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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. GEBIET DER ERFINDUNG:
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Gen, das für einen
Transkriptionsfaktor kodiert, der in der Lage ist, Eigenschaften
einer Pflanze und ihrer Verwendung zu verändern. Genauer bezieht sich
die vorliegende Erfindung auf das PetSPL3-Gen, welches ein neues
Gen ist, das von Petunia hybrida abgeleitet worden ist, auf mit
diesem verwandten Genen und deren Verwendung.
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2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN
STANDES DER TECHNIK:
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Um
regulatorische Mechanismen, welche die Eigenschaften einer Pflanze,
z. B. Morphogenese einer Blüte,
kontrollieren, zu klären,
wurden molekularbiologische und molekulargenetische Untersuchungen
unter Verwendung von Arabidopsis thaliana, Antirrhinum majus und
Petunia hybrida durchgeführt.
Insbesondere wird Petunia hybrida als ein Untersuchungssubjekt aus
den folgenden Gründen
bevorzugt verwendet: hoher Wert als eine Gartenbaupflanze, das Vorkommen
zahlreicher Arten, die Leichtigkeit der Transformation, die Leichtigkeit,
sie zu beobachten wegen ihrer großen Blüte, und Akkumulierung genetischer
Befunde (H. Takatsuji "Molecular
mechanism for determining a shape of a plant", Cell Technology, Plant Cell Technology
Series, (SHUJUNSHA) (1994), S. 96-106).
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Es
wurden Gene, die Mutation verursachen, aus Mutanten isoliert, in
welchen Blütenorgane
der oben genannten Pflanze geändert
sind. Als ein Ergebnis wird deutlich, dass Transkriptionsfaktoren
wichtige Rollen bei der Differenzierung und Morphogenese einer Blüte spielen.
Zum Beispiel ist SUPERMAN von Arabidopsis thaliana ein Transkriptionsfaktor
mit einem Zinkfingermotiv als eine DNS-Bindungsdomäne. Es ist
bekannt, dass bei SUPERMAN-Mutanten die Anzahl der Staubgefäße bemerkenswert
erhöht
ist und dass die Stempel defekt sind (THE IDEN, April 1997 (Band
51, Nr. 4) S. 34-38). Gene von Zinkfingerproteinen vom EPF-Typ wurden
in Petunien unter Verwendung eines PCR-Ansatzes identifiziert. Ein hochkonserviertes
Motiv unter den Gliedern der EPF-Familie und anderen Cys2/His2-Zinkfingerproteinen
in Pflanzen ist kritisch für
die DNS-Bindungsaktivität
(K. Kubo et al., Nucleic Acid Research, 1998, Band 22, Nr. 2, S.
608-615).
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Es
wurde von der Isolierung und Charakterisierung der cDNS von vier
neuen Zinkfingerproteinen (PetSPL1, PetSPL2, PetSPL3 und PetSPL4),
die Ähnlichkeit
in der Proteinstruktur mit dem SUPERMAN-Transkriptionsfaktor teilen,
berichtet (H. Nakagawa et al.; Abstract 421; Fifth International
Congress of Plant Molecular Biology, Singapur, 21.-27. September 1997).
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen
der vier Zinkfingerproteine (PetSPL1, PetSPL2, PetSPL3 und PetSPL4)
wurde auf dem "Annual
Meeting of the Japanese Society of Plant Pathologists", abgehalten in Tokio,
Japan, vom 3.–5.
Mai 1998, diskutiert. In einigen Transformanten wurde die Co-Suppression
von PetSPL2 beobachtet und diese Pflanzen waren auch weiblich-steril wegen
Aberration in den Karpellen. Von einigen anderen Transformanten
für PetSPL2
wurde gefunden, dass sie das Transgen der gesamten Pflanze überexprimieren
(H. Nakagawa et al., Plant and Cell Physiology, 1998, Band 39, Nr.
Suppl., Seite S63). Weiterhin resultiert die ektotopische Expression
des PetSPL2-Gens in Zwergpflanzen mit kurzen Internodien (H. Takasuji
et al.; Plant and Cell Physiology, 1998; Band 39, Nr. Suppl., Seite S3).
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Um
den Mechanismus für
die Kontrolle von Eigenschaften einer Pflanze zu verstehen, ist
es wichtig, einen neuen Transkriptionsfaktor zu identifizieren,
der in eine solche Kontrolle verwickelt ist. Ein Gen für einen Transkriptionsfaktor,
der die Morphogenese einer Blüte
kontrolliert, kann in eine Pflanze unter Verwendung eines gentechnischen
Verfahrens eingeführt
werden. Es ist möglich,
eine Pflanze mit einer Blüte
mit neuen Eigenschaften unter Verwendung von Geneinführung zu
erhalten, die durch konventionelle Züchtung nicht erhalten wurde
oder es nicht wahrscheinlich ist, dass sie durch sie erhalten wird.
Es ist gedacht, dass eine Pflanze mit solch neuen Eigenschaften
gartenbautechnisch wertvoll ist.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
Gen, das aus seiner natürlichen
Umgebung isoliert oder mit Hilfe eines technischen Prozesses (wie
z. B. Rekombinationstechniken) der vorliegenden Erfindung erzeugt
worden ist, hat DNS, die ausgewählt ist
aus a) oder b): a) DNS mit einer Nucleotidsequenz von der 90sten
Position bis zur 728sten Position einer Nucleotidsequenz dargestellt
in SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls; oder b) DNS, die an DNS aus
a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für einen
Transkriptionsfaktor kodiert, der in der Lage ist, die Eigenschaften
einer Pflanze zu ändern;
worin
die Eigenschaften einer Pflanze eine solche einschließen, die
ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus der Morphologie einer Blüte und der
Farbe einer Blüte.
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Ein
Gen, das aus seiner natürlichen
Umgebung isoliert oder mit Hilfe eines technischen Vorgangs (wie z.
