JP2005518805A - 花組織においてトランスジーンを発現させるためのlisプロモーター - Google Patents
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Abstract
本発明は植物の少なくとも1個の花において少なくとも1個の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子に高レベルの発現を付与するために使用することができるS−リナルールシンターゼ遺伝子に由来する単離プロモーターに関する。
Description
本発明は植物遺伝子工学に関する。より詳細には、本発明は、植物の少なくとも1個の花において、少なくとも1個の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の高レベルの発現を誘導することが可能なS−リナルールシンターゼ遺伝子に由来する単離プロモーター、植物の少なくとも1個の花において優先的に発現されるトランスジーン、及び前記トランスジーンを含む形質転換植物に関する。
植物組織でトランスジーンが発現するためには、植物の内部で機能的なプロモーターが機能的に連結されていることが必要である。プロモーター配列の選択により、植物内の何処で何時トランスジーンが発現されるかが決まる。構成的、誘導的、及び組織特異的プロモーター等の多数の異なる型のプロモーターが当分野で公知である。構成的プロモーターは植物の細胞全体でトランスジーンの連続発現が所望される場合に使用される。当分野で公知の構成的プロモーターとしては限定されないが、コメアクチン1(Wangら,Molecular and Cellular Biology,12(8):3399−3406(1992),米国特許第No.5,641,876号)、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S RNA(Odellら,Nature,313:810−812(1985))、CaMV 19S RNA(Lawtonら.,Plant Mol.Biol.,49:95−106(1987))、nos(Ebertら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:5745−5749(1987))、Adh1(Walkerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6624−6628(1987))等が挙げられる。誘導的プロモーターは刺激に応答する遺伝子発現が所望される場合に使用される。当分野で公知の誘導的プロモーターとしては限定されないが、アブシシン酸ABA及び膨圧誘導プロモーター、オーキシン結合蛋白質遺伝子のプロモーター(Schwobら,Plant J.,4(3):423−432(1993))、UDPグルコースフラボノイドグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター(Ralstonら,Genet.,119(1):185−197(1988))等が挙げられる。組織特異的プロモーターは特定組織又は臓器での発現が所望される場合に使用される。当分野で公知の組織特異的プロモーターの例としては限定されないが、レクチン(Vodkinら,Cell,34:1023(1983),Lindstronら,Developmental Genetics,11:160(1990)),エンドウマメ小サブユニットRuBPカルボキシラーゼ(Poulsenら,Mol.Gen.Genet.,205(2):193−200(1986),Cashmoreら,Gen.Eng.of Plants,Plenum Press,New York 29−38(1983))、Tiプラスミドマンノピンシンターゼ(Langridgeら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3219−3223(1989))、ペチュニアカルコンイソメラーゼ(Van Tunenら,EMBO J.,7:1257(1988))等が挙げられる。
多数の異なる型のプロモーターが当分野で公知であるが、トランスジェニック植物において外来遺伝子の高レベル発現を誘導する能力等の有益な発現特性をもつ新規プロモーターの発見が必要である。
1態様において、本発明はプロモーターをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。本発明のプロモーターは植物の少なくとも1個の花において少なくとも1個の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の転写を開始することができる。この単離ポリヌクレオチドは配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつ。本発明は上記配列のフラグメント及び変異体にも関する。配列が配列番号2とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で42℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で65℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
第2の態様では、本発明は植物の少なくとも1個の花において少なくとも1個の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の転写を開始するのに優先的に活性なプロモーターをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。この単離ポリヌクレオチドは配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつ。本発明は上記配列のフラグメント及び変異体にも関する。配列が配列番号2とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で42℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で65℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
更に別の態様では、本発明は上記単離プロモーターを含む発現カセットに関する。本発明の発現カセットはポリヌクレオチド配列に機能的に連結された上記プロモーターを含む。このプロモーターは発現カセットで形質転換された植物の少なくとも1個の花において前記ポリヌクレオチド配列の転写と発現を開始することができる。プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列は発現カセットにセンス又はアンチセンス方向に挿入されている。
更に別の態様では、本発明は上記発現カセットを含む発現ベクターに関する。
更に別の態様では、本発明は上記発現カセットで安定的に形質転換された植物又は植物部分に関する。形質転換可能な植物部分としては限定されないが、細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯が挙げられる。形質転換可能な植物は単子葉植物でも双子葉植物でもよい。単子葉植物の例としては限定されないが、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)(ネギ属(Allium)、スイセン属(Narcissus));イネ科(Graminae又はPoaceae)(カラスムギ属(Avena)、オオムギ属(Hordeum)、イネ属(Oryza)、キビ属(Panicum)、チカラシバ属(Pennisetum)、ナガハグサ属(Poa)、サトウキビ属(Saccharum)、ライムギ属(Secale)、モロコシ属(Sorghum)、コムギ属(Triticum)、トウモロコシ属(Zea))が挙げられる。双子葉植物の例としては限定されないが、キョウチクトウ科(Apocynaceae)(ニチニチソウ属(Catharanthus));キク科(Asteraceae又はCompositae)(アスター属(Aster)、キンセンカ属(Calendula)、エゾギク属(Callistephus)、キクニガナ属(Cichorium)、ハリシャギク属(Coreopsis)、ダリア属(Dahlia)、キク属(Dendranthema)、クンショウギク属(Gazania)、ガーベラ属(Gerbera)、ヒマワリ属(Helianthus)、ムギラワギク属(Helichrysum)、アキノノゲシ属(Lactuca)、オオハンゴンソウ属(Rudbeckia)、マンジュギク属(Tagetes)、ヒャクニチソウ属(Zinnia));ツリフネソウ科(Balsaminaceae)(ツリフネソウ属(Impatiens));シュウカイドウ科(Begoniaceae)(ベゴニア属(Begonia));ナデシコ科(Caryophyllaceae)(ナデシコ属(Dianthus));アカザ科(Chenopodiaceae)(フダンソウ属(Beta)、ホウレンソウ属(Spinacia));ウリ科(Cucurbitaceae)(スイカ属(Citrullus)、カボチャ属(Cucurbita)、キュウリ属(Cucumis));アブラナ科(Cruciferae)(イワナズナ属(Alyssum)、アブラナ属(Brassica)、エゾスズシロ属(Erysimum)、アラセイトウ属(Matthiola)、ダイコン属(Raphanus));リンドウ科(Gentianaceae)(トルコギキョウ属(Eustoma));フウロソウ科(Geraniaceae)(テンジクアオイ属(Pelargonium));トウダイグサ科(Euphorbiaceae)(ポインセチア属(Poinsettia));シソ科(Labiatae)(サルビア属(Salvia));マメ科(Leguminosae)(ダイズ属(Glycine)、レンリンソウ属(Lathyrus)、ウマゴヤシ属(Medicago)、インゲンマメ属(Phaseolus)、エンドウ属(Pisum));ユリ科(Liliaceae)(ユリ属(Lilium));サワギキョウ科(Lobeliaceae)(ミゾカクシ属(Lobelia));アオイ科(Malvaceae)(トロロアオイ属(Abelmoschus)、ワタ属(Gossypium)、ゼニアオイ属(Malva));イソマツ科(Plumbaginaceae)(リモニウム属(Limonium));ハナシノブ科(Polemoniaceae)(フロックス属(Phlox));サクラソウ科(Primulaceae)(シクラメン属(Cyclamen));キンボウゲ科(Ranunculaceae)(トリカブト属(Aconitum)、イチリンソウ属(Anemone)、オダマキ属(Aquilegia)、リュウキンカ属(Caltha)、オオヒエンソウ属(Delphinium)、キンポウゲ属(Ranunculus));バラ科(Rosaceae)(バラ属(Rosa));アカネ科(Rubiaceae)(ペンタス属(Pentas));ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)(アンゲロニア属(Angelonia)、キンギョソウ属(Antirrhinum)、トレニア属(Torenia));ナス科(Solanaceae)(トウガラシ属(Capsicum)、トマト属(Lycopersicon)、タバコ属(Nicotiana)、ペチュニア属(Petunia)、ナス属(Solanum));セリ科(Umbelliferae)(オランダミツバ属(Apium)、ニンジン属(Daucus)、パースニップ属(Pastinaca));クマツヅラ科(Verbenaceae)(クマツヅラ属(Verbena)、ランタナ属(Lantana));スミレ科(Violaceae)(スミレ属(Viola))が挙げられる。
更に別の態様では、本発明は上記発現カセットを含む上記植物により生産された種子に関する。
更に別の態様では、本発明はポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたキメラプロモーターを含む発現カセットに関する。この発現カセットにおいて使用されるキメラプロモーターは(a)植物の少なくとも1個の花において少なくとも1個の目的とする機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の転写を開始することが可能であり、配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにこれらの配列のフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつ第1のポリヌクレオチドと、(b)植物においてポリヌクレオチド配列又は選択遺伝子の転写を開始することが可能な少なくとも第2のポリヌクレオチド配列を含む。場合により、キメラプロモーターを構成する第2のポリヌクレオチド配列は配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつ。これらの配列のフラグメント及び変異体も本発明の範囲に含まれる。キメラプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドは発現カセットにセンス又はアンチセンス方向に挿入することができる。
更に別の態様では、本発明はキメラプロモーターを含む上記発現カセットを含む発現カセットを含む発現ベクターに関する。
更に別の態様では、本発明はキメラプロモーターを含む上記発現カセットで安定的に形質転換された植物又は植物部分に関する。形質転換可能な植物部分としては限定されないが、細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯が挙げられる。形質転換可能な植物は単子葉植物でも双子葉植物でもよい。単子葉植物の例としては限定されないが、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)(ネギ属(Allium)、スイセン属(Narcissus));イネ科(Graminae又はPoaceae)(カラスムギ属(Avena)、オオムギ属(Hordeum)、イネ属(Oryza)、キビ属(Panicum)、チカラシバ属(Pennisetum)、ナガハグサ属(Poa)、サトウキビ属(Saccharum)、ライムギ属(Secale)、モロコシ属(Sorghum)、コムギ属(Triticum)、トウモロコシ属(Zea))が挙げられる。双子葉植物の例としては限定されないが、キョウチクトウ科(Apocynaceae)(ニチニチソウ属(Catharanthus));キク科(Asteraceae又はCompositae)(アスター属(Aster)、キンセンカ属(Calendula)、エゾギク属(Callistephus)、キクニガナ属(Cichorium)、ハリシャギク属(Coreopsis)、ダリア属(Dahlia)、キク属(Dendranthema)、クンショウギク属(Gazania)、ガーベラ属(Gerbera)、ヒマワリ属(Helianthus)、ムギラワギク属(Helichrysum)、アキノノゲシ属(Lactuca)、オオハンゴンソウ属(Rudbeckia)、マンジュギク属(Tagetes)、ヒャクニチソウ属(Zinnia));ツリフネソウ科(Balsaminaceae)(ツリフネソウ属(Impatiens));シュウカイドウ科(Begoniaceae)(ベゴニア属(Begonia));ナデシコ科(Caryophyllaceae)(ナデシコ属(Dianthus));アカザ科(Chenopodiaceae)(フダンソウ属(Beta)、ホウレンソウ属(Spinacia));ウリ科(Cucurbitaceae)(スイカ属(Citrullus)、カボチャ属(Cucurbita)、キュウリ属(Cucumis));アブラナ科(Cruciferae)(イワナズナ属(Alyssum)、アブラナ属(Brassica)、エゾスズシロ属(Erysimum)、アラセイトウ属(Matthiola)、ダイコン属(Raphanus));リンドウ科(Gentianaceae)(トルコギキョウ属(Eustoma));フウロソウ科(Geraniaceae)(テンジクアオイ属(Pelargonium));トウダイグサ科(Euphorbiaceae)(ポインセチア属(Poinsettia));シソ科(Labiatae)(サルビア属(Salvia));マメ科(Leguminosae)(ダイズ属(Glycine)、レンリンソウ属(Lathyrus)、ウマゴヤシ属(Medicago)、インゲンマメ属(Phaseolus)、エンドウ属(Pisum));ユリ科(Liliaceae)(ユリ属(Lilium));サワギキョウ科(Lobeliaceae)(ミゾカクシ属(Lobelia));アオイ科(Malvaceae)(トロロアオイ属(Abelmoschus)、ワタ属(Gossypium)、ゼニアオイ属(Malva));イソマツ科(Plumbaginaceae)(リモニウム属(Limonium));ハナシノブ科(Polemoniaceae)(フロックス属(Phlox));サクラソウ科(Primulaceae)(シクラメン属(Cyclamen));キンボウゲ科(Ranunculaceae)(トリカブト属(Aconitum)、イチリンソウ属(Anemone)、オダマキ属(Aquilegia)、リュウキンカ属(Caltha)、オオヒエンソウ属(Delphinium)、キンポウゲ属(Ranunculus));バラ科(Rosaceae)(バラ属(Rosa));アカネ科(Rubiaceae)(ペンタス属(Pentas));ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)(アンゲロニア属(Angelonia)、キンギョソウ属(Antirrhinum)、トレニア属(Torenia));ナス科(Solanaceae)(トウガラシ属(Capsicum)、トマト属(Lycopersicon)、タバコ属(Nicotiana)、ペチュニア属(Petunia)、ナス属(Solanum));セリ科(Umbelliferae)(オランダミツバ属(Apium)、ニンジン属(Daucus)、パースニップ属(Pastinaca));クマツヅラ科(Verbenaceae)(クマツヅラ属(Verbena)、ランタナ属(Lantana));スミレ科(Violaceae)(スミレ属(Viola))が挙げられる。
