M.Glover編、DNA Cl
oning,IPL PRESS,第２巻、78頁)で振とう培養（28℃，2
00rpm）した後、滅菌水で20倍に希釈した。この希釈液
中で、ペチュニア（Petunia hybrida var.Mitchell）の
葉片を培養した。２〜３日後、カルベニシリンを含む培
地で上記細菌を除去し、その後、この葉片を２週間ごと
に選択培地で継代培養した。上記PetSPL3遺伝子と共に
導入されたpBINPLUS由未のNPTII遺伝子発現によるカナ
マイシン抵抗性を指標として、形質転換されたペチュニ
ア細胞を選抜した。常法により、形質転換細胞からカル
スを誘導した後、植物体に再分化した。

【００５６】（実施例５：PetSPL3形質転換植物におけ
るPetSPL3遺伝子の発現）実施例４で得られたPetSPL3形
質転換ペチュニア14個体の葉から、全RNAを抽出した。
抽出物10μgずつを変性アガロース電気泳動によって展
開し、常法にしたがってGenescreen plusフィルター（D
upont製）にブロッティングした。DIG RNAラベリングキ
ット(Boeringer Mannheim製）を用いて標識したPetSPL3
アンチセンスRNAを用い、キットの指示に従ってハイブ
リダイゼーションおよびフィルターの洗浄を行った。洗
浄後、フィルターをXARフィルム（Kodak製）に常温で１
時間露光した。図３は、14個体のうちの９個体のPetSPL
3遺伝子mRNAを検出した変性アガロースゲル電気泳動像
のフルオログラムを示す。これらの結果より、独立の形
質転換ペチュニア14個体のうち、３個体が高発現プロモ
ーターによる制御によってPetSPL3mRNAを高レベルに発
現していることが示された。

【００５７】（実施例６：PetSPL3遺伝子を高レベルに
発現する形質転換ペチュニアの表現型）PetSPL3遺伝子
を高レベルに発現する３個体の独立の形質転換ペチュニ
アにおいて、以下のような共通した表現型が観察され
た。植物体に見られる変化としては、第一に、頂芽優勢
が低下した結果、植物が矮化すると共に著しい分枝が起
こる(図４、左は野生型ペチュニア、右はPetSPL3形質転
換ペチュニアを示す）。葉は小さくなり、アントシアニ
ン色素の蓄積と思われる紫色の着色が随所に見られる
（図５、上段は野生型ペチュニアの葉、下段はPetSPL3
形質転換ペチュニアの葉を示す）。花に関しては、野生
型の花は上から見ると円形に近い形であるのに対して、
PetSPL3形質転換体では星型に見える（図６、（ａ）は
野生型ペチュニアの花、（ｂ）および（ｃ）はPetSPL3
形質転換ペチュニアの花を示す）。これは花弁の展開異
常の結果と推測される。本実験に用いたペチュニアの品
種であるMitchellは花弁が白色である。これは、花弁の
着色を制御する調節遺伝子an2などの突然変異の結果と
される（Quattrocchio,F.,アムステルダム自由大学博士
論文(1994)）。これに対して、PetSPL3の形質転換体で
は、花弁の外縁のみに薄い紫色の着色を呈した（図６
（ｃ））。

【００５８】上記の結果から、PetSPL3形質転換ペチュ
ニアの花の形態および/または着色パターンは、野生種
および園芸品種のペチュニアには全く存在しないかまた
は極めて珍しいものであることが見出された。遺伝子工
学的手法によって植物の花にこのような形質が付与され
た例は、本発明者らの知る限り存在しない。また、PetS
PL3形質転換ペチュニアは、矮性および分枝性であり、
これらの形質は園芸上利用価値が高い。

【００５９】（実施例７：PetSPL3遺伝子の５’上流領
域のポリヌクレオチドをGUSレポーター遺伝子の上流に
含む植物発現ベクターの構築）実施例７および８におい
ては、PetSPL3遺伝子のプロモーターおよび遺伝子の発
現パターンを解析し、SUPERMAN遺伝子および他のPetSPL
遺伝子との比較を行った。