B. Rekombinationstechniken) der vorliegenden Erfindung isoliert
worden ist, kodiert einen Transkriptionsfaktor, der ausgewählt ist
aus i) oder ii): i) ein Transkriptionsfaktor mit einer Aminosäuresequenz
von der ersten Position bis zur 213ten Position einer Aminosäuresequenz,
dargestellt in SEQ ID Nr. 2; oder ii) ein Transkriptionsfaktor mit
einer Aminosäuresequenz,
in welcher 20 oder weniger Aminosäuren von i) der Deletion, Substitution
oder Addition unterzogen worden sind, und der in der Lage ist, die
Eigenschaften einer Pflanze zu ändern,
worin
die Eigenschaften einer Pflanze eine solche einschließen, die
ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus der Morphologie einer Blüte und der
Farbe einer Blüte.
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Ein
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze der vorliegenden
Erfindung schließt
die folgenden Schritte ein: Einführen
einer Pflanzenzelle mit dem oben genannten Gen und Regenieren eines
Pflanzenkörpers
aus der Pflanzenzelle mit dem eingeführten Gen.
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In
einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung gehört
die Pflanze zu den Dicotyledonen.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung gehört
die Pflanze zu den Solanaceae.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung gehört
die Pflanze zu den Petunia.
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In
einem anderen Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung wird das Gen in einen Pflanzenexpressionsvektor
eingebaut.
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Eine
transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung wird durch das oben
genannte Verfahren erzeugt.
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Folglich
macht die hierin beschriebene Erfindung die folgenden Vorteile möglich: 1)
Bereitstellen eines Gens, das für
einen Transkriptionsfaktor kodiert, der in der Lage ist, Eigenschaften
einer Pflanze zu ändern;
2) Bereitstellen eines Verfahrens zur Erzeugung einer Pflanze, deren
Eigenschaften durch Einführen
des Gens geändert
worden sind; und 3) Bereitstellen einer transgenen Pflanze.
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Diese
und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute
nach dem Lesen und Verstehen der folgenden detaillierten Beschreibung
mit Bezugnahme auf die begleitenden Figuren offensichtlich werden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
eine Nucleotidsequenz des PetSPL3-Gens und ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenz.
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2A ist
eine schematische Darstellung, die einen Hochexpressionsvektor (pBIN-35S-PetSPL3) zeigt, der
das PetSPL3-Gen enthält,
und 2B ist eine schematische Darstellung, die einen
Vektor (pBIN-PetSPL3-GUS) für
die Analyse des Promotors des PetSPL3-Gens zeigt.
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3 zeigt
ein Autoradiogramm einer Aufnahme einer denaturierten Agarosegelelektrophorese,
mit der mRNS des PetSPL3-Gens in Petunia hybrida, die mit dem PetSPL3-Gen
transformiert worden ist, nachgewiesen wurde.
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4 zeigt
Bilder der Morphologie eines Pflanzenkörpers von Wildtyp-Petunia-hybrida
(links) und jenes von Petunia hybrida, die mit dem PetSPL3-Gen transformiert
worden ist (rechts).
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5 zeigt
Bilder der Morphologie von Blättern
der Wildtyp-Petunia-hybrida (oberer Teil) und jener von Petunia
hybrida, die mit dem PetSPL3-Gen transformiert worden ist (unterer
Teil).
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6A zeigt
ein Foto der Morphologie einer Blüte von Wildtyp-Petunia-hybrida
und die 6B und 6C zeigen
Bilder der Morphologie von Blüten
von Petunia hybrida, die mit dem PetSPL3-Gen transformiert worden
ist.
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7 ist
ein Bild, das ein GUS-Färbungsmuster
eines Stamms von Petunia hybrida zeigt der mit pB-PetSPL3-GUS transformiert
worden ist.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Hiernach
wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben werden.
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Der
Begriff "Transkriptionsfaktor", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf ein Protein, das an einen regulatorischen
DNS-Bereich von Genen bindet, um die Synthese von mRNS zu kontrollieren.
Von etlichen Transkriptionsfaktoren ist bekannt, dass sie eine hoch
konservierte Aminosäuresequenz,
die als Zinkfingermotiv bezeichnet wird, in ihren DNS-Bindungsdomänen haben.
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Ein
Gen der vorliegenden Erfindung kodiert einen Transkriptionsfaktor,
der in der Lage ist, Eigenschaften einer Pflanze zu ändern. Dieses
Gen kann jede der folgenden DNS enthalten:
- a)
DNS mit einer Nucleotidsequenz von der 90sten Position bis zur 728sten
Position einer in der SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls dargestellten
Nucleotidsequenz; oder
- b) DNS, die mit der DNS von a) unter stringenten Bedingungen
hybridisiert und die einen Transkriptionsfaktor kodiert, der in
der Lage ist, Eigenschaften einer Pflanze zu ändern,
worin die Eigenschaften
einer Pflanze eine solche einschließen, die aus der Gruppe ausgewählt wird,
bestehend aus der Morphologie einer Blüte und der Farbe einer Blüte.
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Vorzugsweise
mag das Gen der vorliegenden Erfindung DNS von a) enthalten.
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Das
Gen der vorliegenden Erfindung kann auch für jeden der folgenden Transkriptionsfaktoren
kodieren:
- i) ein Transkriptionsfaktor mit einer
Aminosäuresequenz
von der ersten Position bis zur 213ten Position einer in SEQ ID
Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz;
oder
- ii) ein Transkriptionsfaktor mit einer Aminosäuresequenz,
in welcher 20 oder weniger (vorzugsweise 10 oder weniger) Aminosäuren von
i) der Deletion, Substitution oder Addition ausgesetzt worden sind,
und der in der Eigenschaften, einer Pflanze zu ändern,
worin die Eigenschaften
einer Pflanze eine solche einschließen, die aus der Gruppe ausgewählt wird,
bestehend aus der Morphologie einer Blüte und der Farbe einer Blüte.
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Vorzugsweise
mag das Gen der vorliegenden Erfindung den Transkriptionsfaktor
von i) kodieren.