更に別の態様では、本発明はキメラプロモーターを含む上記発現カセットを含む上記植物により生産された種子にも関する。
更に別の態様では、本発明は植物の少なくとも1個の花において転写を誘導することが可能なプロモーターを含むDNA分子で安定的に形質転換されたトランスジェニック植物細胞に関する。プロモーターは配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む。これらの配列のフラグメント及び変異体も本発明に含まれる。植物細胞を形質転換するために使用されるDNA分子は更にプロモーターに機能的に連結された選択コーディング領域を含む。この選択コーディング領域はセンス方向でもアンチセンス方向でもよい。更に、選択コーディング領域は昆虫耐性蛋白質、細菌病耐性蛋白質、真菌病耐性蛋白質、ウイルス病耐性蛋白質、アントシアニン生合成酵素、カロテノイド生合成酵素、花の香り生合成蛋白質、スクリーニング可能なマーカー蛋白質又は花の寿命を促進する蛋白質をコードすることができる。選択コーディング領域がスクリーニング可能なマーカーをコードする場合には、前記スクリーニング可能なマーカーはβ−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン及びグリーン蛍光蛋白質から構成される群から選択することができる。選択コーディング領域がアントシアニン生合成酵素をコードする場合には前記アントシアニン生合成酵素はペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、及びペツニジンの化合物を産生することができる。選択コーディング領域がカロテノイド生合成酵素をコードする場合には、前記カロテノイド生合成酵素はフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、アドニルビン及びアドニキサンチンの化合物を産生することができる。
配列が配列番号2とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で42℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で65℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
更に別の態様では、本発明はトランスジェニック植物の少なくとも1個の花において第1のポリヌクレオチド配列を選択的に発現させる方法に関する。本方法は発現カセットを含む発現ベクターで植物又は植物細胞を形質転換する段階を含み、前記発現カセットはプロモーターと前記プロモーターに機能的に連結された第1のポリヌクレオチド配列を含み、プロモーターは植物の少なくとも1個の花において前記第1のポリヌクレオチド配列の転写を開始し、発現を誘導することが可能であり、配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む。これらの配列のフラグメント及び変異体も本発明の範囲に含まれる。第1のポリヌクレオチドは発現カセットにセンス又はアンチセンス方向に挿入される。
配列が配列番号2とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で42℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で65℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
発現カセットに挿入された第1のポリヌクレオチド配列は昆虫耐性蛋白質、細菌病耐性蛋白質、真菌病耐性蛋白質、ウイルス病耐性蛋白質、アントシアニン生合成酵素、カロテノイド生合成酵素、花の香り生合成蛋白質、スクリーニング可能なマーカー蛋白質又は花の寿命を促進する蛋白質をコードすることができる。第1のポリヌクレオチド配列がスクリーニング可能なマーカーをコードする場合には、前記スクリーニング可能なマーカーはβ−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン及びグリーン蛍光蛋白質から構成される群から選択することができる。第1のポリヌクレオチド配列がアントシアニン生合成酵素をコードする場合には前記アントシアニン生合成酵素はペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、及びペツニジンの化合物を産生することができる。第1のポリヌクレオチド配列がカロテノイド生合成酵素をコードする場合には、前記カロテノイド生合成酵素はフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、アドニルビン及びアドニキサンチンの化合物を産生することができる。
形質転換される植物又は植物細胞は単子葉植物に由来するものとすることができ、限定されないが、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)(ネギ属(Allium)、スイセン属(Narcissus));イネ科(Graminae又はPoaceae)(カラスムギ属(Avena)、オオムギ属(Hordeum)、イネ属(Oryza)、キビ属(Panicum)、チカラシバ属(Pennisetum)、ナガハグサ属(Poa)、サトウキビ属(Saccharum)、ライムギ属(Secale)、モロコシ属(Sorghum)、コムギ属(Triticum)、トウモロコシ属(Zea))が挙げられる。あるいは、形質転換される植物又は植物細胞は双子葉植物に由来するものとすることができ、限定されないが、キョウチクトウ科(Apocynaceae)(ニチニチソウ属(Catharanthus));キク科(Asteraceae)又は(Compositae)(アスター属(Aster)、キンセンカ属(Calendula)、エゾギク属(Callistephus)、キクニガナ属(Cichorium)、ハリシャギク属(Coreopsis)、ダリア属(Dahlia)、キク属(Dendranthema)、クンショウギク属(Gazania)、ガーベラ属(Gerbera)、ヒマワリ属(Helianthus)、ムギラワギク属(Helichrysum)、アキノノゲシ属(Lactuca)、オオハンゴンソウ属(Rudbeckia)、マンジュギク属(Tagetes)、ヒャクニチソウ属(Zinnia));ツリフネソウ科(Balsaminaceae)(ツリフネソウ属(Impatiens));シュウカイドウ科(Begoniaceae)(ベゴニア属(Begonia));ナデシコ科(Caryophyllaceae)(ナデシコ属(Dianthus));アカザ科(Chenopodiaceae)(フダンソウ属(Beta)、ホウレンソウ属(Spinacia));ウリ科(Cucurbitaceae)(スイカ属(Citrullus)、カボチャ属(Cucurbita)、キュウリ属(Cucumis));アブラナ科(Cruciferae)(イワナズナ属(Alyssum)、アブラナ属(Brassica)、エゾスズシロ属(Erysimum)、アラセイトウ属(Matthiola)、ダイコン属(Raphanus));リンドウ科(Gentianaceae)(トルコギキョウ属(Eustoma));フウロソウ科(Geraniaceae)(テンジクアオイ属(Pelargonium));トウダイグサ科(Euphorbiaceae)(ポインセチア属(Poinsettia));シソ科(Labiatae)(サルビア属(Salvia));マメ科(Leguminosae)(ダイズ属(Glycine)、レンリンソウ属(Lathyrus)、ウマゴヤシ属(Medicago)、インゲンマメ属(Phaseolus)、エンドウ属(Pisum));ユリ科(Liliaceae)(ユリ属(Lilium));サワギキョウ科(Lobeliaceae)(ミゾカクシ属(Lobelia));アオイ科(Malvaceae)(トロロアオイ属(Abelmoschus)、ワタ属(Gossypium)、ゼニアオイ属(Malva));イソマツ科(Plumbaginaceae)(リモニウム属(Limonium));ハナシノブ科(Polemoniaceae)(フロックス属(Phlox));サクラソウ科(Primulaceae)(シクラメン属(Cyclamen));キンボウゲ科(Ranunculaceae)(トリカブト属(Aconitum)、イチリンソウ属(Anemone)、オダマキ属(Aquilegia)、リュウキンカ属(Caltha)、オオヒエンソウ属(Delphinium)、キンポウゲ属(Ranunculus));バラ科(Rosaceae)(バラ属(Rosa));アカネ科(Rubiaceae)(ペンタス属(Pentas));ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)(アンゲロニア属(Angelonia)、キンギョソウ属(Antirrhinum)、トレニア属(Torenia));ナス科(Solanaceae)(トウガラシ属(Capsicum)、トマト属(Lycopersicon)、タバコ属(Nicotiana)、ペチュニア属(Petunia)、ナス属(Solanum));セリ科(Umbelliferae)(オランダミツバ属(Apium)、ニンジン属(Daucus)、パースニップ属(Pastinaca));クマツヅラ科(Verbenaceae)(クマツヅラ属(Verbena)、ランタナ属(Lantana));スミレ科(Violaceae)(スミレ属(Viola))が挙げられる。
更に別の態様では、本発明はトランスジェニック植物の少なくとも1個の花において選択蛋白質を発現させる方法に関する。本方法の第1段階は植物の花において転写を開始することが可能なプロモーターに機能的に連結された選択コーディング領域を含む発現ベクターを得る。プロモーターは配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む。これらの配列のフラグメント及び変異体も本発明の範囲に含まれる。第2段階はのレシピエント植物細胞を前記ベクターで形質転換する。第3段階は前記選択蛋白質を発現するトランスジェニック植物を前記レシピエント植物細胞から再生させる。
発現カセットで使用される選択コーディング領域はセンス方向でもアンチセンス方向でもよい。配列が配列番号2とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で42℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液で65℃にて30分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
植物細胞の形質転換は当分野で公知の技術を使用して実施することができ、限定されないが、電子銃照射、ポリエチレングリコールによるプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション及びアグロバクテリウムによる形質転換が挙げられる。形質転換されるレシピエント植物細胞は単子葉植物に由来するものでも双子葉植物に由来するものでもよい。単子葉植物の例としては限定されないが、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)(ネギ属(Allium)、スイセン属(Narcissus));イネ科(Graminae又はPoaceae)(カラスムギ属(Avena)、オオムギ属(Hordeum)、イネ属(Oryza)、キビ属(Panicum)、チカラシバ属(Pennisetum)、ナガハグサ属(Poa)、サトウキビ属(Saccharum)、ライムギ属(Secale)、モロコシ属(Sorghum)、コムギ属(Triticum)、トウモロコシ属(Zea))が挙げられる。双子葉植物の例としては限定されないが、キョウチクトウ科(Apocynaceae)(ニチニチソウ属(Catharanthus));キク科(Asteraceae又はCompositae)(アスター属(Aster)、キンセンカ属(Calendula)、エゾギク属(Callistephus)、キクニガナ属(Cichorium)、ハリシャギク属(Coreopsis)、ダリア属(Dahlia)、キク属(Dendranthema)、クンショウギク属(Gazania)、ガーベラ属(Gerbera)、ヒマワリ属(Helianthus)、ムギラワギク属(Helichrysum)、アキノノゲシ属(Lactuca)、オオハンゴンソウ属(Rudbeckia)、マンジュギク属(Tagetes)、ヒャクニチソウ属(Zinnia));ツリフネソウ科(Balsaminaceae)(ツリフネソウ属(Impatiens));シュウカイドウ科(Begoniaceae)(ベゴニア属(Begonia));ナデシコ科(Caryophyllaceae)(ナデシコ属(Dianthus));アカザ科(Chenopodiaceae)(フダンソウ属(Beta)、ホウレンソウ属(Spinacia));ウリ科(Cucurbitaceae)(スイカ属(Citrullus)、カボチャ属(Cucurbita)、キュウリ属(Cucumis));アブラナ科(Cruciferae)(イワナズナ属(Alyssum)、アブラナ属(Brassica)、エゾスズシロ属(Erysimum)、アラセイトウ属(Matthiola)、ダイコン属(Raphanus));リンドウ科(Gentianaceae)(トルコギキョウ属(Eustoma));フウロソウ科(Geraniaceae)(テンジクアオイ属(Pelargonium));トウダイグサ科(Euphorbiaceae)(ポインセチア属(Poinsettia));シソ科(Labiatae)(サルビア属(Salvia));マメ科(Leguminosae)(ダイズ属(Glycine)、レンリンソウ属(Lathyrus)、ウマゴヤシ属(Medicago)、インゲンマメ属(Phaseolus)、エンドウ属(Pisum));ユリ科(Liliaceae)(ユリ属(Lilium));サワギキョウ科(Lobeliaceae)(ミゾカクシ属(Lobelia));アオイ科(Malvaceae)(トロロアオイ属(Abelmoschus)、ワタ属(Gossypium)、ゼニアオイ属(Malva));イソマツ科(Plumbaginaceae)(リモニウム属(Limonium));ハナシノブ科(Polemoniaceae)(フロックス属(Phlox));サクラソウ科(Primulaceae)(シクラメン属(Cyclamen));キンボウゲ科(Ranunculaceae)(トリカブト属(Aconitum)、イチリンソウ属(Anemone)、オダマキ属(Aquilegia)、リュウキンカ属(Caltha)、オオヒエンソウ属(Delphinium)、キンポウゲ属(Ranunculus));バラ科(Rosaceae)(バラ属(Rosa));アカネ科(Rubiaceae)(ペンタス属(Pentas));ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)(アンゲロニア属(Angelonia)、キンギョソウ属(Antirrhinum)、トレニア属(Torenia));ナス科(Solanaceae)(トウガラシ属(Capsicum)、トマト属(Lycopersicon)、タバコ属(Nicotiana)、ペチュニア属(Petunia)、ナス属(Solanum));セリ科(Umbelliferae)(オランダミツバ属(Apium)、ニンジン属(Daucus)、パースニップ属(Pastinaca));クマツヅラ科(Verbenaceae)(クマツヅラ属(Verbena)、ランタナ属(Lantana));スミレ科(Violaceae)(スミレ属(Viola))が挙げられる。
