KR100298877B1 - 식물의형질을변화시키는전사인자의유전자및그의이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 a) 또는 b)로부터 선택된 DNA를 함유하는 유전자에 관한 것으로, a)는 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열의 90∼728번째 위치에 있는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 DNA이고, b)는 a)의 DNA와 스트린전트(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)되고, 그 식물의 형질을 변화시키는 전사 인자를 암호화하는 DNA이다.
Description
본 발명은 식물의 형질을 변화시킬 수 있는 전사 인자를 암호화하는 유전자 및 그의 이용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 페튜니아 하이브리다(Petunia hybrida)로부터 유래한 신규한 유전자인 PetSPL3 유전자, 그와 관련된 유전자 및 그의 이용에 관한 것이다.
식물의 형질, 예를 들면 꽃의 형태발생을 조절하는 조절 메카니즘을 확인하기 위하여 분자 생물학 및 분자 유전학적 연구가 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 안티리히눔 마주스(Antirrhinum majus) 및 페튜니아 하이브리다(Petunia hybrida)를 이용하여 수행되어 왔다. 상세하게는, 페튜니아 하이브리다는 다음과 같은 이유 : 원예식물로서의 높은 부가가치, 다양한 종의 존재, 형질전환의 간편성, 다량의 꽃에 기인한 관찰의 간편성 및 축적된 유전학적 발견(H. Takatsuji, "Molecular mechanism for determining a shape of a plant",Cell Technology, Plant Cell Technology Series (SHUJUNSHA), pp. 96∼106)으로 연구의 소재로써 바람직하게 이용된다.
변이를 유발하는 유전자를 상기 언급된 식물의 꽃 기관이 변형된 변이체로부터 분리한다. 결과적으로, 전사 인자가 꽃의 분화 및 형태발생에 중요한 기능을 한다는 사실을 확인하게 되었다. 예들 들면, 아라비돕시스 탈리아나의 SUPERMAN은 DNA 결합 도메인으로서 징크 핑거 모티프(zinc finger motif)를 지니는 전사인자이다. SUPERMAN 변이체에서 수술(stamen)의 수는 두드러지게 증가하고, 암술(pistil)의 결함이 생긴다는 사실이 알려져 있다(THE IDEN, April, 1997 (Vol.51, No. 4), pp. 34∼38).
식물의 형질을 조절하기 위한 메카니즘을 이해하기 위해서는 그 조절에 관련된 신규한 전사 인자를 확인하는 것이 중요하다. 꽃의 형태형성을 조절하는 전사 인자의 유전자를 유전자 조작법을 이용하여 식물로 도입할 수 있다. 유전자 도입에 따라 종래의 육종에 의해서는 수득되지 않거나, 수득되기 곤란한 신규한 형질을 지니는 꽃을 갖는 식물을 수득하는 것이 가능하다. 그러한 신규한 형질을 지닌 식물은 원예학적으로 가치가 있는 것으로 고려된다.
도 1은 PetSPL3 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 그로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2a는 PetSPL3 유전자를 함유하는 고도의 발현 벡터(pBIN-35S-PetSPL3)을 나타내는 개략도이고, 도 2b는 PetSPL3 유전자의 프로모터를 분석하기 위한 벡터(pBIN-PetSPL3-GUS)를 나타내는 개략도이다.
도 3은 PetSPL3 유전자로 형질전환된 페튜니아 하이브리다 내에 있는 PetSPL3 유전자의 mRNA를 검색한 변성된 아가로오스 겔 전기영동 상의 오토라디오그램(autoradiogram)을 나타낸 것이다.
도 4는 야생형 페튜니아 하이브리다의 식물체(좌측)와 PetSPL3 유전자로 형질전환된 페튜니아 하이브리다의 식물체(우측)의 형태 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 야생형 페튜니아 하이브리다의 잎(상단)과 PetSPL3 유전자로 형질전환된 페튜니아 하이브리다의 잎(하단)의 형태 사진을 나타낸 것이다.
도 6a는 야생형 페튜니아 하이브리다의 꽃의 형태 사진을 나타낸 것이고, 도 6b와 도 6c는 PetSPL3 유전자로 형질전환된 페튜니아 하이브리다의 꽃의 형태 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 PetSPL3 유전자로 형질전환된 페튜니아 하이브리다의 줄기의 GUS-염색 패턴을 나타낸 사진이다.
본 발명은 하기 a) 또는 b)로부터 선택된 DNA를 함유하는 유전자에 관한 것으로, a)는 하기 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열의 90∼728번째 위치에 있는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 DNA이거나, b)는 a)의 DNA와 스트린전트(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)되고, 그 식물의 형질을 변화시키는 전사인자를 암호화하는 DNA 이다.
본 발명은 하기 ⅰ) 또는 ⅱ)의 전사인자를 암호화하는 유전자에 관한 것으로, ⅰ)은 하기 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 1∼213번째 위치에 있는 아미노산 서열을 지닌 전사인자이거나, ⅱ)는 아미노산 서열 ⅰ)에 있어서 1종 이상의 아미노산이 삭제, 치환 또는 부가한 아미노산 서열을 지닌 것으로, 식물의 형질을 변화시킬 수 있는 전사인자이다.