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Das
besonders bevorzugte Gen in der vorliegenden Erfindung ist das PetSPL3-Gen. 1 zeigt
eine cDNS-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) dieses Gens und seine abgeleitete
Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr. 2).
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Änderungen
in den "Eigenschaften
einer Pflanze" beziehen
sich auf jegliche Änderungen
in wenigstens einem der Morphologie einer Blüte oder der Farbe einer Blüte. Diese Änderungen
werden durch Vergleichen der Eigenschaften einer Pflanze, die durch
Einführen
eines Gens der vorliegenden Erfindung erhalten worden ist, mit den
Eigenschaften einer Pflanze (Wildtyp oder Gartenbautyp) vor dem
Einführen
des Gens beurteilt.
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(Hiernach
bezieht sich der Begriff "Blüte" auf Blütenblätter, wenn
nicht anderweitig spezifiziert.)
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Beispiele
der geänderten
Morphologie einer Blüte
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die Morphologie, die durch eine Änderung
in einer Form eines einzelnen Blütenblattes
verursacht wird (große
Blütenblätter, kleine
Blütenblätter, sägezahnförmige Blütenblätter, runde
Blütenblätter, wellenförmige Blütenblätter etc.),
die Morphologie, welche durch eine Änderung in der Anzahl der Blütenblätter verursacht
wird (doppelte Blüte,
einzelne Blüte
etc.), und die Morphologie, die durch eine anormale Entwicklung
der Blütenblätter verursacht
wird (sternförmige
Blütenblätter etc.).
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Beispiele
der Farbänderung
einer Blüte
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf einzelne Farben wie weiß, scharlachrot,
lachsrosa, rosa, pink, blauviolett, violett, blassviolett, himmelsblau,
violettrot und gelbweiß und
Vielfarbmuster von zwei oder mehr Farben (z. B. Buntheit, Flecken,
Buntheit am Rand, Färben
einer außeren
Ecke eines Blütenblattes).
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Geänderte Eigenschaften
einer Pflanze schließen
vorzugsweise die Morphologie ein, die durch eine anormale Entwicklung
von Blütenblättern verursacht
wird, ein zweifarbiges Muster, ein Zwerg oder eine gesteigerter
Verzweigung, und am bevorzugtesten eine Kombination davon (z. B.
eine Kombination der anormalen Entwicklung von Blütenblättern und
ein Doppelfarbmuster und/oder eine Kombination aus Zwerg und gesteigerter
Verzweigung). Bevorzugter schließen geänderte Eigenschaften einer
Pflanze die Morphologie einer Sternform, die Färbung einer äußeren Ecke
eines Blütenblattes,
einen Zwerg oder eine gesteigerte Verzweigung ein, und bevorzugter
eine Kombination davon (z. B. eine Kombination der Morphologie einer
Sternform und die Färbung
einer äußeren Ecke
eines Blütenblattes
und/oder eine Kombination von Zwergwuchs und gesteigerter Verzweigung).
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Das
Gen der vorliegenden Erfindung kann z. B. durch Durchführen von
Polymerasekettenreaktion (PCR) mit genomischer DNS einer Pflanze
als eine Matrize isoliert werden, unter Verwendung eines Paares degenerierter
Primer, die einem konservierten Bereich der Aminosäuresequenz
entsprechen, die durch ein Gen eines bekannten Transkriptionsfaktors
kodiert wird, und durch Screening einer genomischen Bibliothek derselben
Pflanze unter Verwendung des demzufolge erhaltenen amplifizierten
DNS-Fragmentes als eine Sonde. Beispiele eines Primerpaars schließen eine
Kombination aus 5'-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3' (SEQ ID Nr. 3) oder
5'-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3' (SEQ ID Nr. 4) mit
5'-ARNCKNARYTCNARRTC-3' (SEQ ID Nr. 5) ein,
in welchen N Inosin, R G oder A, Y C oder T und K T oder G ist.
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PCR
kann in Übereinstimmung
mit den Anweisungen des Herstellers eines im Handel erhältlichen
Kits und Instrumentes durchgeführt
werden oder durch ein Fachleuten wohl bekanntes Vorgehen. Ein Verfahren
für die
Erzeugung einer Genbibliothek, stringente Bedingungen, die für die Hybridisierung
mit einer Sonde verwendet werden, und ein Verfahren für die Klonierung
eines Gens sind Fachleuten wohl bekannt. Zum Beispiel siehe Maniatis
at al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).
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Eine
Nucleotidsequenz des demzufolge erhaltenen Gens kann durch ein im
Stand der Technik bekanntes Nucleotidsequenzanalyseverfahren oder
durch ein im Handel erhältliches
automatisches Sequenziergerät
bestimmt werden.
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Das
Gen der vorliegenden Erfindung ist nicht auf jene begrenzt, die
von dem natürlichen
Genom isoliert worden sind, sondern kann synthetische Polynucleotide
einschließen.
Synthetische Polynucleotide können
z. B. durch Modifizieren eines sequenzierten Gens, wie oben beschrieben,
unter Verwendung eines Fachleuten wohl bekannten Verfahrens erhalten
werden.
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Das
Gen der vorliegenden Erfindung kann in einen geeigneten Pflanzenexpressionsvektor
durch ein Fachleuten wohl bekanntes Verfahren ligiert und in eine
Pflanzenzelle durch eine bekannte Genrekombinationstechnik eingeführt werden.
Das eingeführte
Gen wird in die DNS einer Pflanzenzelle eingebaut. Die DNS einer
Pflanzenzelle schließt
DNS, die in verschiedenen Organellen (z. B. Mitochondrien, Chlorplasten
etc.) einer Pflanzenzelle enthalten ist, ebenso wie Chromosomen
ein.
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Die "Pflanze" schließt sowohl
Monocotyledonen als auch Dicotyledonen ein. Die bevorzugte Pflanze ist
eine Dicotyledone. Die Dicotyledone schließt sowohl Archichlamiidae als
auch Sympetalidae ein. Es wird eine Pflanze der Sympetalidae bevorzugt.