(発明の詳細な説明)
緒言
本発明は植物の少なくとも1個の花等の特定組織で転写を開始するためのプロモーターとしてのS−リナルールシンターゼ遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列の使用に関する。本発明のポリヌクレオチド配列は植物の少なくとも1個の花において目的蛋白質を発現させるために使用することができる。
緒言
本発明は植物の少なくとも1個の花等の特定組織で転写を開始するためのプロモーターとしてのS−リナルールシンターゼ遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列の使用に関する。本発明のポリヌクレオチド配列は植物の少なくとも1個の花において目的蛋白質を発現させるために使用することができる。
定義
本発明の種々の側面又は態様は本明細書に記載する見出しに限定されず、明細書全体を参照して理解することができる。従って、以下に定義する用語は明細書全体を参照して完全に定義される。
本発明の種々の側面又は態様は本明細書に記載する見出しに限定されず、明細書全体を参照して理解することができる。従って、以下に定義する用語は明細書全体を参照して完全に定義される。
本明細書で使用する「外来コーディング領域」又は「選択コーディング領域」なる用語は生物に導入又は再導入されるポリヌクレオチド又は選択遺伝子のコーディング領域を意味する。例えば、カロテノイドルテインをコードするコーディング領域(ポリヌクレオチド又は選択遺伝子に由来する)は生物(例えばマリーゴールド等の植物)に導入又は再導入される場合に外来コーディング領域又は選択コーディング領域とみなされる。
本明細書で使用する「発現」なる用語は構造遺伝子又はポリヌクレオチド等のコーディングDNA分子の転写及び翻訳によりポリペプチドを産生するプロセスを含む細胞内プロセスの組合せを意味する。
本明細書で使用する「発現カセット」なる用語は遺伝子形質転換により宿主ゲノムに導入されるように設計されたキメラDNA分子を意味する。本発明の好ましい発現カセットは選択遺伝子又はポリヌクレオチド配列の発現を誘導するために必要な全遺伝子エレメントを含む。本発明の発現カセットはLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターを含む。
本明細書で使用する「発現ベクター」なる用語は少なくとも1個の発現カセットを含むDNAベクターを意味する。
「遺伝子」なる用語は、染色体DNA、プラスミドDNA、cDNA、合成DNAもしくは(ペプチド、ポリペプチド、蛋白質をコードする)他のDNA、またはRNA分子、発現の調節に関与するコーディング配列のフランキング領域を意味する。
本明細書で使用する「宿主」なる用語は細菌、完全植物、小植物、又は植物部分(例えば植物細胞、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、珠芽、種子、苗、花粉及び植物組織)を意味する。
本明細書で使用する「単離」なる用語はポリヌクレオチドや蛋白質等の材料が(a)その天然環境に認められるような通常この材料に付随するか又はこれと反応する成分を実質的又は本質的に含まないか、あるいは(b)この材料がその天然環境にある場合には、この材料が意図的な人的介入により組成を改変されているか及び/又はこの材料の本来の遺伝子座以外の細胞内の遺伝子座に配置されていることを意味する。
本明細書で使用する「マーカー遺伝子」なる用語はマーカー遺伝子を発現する細胞に別個の表現型を付与し、マーカー遺伝子をもたない細胞から形質転換細胞を区別させる遺伝子を意味する。このような遺伝子は観察又は試験により(即ちグリーン蛍光蛋白質等によるスクリーニングにより)識別できるスクリーニング可能なマーカーをコードすることができる。
本明細書で使用する「組織優先」なる用語は特定機能を実施する細胞の任意の群において最高レベルのポリヌクレオチド又は選択遺伝子発現を意味する。細胞の群で最高レベルのポリヌクレオチド又は遺伝子発現を測定する技術は当分野で公知であり、限定されないが、組織化学及び蛍光アッセイが挙げられる。
本明細書で使用する「花優先」なる用語は植物の少なくとも1個の花において優先的な少なくとも1個のポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現を意味する。
本明細書で使用する「花弁優先」なる用語は花弁組織において最高レベルのポリヌクレオチド又は選択遺伝子発現を意味する。細胞の群で最高レベルのポリヌクレオチド又は遺伝子発現を測定する技術は当分野で公知であり、限定されないが、組織化学及び蛍光アッセイが挙げられる。
本明細書で使用する「植物部分」又は「植物の部分」なる用語は細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯を意味する。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」なる用語は任意長のヌクレオチドのポリマー形を意味し、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。この用語は2本鎖及び1本鎖DNAと2本鎖及び1本鎖RNAを含む。更にメチル化又はキャッピング等のポリヌクレオチドの修飾形態と非修飾形態む含む。
本明細書で使用する「プロモーター」なる用語はポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現制御エレメントを提供し、RNAポリメラーゼが特異的に結合してこの遺伝子の転写(RNA合成)を開始するDNA配列又はDNA配列群上の認識部位を意味する。プロモーターは一般に転写の開始、調節、及び効率に関与する数個の調節エレメントから構成され、このようなエレメントは転写開始部位に近接する数百あるいは数千ヌクレオチドであり得る。このような調節エレメントとしては限定されないが、TATAボックス、エンハンサー、上流活性化配列等が挙げられる。
本明細書で使用する「選択遺伝子」なる用語はトランスジェニック植物、植物細胞又は植物部分で発現させる遺伝子を意味する。選択遺伝子は宿主ゲノムに内在するものでもよいし、外来でもよい。選択遺伝子が宿主ゲノムに存在する場合には、遺伝子の天然コピーとは異なる1個以上の調節又は機能エレメントを含む。
本明細書で使用する「形質転換細胞」なる用語はそのDNA相補鎖が外来DNA分子(即ち外来コーディング領域)を細胞に導入することにより改変されている細胞を意味する。「外来DNA分子」は(1)細胞に本来存在しない配列と、(2)形質転換される細胞に内在しており、前記細胞に再導入される配列を含む。
本明細書で使用する「トランスジーン」なる用語は宿主ゲノムに組込まれているか又は宿主細胞で自律複製することができ、1個以上の細胞産物を発現させることが可能なDNAセグメントを意味する。
本明細書で使用する「トランスジェニック植物」なる用語は植物又はその任意後続世代の植物の子孫であって、植物又はその子孫のDNAが同一株の非トランスジェニック植物に本来存在しない外来DNA分子を導入されているものを意味する。トランスジェニック植物は形質転換される植物に内在する配列も含むことができるが、「外来」遺伝子は遺伝子の発現レベル又はパターンを変化させるように改変されている。
本明細書で使用する「トランジットペプチド」なる用語は特定オルガネラ又は細胞内の他の位置にポリペプチドを誘導することが可能なポリペプチド配列を意味する。
本明細書で使用する「ベクター」なる用語は宿主細胞で複製可能であるか、及び/又は別のDNAセグメントを機能的に連結して付加セグメントの複製を生じることができるDNA分子を意味する。ベクターの1例はプラスミドである。
配列表
本願は5種のポリヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列も含む。これらのポリヌクレオチド配列では、塩基対は以下の塩基コードにより記載される。
記号 意味
A アデニン
C シトシン
G グアニン
T チミン
U ウラシル
M A又はC
R A又はG
W A又はT/U
S C又はG
記号 意味
Y C又はT/U
K G又はT/U
V A又はC又はG;T/U以外
H A又はC又はT/U;G以外
D A又はG又はT/U;C以外
B C又はG又はT/U;A以外
N (A又はC又はG又はT/U)。
本願は5種のポリヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列も含む。これらのポリヌクレオチド配列では、塩基対は以下の塩基コードにより記載される。
記号 意味
A アデニン
C シトシン
G グアニン
T チミン
U ウラシル
M A又はC
R A又はG
W A又はT/U
S C又はG
記号 意味
Y C又はT/U
K G又はT/U
V A又はC又はG;T/U以外
H A又はC又はT/U;G以外
D A又はG又はT/U;C以外
B C又はG又はT/U;A以外
N (A又はC又はG又はT/U)。
本願に示すアミノ酸はL形であり、以下のアミノ酸3文字略語により記載される。
略語 アミノ酸名
Ala L−アラニン
Arg L−アルギニン
Asn L−アスパラギン
Asp L−アスパラギン酸
Asx L−アスパラギン酸又はアスパラギン
Cys L−システイン
Glu L−グルタミン酸
Gln L−グルタミン
Glx L−グルタミン又はグルタミン酸
Gly L−グリシン
His L−ヒスチジン
Ile L−イソロイシン
Leu L−ロイシン
Lys L−リジン
Met L−メチオニン
Phe L−フェニルアラニン
Pro L−プロリン
Ser L−セリン
Thr L−スレオニン
Trp L−トリプトファン
Tyr L−チロシン
Val L−バリン
Xaa L−不明又はその他。
略語 アミノ酸名
Ala L−アラニン
Arg L−アルギニン
Asn L−アスパラギン
Asp L−アスパラギン酸
Asx L−アスパラギン酸又はアスパラギン
Cys L−システイン
Glu L−グルタミン酸
Gln L−グルタミン
Glx L−グルタミン又はグルタミン酸
Gly L−グリシン
His L−ヒスチジン
Ile L−イソロイシン
Leu L−ロイシン
Lys L−リジン
Met L−メチオニン
Phe L−フェニルアラニン
Pro L−プロリン
Ser L−セリン
Thr L−スレオニン
Trp L−トリプトファン
Tyr L−チロシン
Val L−バリン
Xaa L−不明又はその他。
好適態様の説明
1態様では、本発明はプロモーターをコードするS−リナルールシンターゼ(LIS)遺伝子に由来する単離ポリヌクレオチド配列の使用に関する。本明細書に記載するポリヌクレオチド配列は植物の少なくとも1個の花において目的とする任意の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現を誘導することができる。このような発現は花優先のみならず、より詳細には花弁優先であることが判明した。
1態様では、本発明はプロモーターをコードするS−リナルールシンターゼ(LIS)遺伝子に由来する単離ポリヌクレオチド配列の使用に関する。本明細書に記載するポリヌクレオチド配列は植物の少なくとも1個の花において目的とする任意の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現を誘導することができる。このような発現は花優先のみならず、より詳細には花弁優先であることが判明した。
本発明のプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号2と図1のヌクレオチド7−1033に示される(以下、「LIS1プロモーター」と言う)。このポリヌクレオチド配列はClarkia breweriiに由来するS−リナルールシンターゼ遺伝子(配列番号1)から誘導した。Clarkia breweriiに由来するS−リナルールシンターゼ遺伝子の完全ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列はGenbank Accession AF067601(配列番号1)とCseke,L.ら,Mol.Biol.Evol.,15:1491−1498(1998)に記載されている。S−リナルールシンターゼ遺伝子は揮発性モノテルペノイドであるS−リナルールの産生を触媒する花の香りの生合成酵素であるS−リナルールシンターゼをコードする(Dudarevaら,The Plant Cell,8:1137−1148(1996))。
別の花化合物である安息香酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼは安息香酸メチルの生合成における最終酵素であり、キンギョソウの花に最も豊富に存在する芳香化合物として知られている。キンギョソウでは、BAMT遺伝子活性の大部分が花冠の上下葉で検出された(Dudarevaら,The Plant Cell,12:949−961(2000))。1実施例によると、BAMT遺伝子に由来するプロモーターはトランスジェニックペチュニア花弁組織で外来遺伝子発現を誘導しないことが分かった。従って、このプロモーターは他の種で花弁優先プロモーターであると予想することができない。
本発明のプロモーターは本発明のプロモーターの配列との配列相同に基づいて当分野で公知の慣用技術を使用して他の生物から他のプロモーターを単離するために使用することができる。これらの技術では、好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド長のユニークな他の配列と選択的にハイブリダイズするプローブとして本発明のプロモーターの全部又は一部を使用する。これらのプローブはポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)を使用して選択した生物から対応するプロモーターを増幅するために使用することができる。この技術は所望生物から付加プロモーターを単離するため又は生物におけるプロモーターの存在を調べるための診断アッセイとして使用することができる。例えば、プレーティングしたDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングが挙げられる(プラーク又はコロニー;例えばInnisら,PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,eds.,Academic Press(1990)参照)。
本発明は本発明のプロモーターに対応し、本発明のプロモーターとハイブリダイズし、開示配列と少なくとも50%相同、70%相同、85%相同、90%相同、95%相同、更には99%相同の配列にも関する。即ち、プローブとターゲットの配列類似度は少なくとも約50%、約70%、約85%、約90%、約95%、更には約95%の範囲とすることができる。
比較のための配列の整列方法は当分野で周知である。遺伝子比較はデフォルトパラメーターを使用してBLAST“GENEMBL”データベースに含まれる配列との一致をBLAST(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul,S.F.ら,J.Mol.Biol.215:403−410(1993);www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTも参照)により検索することにより決定することができる。デフォルトパラメーターを使用してBLASTNアルゴリズムによりGENEMBLデータベースに含まれる全公共入手可能なDNA配列との一致について配列を分析することができる。本発明の配列との一致は完全プロモーターに対して少なくとも50%の配列一致度、より好ましくは少なくとも70%の配列一致度、より好ましくは少なくとも75%の配列一致度、より好ましくは少なくとも80%の一致度、より好ましくは少なくとも85%の配列一致度、より好ましくは少なくとも90%の配列一致度、より好ましくは少なくとも95%の配列一致度、最も好ましくは少なくとも99%の配列一致度をもつポリヌクレオチド配列を意味する。