본 발명의 한 실시태양에서, 식물의 형질은 꽃의 형태(morphology), 꽃의 색, 식물의 크기 및 가지의 수로 이루어진 그룹에서 선택된 하나를 포함한다.
본 발명의 형질전환 식물을 생산하는 방법은 상기 언급된 유전자를 식물 세포에 도입하고, 도입된 유전자를 지닌 식물 세포로부터 식물체를 재생하는 과정을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 식물은 쌍자옆 식물에 속한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 식물은 솔라나시에(Solanaceae)에 속한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 식물은 페튜니아(Petunia)에 속한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 유전자를 식물 발현 벡터로 합체한다.
본 발명의 형질전환 식물을 상기 언급된 방법에 의해 생산한다.
그러므로 여기에 개시된 발명은 (1) 식물의 형질을 변화시킬 수 있는 전사 인자를 암호화하는 유전자를 제공하고, (2) 그 유전자의 도입에 의해 변화된 형질을 지닌 식물을 생산하는 방법을 제공하며, (3) 형질전환 식물을 제공하는 장점을 가능하게 한다.
이들과 본 발명의 다른 장점들은 이하 도면에 수반되어 상세히 기재된 문헌들을 읽고 이해할 수 있는 당 분야에 통상의 지식을 가진자에게 명백할 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 사용된 "전사 인자"라는 용어는 mRNA 의 합성을 제어하기 위한 유전자 조절 영역 DNA 에 결합하는 단백질을 언급하는 것이다. 몇 가지 전사 인자가 그들의 DNA 결합 도메인에서 징크 핑거 모티프(zinc finger motif)로 불리워지는 고도로 보존된 아미노산 서열을 지니는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 유전자는 식물의 형질을 변화시키는 전사인자를 암호화하는 유전자이다. 이 유전자는 DNA 등을 함유하고 있는 바, a) 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열의 90∼728번째 위치에 있는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 DNA이거나, b) a)의 DNA와 스트린전트(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈시켜 그 식물의 형질을 변화시키는 전사인자를 암호화하는 DNA 이다.
본 발명의 유전자는 또한 식물의 형질을 변화시킬 수 있는 전사 인자를 암호화하는 DNA를 지니는데, a)의 DNA와의 상동성이 약 60% 또는 그 이상이고, 바람직하게는 약 70% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 또는 그 이상이며, 가장 바람직하게는 약 90% 또는 그 이상인 DNA인 것이다.
바람직하게는 본 발명의 유전자는 a)의 DNA를 함유한다.
본 발명의 유전자는 또한 하기 전사 인자 중의 하나를 암호화할 수 있다 :
ⅰ)은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 1∼213번째 위치에 있는 아미노산 서열을 지닌 전사인자이거나, ⅱ)는 아미노산 서열 ⅰ)에 있어서 1종 이상의 아미노산이 삭제, 치환 또는 부가한 아미노산 서열을 지닌 것으로, 식물의 형질을 변화시킬 수 있는 전사인자이다.
삭제, 치환 또는 부가한 아미노산의 수는 약 130 또는 그 이하, 바람직하게는 약 60 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 약 30 또는 그 이하, 가장 바람직하게는 20 또는 그 이하, 최고로 바람직하게는 10 또는 그 이하이다.
바람직하게 본 발명의 유전자는 ⅰ)의 전사 인자를 암호화한다.
본 발명에 가장 바람직한 유전자는 PetSPL3 유전자이다. 도 1은 이 유전자의 cDNA 서열(서열번호 1)과 그로부터 유추된 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸 것이다.
"식물의 형질"을 변화시킨다는 것은 적어도 식물의 하나의 형질에의 어떤 변화를 언급하는 것으로, 더욱 상세하게는, 꽃의 형태, 꽃의 색, 식물의 크기 및 가지의 수 중의 적어도 하나에의 어떤 변화를 언급하는 것이다. 이들의 변화를 유전자 도입 전 식물(야생형 또는 원예형)의 형질과 본 발명의 유전자 도입에 의해 수득된 식물의 형질을 비교함으로써 측정할 수 있다.
꽃의 형태 및/또는 꽃의 색의 변화은 식물 형질의 바람직한 변화의 예이다. (이하, "꽃"이라는 용어는 다른 방법으로 특정된 것이 아닌 한, 꽃잎(petal)을 언급하는 것이다.)
꽃의 변화된 형태의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만, 각각의 꽃잎 모양의 변형에 의해 유발된 형태(큰 꽃잎, 작은 꽃잎, 톱니 모양(sawtooth-shaped)의 꽃잎, 둥근 꽃잎, 주름 모양의 꽃잎 등), 꽃잎의 수의 변화에 의해 유발된 형태(겹꽃, 단꽃 등) 및 꽃잎의 비정상 발생에 의해 유발된 형태(별 모양의 꽃잎 등)를 포함한다.