Beispiele der Pflanzen der Sympetalidae schließen Gentianales, Solanales,
Lamiales, Callitrichales, Plantaginales, Campanulales, Scrophulariales,
Rubiales, Dipsacales, Asterales und ähnliche ein. Eine Pflanze der
Solanales wird bevorzugt. Beispiele der Pflanzen der Solanales schließen Solanaceae,
Hydrophyllaceae, Polemoniaceae, Cuscutaceae, Convolvulaceae und ähnliche
ein. Solanaceae werden bevorzugt. Solanaceae schließen Petunia,
Datura, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, Capsicum, Physalis und
Lycium etc. ein. Pflanzen der Petunia, Datura und Nicotiana werden
bevorzugt. Petunia ist bevorzugter. Beispiele der Pflanzen der Petunia
schließen
P. hybrida, P. axillaris, P. inflata, P. violacea und ähnliche
ein. Eine Pflanze der P. hybrida ist besonders bevorzugt. Die "Pflanze" bezieht sich auf
einen Pflanzenkörper
mit einer Blüte
und einem Samen, der von dieser erhalten wird, soweit nicht anderweitig
spezifiziert. Beispiel der "Pflanzenzelle" schließen Zellen
der Pflanzenorgane wie Blätter
und Wurzeln, Kallus und in Suspension kultivierte Zellen ein.
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Der
Begriff "Pflanzenexpressionsvektor", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, in welcher zahlreiche
regulatorische Elemente wie ein Promotor für die Regulierung der Expression
des Gens der vorliegenden Erfindung miteinander gekoppelt sind,
um in einer Wirtspflanzenzelle operabel zu sein. Vorzugsweise kann
der Pflanzenexpressionsvektor Pflanzenpromotor, Terminator, Arzneimittelresistenzgen
und Enhancer einschließen.
Es ist Fachleuten wohl bekannt, dass der Typ des Pflanzenexpressionsvektors
und Regulatorelementes in Abhängigkeit
von dem Typ der Wirtszelle variiert werden kann. Ein Pflanzenexpressionsvektor,
der gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, kann weiterhin eine T-DNS-Region enthalten.
Die T-DNS-Region ermöglicht
einem Gen, wirksam in ein Pflanzengenom eingeführt zu werden, insbesondere
wenn Agrobacterium verwendet wird, um eine Pflanze zu transformieren.
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Der
Begriff "Pflanzenpromotor", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf einen Promotor, der in einer Pflanze funktioniert.
Konstitutive Promotoren, ebenso wie gewebespezifische Promotoren,
die selektiv in einem Teil eines Pflanzenkörpers, einschließlich einer
Blüte,
funktionieren, sind bevorzugt. Beispiele von Pflanzenpromotoren
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf den Blumenkohlmosaikvirus- (CaMV-)355-Promotor und einen
Promotor der Nopalinsynthase.
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Der
Begriff "Terminator", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf eine Sequenz, die stromabwärts von
einem Bereich eines Gens positioniert ist, das für ein Protein kodiert, welches
in die Termination der Transkription von mRNS und die Addition einer
Poly-A-Sequenz verwickelt
ist. Von dem Terminator ist bekannt, dass er zu der Stabilität der mRNS
beiträgt,
wodurch das Expressionsmaß eines
Gens beeinflusst wird. Beispiele solcher Terminatoren schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf den CaMV-35S-Terminator und einen Terminator
des Nopalinsynthasegens (Tnos).
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Ein
Arzneimittelresistenzgen ist wünschenswert,
um die Selektion transgener Pflanzen zu erleichtern. Die Beispiele
solcher Arzneimittelresistenzgene für die Verwendung in der Erfindung
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf ein Neomycinphosphotransferase-II-(NPTII-)Gen für die Verleihung
von Kanamycinresistenz und ein Hygromycinphosphotransferasegen für die Verleihung
von Hygromycinresistenz.
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Ein
Enhancer kann verwendet werden, um das Expressionsmaß eines
Gens von Interesse zu verstärken.
Als Enhancer wird ein Enhancerbereich, der eine Sequenz stromaufwärts des
oben genannten CaMV-35S-Promotors enthält, bevorzugt. Es kann in einem
Pflanzenexpressionsvektor mehr als ein Enhancer verwendet werden.
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Der
Pflanzenexpressionsvektor gemäß der vorliegenden
Erfindung kann unter Verwendung einer Fachleuten wohl bekannten
DNS-Rekombinations-Technik hergestellt werden. Die Beispiele bevorzugter
Vektoren für
die Konstruktion eines Pflanzenexpressionsvektors schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf Vektoren vom pBI-Typ und Vektoren
vom pUC-Typ.
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Ein
Pflanzenexpressionsvektor kann in eine Pflanzenzelle unter Verwendung
von Fachleuten wohl bekannten Verfahren eingeführt werden, z. B. einem Verfahren
für die
Infektion einer Pflanzenzelle mit Agrobacterium oder ein Verfahren
für das
direkte Einführen
eines Vektors in eine Zelle. Das Verfahren, das Agrobacterium verwendet,
kann z. B. wie beschrieben in Nagel et al., Microbiol. Lett., 67,
325, 1990 durchgeführt
werden. Gemäß diesem
Verfahren wird Agrobacterium zuerst mit einem Pflanzenexpressionsvektor
z. B. durch Elektroporation transformiert und dann wird das transformierte
Agrobacterium eine Pflanzenzelle durch ein wohl bekanntes Verfahren
wie z. B. die Blattscheibenmethode infiziert. Beispiele der Verfahren
für das
direkte Einführen
eines Pflanzenexpressionsvektors in eine Zelle schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf ein Elektroporationsverfahren, ein
Verfahren mit der Partikelkanone, ein Calciumphosphatverfahren und
ein Polyethylenglykolverfahren. Diese Verfahren sind im Stand der
Technik wohl bekannt und ein Verfahren, das für eine bestimmte zu transformierende
Pflanze geeignet ist, kann durch Fachleute geeignet ausgewählt werden.