本発明のポリヌクレオチド配列(配列番号2)にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列の同定はストリンジェント条件の使用等の当分野の慣用技術を使用して実施することができる。本明細書で使用する「ストリンジェント条件」又は「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」なる用語はプローブが他の配列よりも検出可能に高度な程度(例えばバックグラウンドの少なくとも2倍)までそのターゲット配列とハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェント条件はターゲット配列に依存し、ポリヌクレオチドの構造により異なる。ハイブリダイゼーション及び/又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに100%相補的なターゲット配列を同定することができる(このようなプロービングは「ホモプロービング」として知られる)。あるいは、より低い類似度を検出するように配列をある程度ミスマッチさせるようにストリンジェンシー条件を調節することができる(このようなプロービングは「ヘテロプロービング」として知られる)。一般に、この種のプローブは約100ヌクレオチド長〜約250ヌクレオチド長である。
核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きはTijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,N.Y.(1993);及びCurrent Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Ausubelら,Eds.,Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York(1995)に記載されている。Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))も参照。
特異性は一般にハイブリダイゼーション後の洗浄に依存し、必須因子は最終洗浄溶液のイオン強度と温度である。一般に、ストリンジェント洗浄温度条件は規定イオン強度及びpHで特定配列の融点(Tm)よりも約5℃〜約2℃低くなるように選択される。DNAの融点又は変性は狭い温度範囲で生じ、二重螺旋からその相補的1本鎖への分解に相当する。プロセスは遷移中間点の温度Tm(融点とも言う)により表される。融点を決定するための式は当分野で公知である。
本発明のプロモーターに好適なハイブリダイゼーション条件としては42℃で50%(w/v)ホルムアミド、6x標準クエン酸食塩水(“SSC”)、0.5%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(“SDS”)、100μg/mlサケ精子DNAの溶液中のハイブリダイゼーションが挙げられる。低ストリンジェンシー洗浄条件の例としては42℃で30分間2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液中のハイブリダイゼーションとその反復が挙げられる。中ストリンジェンシー洗浄条件の例としては50℃で30分間2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液中のハイブリダイゼーションとその反復が挙げられる。高ストリンジェンシー洗浄条件の例としては65℃で30分間2XSSC,0.5%(w/v)SDSの溶液中のハイブリダイゼーションとその反復が挙げられる。本発明のプロモーターに対応する配列は全上記条件を使用して得られる。
本発明は本発明のプロモーター(即ち配列番号2)から誘導されるフラグメント及び変異体にも関する。本明細書で使用する「フラグメント」とはポリヌクレオチド配列の一部を意味する。本発明のフラグメントは配列番号2の一部を含む。これらのフラグメントは生物活性を維持することができるので、植物の少なくとも1個の花において機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現を誘導することが可能なフラグメントを含む。本発明のプロモーターのポリヌクレオチドフラグメントは少なくとも20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1010ヌクレオチドを含むか又は本明細書に開示する全長LIS1プロモーターに存在するヌクレオチド数まで含む。ポリヌクレオチドフラグメントは通常は特定プロモーター配列のTATA認識配列(TATAボックスとしても知られる)を含む。このようなフラグメントは制限酵素を使用して本明細書に開示するプロモーターのポリヌクレオチド配列を切断するか、天然プロモーターDNA配列からポリヌクレオチド配列を合成するか、又はPCR技術を使用することにより得られる。特にMullisら,Methods Enzyniol.155:335−350(1987),及びErlichら,(1989)PCR Technology(Stockton Press,N.Y.(1989))参照。
上記に要約したように、本発明は本発明のプロモーター(配列番号2)の変異体にも関する。本明細書で使用する「変異体」なる用語は実質的に類似する配列を意味する。天然変異体はポリメラーゼ連鎖反応等の当分野で公知の慣用技術を使用して同定することができる。変異体ポリヌクレオチドは更に以下に詳述する部位特異的突然変異誘発により生産されたもの等の合成により誘導されたポリヌクレオチド配列も含む。生体活性変異体も本発明の範囲に含まれる。
本発明のプロモーターの変異体は当分野で公知の慣用技術を使用して配列番号2を挿入、欠失又は突然変異させることにより生産することができる。例えば、上記に要約したように、このような変異体は配列番号2の部位特異的突然変異誘発により得られる配列を含む。部位特異的突然変異誘発を実施するための技術はMikaelianら,Nucl.Acids Res.,20:376(1992),Zhouら,Nucl.Acids Res.,19:6052(1991)に記載されている。更に、本発明はZhuら,The Plant Cell 7:1681−89(1995)により記載されているように、プロモーター活性を損わずに欠失させることができる転写開始部位の近傍のTATAボックスまでのプロモーターの5’部分の変異体にも関する。このような変異体は植物の少なくとも1個の花において発現を誘導する能力を維持すべきである。
本発明のポリヌクレオチド配列は植物の少なくとも1個の花において特定蛋白質又はポリペプチド産物又はRNA分子をコードする機能的に連結されたポリヌクレオチド及び/又は選択遺伝子から選択コーディング領域の発現を誘導するのに使用することができる。レシピエント植物細胞の形質転換にLIS1プロモーターと併用する特定選択コーディング領域の選択は形質転換の目的によって異なる。植物の形質転換の主目的の1つは商業的に望ましいか、農学又は園芸学的に重要な形質を植物に付加することである。このような形質としては限定されないが、昆虫抵抗性ないし耐性、疾病抵抗性ないし耐性(ウイルス、細菌、真菌)、色(例えば(1)アントシアニン(限定されないが、例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、ペツニジン等のアントシアニン化合物を産生するアントシアニン生合成酵素の産生又は発現増加による(上記化合物を産生するアントシアニン生合成酵素をコードするポリヌクレオチド及び遺伝子配列は当分野で公知であり、Holtonら,The Plant Cell,7:1071−1083(1995)に記載されている)及び/又は(2)カロテノイド(限定されないが、例えばフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン等の化合物を産生するカロテノイド生合成酵素の産生又は発現増加による(上記カロテノイド化合物を産生するカロテノイド生合成酵素をコードするポリヌクレオチド及び遺伝子配列は当分野で公知であり、WO00/32788と米国特許第5,684,238号、5,530,188号、5,429,939号及び5,618,988号、Cunningham and Gantt,Breeding for Ornamentals:Classical and Molecular Approaches,ed.A.Vainstein(Kluwer Academic Publishers,Dordrecht(2002)),Chamovitzら,FEBS Lett.,296(3):305−310(1992),Chappell,J.,Ann.Rev.Plant Cell Physiol.Plant Cell Mol.Biol.,46:521−547(1995),Cunninghamら,FEBS Lett.,328(1−2):130−138(1993),Hugueney,ら,Eur.J.Biochem.,209(1):399−407(1992),Hundleら,FEBS Lett.,315(3):329−334(1993),Kajiwaraら,Plant Mol.Biol.,29(2):343−352(1995),Kuntzら,Plant J.,2(1):25−34(1992),Lindenら,Plant Mol.Biol.,24(2):369−79(1994),Lotanら,FEBS Lett.,364(2):125−128(1995),Mathら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(15):6761−6764(1992),Misawaら,J.Bacteriol.,172(12):6704−6712(1990),Misawaら,J.Biochem.(Tokyo),116(5):980−985(1994),Sandmann,G.,FEMS Microbiol.Lett.,69(3):253−257(1992),Sandmannら,FEMS Microbiol.Lett.,59(1−2):77−82(1990)及びKajiwaraら,Biochem.J.,324:421−426(1997)に記載されている))、花の香り、花の寿命等が挙げられる。選択コーディング領域はセンス又はアンチセンス方向で本発明のプロモーターと併用することができる。
更に別の態様では、本発明は植物の少なくとも1個の花において特定蛋白質又はポリペプチド産物又はRNA分子をコードする機能的に連結されたポリヌクレオチド及び/又は選択遺伝子から選択コーディング領域の発現を誘導するために使用することができるキメラプロモーターに関する。より詳細には、本発明のポリヌクレオチド又はそのフラグメントもしくは変異体はキメラプロモーター(以下、「LIS1キメラプロモーター」と言う)を形成するために当分野で公知の慣用技術を使用して別のプロモーターと機能的に連結することができる。例えば、本発明のプロモーターは植物の少なくとも1個の花において前記キメラプロモーターに機能的に連結された少なくとも1個のポリヌクレオチド又は選択遺伝子の高レベル発現を誘導するためにCaMV35Sプロモーターの特定領域と機能的に連結することができる。本発明のLIS1プロモーターと共にLIS1キメラプロモーターを作製するために使用されるプロモーターは単に植物の花においてポリヌクレオチド配列又は選択遺伝子の発現を誘導するのでなくてもよい。実際に、このプロモーターは単に組織特異的プロモーターでなくてもよい。場合により、前記プロモーターは構成的プロモーターでも誘導的プロモーターでもよく、いずれも当分野で周知である。
形質転換にLIS1プロモーターと併用する特定選択コーディング領域の選択は形質転換の目的によって異なる。植物の形質転換の主目的の1つは商業的に望ましいか、農学又は園芸学的に重要な形質を植物に付加することである。このような形質としては限定されないが、昆虫抵抗性ないし耐性、疾病抵抗性ないし耐性(ウイルス、細菌、真菌)、色(例えば(1)アントシアニン(限定されないが、例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、ペツニジン等のアントシアニン化合物を産生するアントシアニン生合成酵素の産生又は発現増加による)及び/又は(2)カロテノイド(限定されないが、例えばフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン等のカロテノイド化合物を産生するカロテノイド生合成酵素の産生又は発現増加による)、花の香り、花の寿命等が挙げられる。特定選択コーディング領域はセンス又はアンチセンス方向でLIS1キメラプロモーターと併用することができる。
別の態様では、本発明は2種以上の形質転換構築物によるレシピエント細胞の形質転換に関する。別個の選択蛋白質をコードするベクターを使用するか又は2種以上のポリヌクレオチドもしくは選択遺伝子配列を組込んだ単一ベクターを使用して単一形質転換イベントで2種以上のトランスジーンを作製することができる。例えば、昆虫又は疾病(ウイルス、細菌、真菌)抵抗性、色もしくは花の香りの改変(増減)又は花の寿命を付与するトランスジーン等の任意種類の2種以上のトランスジーンを所望に応じて使用することができる。
更に別の態様では、本発明は植物又は植物細胞と2種以上のベクターの同時形質転換に関する。同時形質転換はマーカーと1種以上の目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子を含むベクターを使用して実施することができる。あるいは、ベクター(限定されないが、例えばプラスミド)毎に異なる目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子を含むこともでき、プラスミドをレシピエント宿主細胞に同時に送達することができる。この方法によると、マーカーを導入した細胞の所定百分率は他の目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子も受け取っていると予想される。その場合、マーカーにより選択される全細胞が細胞に同時に提示された他の目的蛋白質を発現する訳ではない。
植物形質転換に適した任意ベクターを本発明で使用できる。このようなベクターとしては限定されないが、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体(「YAC」)、細菌人工染色体(「BAC」)又は他の任意の適切なクローニングシステムが挙げられる。挿入容量の大きいクローニングシステムを使用すると、2個以上の選択遺伝子を含む大きいDNA配列を導入できると予想される。このような配列の導入はBAC、YAC、又は植物人工染色体の使用により助長することができる。
従来記載されているベクターから単離された発現カセットを形質転換で使用することができる。植物細胞を形質転換するために使用されるDNA分子は一般にレシピエント宿主細胞に導入されて発現されるcDNA即ち1個以上の選択遺伝子又はポリヌクレオチドを含む。DNA分子はLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーター以外に更にエンハンサー、ポリリンカー、イントロン、ターミネーター又は他の調節因子もしくは遺伝子発現を変化させる遺伝子等の構造を含むことができる。植物細胞を形質転換するために使用されるDNA分子は発現カセットにセンス又はアンチセンス方向に挿入することができ、多くの場合には得られる組換え細胞で発現される蛋白質をコードし、その結果、スクリーニング可能又は選択可能な形質を付与するか及び/又は得られるトランスジェニック植物に改善された表現型を付与する。しかし、必ずしもそうでない場合もあり、本発明は発現されないトランスジーン又は非コーディングRNA(例えばアンチセンスRNA分子、リボザイムをコードするポリヌクレオチド又はRNase P−によりターゲットRNA分子の切断を促進することが可能なポリヌクレオチド)を組込んだトランスジェニック植物及び植物部分にも関する。
上述のように、LIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターを含む形質転換構築物にエンハンサー配列を加え、目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子のコーディング領域に機能的に連結することができる。エンハンサー配列は真核細胞で機能するプロモーターの転写開始部位の5’側に配置することができる。場合により、これらのエンハンサー配列はイントロンの内部に存在する。エンハンサー配列は目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子のコーディング配列の5’又は3’側に順又は逆方向に挿入することができる。本発明により使用可能なエンハンサーの例としてはCaMV 35S RNAプロモーター及びオクトピンシンターゼ遺伝子に由来するエンハンサー配列が挙げられる(Ellisら,EMBO J,6(11):3203−3208(1987))。