【００６０】PetSPL3遺伝子の翻訳開始点から約70bp上
流に存在する配列およびBamHI認識配列を含むプライマ
ー（ACTGGATCCCATTAGAGAGAGAGAG；配列異番号６）、お
よびベクター中の配列に対応するM13 reverseプライマ
ー（GGAAACAGCTATGACCATG；配列番号７）を用い、上記
のプラスミドpBS/PetSPL3を鋳型としてPCRを行い、PetS
PL3遺伝子のプロモーター領域を含むと考えられる約2.4
kbのDNA断片を増幅した。このDNA断片を、その両末端近
傍に存在するXbaIおよびBamHIサイトで切断した。pUCAP
（van Engelen,F.A.ら、(1995）,前出)のXbaIおよびEco
RIサイトの間に、pBI221（Clontech杜から購入）から切
り出した、GUSコード領域およびノパリン合成酵素のタ
ーミネーターを含むXbaI-EcoRI断片を挿入して、pUCAPG
USプラスミドを得た。上記で得られたXbaI-BamHI断片
を、そのpUCAPGUSプラスミド中のβ-グルクロニダーゼ
（GUS）遺伝子コード領域の上流（XbaIおよびBamHIサイ
ト）に挿入した。このプラスミドから、PetSPL3遺伝子
の５’上流領域、GUSコード領域、およびノパリン合成
酵素のターミネーター領域を含むDNA断片をAscIおよびP
acIで切り出し、実施例３において使用したpBINPLUSのA
scIおよびPacIサイトに挿入した。このようにして構築
された、プロモーター解析用プラスミド(pBIN-PetSPL3-
GUS)の構成を図２ｂに示す。

【００６１】（実施例８：PetSPL3遺伝子の茎での発現
パターン）上記PetSPL3遺伝子の５’上流領域のポリヌ
クレオチドをGUSレポーター遺伝子の上流に含む組換え
プラスミドを、実施例３と同様にペチュニア（Petunia
hybrida ver.Mitchell）に導入した。得られた形質転換
体の若い茎を用いて、常法に従って（村上、大橋、植物
細胞工学、14,281-286,(1992）)、X-GUSを基質にしてGU
S活性の分布を調べた結果、葉腋に特異的なGUS活性が検
出された（図７）。したがって、PetSPL3遺伝子の５'上
流部分を合むDNA領域は葉腋に特異的なプロモーター活
性を有することがわかり、PetSPL3遺伝子は葉腋に特異
的に発現していると推測された。この発現特異性は、SU
PERMANの発現特異性（雄しべの原基および胚珠）とは全
く異なる。この相違点と、アミノ酸配列の類似性の低さ
とを考え合わせ（実施例２）、PetSPL3はSUPERMANとは
別のクラスの新規な転写因子であると結論される。

【００６２】

【発明の効果】本発明によれば、植物の形態および着色
などを変化させ得る転写因子をコードする遺伝子が提供
される。この遺伝子を利用することにより、植物の形質
が変化した植物を作出し得る。作出された植物には、野
生種および園芸品種には存在しないか極めてまれである
形質が付与されるため、園芸上有用である。