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Die
Zellen, in welchen Pflanzenexpressionsvektoren eingeführt worden
sind, werden z. B. basierend auf ihrer Arzneimittelresistenz wie
der Resistenz gegen Kanamycin selektiert. Danach können die
Zellen zu einem Pflanzenkörper
unter Verwendung eines gewöhnlichen
Verfahrens regeneriert werden.
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Die
Expression des eingeführten
Gens der vorliegenden Erfindung in den regenerierten Pflanzenkörper kann
unter Verwendung eines Fachleuten wohl bekannten Vorgehens bestätigt werden.
Diese Bestätigung kann
z. B. durch Northern-Blot-Analyse durchgeführt werden. Genauer kann die
Gesamt-RNS aus den Blättern einer
resultierenden Pflanze extrahiert werden und dann denaturierender
Agarosegelelektrophorese ausgesetzt werden und dann kann die RNS
auf eine geeignete Membran geblottet werden. Der Blot kann mit einer markierten
RNS-Sonde hybridisiert werden, die komplementär zu einem Teil des eingeführten Gens
ist, um RNS von dem Gen der vorliegenden Erfindung nachzuweisen.
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Die
Pflanze der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze, hergestellt
durch das oben genannte Vorgehen. Es ist bevorzugt, dass die geänderten
Eigenschaften der transgenen Pflanze (das heißt Morphologie einer Blüte und/oder
Färbung
einer Blüte)
jene einschließen,
die nicht in einem bekannten Wildtyp oder Gartenbautyp gefunden
werden. Es ist auch bevorzugt, dass die geänderten Eigenschaften einer
Pflanze gartenbautechnisch wertvoll sind. Weiterhin ist es bevorzugt,
dass geänderte
Eigenschaften einer Blüte
stabil über nachfolgende
Generationen konserviert werden.
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BEISPIELE
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Hiernach
wird die vorliegende Erfindung im Wege der folgenden erläuternden
Beispiele beschrieben werden. Restriktionsenzyme, Plasmide und Ähnliches,
die in den folgenden Beispielen verwendet werden, sind aus Handelsquellen
erhältlich.
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Beispiel 1: Isolierung
des PetSPL3-Gens
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Das
Protein, das durch das SUPERMAN-Gen von Arabidopsis thaliana kodiert
wurde, wurde mit dem Protein verglichen, das durch das GmN479-Gen
(Kouchi et al., persönliche
Kommunikation) kodiert wird, das spezifisch in Sojabohnenwurzelknoten
exprimiert wird. Drei unterschiedliche degenerierte Primer für die Verwendung
in PCR wurden basierend auf den Aminosäuresequenzen, die gewöhnlichen
in beiden Proteinen vorhanden sind, synthetisiert. Die Nucleotidsequenzen
der beiden Primer in 5'-3'-Richtung in den
Genen sind 5'-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3' (Primer 1, entsprechend
einer Aminosäuresequenz
QALGGH, SEQ ID Nr. 3) bzw. 5'-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3' (Primer 2, entsprechend
einer Aminosäuresequenz
LGGHMN, SEQ ID Nr. 4), und einer Nucleotidsequenz eines in 3'-5'-Richtung orientierten
Primers in den Genen ist 5'-ARNCKNARYTCNARRTC-3' (Primer 3, entsprechend
einer Aminosäuresequenz DLELRL,
SEQ ID Nr. 5), worin N Inosin, Y entweder C oder T, R entweder G
oder A und K entweder T oder G ist.
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Ein
erster Satz an PCR wurde mit dem Primer 1 und Primer 3 unter den
folgenden Bedingungen durchgeführt:
94°C für 10 Minuten,
gefolgt von 30 Zyklen mit 94°C
für 30
Sekunden, 50°C
für 30
Sekunden und 72 °C
für 60
Sekunden und anschließend
72°C für 7 Minuten,
unter Verwendung einer genomischen DNS einer Petunie (Petunia hybrida
var. Mitchell) als eine Matrize, extrahiert gemäß dem Verfahren, beschrieben
in M. Boutry und N.H. Chua (1985), EMBO J., 4, 2159-2165. Zusätzlich wurde
eine zweite PCR mit dem Primer 2 und dem Primer 3 durchgeführt, während als
eine Matrize ein Teil des Produktes aus der ersten PCR verwendet
wurde. Die Reaktionsbedingungen waren dieselben wie jene, die in
der ersten PCR verwendet worden sind. Amplifizierte DNS-Fragmente
wurden in den TA-Klonierungsvektor
(hergestellt von Invitrogen) inseriert, welche dann in E. coli gemäß einem
gewöhnlichen
Verfahren eingeführt
wurden. Plasmide wurden aus den transformierten E. coli extrahiert
und die Nucleotidsequenzen des DNS-Fragmentes wurden bestimmt. Die
Ergebnisse zeigten, dass ein Teil des Zinkfingermotivs, das gemeinsam
in SUPERMAN und GmN479 enthalten ist, in dem resultierenden DNS-Fragment
kodiert war. Das Gen, aus welchem dieses DNS-Fragment abgeleitet worden
ist, wurde als PetSPL3-Gen bezeichnet. In denselben Experimentenreihen
wurde die Anwesenheit von drei anderen DNS (PetSPL1-, -2- und -4-Gene), die
eine Nucleotidsequenz enthalten, die ähnliche zu jener von PetSPL3
ist, gezeigt.