選択蛋白質を発現させるためにLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターとエンハンサーを併用する場合には、エンハンサーはプロモーターと目的とする機能的に連結されたポリヌクレオチド又は遺伝子のコーディング領域の開始コドンの上流に配置することが好ましい。しかし、エンハンサーにより付与される有益な特性が得られるように、目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子の他のコーディング領域に対してエンハンサーを別の配置で使用することもできる。例えば、エンハンサーはプロモーターの5’側、プロモーターの内部、目的ポリヌクレオチドもしくは選択遺伝子のコーディング領域の内部(他のイントロン配列が存在する場合にはその任意イントロン配列の内部を含む)、又はコーディング領域の3’側に配置することができる。
エンハンサー配列に加え、LIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターを含む形質転換構築物で非翻訳リーダー配列も使用できる。このような構築物で使用することができる好ましいリーダー配列としては、目的とする機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の付加コーディング領域の最適発現を誘導することが可能な配列をもつものが挙げられる(即ちmRNA安定性を増加もしくは維持、翻訳の誤った開始を防止、又はより効率的な翻訳開始を促進することが可能な好適コンセンサスリーダー配列の付加)。形質転換構築物で使用することができる非翻訳リーダー配列は当業者が容易に決定することができる。
本発明により作製される形質転換構築物は更に3’末端プロセシングのシグナルとして機能する3’末端DNA配列を含むことができ、LIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターに機能的に連結された配列をコードすることにより産生されるmRNAのポリアデニル化を可能にする。LIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターと併用することができるポリアデニル化領域としては限定されないが、リボース−1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ(rbcS)の小サブユニット、Agrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するターミネーター(nos 3’末端)(Bevanら,Nucleic Acids Research 11(2):369−385(1983))、Agrobacterium tumefaciensのオクトピンシンターゼ遺伝子に由来するT7転写産物のターミネーター、及びジャガイモ又はトマトに由来するプロテアーゼインヒビターI又はII遺伝子の3’末端をコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。
本発明の形質転換構築物は更にトランジットペプチドとシグナル配列を使用することができる。発現させようとするポリヌクレオチド又は選択遺伝子のコーディング配列に結合されており、翻訳後に初期翻訳産物から除去することができ、細胞内又は細胞外膜内又は膜を通して蛋白質の輸送を助長する配列をトランジットペプチド(これらのペプチドは液胞、小胞、プラスチド及び他の細胞内オルガネラ内への蛋白質輸送を助長する)及びシグナル配列(これらのペプチドは小胞体、ゴルジ装置及び細胞膜の外側への輸送を助長する)と言う(米国特許第5,728,925号は葉緑体トランジットペプチドを記載しており、米国特許第5,510,471号は最適化トランジットペプチドを記載している。)。細胞内外の区画への蛋白質の輸送を助長することにより、これらの配列は蛋白分解から保護することにより遺伝子産物の蓄積を増加することができる。これらの配列は更に高度に発現される遺伝子からの付加mRNA配列を遺伝子のコーディング配列に付加することができる。リボソームにより翻訳されるmRNAは翻訳できないmRNAよりも安定であるので、ポリヌクレオチド又は遺伝子の前に翻訳可能なmRNAが存在すると、遺伝子からのmRNA転写産物の総安定性を増し、従ってポリヌクレオチド又は遺伝子産物の合成を増すことができる。トランジット及びシグナル配列は翻訳後に初期翻訳産物から除去されるので、これらの配列を使用すると、最終ポリペプチドに出現しない付加翻訳配列を加えることができる。更に、蛋白質の安定性を高めるためには所定蛋白質のターゲティングが望ましいと予想される(米国特許第5,545,818号参照)。
本発明のLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターは機能的に連結されたスクリーニング可能なマーカー遺伝子の発現を誘導するために使用することもできる。本発明で使用することができるスクリーニング可能なマーカー遺伝子からのコーディング領域の例としては限定されないが、下表1に示すものが挙げられる。
別の態様では、本発明は選択蛋白質を植物において効率的に発現させるための方法と組成物に関する。本発明のLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターは選択蛋白質を単子葉植物又は双子葉植物等の任意型の植物及び植物部分で発現させるために使用することができる。LIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターを使用することができる単子葉植物の例としては限定されないが、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)(ネギ属(Allium)、スイセン属(Narcissus));イネ科(Graminae又はPoaceae)(カラスムギ属(Avena)、オオムギ属(Hordeum)、イネ属(Oryza)、キビ属(Panicum)、チカラシバ属(Pennisetum)、ナガハグサ属(Poa)、サトウキビ属(Saccharum)、ライムギ属(Secale)、モロコシ属(Sorghum)、コムギ属(Triticum)、トウモロコシ属(Zea))が挙げられる。LIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターを使用することができる双子葉植物の例としては限定されないが、キョウチクトウ科(Apocynaceae)(ニチニチソウ属(Catharanthus));キク科(Asteraceae又はCompositae)(アスター属(Aster)、キンセンカ属(Calendula)、エゾギク属(Callistephus)、キクニガナ属(Cichorium)、ハリシャギク属(Coreopsis)、ダリア属(Dahlia)、キク属(Dendranthema)、クンショウギク属(Gazania)、ガーベラ属(Gerbera)、ヒマワリ属(Helianthus)、ムギラワギク属(Helichrysum)、アキノノゲシ属(Lactuca)、オオハンゴンソウ属(Rudbeckia)、マンジュギク属(Tagetes)、ヒャクニチソウ属(Zinnia));ツリフネソウ科(Balsaminaceae)(ツリフネソウ属(Impatiens));シュウカイドウ科(Begoniaceae)(ベゴニア属(Begonia));ナデシコ科(Caryophyllaceae)(ナデシコ属(Dianthus));アカザ科(Chenopodiaceae)(フダンソウ属(Beta)、ホウレンソウ属(Spinacia));ウリ科(Cucurbitaceae)(スイカ属(Citrullus)、カボチャ属(Cucurbita)、キュウリ属(Cucumis));アブラナ科(Cruciferae)(イワナズナ属(Alyssum)、アブラナ属(Brassica)、エゾスズシロ属(Erysimum)、アラセイトウ属(Matthiola)、ダイコン属(Raphanus));リンドウ科(Gentianaceae)(トルコギキョウ属(Eustoma));フウロソウ科(Geraniaceae)(テンジクアオイ属(Pelargonium));トウダイグサ科(Euphorbiaceae)(ポインセチア属(Poinsettia));シソ科(Labiatae)(サルビア属(Salvia));マメ科(Leguminosae)(ダイズ属(Glycine)、レンリンソウ属(Lathyrus)、ウマゴヤシ属(Medicago)、インゲンマメ属(Phaseolus)、エンドウ属(Pisum));ユリ科(Liliaceae)(ユリ属(Lilium));サワギキョウ科(Lobeliaceae)(ミゾカクシ属(Lobelia));アオイ科(Malvaceae)(トロロアオイ属(Abelmoschus)、ワタ属(Gossypium)、ゼニアオイ属(Malva));イソマツ科(Plumbaginaceae)(リモニウム属(Limonium));ハナシノブ科(Polemoniaceae)(フロックス属(Phlox));サクラソウ科(Primulaceae)(シクラメン属(Cyclamen));キンボウゲ科(Ranunculaceae)(トリカブト属(Aconitum)、イチリンソウ属(Anemone)、オダマキ属(Aquilegia)、リュウキンカ属(Caltha)、オオヒエンソウ属(Delphinium)、キンポウゲ属(Ranunculus));バラ科(Rosaceae)(バラ属(Rosa));アカネ科(Rubiaceae)(ペンタス属(Pentas));ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)(アンゲロニア属(Angelonia)、キンギョソウ属(Antirrhinum)、トレニア属(Torenia));ナス科(Solanaceae)(トウガラシ属(Capsicum)、トマト属(Lycopersicon)、タバコ属(Nicotiana)、ペチュニア属(Petunia)、ナス属(Solanum));セリ科(Umbelliferae)(オランダミツバ属(Apium)、ニンジン属(Daucus)、パースニップ属(Pastinaca));クマツヅラ科(Verbenaceae)(クマツヅラ属(Verbena)、ランタナ属(Lantana));スミレ科(Violaceae)(スミレ属(Viola))が挙げられる。
上記に要約したように、本発明は選択蛋白質を植物及び植物部分で発現させるためのLIS1プロモーター及びLIS1キメラプロモーターを提供する。本発明により植物宿主細胞において発現させる選択蛋白質の選択は形質転換の目的によって異なる。作物の形質転換の主目的の1つは商業的に望ましいか、農学又は園芸学的に重要な形質を植物に付加することである。このような形質としては限定されないが、昆虫抵抗性ないし耐性、疾病抵抗性ないし耐性(ウイルス、細菌、真菌)、色(アントシアニン(限定されないが、例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、ペツニジン等)及び/又はカロテノイド(限定されないが、例えばフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン等))、花の香り、花の寿命等が挙げられる。
本発明の別の態様では、2種以上の目的ポリヌクレオチド及び/又は選択遺伝子を使用してレシピエント植物細胞の形質転換を実施することができる。更に、別個のトランスジーンをコードするベクターを使用するか又は2種以上のコーディング配列を組込んだ単一ベクターを使用して単一形質転換イベントで目的とする2種以上のポリヌクレオチド又は選択遺伝子に由来する2種以上の外来コーディング領域を提供することもできる。例えば、収束、発散又は共直線方向にbar及びaroA発現ユニットをもつプラスミドが特に有用であるとみなされる。昆虫、疾病(ウイルス、細菌、真菌)又は色(アントシアニン(限定されないが、例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、ペツニジン等)及び/又はカロテノイド(限定されないが、例えばフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン等))、花の香り又は花の寿命を付与するトランスジーン等の任意種類の2種以上のトランスジーンを所望に応じて使用することができる。
別の態様では、本発明のLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターは植物表現型を変化させるが、蛋白質に翻訳されないRNA分子(転写産物)を発現させる目的で機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子を植物に導入するために使用することができる。このような目的はアンチセンスRNA、リボザイムと呼ばれるRNA酵素を使用するか又はRNase PによるターゲットmRNA分子の分解を促進することが可能なRNA転写産物の使用により実施することができる。アンチセンスRNA、リボザイム又はRNase PによるターゲットmRNAの分解は形質転換植物における天然又は導入された植物遺伝子の発現を低減又は除去するために使用することができる。
当分野で公知の慣用技術によりターゲット分子の発現を抑制するために少なくとも1個のアンチセンスRNA分子の発現を使用することができる。より詳細には、本発明は相補的ポリヌクレオチド単位(例えばアンチセンスRNA分子)をコードするポリヌクレオチド配列に本発明のプロモーターを機能的に連結することができる発現カセットの構築に関する。この相補的ポリヌクレオチド単位とターゲット分子の結合は阻害的とすることができる。例えば、ターゲット分子がmRNA分子である場合には、相補的ポリヌクレオチド単位であるRNAが結合する結果としてハイブリダイゼーションが生じ、ターゲット蛋白質の翻訳が阻止される。
あるいは、本発明のプロモーターはリボザイムをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結することができる。より詳細には、本発明はリボザイムをコードするポリヌクレオチド配列に本発明のプロモーターを機能的に連結された発現ベクターの構築に関する。mRNA分子で所定ターゲット配列に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を発現するようにリボザイムを設計できることは当分野で公知である。例えば、タバコプロトプラストでリボザイムによりネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子発現の100%までの阻害が達成された(Steineckeら,EMBO J,11:1525(1992)参照)。本発明では、リボザイムに適したターゲットRNA分子の例としては植物生化学経路に存在する生合成酵素をコードするmRNAが挙げられる。
更に別の態様では、本発明のプロモーターはRNase PによるターゲットmRNA分子の分解を促進することが可能なRNA分子(転写産物)の産生を誘導するために使用することができる。より詳細には、本発明は更に本発明のプロモーターがRNase PによるターゲットmRNA分子の分解を促進することが可能なRNA転写産物の産生を誘導する発現ベクターの構築に関する。このアプローチによると、外来リボザイム、RNase Pを特定mRNA種に誘導した後に細胞リボザイムにより切断するための外部案内配列を構築することができる(米国特許第5,168,053号;Yuanら,Science,263:1269(1994)参照)。
本発明は更に同時抑制メカニズムにより天然遺伝子産物の発現が低下したトランスジェニック植物を生産するように少なくとも1個のポリヌクレオチド又は選択遺伝子を導入するためにLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターを使用できると想定する。タバコ、トマト及びペチュニアで示されたように(Goringら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1770−1774(1991),Smithら,Mol.Gen.Genet.,224:447−481(1990),Napoliら,Plant Cell,2:279−289(1990),van der Krolら,Plant Cell,2:291−299(1990))、アンチセンス遺伝子で観察されると同様に天然遺伝子のセンス転写産物の発現を低下させるか又は天然遺伝子を発現させなくなることができる。導入される遺伝子は標的天然蛋白質の全部又は一部をコードすることができるが、天然蛋白質のレベルを低下させるためにその翻訳は必要ないと思われる。