꽃의 색 변화의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만, 백색, 진홍색(scarlet red), 연어 살빛(salmon pink), 적색, 분홍색, 푸른 보라색, 보라색, 연보라색, 하늘 빛, 붉은 보라 및 누르스름한 백색과 같은 단일 색과 둘 또는 그 이상의 색(예를 들면, 얼룩색, 점색, 주변 얼룩색, 꽃잎 가장자리의 도색)의 다중-색 패턴을 포함한다.
식물의 크기 변화의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만, 분재크기(dwarf) 및 중간 분재크기(semi-dwarf)이다. 왜소발육증(dwarfism)은 유전자 도입 전 식물의 표준 크기의 바람직하게는 약 1/2 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 1/3 또는 그 이하이다. 변화된 가지의 수의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만 증가된 가지이다.
식물의 변화된 형질은 바람직하게는 꽃잎, 이중 색 패턴, 분재크기, 또는 증가된 가지의 비정상적 발생에 의해 유발된 형태이고, 더욱 바람직하게는 그의 조합(예를 들면, 꽃잎의 비정상 발생과 이중 색 패턴의 조합 및/또는 분재크기와 증가된 가지의 조합)이다. 더욱 바람직하게는, 변화된 식물의 형질은 별 모양, 꽃잎 가장자리의 도색, 분재크기 또는 증가된 가지를 포함하고, 더욱 바람직하게는 그들의 조합(별 모양과 꽃잎 가장자기의 도색의 조합 및/또는 분재크기와 증가된 가지의 조합)이다.
본 발명의 유전자는 예들 들면, 공지의 전사 인자의 유전자에 따라 암호화된 아미노산 서열의 보존영역에 대응하는 한 쌍의 디제너레이티드(degenerated) 프라이머를 이용하여, 식물의 제놈 DNA를 주형으로서 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하고, 그후 수득한 증폭된 DNA 절편을 프로브로 이용하여 동일한 식물의 제놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리할 수 있다. 한 쌍의 프라이머의 예로는, 5'-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3' 또는 5'-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3'과 5'-ARNCKNARYTCNA RRTC-3'의 조합을 포함하며, 이때 N은 이노신(inocine), R 은 G 또는 A, Y 는 C 또는 T 이고, K 는 T 또는 G이다.
PCR은 조작자의 지시에 따라 통상적으로 이용되는 키트 및 기구, 또는 당 업자에게 잘 알려진 과정에 의해 수행된다. 유전자 라이브러리를 생산하는 방법에서, 스트린전트한 조건을 프로브와 융합하는데에 이용하고, 유전자를 클로닝하는 방법은 당업자의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다(예를 들면, Maniatis et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 개시되어 있다.)
그와 같이 수득된 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 당 분야에 공지된 뉴클레오타이드 서열 분석 방법 또는 통상적으로 이용되는 오토매틱 시퀀서(automatic sequencer)에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 유전자는 본래의 제놈으로부터 분리된 것에 한하지 않고, 합성 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 합성 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들면 당업자에게 공지된 과정을 이용하여 상기에 기재된 바와 같이 서열화된 유전자를 조작함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 유전자는 당업자에게 공지된 방법에 의해 적절한 식물 발현 벡터에 결합시키고, 공지된 유전자 재조합 기술에 의해 식물 세포로 도입할 수 있다. 도입된 유전자를 식물 세포의 DNA로 합체시킨다. 식물 세포의 DNA는 염색체 뿐만 아니라 식물 세포의 다양한 기관(예를 들면, 미토콘드리아, 엽록체 등)내에 함유된 DNA를 포함한다.
"식물"은 단자옆과 쌍자옆 모두를 포함한다. 바람직한 식물은 쌍자옆이다. 쌍자옆은 아르키클라미대(Archichlamidae)와 심페탈리대(Sympetalidae) 모두를 포함한다. 심페탈리대의 식물이 바람직한다. 심페탈리대의 식물의 예로는 젠티아날스(Gentianales), 솔라날스(Solanales), 라미알스(Lamiales), 칼리트리찰스(Callitrichales), 플랜타지날스(Plantaginales), 캠패눌랄스(Campanulales), 스크로풀라리알스(Scrophulariales), 루비알스(Rubiales), 딥사칼스(Dipsacales), 아스테랄스(Asterales) 및 그와 같은 것들을 포함한다. 솔라날스의 식물이 바람직하다. 솔라날스의 식물의 예로는 솔라나시에(Solanaceae), 하이드로필라시에(Hydrophyllaceae), 폴레모니아시에(Polemoniaceae), 쿠스쿠타시에(Cuscutaceae), 콘볼불라시에(Convolvulaceae) 및 그와 같은 것들을 포함한다. 솔라나시에가 바람직한다. 솔라나시에는 페튜니아(Petunia), 대튜라(Datura), 니코티아나(Nicotiana), 솔라눔(Solanum), 라이코퍼시콘(Lycopersicon), 캡시쿰(Capsicum), 피사리스(Physalis) 및 라이시움(Lycium) 등을 포함한다. 페튜니아, 대튜라 및 니코티아타의 식물이 바람직하다.