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Das
EcoRI-EcoRI-Fragment wurde aus einem Plasmid ausgeschnitten, welches
das oben beschriebene, mit PCR amplifizierte DNS-Fragment enthält. Dieses
DNS-Fragment wurde mit [α-32P]dCTP
unter Verwendung eines gewöhnlichen
Zufalls-Priming-Verfahrens (Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory)) markiert, um eine radioaktiv markierte
Sonde zu erzeugen. Unter Verwendung dieser markierten Sonde wurde
eine genomische Bibliothek einer Petunie (Petunia hybrida var. Mitchell),
welche in einem EMBL3-Vektor (hergestellt von Stratagene) erzeugt
worden war, gescreent. Ein Klon, der durch dieses Screening erhalten
wurde, enthielt ein genomisches DNS-Fragment von ungefähr 3,2 kb.
Dieses Fragment wurde in die XbaI-Stelle eines pBluescript-Vektors
(pBS/PetSPL3) subkloniert. Folglich wurde das PetSPL3-Gen, abgeleitet
aus Petunia hybrida, isoliert.
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Beispiel 2: Analyse der
Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz
des PetSPL3 Gens
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Aus
dem in Beispiel 1 erhaltenen pBS/PetSPL3-Vektor wurde ein Bereich,
der eine Proteinkodierungsregion des PetSPL3-Gens enthält (die
Region zwischen der HindIII-Stelle
und der XbaI-Stelle), gewonnen und weiter in einen pBluescript-Vektor
subkloniert (pBS/PetSPL3-HX) und dann wurde die DNS-Nucleotidsequenz der
Proteinkodierungsregion bestimmt (SEQ ID Nr. 1). Aus einem offenen
Leserahmen, der in der resultierenden DNS-Nucleotidsequenz enthalten
ist, wurde eine Aminosäuresequenz
des Proteins abgeleitet (SEQ ID Nr. 2).
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Der
Vergleich der Nucleotidsequenzen zeigte, dass die Nucleotidsequenzhomologie
des PetSPL3-Gens mit den SUPERMAN-, PetSPL1-, PetSPL2- und PetSPL4-Genen
29%, 37%, 52% bzw. 23% betrug. Dieser Vergleich der Nucleotidsequenzen
wurde nur innerhalb des kodierenden Bereichs jedes Gens durchgeführt.
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Die
abgeleitete Aminosäuresequenz
von PetSPL3 enthielt ein einzelnes Zinkfingermotiv vom TFIIIA-Typ, ähnlich jenem
von SUPERMAN. Auf dieser Basis wurde angenommen, dass PetSPL3 ein
Transkriptionsfaktor war. PetSPL1 und PetSPL2, die auch von den
gegenwärtigen
Erfindern kloniert worden waren, zeigten ungefähr 35% Homologie mit SUPERMAN
in den Aminosäuresequenzen
der vollen Länge.
PetSPL3 zeigt dagegen ungefähr
20% Homologie mit SUPERMAN in der Aminosäuresequenz der vollen Länge.
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Weiterhin
wurde von der Aminosäurehomologie
von PetSPL3 mit SUPERMAN in dem Zinkfingermotiv gezeigt, dass sie
ungefähr
20% beträgt,
was niedriger ist als jene von PetSPL1 und PetSPL2 mit SUPERMAN (ungefähr 38% bzw.
35%). Tabelle 1 vergleicht die Aminosäuresequenz von SUPERMAN mit
jener von jedem PetSPL in dem Zinkfingermotiv. Tabelle 1 zeigt auch
einen Vergleich der C-terminalen hydrophoben Region von SUPERMAN
mit jener von jedem PetSPL.
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C-terminale
hydrophobe Region
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Aus
den oben beschriebenen Ergebnissen wurde abgeleitet, dass PetSPL3
ein neuer Transkriptionsfaktor ist, der zu einer Klasse gehört, die
sich von jenen von SUPERMAN, PetSPL1 und PetSPL2 unterscheidet.
Dies wurde auch durch den Unterschied in den Expressionsmustern
von PetSPL3 und SUPERMAN gestützt.
Siehe das folgende Beispiel 8.
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Beispiel 3: Konstruktion
eines Pflanzenexpressionsvektors der ein Polynucleotid enthält das für das PetSPL3-Gen
kodiert
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Es
wurden ein DNS-Fragment (HindIII-XbaI-Fragment), das einen CaMV-35S-Promotor
in einem Plasmid pBI221 (bezogen von Clontech) enthält, und
ein DNS-Fragment (SacI-EcoRI-Fragment),
das einen NOS-Terminator enthält,
nacheinander in eine Multiklonierstelle des Plasmids pUCAP (F. A.
van Engelen et al., Transgenic Res., 4: 288-290 (1995)) inseriert, um pUCAP35S zu
erzeugen. Auf der anderen Seite wurde das pBS/PetSPL3-HX-Plasmid,
das PetSPL3 enthält,
an HindIII- (Position 0) und AccI-Stellen (Position 258) geschnitten.
Indem beide geschnittene terminale Enden mit dem Klenow-Enzym stumpf gemacht
wurden und indem die beiden Enden wiederum verbunden wurden, wurde
eine 258 bp große
DNS-Region stromaufwärts der
Translationsinitiierungsstelle entfernt. Ein DNS-Fragment (KpnI-SacI-Fragment),
das PetSPL3 kodiert, wurde aus dem resultierenden Plasmid ausgeschnitten
und zwischen die KpnI- und SacI-Stellen des oben beschriebenen Plasmids
pUCAP35 eingefügt.
Dieses rekombinante Plasmid wurde weiter mit AscI und PacI geschnitten
und das resultierende DNS-Fragment, das PetSPL3 kodiert, wurde in
die AscI- und PacI-Stellen eines binären Vektors pBINPLUS (F. A.
van Engelen et al. (1995) oben) eingefügt.
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Der
konstruierte Hochexpressionsvektor für das PetSPL3-Gen (pBIN-35S-PetSPL3)
schließt,
wie in 2a gezeigt, einen CaMV-35S-Promotorbereich
(P35S, 0,9 kb), ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung, das
für PetSPL3
kodiert (PetSPL3, 0,8 kb), und einen Terminatorbereich der Nopalinsynthase
(Tnos, 0,3 kb) ein. In 2 zeigen Pnos
und NPTII einen Promotorbereich des Nopalinsynthase- bzw. Neomycinphosphotransferase-II-Gens. LB und RB zeigen
die linke Grenze der T-DNS bzw. die rechte Grenze der T-DNS.