本発明は更にトランスジーン発現効率を確認又は決定するための当分野で公知の2種以上のアッセイの使用に関する。例えば、種々の異なるエンハンサー配列、ターミネーター又は地の調節因子と併用する場合に植物の少なくとも1個の花において蛋白質発現を誘導するLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターの効率を測定するためにアッセイを使用することができる。また、蛋白質発現を誘導するLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターの種々の欠失突然変異体の効率を測定するためにアッセイを使用することもできる。
アッセイする生物サンプルは当分野で公知の分子生物学技術を使用して任意植物材料から単離されたポリヌクレオチドとすることができる(Sambrookら,In:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。ポリヌクレオチドはゲノムDNA又は断片又は全細胞RNAとすることができる。RNAを使用する場合には、適宜DNAに変換することができる。
本発明で使用することができる種々のアッセイの例としては蛍光in situハイブリダイゼーション(「FISH」)、直接DNAシーケンシング、パルスフィールドゲル電気泳動(「PFGE」)解析、RNA又はDNAゲルブロット解析、1本鎖コンホメーション解析(「SSCA」)、RNase保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(「ASO」)、ドットブロット解析、変性グラジエントゲル電気泳動及び制限酵素断片長多形(「RFLP」)が挙げられる。
特定トランスジーンが発現される効率を測定するためには、トランスジーンにより発現されるポリペプチドを精製し、定量する。蛋白質の精製技術は当分野で公知である。これらの技術としては限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、高速蛋白質液体クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーが挙げられる。更に、免疫法も蛋白質検出に使用することができる。方法としては限定されないが、酵素免疫測定法(「ELISA」)、ウェスタンブロット及びラジオイムノアッセイ(「RIA」)が挙げられる。
本発明の関連で使用するのに適した植物形質転換法としてはDNAを宿主細胞に導入できる任意方法が挙げられ、限定されないが、下表2に記載する方法が挙げられる。
上記形質転換技術の任意のものにより形質転換された植物細胞を培養し、形質転換遺伝子型をもつ完全植物を再生することができる。このような再生技術は組織培養増殖培地で所定植物ホルモンを操作することにより行われ、一般にはLIS1プロモーター又はLIS1キメラプロモーターと目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子に由来するコーディング領域と共に導入したマーカー因子を利用する。培養プロトプラストからの植物再生はEvansら,Protoplasts Isolation and Culture,Handbook of Plant Cell Culture,pp.124−176,Macmillan Publishing Company,New York,1983;及びBinding;Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,pp.21−73,CRC Press,Boca Raton,1985に記載されている。再生は植物カルス、外植体、器官、又はその部分からも得られる。このような再生技術はKleeら,Ann.Ref.of Plant Phys.38:467−486(1987)に概説されている。
本発明の方法は天然には存在しない方法及び状況で種々の目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子を形質転換植物組込むために特に有用である。特に、種々のポリヌクレオチド又は選択遺伝子を天然植物の特徴ではない時点又は量で発現させることができる。
当業者に自明の通り、形質転換構築物がトランスジェニック植物に安定的に組込まれ、機能可能であることが確認された後に、雌雄交配により他の植物体に導入することができる。交配する種に応じて多数の標準育種技術の任意のものを使用することができる。
以下、本発明の実施例を記載するが、以下の実施例により本発明を制限するものではない。
pBHXプラスミド
pBHX109
GFP遺伝子(Columbus,OHに所在のArabidopsis Biological Resource Centerから入手可能なプラスミドpCD3−327に含まれるsm−RSGFPバージョン)に融合したArabidopsis UBQβポリユビキチン遺伝子(1.3kb)のプロモーター含有領域とnos polyAシグナル含有領域から構成される2.4Kb HindIII−EcoRIフラグメントを単離した。次に、このフラグメントをHindIIIとEcoRIで予め消化しておいたT−DNAバイナリーベクターにライゲーションし、pBHX109を作製した。
pBHX109
GFP遺伝子(Columbus,OHに所在のArabidopsis Biological Resource Centerから入手可能なプラスミドpCD3−327に含まれるsm−RSGFPバージョン)に融合したArabidopsis UBQβポリユビキチン遺伝子(1.3kb)のプロモーター含有領域とnos polyAシグナル含有領域から構成される2.4Kb HindIII−EcoRIフラグメントを単離した。次に、このフラグメントをHindIIIとEcoRIで予め消化しておいたT−DNAバイナリーベクターにライゲーションし、pBHX109を作製した。
pBHX113
GFP遺伝子(Columbus,OHに所在のArabidopsis Biological Resource Centerから入手可能なプラスミドpCD3−327に含まれるsm−RSGFPバージョン)に融合したClarkia brewerii LIS1遺伝子のプロモーター含有領域(pBHX103と同一領域)とnos polyAシグナル含有領域から構成されるHindIII−EcoRIフラグメントを単離した。次に、このフラグメントをHindIIIとEcoRIで予め消化しておいたT−DNAバイナリーベクターにライゲーションし、pBHX113を作製した。
GFP遺伝子(Columbus,OHに所在のArabidopsis Biological Resource Centerから入手可能なプラスミドpCD3−327に含まれるsm−RSGFPバージョン)に融合したClarkia brewerii LIS1遺伝子のプロモーター含有領域(pBHX103と同一領域)とnos polyAシグナル含有領域から構成されるHindIII−EcoRIフラグメントを単離した。次に、このフラグメントをHindIIIとEcoRIで予め消化しておいたT−DNAバイナリーベクターにライゲーションし、pBHX113を作製した。
pBHX94
Clarkia brewerii LIS1遺伝子の5’フランキング領域を含むプラスミドをミシガン大学から入手した。プライマーとしてBHX30:CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(配列番号3)とBHX31:GGCCATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(配列番号5)を使用してLIS1 5’フランキング領域を含む〜1kbフラグメントをPCRにより合成した。これらのプライマーは一方の末端が5’フランキング領域とアニールし、3’末端が5’未翻訳リーダー領域内にアニールするように設計した。フラグメントの5’及び3’末端を夫々切断する制限酵素HindIII及びNcoIでPCR産物を消化した。NcoI部位はLIS1蛋白質コーディング領域の開始コドンにオーバーラップする。消化したフラグメントをゲル精製した後、プロモーターなしにプラスミドに導入したgusA::nosトランスジーン(予めHindIIIとNcoIで消化)とインフレーム融合し、LIS1::gusA::nosトランスジーン(pBHX94と命名)を作製した。
Clarkia brewerii LIS1遺伝子の5’フランキング領域を含むプラスミドをミシガン大学から入手した。プライマーとしてBHX30:CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(配列番号3)とBHX31:GGCCATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(配列番号5)を使用してLIS1 5’フランキング領域を含む〜1kbフラグメントをPCRにより合成した。これらのプライマーは一方の末端が5’フランキング領域とアニールし、3’末端が5’未翻訳リーダー領域内にアニールするように設計した。フラグメントの5’及び3’末端を夫々切断する制限酵素HindIII及びNcoIでPCR産物を消化した。NcoI部位はLIS1蛋白質コーディング領域の開始コドンにオーバーラップする。消化したフラグメントをゲル精製した後、プロモーターなしにプラスミドに導入したgusA::nosトランスジーン(予めHindIIIとNcoIで消化)とインフレーム融合し、LIS1::gusA::nosトランスジーン(pBHX94と命名)を作製した。
pBHX99
プラスミドpBHX94をHindIIIとEcoRIで消化し、LIS1::gusA::nosトランスジーンを含むフラグメントを遊離させた。次に、このフラグメントをHindIIIとEcoRIで予め消化しておいたT−DNAバイナリーベクターにライゲーションし、pBHX99を作製した。
プラスミドpBHX94をHindIIIとEcoRIで消化し、LIS1::gusA::nosトランスジーンを含むフラグメントを遊離させた。次に、このフラグメントをHindIIIとEcoRIで予め消化しておいたT−DNAバイナリーベクターにライゲーションし、pBHX99を作製した。
pBHX103
Clarkia brewerii LIS1遺伝子の5’フランキング領域を含むプラスミドをミシガン大学から入手した。プライマーとしてBHX30:CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(配列番号3)とBHX36:CAGCCCGGGATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(配列番号4)を使用してLIS1 5’フランキング領域を含む〜1kbフラグメントをPCRにより合成した。これらのプライマーは一方の末端が5’フランキング領域とアニールし、3’末端が5’未翻訳リーダー領域内にアニールするように設計した。フラグメントの5’及び3’末端を夫々切断する制限酵素HindIII及びSmaIでPCR産物を消化した。消化したフラグメントをゲル精製した後、多重クローニング部位領域(MCS)とそれに続いてnos polyAシグナル含有領域を含み、HindIIIとSmaIで消化しておいたプラスミドに挿入し、LIS1::MCS::nosトランスジーン(pBHX103と命名)を作製した。
Clarkia brewerii LIS1遺伝子の5’フランキング領域を含むプラスミドをミシガン大学から入手した。プライマーとしてBHX30:CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(配列番号3)とBHX36:CAGCCCGGGATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(配列番号4)を使用してLIS1 5’フランキング領域を含む〜1kbフラグメントをPCRにより合成した。これらのプライマーは一方の末端が5’フランキング領域とアニールし、3’末端が5’未翻訳リーダー領域内にアニールするように設計した。フラグメントの5’及び3’末端を夫々切断する制限酵素HindIII及びSmaIでPCR産物を消化した。消化したフラグメントをゲル精製した後、多重クローニング部位領域(MCS)とそれに続いてnos polyAシグナル含有領域を含み、HindIIIとSmaIで消化しておいたプラスミドに挿入し、LIS1::MCS::nosトランスジーン(pBHX103と命名)を作製した。
pBHX107
(rbsSトランジットペプチドをcrtB蛋白質コーディング領域のN末端に融合したcrtB遺伝子を含む)プラスミドpATC921に由来する1.5kb HincIIフラグメントをプラスミドpBHX103のLIS1プロモーターとnosフラグメントの間に位置するSmaI部位にセンス方向に挿入し、プラスミドpBHX107を作製した。
(rbsSトランジットペプチドをcrtB蛋白質コーディング領域のN末端に融合したcrtB遺伝子を含む)プラスミドpATC921に由来する1.5kb HincIIフラグメントをプラスミドpBHX103のLIS1プロモーターとnosフラグメントの間に位置するSmaI部位にセンス方向に挿入し、プラスミドpBHX107を作製した。
pBHX112
プラスミドpBHX107をHindIIIとEcoRIで消化し、LIS1::crtB::nosトランスジーンを含むフラグメントを遊離させた。次に、このフラグメントをHindIIIとEcoRIで予め消化しておいたT−DNAバイナリーベクターにライゲーションし、pBHX112を作製した。
プラスミドpBHX107をHindIIIとEcoRIで消化し、LIS1::crtB::nosトランスジーンを含むフラグメントを遊離させた。次に、このフラグメントをHindIIIとEcoRIで予め消化しておいたT−DNAバイナリーベクターにライゲーションし、pBHX112を作製した。
LIS1プロモーター又は構成的UBQ3プロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株における遺伝子発現の評価
LIS1プロモーターによる花組織における遺伝子発現を評価するために、’Mitchell’品種ペチュニアをLIS1::GFP::nos(pBHX113)又はUBQ3::GFP::nos(pBHX109)構築物で形質転換した。UBQ3は当分野で周知の構成的プロモーターである。ペチュニア形質転換体を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、蛍光顕微鏡から発生される青色光を使用して各植物体からのサンプル花のGFP発現を評価した。明白な発現のない0から最高発現に相当する4までの主観的採点システムを使用した。
LIS1プロモーターによる花組織における遺伝子発現を評価するために、’Mitchell’品種ペチュニアをLIS1::GFP::nos(pBHX113)又はUBQ3::GFP::nos(pBHX109)構築物で形質転換した。UBQ3は当分野で周知の構成的プロモーターである。ペチュニア形質転換体を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、蛍光顕微鏡から発生される青色光を使用して各植物体からのサンプル花のGFP発現を評価した。明白な発現のない0から最高発現に相当する4までの主観的採点システムを使用した。
結果を下表3に示す。LIS1により誘導されるGFP発現は花弁及び花喉の花組織で最も明白であった。試験したLIS1及びUBQ3トランスジェニック植物体のうちで雌蘂組織にGFP発現が認められたのはLIS1プロモーター含有植物体2株のみであった。構成型プロモーターで予想される通り、UBQ3により誘導されるGFP発現のほうが花組織全体でより均一であった。この結果、花弁組織におけるLIS1プロモーターとUBQ3構成的プロモーターによるGFP発現は同等であることが分かった。
LIS1プロモーター又はCaMV由来35Sプロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株における遺伝子発現の評価