【００６３】

【配列表】

【００６４】

【配列番号：１】配列の長さ：８８７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： TCTACAAGGC AATAACAAGT TATAGTATCA TCTTTCTTTT ATTACCTTTA TAGAACTATC 60 ATTTTTCCAC CGTTGACTCT CTCTCTCTA ATG GAA ACT AGT AAA AAT CAG CCG 113 Met Glu Thr Ser Lys Asn Gln Pro 5 TCT GTC TCA GAA AAT GTT GAT CAG CAG AAA GTA GAT AAC TCT TCT TCA 161 Ser Val Ser Glu Asn Val Asp Gln Gln Lys Val Asp Asn Ser Ser Ser 10 15 20 GAT GAA CAA CAA ATT TCA ATT ATC CAA AGC AGC CAT ACT ACT AAA TCC 209 Asp Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ile Gln Ser Ser His Thr Thr Lys Ser 25 30 35 40 TAT GAG TGC AAC TTT TGT AAA AGA GGT TTT TCT AAC GCA CAA GCA CTT 257 Tyr Glu Cys Asn Phe Cys Lys Arg Gly Phe Ser Asn Ala Gln Ala Leu 45 50 55 GGT GGC CAC ATG AAT ATC CAT CGT AAG GAC AAG GCC AAA CTC AAA AAA 305 Gly Gly His Met Asn Ile His Arg Lys Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys 60 65 70 CAA AAG CAG CAT CAA CGA CAA CAA AAA CCT ACC TCG GTT TCC AAA GAA 353 Gln Lys Gln His Gln Arg Gln Gln Lys Pro Thr Ser Val Ser Lys Glu 75 80 85 ACC AAC ATG GCT CAC AAT ATC TTG CTA GCG GAT GAT TCT AAC ATC CCT 401 Thr Asn Met Ala His Asn Ile Leu Leu Ala Asp Asp Ser Asn Ile Pro 90 95 100 ACC ACA ATC CCC TTT TTT CCT TCT CTT ACA TCA CCA AAC ACA TCC AAC 449 Thr Thr Ile Pro Phe Phe Pro Ser Leu Thr Ser Pro Asn Thr Ser Asn 105 110 115 120 CCT TTA GGG TTC GTG TCT TCT TGC ACT ACT GCA GAC ACC GTC GGG CAA 497 Pro Leu Gly Phe Val Ser Ser Cys Thr Thr Ala Asp Thr Val Gly Gln 125 130 135 AGA CAG ATT CAA GAT CTA AAC TTA GTC ATG GGT TCA ACT CTT AAC GTT 545 Arg Gln Ile Gln Asp Leu Asn Leu Val Met Gly Ser Thr Leu Asn Val 140 145 150 CTC AGA ATG AAT AGT GTT GAA GCG GGT TCT GTT GAT TCA CGT GAA AAT 593 Leu Arg Met Asn Ser Val Glu Ala Gly Ser Val Asp Ser Arg Glu Asn 155 160 165 AGA TTG CCG GCT AGA AAT CAA GAA ACT ACA CCA TTT TAC GCG GAA TTG 641 Arg Leu Pro Ala Arg Asn Gln Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Ala Glu Leu 170 175 180 GAC CTT GAG CTG CGA TTA GGT CAT GAG CCT GCA CCT TCC ACG GAT ATA 689 Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly His Glu Pro Ala Pro Ser Thr Asp Ile 185 190 195 200 TCA TCA GCT AAT TCG GGT TTA GGC ACA AGA AAG TTC TTA TGATTTATTG 738 Ser Ser Ala Asn Ser Gly Leu Gly Thr Arg Lys Phe Leu 205 ２１０ ＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣ ＴＧＣＴＡＡＡＴＧＣ ＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴ ＴＡＣ
ＴＡＣＴＧＴＴ ＴＡＧＧＧＴＴＴＴＴ ＴＴＧＴＧＡＣＴＡＴ ７９８ ＧＡＴＡＣＴＡＣＴＴ ＴＴＧＣＴＡＣＡＴＣ ＴＧＡＡＴＴＧＴＣＴ ＴＧＡ
ＡＣＴＣＴＴＴ ＴＡＴＴＣＡＧＡＧＴ ＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴ ８５８ ＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴ ＧＴＴＴＴＡＡＴＣＴ ＧＧＣＴＣＴＡＧＡ
８８７

【００６５】

【配列番号：２】配列の長さ：２１３ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列： Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ 5 10 15 Gln Lys Val Asp Asn Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ile 20 25 30 Gln Ser Ser His Thr Thr Lys Ser Tyr Glu Cys Asn Phe Cys Lys Arg 35 40 45 Gly Phe Ser Asn Ala Gln Ala Leu Gly Gly His Met Asn Ile His Arg 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys Gln Lys Gln His Gln Arg Gln Gln 65 70 75 80 Lys Pro Thr Ser Val Ser Lys Glu Thr Asn Met Ala His Asn Ile Leu 85 90 95 Leu Ala Asp Asp Ser Asn Ile Pro Thr Thr Ile Pro Phe Phe Pro Ser 100 105 110 Leu Thr Ser Pro Asn Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Val Ser Ser Cys 115 120 125 Thr Thr Ala Asp Thr Val Gly Gln Arg Gln Ile Gln Asp Leu Asn Leu 130 135 140 Val Met Gly Ser Thr Leu Asn Val Leu Arg Met Asn Ser Val Glu Ala 145 150 155 160 Gly Ser Val Asp Ser Arg Glu Asn Arg Leu Pro Ala Arg Asn Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Pro Phe Tyr Ala Glu Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly His 180 185 190 Glu Pro Ala Pro Ser Thr Asp Ile Ser Ser Ala Asn Ser Gly Leu Gly 195 200 205 Thr Arg Lys Phe Leu 210