페튜니아는 가장 바람직하다. 페튜니아의 식물의 예로는 페튜니아 하이브리다(P. hybrida), 페튜니아 액실라리스(P. axillaris), 페튜니아 인플라타(P. inflata), 페튜니아 비오라세(P. violaceae) 및 그와 같은 것들을 포함한다. 페튜니아 하이브리다의 식물이 특히 바람직한다. "식물"이라는 용어는 다른 방법으로 특정되지 않는 한, 그로부터 수득된 꽃과 종자를 지닌 식물체로 언급되어 진다. "식물 세포"의 예로는 잎과 뿌리, 캘러스 및 현탁 배양세포와 같은 식물 기관으로부터의 세포를 포함한다.
여기에 사용된 "식물 발현 벡터"라는 용어는 본 발명의 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 등의 각종의 조절 엘레멘트가 숙주 식물 세포내에서 작동하도록 연결되어 있는 핵산 서열을 언급하는 것이다. 바람직하게는 식물 발현 벡터는 식물 프로모터, 터미네이터, 약물 내성 유전자 및 증진제를 포함한다. 식물 발현 벡터와 조절 엘레멘트의 타입이 숙주 세포의 타입에 따라 변할 수 있다는 사실은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 따라 이용되는 식물 발현 벡터는 나아가 T-DNA 영역을 함유할 수 있다. T-DNA 영역은 특히, 아그로박테리움을 식물의 형질전환에 사용할 때 유전자를 식물 제놈으로 효과적으로 도입되게 한다.
여기에 사용된 "식물 프로모터"라는 용어는 식물 내에서 발현하는 프로모터를 언급한다. 구성적 프로모터(constitutive promoter)와 꽃을 포함하는 식물체의 일부에 있어서 선택적으로 발현하는 프로모터가 바람직하다. 식물 프로모터의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만, 컬리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus ; CaMV) 35S 프로모터와 노파라인 신테이즈(nopaline synthase)의 프로모터를 포함한다.
여기에 사용된 "터미네이터"라는 용어는 mRNA 전사의 종결을 포함하는 단백질을 암호화하는 유전자의 하부 영역에 위치한 서열을 언급하는 것으로, 폴리 A 서열이 부가되어 있다. 터미네이터는 유전자의 발현 수준에 영향을 줌으로써 mRNA의 안정성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 터미네이터의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만, CaMV 35S 터미네이터와 노파라인 신테이즈 유전자의 터미네이터(Tnos)를 포함한다.
"약물 내성 유전자"가 형질전환된 식물의 선별을 용이하게 하기 위해 요구되어 진다. 본 발명에 사용되기 위한 약물 내성 유전자의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만, 가나마이신 내성을 부여하기 위한 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 Ⅱ(neomycin phosphotransferase Ⅱ ; NPTⅡ) 유전자와 하이그로마이신(hygromycin) 내성을 부여하기 위한 하이그로마이신 포스포트랜스퍼레이즈 유전자를 포함한다.
"증진제(enhancer)"를 관심있는 유전자의 발현 수준을 증진시키기 위해 사용할 수 있다. 증진제로서, 상기 언급된 CaMV 35S 프로모터의 서열 상부에 함유된 증진제 영역이 바람직하다. 1종 이상의 증진제가 하나의 식물 발현 벡터에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 식물 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려진 DNA 재조합 기술을 이용하여 생산할 수 있다. 식물 발현 벡터를 구축하기 위한 바람직한 벡터의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만, pBI-타입 벡터 또는 pUC-타입 벡터를 포함한다.
식물 발현 벡터를, 예를 들면 아그로박테리움으로 식물 세포를 감염하는 방법 또는 세포내로 벡터를 직접 도입하는 방법과 같은 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 식물 세포로 도입할 수 있다. 아그로박테리움을 이용하는 방법은, 예를 들면 나겔 등(Nagel et al.,Microbiol. Lett.,67, 325, 1990)에 기재된 대로 수행할 수 있다. 본 방법에 따라, 아그로박테리움을 일렉트로포레이션(electroporation)과 같은 것으로써 식물 발현 벡터로 처음 형질전환하고, 그 후 형질전환된 아그로박테리움을 잎-디스크(leaf-disk) 방법과 같은 공지된 방법에 의해 식물 세포로 감염시킨다. 세포로 식물 발현 벡터를 직접 도입하는 방법의 예로는, 그로 한정하는 것은 아니지만, 일렉트로포레이션 방법, 입자 총(particle gun) 법, 칼슘 포스페이트 방법 및 폴리에틸렌 글리콜 방법을 포함한다. 이 방법들은 당업자에게 잘 알려진 방법이고, 특정 식물을 형질전환시키기에 적당한 방법은 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
식물 발현 벡터가 도입된 세포를 예를 들면, 가나마이신에 대한 내성과 같은 그들의 약물 내성에 바탕을 두고 선별할 수 있다. 그후, 세포를 종래의 방법을 이용하여 식물체로 재발생시킨다.