プラスミドLIS1::gusA::nos(pBHX99)を含む11個のトランスジェニック’Dreams White’品種ペチュニア株(’Dreams White’はPanAmerican Seed Company,622 Town Road,West Chicago,ILの市販品)と35S::gusA::nos構築物(pBI121)を含む3個のトランスジェニック株を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、各植物体からのサンプル花及び若葉を5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸シクロヘキシルアンモニウム塩溶液(X−gluc)で組織化学的に染色し、各種組織におけるGUS発現を評価した(下表4参照)。明白な発現のない0から最高発現に相当する3までの主観的採点システムを使用した。
プラスミドLIS1::gusA::nos(pBHX99)を含む11個のトランスジェニック’Dreams White’品種ペチュニア株(’Dreams White’はPanAmerican Seed Company,622 Town Road,West Chicago,ILの市販品)と35S::gusA::nos構築物(pBI121)を含む3個のトランスジェニック株を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、各植物体からのサンプル花及び若葉を5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸シクロヘキシルアンモニウム塩溶液(X−gluc)で組織化学的に染色し、各種組織におけるGUS発現を評価した(下表4参照)。明白な発現のない0から最高発現に相当する3までの主観的採点システムを使用した。
下表4に示すように、数個の株は花優先発現を示す。これに対して全3個の35S::gusA::nos(pBI121)株は試験した全組織で中度から高度のGUS発現を示した(下表4参照)。この結果、LIS1::gusA::nos(pBHX99)トランスジェニック株のうちには葉組織でGUS発現を示すものがあり、LIS1プロモーターはペチュニアゲノムの特定領域に組込み後に不適切に発現される可能性があることが分かった(所謂「位置効果」)。他方、同定された(6個の)LIS1::gusA::nos(pBHX99)株の殆どは花弁及び他の花組織で中から高度の発現を示し、葉に明白なGUS発現はなかった。図2に示す写真から明らかなように、LIS1::gusA::nos又は35S::gusA::nos(pBI121)構築物を含むトランスジェニックペチュニア株間にはGUS発現の差がある。
35S::gusA::nos(pBI121)形質転換株と比較してLIS1::gusA::nos(pBHX99)で形質転換した植物体におけるGUS活性の定量的測定値を得るために、メチルウンベリフェリル−B−D−グルクロニド(MUG)を基質として各種植物組織からの無細胞粗抽出物を利用してGUS発現の蛍光検出を実施した。二重分析を実施し、結果を下表5に示す。
全LIS1::gusA::nos形質転換植物体は花弁におけるGUS発現が対照よりも多く、1株(1700−1−6)以外は35S::gusA::nos形質転換植物体の花弁よりも多かった。更に、全LIS1::gusS::nos形質転換植物体で花弁のGUS発現のほうがは葉及び萼組織よりも有意に多かった。ペチュニア株1700−1−14Aは花弁組織で最高発現を示し、2160.4±626.3nmol/min/g[fw]のレベルであった。このGUS活性レベルは双子葉植物において非常に活性であるとして知られているプロモーターであるCaMV 35S RNAプロモーターの28倍である。従って、LIS1プロモーターはペチュニア花弁で高レベルの発現を誘導すると結論することができる。
LIS1プロモーターが他のペチュニア変異株で花優先遺伝子発現を生じることを例証するために、’Mitchell’品種ペチュニアの形質転換体でGUS活性を測定した。二重分析を実施し、結果を下表6に示す。総GUS発現はトランスジェニック’Dreams White’の花弁に比較してLIS1::gusA::nos’Mitchell’ペチュニアの花弁のほうが少ないが、傾向は同じである。35S::gusA::nos株の花弁は63nmol/min/g[fw]のレベルであるのに対してLIS1::gusA::nosトランスジェニック’Mitchell’ペチュニアの花弁におけるGUS発現レベルは61〜419nmol/min/g[fw]であり、LIS1::gusA::nosトランスジェニック’Mitchell’ペチュニアの花弁における遺伝子発現レベルは35S::gusA::nos株と同等以上であることが判明した(99A−2700−1−5株で6倍まで)。他方、LIS1::gusA::nosトランスジェニック株の葉及び萼組織におけるGUS発現レベルは夫々0.7〜7.3及び1.9〜20.5nmol/min/g[fw]であった。35S::gusA::nosトランスジェニック株のGUS発現は葉組織で104nmol/min/g[fw]、萼組織で93.9nmol/min/g[fw]に達した。35Sは公知構成的プロモーターであるので、35S::gusA::nosトランスジェニック株の各種組織におけるGUS発現の均質性は予想通りである。’Dreams White’及び’Mitchell’両品種のペチュニアのLIS1::gusA::nosトランスジェニック株で得られた対照的な結果はLIS1プロモーターによる花優先発現を明白に示している。
このように、GUS活性の組織化学アッセイと蛍光アッセイの結果は一致し、LIS1プロモーターがペチュニアの花組織で高レベルのトランスジーン発現を誘導できることが実証された。
LIS1プロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニアの花部分と生育中の花弁における遺伝子発現の評価
プラスミドLIS1::gusH::nosを含むトランスジェニック’Dreams White’品種ペチュニア株1700−1−14Aは花弁組織で最高のGUS発現株として同定された(上記表5参照)。この株を使用して更に試験し、GUS発現に及ぼす花齢の効果を芽又は花長により調べ、成熟花の特定花部分におけるGUS発現を測定した。
プラスミドLIS1::gusH::nosを含むトランスジェニック’Dreams White’品種ペチュニア株1700−1−14Aは花弁組織で最高のGUS発現株として同定された(上記表5参照)。この株を使用して更に試験し、GUS発現に及ぼす花齢の効果を芽又は花長により調べ、成熟花の特定花部分におけるGUS発現を測定した。
萼から花弁端までの長さが2〜5cmの花を1700−1−14A株から選択して花弁におけるGUS活性を測定した。芽が閉じた段階が一般に2cmであり、完全に開花すると5cmになる。結果を下表7に示すように、芽から成熟花までにGUS発現は174倍に増加し、花の成熟につれてGUS発現が増すことが分かった。
1700−1−14Aの完全に開いた花において花部分におけるGUS活性を測定した。試験した花部分は花弁先端部(遠位)、花弁基部、葯/花粉、及び雌蘂とした。二重分析を実施し、結果を下表8に示す。全花組織でGUS発現が観察され、最高のGUS発現は雌蘂であった。雌蘂GUS発現は遠位花弁組織の14倍であった。従って、LIS1プロモーターはペチュニア花組織全体にわたって高レベルの発現を誘導すると結論することができる。
LIS1プロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックマリーゴールド株における遺伝子発現の評価
LIS1プロモーターが第2の異種植物種で高レベルのGUS発現を誘導できるか否かを調べるために、マリーゴールド(Tagetes erecta)植物体PanAmerican Seed権利保護育種株13819をLIS1::gusA::nos(pBHX99)構築物で形質転換し、形質転換株1株99A−3300−1−10を回収した。GUS発現を検出するための蛍光アッセイをこの株の各種植物組織で実施した。LIS1::gusAを発現するペチュニアの場合と同様に、GUS発現(nmol/min/g[fw])は花組織で高かったが、萼と葉では高くなかった。これらの結果はLIS1プロモーターがマリーゴールドで花優先遺伝子発現を誘導したことを示す。
LIS1プロモーターが第2の異種植物種で高レベルのGUS発現を誘導できるか否かを調べるために、マリーゴールド(Tagetes erecta)植物体PanAmerican Seed権利保護育種株13819をLIS1::gusA::nos(pBHX99)構築物で形質転換し、形質転換株1株99A−3300−1−10を回収した。GUS発現を検出するための蛍光アッセイをこの株の各種植物組織で実施した。LIS1::gusAを発現するペチュニアの場合と同様に、GUS発現(nmol/min/g[fw])は花組織で高かったが、萼と葉では高くなかった。これらの結果はLIS1プロモーターがマリーゴールドで花優先遺伝子発現を誘導したことを示す。
GUS活性を検出するための蛍光アッセイを使用してLIS1::gusA::nos(pBHS99)で形質転換したPAS育種株13819の他のトランスジェニック植物体も評価した。上記99A−3300−1−10株を対照雄親PanAmerican Seed権利保護育種株13819と交配した子孫も評価した。二重分析を実施し、結果を下表9に示す。雌蘂、花弁及び発生中の種子を含むマリーゴールド花組織でLIS1による比較的高レベルのGUS発現が観察された。雌蘂では351nmol/min/g[fw]までのGUS発現が観察された。このレベルは’Mitchell’品種ペチュニアの花弁組織で観察されたLIS1によるGUS発現と同等である。葉組織の発現は著しく低いか、又は全く観察されなかった。試験した6個の花托のうちの2個で高レベル発現が観察された。
トランスジェニック99A−3300−1−10を使用して交配した子孫99A−10−2、99A−10−3、99A−10−17及び99A−10−18を分析した処、トランスジーンは雌雄交配遺伝性であることが分かった。更に、2種の子孫(99A−10−17と99A−10−18)では最高の花弁発現レベルが観察された。
花組織でLIS1により誘導されるGUS発現のレベルは対照植物体の花において観察されるよりも高く、試験したうちの3株を除き、花組織でLIS1により誘導されるGUS発現は35S::gusA::nos形質転換植物体よりも高い。従って、LIS1プロモーターはマリーゴールドで遺伝性であり、マリーゴールドとペチュニアの花組織で高レベルのトランスジーン発現を誘導すると結論することができる。
LIS1プロモーターとcrtBを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株の評価
LIS1::crtB::nosを含むpBHX112で形質転換した2個の’Mitchell’品種ペチュニア植物体からの花を分析し、遺伝子発現が特定花領域に局在しているか否かを調べた。crtB遺伝子はカロテノイド生合成経路の初期に存在する無色カロテノイド中間体であるフィトエンを産生する酵素である酵素フィトエンシンターゼをコードする。植物体を112−3200−1−45と112−3200−1−59と命名し、花を花弁、上部花喉及び下部花喉の3部分に分割した。各部分から全RNAを抽出し、RNAゲルブロット分析を実施した。図3に示す結果から明らかなように、crtBmRNAは花弁及び上部花喉組織の両者に中レベルで存在し、下部花喉組織は程度が低く、遺伝子発現を転写産物レベルで検出できることが確認された。
LIS1::crtB::nosを含むpBHX112で形質転換した2個の’Mitchell’品種ペチュニア植物体からの花を分析し、遺伝子発現が特定花領域に局在しているか否かを調べた。crtB遺伝子はカロテノイド生合成経路の初期に存在する無色カロテノイド中間体であるフィトエンを産生する酵素である酵素フィトエンシンターゼをコードする。植物体を112−3200−1−45と112−3200−1−59と命名し、花を花弁、上部花喉及び下部花喉の3部分に分割した。各部分から全RNAを抽出し、RNAゲルブロット分析を実施した。図3に示す結果から明らかなように、crtBmRNAは花弁及び上部花喉組織の両者に中レベルで存在し、下部花喉組織は程度が低く、遺伝子発現を転写産物レベルで検出できることが確認された。
花弁組織における遺伝子活性を更に実証するために、LIS1::crtB::nos(pBHX112)構築物を使用して形質転換した’Mitchell’品種ペチュニア株を使用してHPLC分析を実施した。HPLC分析では、花弁組織抽出手順は乾燥植物材料におけるカロテンとキサントフィルの公式抽出法に従った(Official Methods of analysis(1980)13th Ed.,AOAC,Arlington,VA,sec.43.018−43.023参照)。抽出中に組織を鹸化しなかった。
HPLC装置はAlliance 2690に冷蔵オートサンプラー、カラムヒーター及びWaters Photodiode Array 996検出器(Waters Corp.,Milford,MA)を取付けた。3μm,2.0x150mmのYMC C30カラムで分離し、同一材料のガードカラムを使用した。標準はICC Indofine Chemicals,Somerville,New JerseyとDHI−Water & Environment,Horsholm,デンマークから入手した。乾燥サンプルをメチルtert−ブチルエーテルとメタノールに総容量200μlまで再懸濁し、濾過した。勾配法を使用してカロテノイドを分離した。初期勾配条件は90%メタノール:5%水:5%メチルtert−ブチルエーテルを流速0.4ml/分で流した。0分から15分までは移動相を初期条件から80メタノール:5水:15メチルtert−ブチルエーテルまで変化させ、15分から60分までは20メタノール:5水:75メチルtert−ブチルエーテルまで変化させた。次の10分間で移動相を初期条件に戻し、カラムを更に15分間平衡化させた。カラム温度は27℃に維持した。注入量は10μLとした。下表10に示すカロテノイドの値は450nmの総面積の百分率としてのピーク面積を使用して表す。フィトエンはスペクトルシグネーチャーに基づいて同定し、フィトエン面積は最大プロットから決定した。データは標準化ピーク面積として表し、括弧内の数値は総カロテノイドピーク面積に対する各カロテノイドの百分率を示す。
対照に比較して10倍以上のβ−カロテンレベルが観察されることから花弁組織におけるLIS1プロモーター活性は明白である。トランスジェニックには対照花弁組織で検出されなかったフィトエンの存在も観察された。ゼアキサンチンとルテインの含量は対照と有意差がない。
LIS1::crtB::nos(pBHX112)構築物が雌雄交配遺伝性であるか否かを調べるために、上記112A−3200−1−53及び112A−3200−1−45株を親雌として’Carpet Butter Cream’品種ペチュニア,(PanAmerican Seed Company,622 Town Road,West Chicago,ILの市販品)又はPanAmerican Seed権利保護育種株6923−1と交配した。2種の子孫7685及び7688からの花弁及び葉組織のカロテノイド含量を上記HPLC手順に従って分析した。対照は同一交配からの非トランスジェニック植物体とした。この分析では、抽出中に葉組織を鹸化して葉緑素を除去した。下表11に示すカロテノイドの値は450nmの総面積の百分率としてのピーク面積を使用して表す。フィトエンはスペクトルシグネーチャーに基づいて同定し、フィトエン面積は最大プロットから決定した。データは標準化ピーク面積として表す。
対照に比較して17倍の花弁組織β−カロテンレベルが観察されることから花弁組織におけるLIS1プロモーター活性の遺伝性は明白である。上述のように、トランスジェニック花弁組織にはフィトエンが観察されたが、対照花弁組織には検出されなかった。葉組織カロテノイド含量は対照組織と実質的に差がなかった。ゼアキサンチンとルテインの含量は対照と有意差がない。LIS1プロモーターはマリーゴールドとペチュニアの両者で遺伝性であり、両種の花において高レベルのトランスジーン発現を誘導すると結論することができる。
BAMTプロモーターとgusAを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株におけるGUS発現の評価
BAMTプロモーターを使用して花組織における遺伝子発現を評価するために、’Mitchell’品種ペチュニアをBAMT::gusA::nos構築物で形質転換した。BAMT(安息香酸カルボキシメチルトランスフェラーゼ)はキンギョソウの花に最も豊富に存在する芳香化合物として知られている揮発性エステルである安息香酸メチルの生合成における最終酵素である。ペチュニア形質転換体を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、17個の個体植物体からのサンプル花及び若葉をX−gluc溶液で染色し、GUS活性を検出した。明白な発現のない0から最高発現に相当する4までの主観的採点システムを使用した。