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Beispiel 4: Einführung des
PetSPL3-Gens in Petuniazellen
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(1) (Transformation von
Agrobacterium tumefaciens)
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Agrobacterium-tumefaciens-LBA4404-Linie
(bezogen von Clontech) wurde in einem L-Medium, das 250 μg/ml Streptomycin und 50 μg/ml Rifampicin
enthält,
bei 28°C
kultiviert. Gemäß dem Verfahren
von Nagel et al. (1990) (oben) wurde eine Zellsuspension dieses
Stammes zubereitet. Der Hochexpressionsvektor des PetSPL3-Gens,
in Beispiel 3 konstruiert, wurde in den oben beschriebenen Stamm
durch Elektroporation eingeführt.
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(2) (Einführung eines
Polynucleotids, das für
PetSPL3 kodiert, in Petuniazellen)
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Die
in (1) erhaltene Agrobacterium-tumefaciens-LBA4404-Linie wurde unter
Schütteln
in YEB-Medium (D.M. Glover, Hrsg., DNA-Cloning, IPL Press, 2. Auflage,
S. 78) kultiviert (bei 28°C,
200 rpm), gefolgt von einer 20-fachen Verdünnung mit sterilisiertem Wasser.
Blattabschnitte einer Petunie (Petunia hybrida var. Mitchell) wurden
in dieser verdünnten
Lösung
kultiviert. Nach 2 bis 3 Tagen wurde das Agrobacterium unter Verwendung
eines Mediums entfernt, das Carbenicillin enthält, und danach wurden diese
Blattabschnitte in einem Selektionsmedium subkultiviert, indem sie
auf neue Medien alle 2 bis 3 Wochen übertragen wurden. Das Kanamycinresistenz-Merkmal,
das durch die Expression des von pBINPLUS abgeleiteten NPTII-Gens
verliehen wurde, zusammen mit dem oben genannten PetSPL3-Gen eingeführt, wurde
als ein Indikator verwendet, um transformierte Petuniazellen auszuwählen. Es
wurde ein Kallus aus den transformierten Zellen unter Verwendung
eines gewöhnlichen
Verfahrens induziert und dann in einen Pflanzenkörper redifferenziert.
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Beispiel 5: Expression
des PetSPL3-Gens in eine mit PetSPL3 transformierte Pflanze
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Aus
den Blättern
von in Beispiel 4 erhaltenen 14 mit PetSPL3 transformierten Petunien
wurde Gesamt-RNS extrahiert. 10 μg
aus jedem der Extrakte wurden denaturierender Agarosegelelektrophorese
ausgesetzt und auf ein Genescreen-Plus-Filter (hergestellt von DuPont)
in Übereinstimmung
mit einem gewöhnlichen
Verfahren geblottet. Eine PetSPL3-Gegensinn-RNS wurde unter Verwendung
des DIG-RNS-Markierungskits (hergestellt von Boehringer Mannheim)
markiert. Hybridisierung und Filterwaschen wurden mit der markierten
RNS gemäß den Anweisungen
des Kits durchgeführt.
Nach dem Waschen wurde der Filter einem XAR-Film (hergestellt von
Kodak) für
1 Stunde bei Raumtemperatur ausgesetzt. 3 zeigt
ein Autoradiogramm einer Aufnahme der denaturierenden Agarosegelelektrophorese,
in welcher mRNS des PetSPL3-Gens für 9 von 14 Petunien nachgewiesen
wurde. Diese Ergebnisse zeigten, dass 3 von 14 einzelnen transformierten
Petunien PetSPL3-mRNS in einem hohen Grad unter der Kontrolle eines
Hochexpressionspromotors exprimierten.
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Beispiel 6: Phänotypen
einer transformierten Petunie die das PetSPL3-Gen in einem hohen
Grad exprimieren
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Die
folgenden Phänotypen
wurden gewöhnlich
in drei einzeln transformierten Petunien, die das PetSPL3-Gen in
hohem Maße
exprimieren, beobachtet. Erstens geschah als eine beobachtete Änderung
in einem Pflanzenkörper
eine signifikante Verzweigung mit Zwergwuchs der Pflanze, als ein
Ergebnis der Reduktion der apikalen Dominanz (4,
das linke Feld zeigt eine Wildtyp-Petunie und das rechte Feld eine
mit PetSPL3 transformierte Petunie). Die Blätter wurden schmäler und
es wurden violette Färbungen,
vermutlich resultierend aus der Verlagerung von Anthocyanpigmenten, über die
gesamte Oberfläche
beobachtet (5, die obere Reihe zeigt ein
Blatt einer Wildtyp-Petunie und die untere Reihe zeigt ein Blatt
einer mit PetSPL3 transformierten Petunie). Bezüglich der Blüten zeigt
eine Aufsicht der Wildtypblüte
eine ungefähr
runde Form, während
jene der PetSPL3-Transformanten sternförmig erschienen (6, (a): Wildtyp-Petunie-Blüte, (b)
und (c): die Blüte
einer mit PetSPL3 transformierten Petunie). Es wird angenommen,
dass dies das Ergebnis von Anormalität in der Ausbreitung der Blütenblätter ist.
Mitchell, die Varietät
an Petunia, die in dem vorliegenden Experiment verwendet wurde,
hat weiße
Blütenblätter. Dies
wurde als das Ergebnis von Mutation in einem regulatorischen Gen
wie einem an2 erklärt,
welches die Färbung
der Blütenblätter kontrolliert
(F. Quattrocchio, Ph.D.-Doktorarbeit an der Amsterdam Free University
(1994)). Im Gegensatz dazu erschien in mit PetSPL3 transformierten
Petunien die blassviolette Färbung
nur um die äußere Kante
der Blütenblätter herum (6(c)).