재발생된 식물체내에서 본 발명의 도입된 유전자의 발현을 당업자에게 잘 알려진 과정을 이용하여 확인할 수 있다. 이러한 확인은 예를 들면, 노던 블럿 분석에 의해 수행할 수 있다. 더욱 상세하게는, 전체 RNA를 변이된 식물의 잎으로부터 추출하고, 변성된 아가로오스 겔 전기영동을 한 후, RNA를 적절한 막 위에 블럿팅한다. 블럿을 본 발명의 유전자로부터 mRNA를 검색하기 위해 도입된 유전자의 한 부분과 상보적으로 라벨링된 RNA 프로브로 융합할 수 있다.
본 발명의 식물은 상기 언급된 과정에 의해 생산된 형질전환 식물이다. 형질전환 식물의 변화된 형질(예를 들면, 꽃의 형태, 꽃의 색, 식물의 크기 및/또는 가지의 수)이 공지된 야생형 또는 원예형 타입에서는 발견되지 않는다는 사실은 바람직하다. 또한 식물의 변화된 형질이 원예적으로 가치가 있다는 것도 바람직하다. 게다가 꽃의 변화된 형질이 다음 세대에서도 안정하게 유지된다는 사실도 바람직하다.
이하, 본발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 하기의 실시예에서 사용하는 제한효소, 플라스미드 및 이와 같은 것들은 통상적인 공급원 으로부터 이용한다.
(실시예 1) PetSPL3 유전자의 분리
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 SUPERMAN 유전자에 의해 암호화된 단백질을 특히 콩의 뿌리혹에서 발현하는 GmN479유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교하였다(Kouchi et al., personal communication). 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용되는 세가지 다른 변형된 프라이머를 양쪽의 단백질에 공통적으로 존재하는 아미노산 서열에 기초를 두고 합성하였다. 유전자에서 두 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 5'→3'으로 각각 5'-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3'(프라이머 1: 아미노산 서열 QALGGH)과 5'-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3'(프라이머 2: 아미노산 서열 LGGHMN)이고, 유전자에서 3'→5' 방향 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 5'-ARNCKNARYTCNARRTC-3'(프라이머 3: 아미노산 서열 DLELRL)이며, 여기서 N은 이노신(inosine), Y는 C 또는 T, R은 G 또는 A, K는 T 또는 A이다.
첫 번째 세트의 PCR을 다음 조건 하에서 : 94℃에서 10분, 이후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 60초동안 30회 사이클링하고, 이어서 72℃에서 7분동안 Boutry, M and Chua N. H.EMBO J.4, 2159-2165(1985)에 기재된 방법에 따라 추출된 페튜니아(Petunia hybrida var. Mitchell)의 제놈(gemonic) DNA을 주형으로 사용하여 프라이머 1과 프라이머 3으로 수행하였다. 추가로, 두 번째 PCR을 첫번째 PCR로부터의 생성물의 일부분을 주형으로 사용하여 프라이머 2와 프라이머 3으로 수행하였다. 반응 조건은 첫 번째 PCR에서 사용된 것과 동일하였다. 증폭된 DNA 절편들을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen 에서 제조함)로 삽입한 후, 종래의 방법에 따라 대장균(E. Coli)에 도입하였다. 플라스미드를 형질전환된 대장균으로부터 추출하고, DNA 절편의 뉴클레오타이드 서열을 확인하였다. SUPERMAN과 GmN479이 공통으로 지니는 징크 핑거 모티프(zinc finger motif)가 야기된 DNA 절편 내에서 암호화된다는 사실이 밝혀졌다. 이 DNA 절편이 유추된 유전자를 PetSPL2 유전자라고 명명하였다. 동일한 시리즈의 실험에서, PetSPL3 유전자와 동일한 서열을 함유하는 3개의 다른 DNA들(PetSPL1, 2 및 4 유전자)의 존재를 증명하였다.
EcoRⅠ-EcoRⅠ 절편을 상기에 기재된 PCR-증폭된 DNA 절편을 함유하는 플라스미드로부터 절단하였다. 이 DNA 절편을 방사선 라벨링된 프로브를 생산하기 위해 종래의 랜덤 프라임 방법(Sambrook et al., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(Cold Spring Harbor Laboratory))을 이용하여 [α-32P]dCTP로 라밸링하였다. 이 라벨링된 프로브를 이용하여, EMBL3 벡터(Stratagene 사에서 제조됨)에서 생산되는 페튜니아(Petunia hybrida var. Mitchell)의 제놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 이 스크리닝에 의해 수득된 클론은 약 3.2kb의 제놈 DNA 절편을 함유했다. 이 절편을 pBluescript 벡터(pBS/PetSPL3)의 XbaⅠ 부위로 서브클론하였다. 그 후, 페튜니아 하이브리다로부터 유래된 PetSPL3 유전자를 분리하였다.
(실시예 2) PetSPL3 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 아미노산 서열의 분석
실시예 1에서 수득한 pBS/PetSPL3 벡터로부터, PetSPL3 유전자의 단백질 코딩 영역(HindⅢ 위치와 XbaⅠ 위치 사이의 영역)을 함유하는 영역을 수득하여 더 나아가 pBluescript 벡터(pBS/PetSPL3-HX)로 서브클론하고, 그 후 단백질 코딩 영역의 DNA 뉴클레오타이드 서열을 확인하였다(서열 번호 1). 얻어진 DNA 뉴클레오타이드 서열내에 포함된 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 단백질의 아미노산 서열을 유추하였다.