BAMTプロモーターを使用して花組織における遺伝子発現を評価するために、’Mitchell’品種ペチュニアをBAMT::gusA::nos構築物で形質転換した。BAMT(安息香酸カルボキシメチルトランスフェラーゼ)はキンギョソウの花に最も豊富に存在する芳香化合物として知られている揮発性エステルである安息香酸メチルの生合成における最終酵素である。ペチュニア形質転換体を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、17個の個体植物体からのサンプル花及び若葉をX−gluc溶液で染色し、GUS活性を検出した。明白な発現のない0から最高発現に相当する4までの主観的採点システムを使用した。
下表12に示すように、ペチュニア形質転換体の花弁組織にGUS発現をは検出されなかった。キンギョソウでは、BAMT遺伝子活性の大部分は花冠の上下葉で検出された(Dudarevaら,The Plant Cell,12:949−961(2000))。従って、外来遺伝子の花弁発現を誘導するために花弁組織で発現された遺伝子に由来するプロモーターを使用できるとは予想できない。
本明細書に引用する全文献及び特許は参考資料として組込む。
以上の説明及び実施例により本発明を例証した。以上の説明に鑑みて多数の変形が当業者に自明であるので、以上の説明は非限定的な例証である。請求の範囲の適用範囲と精神に含まれるこのような全変形も本発明に含むものとする。
本発明の概念と範囲から逸脱せずに本明細書に記載する本発明の方法の組成、操作及び構成を変更することができる。
Claims (58)
- 配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列を含むプロモーターをコードする単離ポリヌクレオチド。
- ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 植物の少なくとも1個の花において転写を開始することが可能な配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記配列が配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される前記ポリヌクレオチド。
- ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 植物の花において転写を誘導することが可能な単離プロモーターであって、前記プロモーターは配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む前記プロモーター。
- ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項7に記載のプロモーター。
- ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項7に記載のプロモーター。
- 請求項7に記載のプロモーターと前記プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、前記プロモーターが前記発現カセットで形質転換された植物の花において前記ポリヌクレオチド配列の転写と発現を開始することが可能である前記発現カセット。
- ポリヌクレオチド配列が発現カセットにセンス方向に挿入されている請求項10に記載の発現カセット。
- ポリヌクレオチド配列が発現カセットにアンチセンス方向に挿入されている請求項10に記載の発現カセット。
- 請求項10に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
- 請求項10に記載の発現カセットで安定的に形質転換された植物又は植物部分。
- 植物部分が細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯から構成される群から選択される請求項14に記載の植物部分。
- 植物が単子葉植物である請求項14に記載の植物。
- 前記単子葉植物がヒガンバナ科(Amaryllidaceae)、イネ科(Graminae)、及びイネ科(Poaceae)から構成される群から選択される請求項16に記載の植物。
- 植物が双子葉植物である請求項14に記載の植物。
- 前記双子葉植物がキョウチクトウ科(Apocynaceae)、キク科(Asteraceae)、キク科(Compositae)、ツリフネソウ科(Balsaminaceae)、シュウカイドウ科(Begoniaceae)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)、アカザ科(Chenopodiaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、アブラナ科(Cruciferae)、リンドウ科(Gentianaceae)、フウロソウ科(Geraniaceae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、シソ科(Labiatae)、マメ科(Leguminosae)、ユリ科(Liliaceae)、サワギキョウ科(Lobeliaceae)、アオイ科(Malvaceae)、イソマツ科(Plumbaginaceae)、ハナシノブ科(Polemoniaceae)、サクラソウ科(Primulaceae)、キンボウゲ科(Ranunculaceae)、バラ科(Rosaceae)、アカネ科(Rubiaceae)、ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)、ナス科(Solanaceae)、セリ科(Umbelliferae)、クマツヅラ科(Verbenaceae)、及びスミレ科(Violaceae)から構成される群から選択される請求項18に記載の植物。
- そのゲノムに前記発現カセットを含む請求項14に記載の植物の種子。
- キメラプロモーターとポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列は前記キメラプロモーターに機能的に連結されており、更に、前記キメラプロモーターは(a)植物の花においてプロモーター優先活性をもち、配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつ第1のポリヌクレオチドと、(b)植物においてポリヌクレオチド配列の転写を開始することが可能な少なくとも第2のポリヌクレオチド配列を含む前記発現カセット。
- キメラプロモーターが植物の花においてプロモーター優先活性をもつ少なくとも第2のポリヌクレオチド配列を含む請求項21に記載の発現カセット。
- キメラプロモーターが植物の花においてプロモーター優先活性をもつ第2のポリヌクレオチド配列を含む請求項21に記載の発現カセット。
- キメラプロモーターが(a)植物の花においてプロモーター優先活性をもち、配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつ第1のポリヌクレオチドと、(b)植物の花においてプロモーター優先活性をもち、配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつ第2のポリヌクレオチドを含む請求項21に記載の発現カセット。
- キメラプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列が発現カセットにセンス方向に挿入されている請求項21に記載の発現カセット。
- キメラプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列が発現カセットにアンチセンス方向に挿入されている請求項21に記載の発現カセット。
- 請求項21に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
- 請求項21に記載の発現カセットで安定的に形質転換された植物又は植物部分。
- 植物部分が細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯から構成される群から選択される請求項28に記載の植物部分。
- 植物が単子葉植物である請求項28に記載の植物。
- 前記単子葉植物がヒガンバナ科(Amaryllidaceae)、イネ科(Graminae)、及びイネ科(Poaceae)から構成される群から選択される請求項30に記載の植物。
- 植物が双子葉植物である請求項28に記載の植物。
- 前記双子葉植物がキョウチクトウ科(Apocynaceae)、キク科(Asteraceae)、キク科(Compositae)、ツリフネソウ科(Balsaminaceae)、シュウカイドウ科(Begoniaceae)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)、アカザ科(Chenopodiaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、アブラナ科(Cruciferae)、リンドウ科(Gentianaceae)、フウロソウ科(Geraniaceae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、シソ科(Labiatae)、マメ科(Leguminosae)、ユリ科(Liliaceae)、サワギキョウ科(Lobeliaceae)、アオイ科(Malvaceae)、イソマツ科(Plumbaginaceae)、ハナシノブ科(Polemoniaceae)、サクラソウ科(Primulaceae)、キンボウゲ科(Ranunculaceae)、バラ科(Rosaceae)、アカネ科(Rubiaceae)、ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)、ナス科(Solanaceae)、セリ科(Umbelliferae)、クマツヅラ科(Verbenaceae)、及びスミレ科(Violaceae)から構成される群から選択される請求項32に記載の植物。
- そのゲノムに前記発現カセットを含む請求項28に記載の植物の種子。
- 植物の花において転写を開始することが可能なプロモーターを含むDNA分子で安定的に形質転換されたトランスジェニック植物細胞であって、前記プロモーターが配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む前記トランスジェニック植物細胞。
- DNA分子が更にプロモーターに機能的に連結された選択コーディング領域を含む請求項35に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 選択コーディング領域がセンス方向である請求項36に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 選択コーディング領域がアンチセンス方向である請求項36に記載のトランスジェニック植物細胞。
- ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項35に記載のトランスジェニック植物細胞。
- ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項35に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 前記選択コーディング領域が昆虫耐性蛋白質、細菌病耐性蛋白質、真菌病耐性蛋白質、ウイルス病耐性蛋白質、アントシアニン生合成酵素、カロテノイド生合成酵素、花の香り生合成蛋白質、スクリーニング可能なマーカー蛋白質又は花の寿命を促進する蛋白質をコードする請求項36に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 前記選択コーディング領域がβ−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン及びグリーン蛍光蛋白質から構成される群から選択されるスクリーニング可能なマーカー蛋白質をコードする請求項36に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 前記選択コーディング領域がペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、及びペツニジンの化合物を産生するアントシアニン生合成酵素をコードする請求項36に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 前記選択コーディング領域がフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン及びアスタキサンチンの化合物を産生するカロテノイド生合成酵素をコードする請求項36に記載のトランスジェニック植物細胞。
- トランスジェニック植物の花において選択蛋白質を発現させる方法であって、
(a)植物の花において転写を開始することが可能であり、配列番号2及びストリンジェント条件下で配列番号2とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含むプロモーターに機能的に連結された選択コーディング領域を含む発現ベクターを得る段階と;
(b)レシピエント植物細胞を前記ベクターで形質転換する段階と;
(c)前記選択蛋白質を発現するトランスジェニック植物を前記レシピエント植物細胞から再生させる段階を含む前記方法。 - 選択コーディング領域がセンス方向である請求項45に記載の方法。
- 選択コーディング領域がアンチセンス方向である請求項45に記載の方法。
- ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項45に記載の方法。
- ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項45に記載の方法。
- 前記形質転換段階が電子銃照射、ポリエチレングリコールによるプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション及びアグロバクテリウムによる形質転換から構成される群から選択される方法を含む請求項45に記載の方法。
- 前記形質転換段階が電子銃照射を含む請求項50に記載の方法。
- 前記形質転換段階がポリエチレングリコールによるプロトプラストの形質転換を含む請求項50に記載の方法。
- 前記形質転換段階がエレクトロポレーションを含む請求項50に記載の方法。
- 前記形質転換段階がアグロバクテリウムによる形質転換を含む請求項50に記載の方法。
- 前記レシピエント植物細胞が単子葉植物に由来する請求項45に記載の方法。
- 単子葉植物がヒガンバナ科Amaryllidaceae、イネ科Graminae、及びPoaceaeから構成される群から選択される請求項55に記載の方法。
- 前記レシピエント植物細胞が双子葉植物に由来する請求項45に記載の方法。
- 双子葉植物がキョウチクトウ科(Apocynaceae)、キク科(Asteraceae)、キク科(Compositae)、ツリフネソウ科(Balsaminaceae)、シュウカイドウ科(Begoniaceae)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)、アカザ科(Chenopodiaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、アブラナ科(Cruciferae)、リンドウ科(Gentianaceae)、フウロソウ科(Geraniaceae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、シソ科(Labiatae)、マメ科(Leguminosae)、ユリ科(Liliaceae)、サワギキョウ科(Lobeliaceae)、アオイ科(Malvaceae)、イソマツ科(Plumbaginaceae)、ハナシノブ科(Polemoniaceae)、サクラソウ科(Primulaceae)、キンボウゲ科(Ranunculaceae)、バラ科(Rosaceae)、アカネ科(Rubiaceae)、ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)、ナス科(Solanaceae)、セリ科(Umbelliferae)、クマツヅラ科(Verbenaceae)、及びスミレ科(Violaceae)から構成される群から選択される請求項57に記載の方法。
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