JP2002262894A - 特定のクラスのダイズ種子タンパク質遺伝子の抑制 - Google Patents

特定のクラスのダイズ種子タンパク質遺伝子の抑制

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は種子貯蔵タンパク質をコードする遺
伝子の発現がトランスジェニック植物の種子貯蔵タンパ
ク質特性の変化をもたらすように改変されているトラン
スジェニックダイズ系統の構築を目的とする。 【解決手段】 本発明は（ａ）（ｉ）ダイズ種子貯蔵タ
ンパク質遺伝子からのプロモータ−領域をコードする核
酸フラグメント；及び（ii）（ｉ）のダイズ種子貯蔵タ
ンパク質ではないダイズタンパク質の全部または一部を
コードする核酸フラグメント、該核酸フラグメントが
（ｉ）のプロモーターに対してセンスまたはアンチセン
スの向きに置かれる；及び（iii）転写終結領域を含ん
でなるキメラ遺伝子を構築し、（ｂ）（ａ）のキメラ遺
伝子をダイズ種子中に導入することによりトランスジェ
ニックダイズ種子を作製し、そして（ｃ）工程（ａ）の
キメラ遺伝子の発現をもたらす条件下で工程（ｂ）のト
ランスジェニックダイズ種子を生育することを特徴とす
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は種子貯蔵タンパク質をコードする
遺伝子の発現がトランスジェニック植物の種子貯蔵タン
パク質特性（ｐｒｏｆｉｌｅ）の変化をもたらすように
改変されているトランスジェニックダイズ系統の構築に
関する。そのように改変されたトランスジェニックダイ
ズ系統は独特で有益な機能特性を有する新規なダイズタ
ンパク質製品の製造のために用いられる。
【０００２】
【発明の背景】ダイズ種子は乾量に基づいて３５％から
５５％までのタンパク質を含有する。このタンパク質の
大部分は貯蔵タンパク質であり、それは発芽中に加水分
解され、発生中の実生により必要とされるエネルギー及
び代謝中間体を与える。収穫され、家畜類の飼料として
利用される場合にダイズ種子の貯蔵タンパク質は重要な
栄養供給源である。さらに、ダイズはヒト消費のための
タンパク質の最も経済的な供給源であることが現在一般
的に認識されている。ダイズタンパク質またはタンパク
質単離物はすでに世界の様々な地域で食品のために広く
用いられている。ダイズ種子中の貯蔵タンパク質の量及
び質を向上するために多くの努力が捧げられている。
【０００３】大部分の植物種の種子は当該技術分野で種
子貯蔵タンパク質として知られているものを含有する。
これらはそれらの大きさ及び溶解性に基づいて分類され
ている（Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｔ．Ｊ．（１９８４）Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９
１−２２１）。全てのクラスが全ての種で見いだされる
わけではないが、大部分の植物種の種子は１クラスより
多くからのタンパク質を含有する。通常、特定の溶解性
または大きさのクラス内のタンパク質は同じ種内の異な
るクラスのメンバーよりも他の種の同じクラスのメンバ
ーに構造的に相関している。多くの種において、一定の
クラスの種子タンパク質はしばしば多重遺伝子ファミリ
ーによりコードされ、時折、それらのファミリーを配列
相同性に基づいてサブクラスに分けることができるよう
に複雑である。
【０００４】２種の主要なダイズ種子貯蔵タンパク質：
グリシニン（１１Ｓグロブリンとしても知られている）
及びβ−コングリシニン（７Ｓグロブリンとしても知ら
れている）がある。これらは合わせて種子の全タンパク
質の７０ないし８０％または種子の乾量の２５ないし３
５％を構成する。グリシニンは約３６０ｋＤａの分子量
を有する大きなタンパク質である。それはＧ１、Ｇ２、
Ｇ３、Ｇ４及びＧ５と同定された（一般的にサブユニッ
トと呼ばれる）５個の主要なアイソフォームの各種組み
合わせからなるヘキサマーである。各サブユニットは今
度はジスルフィド結合によりつながれた１個の酸性及び
１個の塩基性ポリペプチドからなる。単一のサブユニッ
トの酸性及び塩基性ポリペプチドの両方が単一の遺伝子
によりコードされる。従って、５個のグリシニンサブユ
ニットをコードする５個の非対立遺伝子がある。これら
の遺伝子はＧｙ１、Ｇｙ２、Ｇｙ３、Ｇｙ４及びＧｙ５
と命名され、それぞれサブユニットＧ１、Ｇ２、Ｇ３、
Ｇ４及びＧ５に対応する（Ｎｉｅｌｓｅn、Ｎ．Ｃ．等
（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：３１３−３２
８）。
【０００５】グリシニンサブユニット遺伝子のゲノムク
ローン及びｃＤＮＡはシークエンスされており、ヌクレ
オチド及びアミノ酸配列の類似性に基づいて２つの群に
分かれる。群ＩはＧｙ１、Ｇｙ２及びＧｙ３からなり、
一方、群IIはＧｙ４及びＧｙ５からなる。群内の遺伝子
間には８５％より高い類似性がある（すなわち、Ｇｙ
１、Ｇｙ２及びＧｙ３のヌクレオチドの少なくとも８５
％が同一であり、Ｇｙ４及びＧｙ５のヌクレオチドの少
なくとも８５％が同一である）が、群Ｉと群IIの遺伝子