뉴클레오타이드 서열의 비교에서 PetSPL3 유전자와 SUPERMAN, PetSPL1, PetSPL2 및 PetSPL4 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 각각 29%, 37%, 52% 및 23%의 상동성을 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열의 비교는 단지 각 유전자의 코딩 영역(coding region) 내에서만 수행하였다.
유추된 PetSPL3의 아미노산 서열은 SUPERMAN의 아미노산 서열과 유사한 단일 TFIIIA-타입 징크 핑거 모티프를 포함하고 있다. 이를 바탕으로, PetSPL3가 전사인자라는 사실을 추정하게 되었다. 또한 본 발명에 의해 클론되는 PetSPL1과 PetSPL2는 전체 아미노산 수준에서 SUPERMAN과 약 35%의 상동성을 나타냈다. 반면, PetSPL3는 전체 아미노산 수준에서 SUPERMAN과 약 20%의 상동성을 나타냈다.
게다가 징크 핑거 모티프에 있어서 PetSPL3의 SUPERMAN에 대한 아미노산 서열 상동성은 약 20%를 나타내어, PetSPL1과 PetSPL2의 SUPERMAN에 대한 상동성(각각, 약 38% 와 35%)보다 낮다. 표 1은 SUPERMAN 및 각 PetSPL의 징크 핑거 모티프 내에 있어서 아미노산 서열을 비교한 것이다. 표 1은 또한 각각의 PetSPL들과 SUPERMAN의 C-말단 소수성 영역(C-terminal hydrophobic region)의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
상기에 개시된 결과로부터 PetSPL3는 SUPERMAN, PetSPL1 및 PetSPL2와는 다른 클래스에 속하는 신규한 전사 인자라는 것이 추정된다. 또한 이는 PetSPL3와 SUPERMAN의 발현 패턴 내의 차이에 의해 지지되어진다.
(실시예 3) PetSPL3 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 식물 발현 벡터의 제조
플라스미드 pBI221(Clontech로부터 구입)에서 CaMV 35S 프로모터를 함유하는 DNA 절편(HindⅢ-XbaⅠ 절편)과 NOS 터미네이터를 함유하는 DNA 절편(SacI-EcoRI 절편)은 pUCAP35S를 생산하기 위해서 플라스미드 pUCAP(van Engelen, F. A. et al.,Transgenic Res. 4:288-290, 1995)의 멀티클로닝 부위(multicloning site)로 순차적으로 삽입하였다. 한편, PetSPL3를 함유하는 pBS/PetSPL3-HX 플라스미드를 HindⅢ(0 위치)와 AccI(258 위치) 부위에서 절단하였다. 클리노우(Klenow) 효소로 양쪽의 절단된 터미널 말단을 무디게 하고, 다시 양쪽의 말단을 연결함으로써 번역 개시 부위의 상부 258bp DNA 영역을 제거하였다. PetSPL3을 암호화하는 DNA 절편(KpnI-SacI 절편)을 야기된 플라스미드로부터 절단하고, 상기 개시된 플라스미드 pUCAP35의 KpnI과 SacI 사이에 삽입하였다. 이 재조합 플라스미드를 AscI와 PacI로 더욱 절단하고, PetSPL3을 암호화하는 야기된 DNA 절편을 바이너리 벡터(binary vector) pBINPLUS의 AscI과 PacI 부위로 도입하였다.
제조된 PetSPL3 유전자(pBIN-35S-PetSPL3)를 위한 고도의 발현 벡터는 도 2a에 개시된 바와 같이, CaMV 35S 프로모터 영역(P35; 0.9kb), PetSPL3(PetSPL3; 0.8kb)를 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 노파라인 신테이즈의 터미네이터 영역(Tnos; 0.3kb)을 포함하였다. 도 2에서, Pnos와 NPTⅡ는 각각 노파라인 신테이즈와 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 Ⅱ 유전자의 프로모터 영역을 나타낸다.
(실시예 4) 페튜니아 세포로 PetSPL3 유전자의 도입
(1) 아그로박테리움 튜메파시앤스(Agrobacterium tumefaciens)의 형질전환
아그로박테리움 튜메파시앤스 LBA4404 라인(Clontech로부터 구입)을 250㎍/㎖의 스트랩토마이신(streptomycin)과 50㎍/㎖의 리팜피신(rifampicin)을 함유하는 L 배지에서 28℃로 배양하였다. Nagel 등의(1990)(supra) 방법에 따라, 이 균주의 세포 현탁액을 준비하였다. 실시예 3에서 제조된 PetSPL3 유전자의 고도 발현 벡터를 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 상기 기재된 균주로 도입하였다.