【００６６】

【配列番号：３】配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：プライマー 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：６ 他の情報：塩基６はイノシン（i）である 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：９ 他の情報：塩基９はイノシン（i）である 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：12 他の情報：塩基12はイノシン（i）である 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：15 他の情報：塩基15はイノシン（i）である 配列： ＣＡＲＧＣＮＹＴＮＧＧＮＧＧＮＣＡＹ
１８

【００６７】

【配列番号：４】配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：プライマー 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅ 存在位置：３ 他の情報：塩基３はイノシン（i）である 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：６ 他の情報：塩基６はイノシン（i）である 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：９ 他の情報：塩基９はイノシン（i）である 配列： YTNGGNGGNCAYATGAAY 18

【００６８】

【配列番号：５】配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：プライマー 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：３ 他の情報：塩基３はイノシン（i）である 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：６ 他の情報：塩基６はイノシン（i）である 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：12 他の情報：塩基12はイノシン（i）である 配列： ARNCKNARYTCNARRTC 17

【００６９】

【配列番号：６】配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：プライマー 配列： ACTGGATCCCATTAGAGAGAGAGAG 25

【００７０】

【配列番号：７】配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：プライマー 配列： ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
１９

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰｅｔＳＰＬ３遺伝子の塩基配列および推定ア
ミノ酸配列を示す。

【図２】（ａ)PetSPL3遺伝子高発現ベクター(pBIN-35S-
PetSPL3)および(ｂ)PetSPL3遺伝子プロモーター解析用
ベクター(pBIN-PetSPL3-GUS)の概略を示す。

【図３】PetSPL3形質転換ペチュニアにおいてPetSPL3遺
伝子のmRNAを検出した変性アガロースゲル電気泳動像の
フルオログラムを示す。

【図４】（左）野生型ペチュニアの植物体と（右）PetS
PL3形質転換ペチュニアの植物体を撮影した生物の形態
を示す写真を示す。

【図５】（上段）野生型ペチュニアの葉と（下段）PetS
PL3形質転換ペチュニアの葉を撮影した生物の形態を示
す写真を示す。

【図６】（ａ）野生型ペチュニアの花と（ｂ）（ｃ）Pe
tSPL3形質転換ペチュニアの花を撮影した生物の形態を
示す写真を示す。

【図７】pBIN-PetSPL3-GUSを導入したペチュニアのGUS
染色した茎を撮影した生物の形態を示す写真を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年６月１４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項５】 請求項１から４のいずれか１つに記載の
遺伝子を植物細胞に導入する工程、および該遺伝子が導
入された植物細胞を植物体に再生する工程を包含する、
植物の形質が変化した植物を作出する方法。

【請求項６】 前記植物が双子葉植物である、請求項５
に記載の方法。

【請求項７】 前記植物がナス科植物である、請求項６
に記載の方法。

【請求項８】 前記植物がペチュニア属植物である、請
求項７に記載の方法。

【請求項９】 前記遺伝子が植物発現ベクターに組み込
まれている、請求項５に記載の方法。

【請求項１０】 請求項５から９のいずれか１つに記載
の方法により作出された、植物の形質が変化した植物。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のDNAを含む
   遺伝子： （ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第９０位
   から第７２８位までの塩基配列を有するDNA；または
   （ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
   トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
   させ得る転写因子をコードするDNA。
2. 【請求項２】 以下の（i）または（ii）の転写因子を
   コードする遺伝子： （i）配列番号２によって示されるアミノ酸配列の第１
   位から第２１３位までのアミノ酸配列を含む転写因子；
   または（ii）アミノ酸配列（i）において、１またはそ
   れ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
   ノ酸配列を有し、かつ植物の形質を変化させ得る転写因
   子。
3. 【請求項３】 前記植物の形質が、花の形態、花の着
   色、植物の大きさ、および枝数からなる群より選択され
   る、請求項１または２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項１から３のいずれか１つに記載の
   遺伝子を植物細胞に導入する工程、および該遺伝子が導
   入された植物細胞を植物体に再生する工程を包含する、
   植物の形質が変化した植物を作出する方法。
5. 【請求項５】 前記植物が双子葉植物である、請求項４
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記植物がナス科植物である、請求項５
   に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記植物がペチュニア属植物である、請
   求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記遺伝子が植物発現ベクターに組み込
   まれている、請求項４に記載の方法。
9. 【請求項９】 請求項４から８のいずれか１つに記載の
   方法により作出された、植物の形質が変化した植物。