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Die
oben beschriebenen Ergebnisse zeigten, dass die Morphologie und/oder
das Färbemuster
der Blüte
der mit PetSPL3 transformierten Petunie überhaupt nicht oder extrem
selten in Wildtyp- und Gartenbauarten von Petunia hybrida gefunden
werden. In dem Ausmaß,
dessen sich die vorliegenden Erfinder bewusst sind, wurden keine
Beispiele berichtet, dass solche Eigenschaften auf eine Pflanzenblüte mittels
Gentechnik übertragen
wurden. Zusätzlich
ist die PetSPL3-Transformanten-Petunie ein Zwerg und hat eine gesteigerte Verzweigung.
Diese Eigenschaften sind gartenbautechnisch höchst nützlich.
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Beispiel 7: Konstruktion
eines Promotoranalysevektors, der ein Polynucleotid aus einem in
5'-Richtung stromaufwärts gelegenen
Bereich des PetSPL3-Gens in dem stromaufwärts gelesenen Bereich des GUS-Reportergens
enthält
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In
den Beispielen 7 und 8 wurde die Promotoraktivität des PetSPL3-Gens, das seine
Expressionsmuster überträgt, analysiert
und mit jenen des SUPERMAN-Gens und den anderen PetSPL-Genen verglichen.
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Ein
Primer, der eine Sequenz, die ungefähr 70 bp stromaufwärts der
Translationsinitiierungsstelle des PetSPL3-Gens vorhanden ist, und
eine BamHI-Erkennungssequenz
(ACTGGATCCCATTAGAGAGAGAGAG, SEQ ID Nr. 6) enthält, und ein M13-Umkehrprimer
(GGAAACAGCTATGACCATG, SEQ ID Nr. 7), der einer Sequenz innerhalb
eines Vektors entspricht, wurden verwendet, um PCR unter Verwendung
des oben beschriebenen Plasmids pBS/PetSPL3 als eine Matrize durchzuführen, wobei
ein DNS- Fragment
von ungefähr
2,4 kb amplifiziert wird, von dem angenonmmen wird, dass es den
Promotorbereich des PetSPL3-Gens enthält. Dieses DNS-Fragment wurde
an den XbaI- und BamHI-Stellen, die nahe an beiden Enden des Fragmentes
vorhanden waren, geschnitten. Ein XbaI-EcoRI-Fragment, enthaltend
einen kodierenden Bereich der β-Glucuronidase
(GUS), und ein Terminator des Nopalinsynthasegens, ausgeschnitten
aus pBI221 (bezogen von Clontech), wurden zwischen die XbaI- und
EcoRI-Stellen von pUCAP (F. A. van Engelen et al., (1995), oben)
inseriert, um ein pUCAPGUS-Plasmid zu erhalten. Das oben erhaltene
XbaI-BamHI-Fragment wurde stromaufwärts (das heißt XbaI-
und BamHI-Stellen) des GUS-Kodierungsbereichs
in dem pUCAPGUS-Plasmid inseriert. Aus dem resultierenden Plasmid
wurde ein DNS-Fragment, das den in 5'-Richtung stromaufwärts gelegenen Bereich des PetSPL3-Gens,
den GUS-Kodierungsbereich und die Terminatorregion der Nopalinsynthase
enthält,
mit AscI und PacI ausgeschnitten und in AscI- und PacI-Stellen von
pBINPLUS, in Beispiel 3 verwendet, inseriert. Das demzufolge konstruierte
Plasmid für
die Promotoranalyse (pBIN-PetSPL3-GUS) ist in 2b gezeigt.
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Beispiel 8: Expressionsmuster
des PetSPL3-Gens in einem Stamm.
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Das
oben genannte rekombinante Plasmid, das ein Polynucleotid aus dem
in 5'-Richtung stromaufwärts gelegenen
Bereich des PetSPL3-Gens stromaufwärts des GUS-Reportergens enthält, wurde
in Petunie (Petunia hybrida var. Mitchell) auf dieselbe Weise wie
in Beispiel 3 eingeführt.
Es wurde die Verteilung der GUS-Aktivität in einem jungen Stamm der
resultierenden Tranfsformante unter Verwendung von X-GUS als ein
Substrat in Übereinstimmung
mit einem gewöhnlichen
Verfahren (Murakami und Ohashi, Plant Cell Engineering, 14, 281-286,
(1992)) untersucht. Als ein Ergebnis wurde die GUS-Aktivität spezifisch
in den Blattachseln nachgewiesen (siehe 7), wodurch
gezeigt wird, dass die DNS-Region, die den in 5'-Richtung stromaufwärts gelegenen Teil des PetSPL3-Gens
enthält,
eine Promotoraktivität
spezifisch für
die Blattachselzellen hat. Folglich wurde angenommen, dass das PetSPL3-Gen
spezifisch in der Blattachsel exprimiert wurde. Diese Expressionsspezifität ist vollständig von
jener des SUPERMAN-Gens verschieden, welches spezifisch ist für die Primordien
an Staubblatt und Eizelle. Wenn dieser Unterschied und eine geringe Ähnlichkeit
der Aminosäuresequenzen
(Beispiel 2) in Betracht gezogen wird, wird geschlossen, dass PetSPL3
ein neuer Transkriptionsfaktor ist, der zu einer Klasse gehört, die
von jener des SUPERMAN unterschiedlich ist.
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Gemäß dem vorliegenden
Verfahren wird ein Gen, das einen Transkriptionsfaktor kodiert der
in der Lage ist, die Morphologie, Farbe und Ähnliches einer Pflanze zu ändern, bereitgestellt.
Durch Nutzen des vorliegenden Gens kann eine Pflanze mit einer geänderten
Eigenschaft hergestellt werden. Die erzeugte Pflanze ist gartenbautechnisch
nützlich,
da sie mit einer Eigenschaft versehen ist, die nicht oder nur selten
in einer Pflanze vom Wildtyp oder Gartenbautyp gefunden wird.
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