(2) 페튜니아 세포로 PetSPL3를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 도입
(1)에서 수득된 아그로박테리움 튜메파시앤스 LBA4404 라인을 YEB 배지(D. M. Glover ed.DNA Cloing, IPL PRESS, second edition, p.78)에서 교반하면서 배양(28℃에서 200 rpm)하고, 이후 멸균된 증류수로 20배 희석하였다. 페튜니아(Petunia hybrida var. Mitchell) 잎 부분을 이 희석된 액에서 배양하였다. 2∼3일 후, 아그로박테리움을 카르베니실린(carbenicillin)을 함유하는 배지를 사용하여 제거한 후, 이 잎 부분을 2주 마다 새로운 배지로 옮겨줌으로써 선택배지에서 부배양하였다. 상기 언급된 PetSPL3 유전자와 함께 도입된 pBINPLUS로부터 유도된 NPTⅡ 유전자의 발현에 의해 부여되는 가나마이신의 내성을 형질전환된 페튜니아 세포를 선택하기 위한 지표로서 사용하였다. 캘러스는 종래의 방법을 이용하여 형질전환된 세포로부터 유도된 후 식물체로 재분화하였다.
(실시예 5) PetSPL3 형질전환 식물에서 PetSPL3의 발현
전체 RNA를 실시예 4에서 수득한 14개의 PetSPL3로 형질변환된 페튜니아의 잎으로부터 추출하였다. 10㎍의 각 추출물들을 변성된 아가로즈 겔 전기영동(denatured agarose gel elctrophoresis) 하였고, 종래의 방법에 따라 제네스크린 플러스 필터(Genescreen plus filter ; DuPont에서 제조함)에 블럿팅하였다. PetSPL3 안티센스 RNA를 DIG RNA 라벨링 키트(Boeringer Mannheim에서 제조함)를 사용하여 라벨링 하였다. 융합과 필터 세척을 키트의 지시에 따라 라벨된 RNA로 수행하였다. 세척한 후, 필터를 실온에서 1시간 동안 XAR 필름(Kodak에서 제조함)에 노출하였다. 도 3은 14개의 페튜니아 개체중 9개에서 검색된 PetSPL3 유전자 mRNA의 변성된 아가로즈 겔 전기영동의 상을 나타낸 오토라디오그램(autoradiogram)이다. 이 결과들은 14개 각각의 형질전환된 페튜니아 중 3개가 고발현 프로모터의 제어로 인해 PetSPL3 mRNA를 높은 수준으로 발현한다는 것을 나타내었다.
(실시예 6) 높은 수준으로 PetSPL3 유전자를 발현하는 형질전환된 페튜니아의 표현형
표현형(Phenotypes)은 하기 기재된 높은 수준으로 PetSPL3 유전자를 발현하는 3개의 형질전환된 페튜니아에서 공통적으로 관찰되었다. 첫 번째, 식물체에서 관찰되는 변화는 식물의 왜소발육증을 지닌 두드러진 가지로, 가지 끝 우세 발육성(apical dominance)의 감소로 야기된다(도 4; 좌측 패널은 야생형 패튜니아를 개시한 것이고, 우측 패널은 PetSPL3-형질전환된 페튜니아를 개시한 것). 안토시아닌 색소의 침착으로 야기된 보다 작고 보라색을 띄는 잎이 표면 전체에서 관찰되었다(도 5 ; 상부 패널은 야생형 페튜니아의 잎을 개시한 것이고, 하부 패널은 PetSPL3-형질전환된 패튜니아의 잎을 개시한 것). 꽃에 있어서, 야생형 꽃의 상부에서는 거의 둥근 모양이고, 반면 PetSPL3 형질전환된 꽃은 별모양이었다(도 6 ; (a): 야생형 페튜니아 꽃, (b) 및 (c): PetSPL3-형질전환된 페튜니아 꽃). 이는 꽃잎 확장에서의 비정상에 의해 야기된 것으로 추정되었다. 본 실험에서 사용된 페튜니아의 변종인 Mitchell은 백색 꽃잎을 지닌다. 이는 꽃잎의 색을 조절하는 an2와 같은 조절 유전자내의 돌연변이의 결과로 설명되어진다(Quattrocchio, F., Ph.D. thesis in Amsterdam Free University (1994)). 반대로, PetSPL3-형질전환된 페튜니아에서는, 꽃잎의 끝 둘레에서만 연보라색을 나타내었다(도 6c).
상기 기재된 결과들은 PetSPL3-형질전환된 페튜니아 꽃의 형태 및/또는 색 패턴이 전혀 발견되지 않거나, 또는 페튜니아 하이브리다의 야생형 및 원예형 종에서 극히 드물게 발견된다는 사실을 나타낸다. 본 발명자들이 인지하고 있는 범위에서, 그러한 형질들을 유전공학적 수단에 의해 식물 꽃에 적용하는 예는 보고되어 있지 않다. 추가로, PetSPL3-형질전환된 페튜니아는 분재이고 증가된 가지를 지닌다. 이러한 형질들은 원예적으로 매우 유용하다.
(실시예 7) GUS 리포터 유전자의 상부에 있는 PetSPL3 유전자의 5' 상부 영역으로부터 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 식물 발현 벡터의 제조
실시예 7과 8에서는, 그 발현 패턴을 제공하는 PetSPL3 유전자의 프로모터 활성을 분석하였고, SUPERMAN 유전자와 다른 PetSPL 유전자들의 것과 비교하였다.
PetSPL3 유전자의 번역 개시 부위의 약 70bp 상부에 존재하는 서열을 함유한 프라이머, BamHI 인식 서열(ACTGGATCCCATTAGAGAGAGAGAG) 및 벡터내에 서열에 상응하는 M13 리버스 프라이머(GGAAACAGCTATGACCATG)를, 주형으로서 상기 기재된 플라스미드 pBS/PetSPL3를 사용하여 PCR을 수행하는데 이용하고, 그로인해 증폭된 약 2.4kb 의 DNA 절편은 PetSPL3 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 것으로 믿어진다. 이 DNA 절편을 절편 양쪽 끝에 가까이 존재하는 XbaI 와 BamHI 부위에서 절단하였다. β-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase ; GUS) 코딩 영역을 함유하는 XbaI-EcoRI 절편과 pBI221(Clontech 로부터 구입)로부터 절단한 노파라인 신테이즈 유전자의 터미네이터를 pUCAPGUS 플라스미드를 수득하기 위해 pUCAP(van Engelen, F. A. et al., (1995), supra)의 XbaI 와 EcoRI 부위 사이에 삽입하였다. 상기 수득한 XbaI-BamHI 절편을 pUCAPGUS 플라스미드 내의 GUS 코딩 영역의 상부(예를 들면, XbaI 와 BamHI 부위)에 삽입하였다. 야기된 플라스미드로부터, PetSPL3 유전자의 5' 상부 영역을 함유하는 DNA 절편, GUS 코딩 영역 및 노파라인 신테이즈의 터미네이터 영역을 AscI 와 PacI로 절단하고, 실시예 3에서 사용한 pBINPLUS의 AscI 와 PacI 부위로 삽입하였다. 프로모터 분석(pBIN-PetSPL3-GUS)을 위해 그와 같이 제조된 플라스미드를 도 2b에 개시하였다.
(실시예 8) 줄기에서 PetSPL3 유전자의 발현 패턴
GUS 리포터 유전자 상부의 PetSPL3 유전자 5' 상부 영역으로부터의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 상기 언급된 재조합 플라스미드를 실시예 3과 동일한 방법으로 페튜니아(Petunia hybrida var. Mitchell)에 도입하였다. GUS 활성의 분포를 종래의 방법에 따라 기질로서 X-GUS를 사용하여 야기된 형질전환체의 어린 줄기에서 관찰하였다(Murakami and Ohashi,Plant Cell Engineering,14, 281∼286, (1992)). 결과로서, GUS 활성을 특이하게 옆액(leaf axile)에서 검색하였고(도 7을 보라), PetSPL3 유전자의 5'상부 영역을 함유하는 DNA 영역은 옆액 세포에 대해 특이적인 활성을 지닌다는 것이 나타났다. 그러므로, PetSPL3 유전자는 옆액에서 특이적으로 발현한다는 것을 추정하게 되었다. 이러한 발현 특이성은 전체적으로 수술과 암술의 근원(primordia)에 특이적인 SUPERMAN 유전자의 것과는 다르다. 아미노산 서열의 낮은 유사성(실시예 2)과 이러한 차이로, PetSPL3가 SUPERMAN의 것과는 다른 클래스에 속하는 신규한 전사 인자라는 결론에 이르게 되었다.
본 발명에 따라, 식물의 형태, 색 및 그와 같은 것들을 변형할 수 있는 전사 인자를 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자를 이용함으로써, 형질이 변화된 식물을 생산할 수 있다. 생산된 식물은 야생형이나 원예형에서 발견할 수 없거나 드물게 발견되는 형질을 제공하기 때문에 원예적으로 유용하다.
여러 가지의 변화가 당 기술의 분야에 있어서 본 발명의 범위와 정신에 따라 행해질 수 있다. 따라서 청구범위는 본 명세서의 기재에 한정되는 것은 아니고, 넓게 해석될 수 있다.
Claims (8)
- 하기 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열의 90~728번째 위치에 있는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 DNA를 포함하는 유전자.(서열 1)
- 하기 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 1~213번째 위치에 있는 아미노산 서열을 지닌 전사 인자를 암호화는 유전자.(서열 2)
- 제1항에 있어서, 상기 식물의 형질은 꽃의 형태, 꽃의 색, 꽃의 크기 및 가지의 수로 구성된 그룹에서 선택된 하나임을 특징으로 하는 유전자.
- 제1항의 유전자를 식물세포에 도입하고, 도입된 유전자를 지닌 식물세포를 식물체로 재생하는 과정을 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
- 제4항에 있어서, 식물은 쌍자옆에 속하는 식물임을 특징으로 하는 형질전환 식물의 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 식물은 솔라나시에(Solanaceae)에 속하는 식물임을 특징으로 하는 형질전환 식물의 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 식물은 페튜니아(Petunia)에 속하는 식물임을 특징으로 하는 형질전환 식물의 제조 방법.
- 제4항에 있어서, 유전자를 식물 발현 벡터에 합체시킴을 특징으로 하는 형질전환 식물의 제조 방법.
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