間では４２％ないし４６％の類似性があるのみである。
【０００６】β−コングリシニン（７Ｓグロブリン）は
１５０ないし２４０ｋＤａの範囲の分子量を有するヘテ
ロ糖タンパク質である。それはα、α’及びβと同定さ
れた３個の非常に負に荷電したサブユニットの各種組み
合わせからなる。α及びα’サブユニットをコードする
遺伝子のコーディング領域に相当するｃＤＮＡクローン
はシークエンスされており、それらは類似した大きさの
ものであり、配列同一性は８５％に限定される。しかし
ながら、βサブユニットのコーディング領域に相当する
ｃＤＮＡの配列はα及びα’ｃＤＮＡよりほぼ０.５ｋ
ｂ小さい。この欠失を除いて、α及びα’サブユニット
に対する配列同一性は７５−８０％である。３クラスの
β−コングリシニンサブユニットがゲノムダイズ内のい
くつかの領域に集まる全部で１５のサブユニット遺伝子
によりコードされる（Ｈａｒａｄａ、Ｊ．Ｊ．等（１９
８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：４１５−４２５）。
【０００７】タンパク質濃縮物、単離物及び人造肉（ｔ
ｅｘｔｕｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）製品のような新規な
ダイズに基づく製品は伝統的な東洋のダイズに基づく食
品を必ずしも受け入れない国々でますます利用される。
しかしながら、食品用途におけるこれらの新規な製品の
使用は、局所的嗜好及び製法条件に関連したタンパク質
製品の機能特性による。過去１０年にわたって、ダイズ
タンパク質の機能特性の理解にかなりの努力が向けられ
ている。機能特性の例は水吸着パラメーター、湿潤性、
膨潤、水分保持、溶解性、増粘、粘性、凝固、ゲル化特
性及び乳化特性を含む。この研究の本体の大部分はβ−
コングリシリン及びグリシニンタンパク質の個々の研究
並びにこれらのタンパク質の各々が全体としてダイズタ
ンパク質系にどのように影響を及ぼすかに集中している
（Ｋｉｎｓｅｌ１ａ、Ｊ．Ｅ．等（１９８５）Ｎｅｗ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｏｄｓ ５：１０７−１７９；Ｍｏ
ｒｒ、Ｃ．Ｖ．（１９８７）ＪＡＯＣＳ ６７：２６５
−２７１；Ｐｅｎｇ、Ｌ．Ｃ．等（１９８４）Ｃｅｒｅ
ａｌ Ｃｈｅｍ ６１：４８０−４８９）。機能特性はタ
ンパク質の物理化学特性に直接関係するので、β−コン
グリシリン及びグリシニンの構造的違いにより著しく異
なる機能特性を有するこれら２つのタンパク質が生じ
る。熱凝集、乳化特性及び水分保持能力の違いが報告さ
れている。さらに、ゲル化特性も同様に異なり、グリシ
ニンはより大きい引張歪、応力及び剪断強度、より優れ
た溶媒保持能力並びにより低い濁度を有するゲルを形成
する。しかしながら、現在製造されているダイズタンパ
ク質製品はグリシニン及びβ−コングリシリンの両方の
ブレンドであり、それ故、グリシニン及びβ−コングリ
シリンの個々の特性のブレンドによる機能特性を有す
る。例えば、グリシニンは１００℃に加熱されると約５
０％のタンパク質が可溶性凝集体に迅速に転化される。
さらなる加熱は凝集体の増大及びそれらの沈殿を生じ
る。沈殿物はグリシニンの塩基性ポリペプチドからな
り、酸性ポリペプチドは可溶性のままである。β−コン
グリシリンが存在すると塩基性ポリペプチドと可溶性複
合体を形成することによりそれらの沈殿を防ぐ。熱変性
が望ましいかどうかは意図される用途による。ただ１種
または他の貯蔵タンパク質を含有するダイズタンパク質
製品を製造できる場合、特定のダイズタンパク質に由来
する特定の物理特性を必要とする製品が利用できるよう
になり、またはそれらは製造するためにより経済的であ
る。
【０００８】過去２０年にわたって、各種貯蔵タンパク
質サブユニットの１種またはそれ以上を欠いているダイ
ズ系統（ヌル突然変異）がダイズ胚原質で同定されるか
または突然変異育種技術を用いて製造されている。突然
変異事象を組み合わせる育種努力により、通常の約半分
量のβ−コングリシニンを種子が含有するダイズ系統が
生じている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．等（１９９４）
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４４：６５−６６；
Ｋｉｔａｍｕｒａ、Ｊ．（１９９５）ＪＡＲＱ ２９：
１−８）。β−コングリシニンの減少は３種の独立した
劣性突然変異により制御される。グリシニンサブユニッ
トヌル突然変異の組み換えにより、著しく減少した量の
グリシニンを種子が含有する系統が生じている（Ｋｉｔ
ａｍｕｒａ、Ｊ．（１９９５）ＪＡＲＱ ２９：１−
８）。ここでも、減少は３種の独立した劣性突然変異に
より制御される。上記の系統から作物栽培学的に生育で
きるダイズ変種で、種子がグリシニンまたはβ−コング
リシニンのみを含有するものを開発することは時間がか
かり、多大の費用を要する。各異種交配は３種の突然変
異事象の独立した分離を生じる。さらに、各突然変異事
象はホモの状態であることが必要である。高収率の作物
栽培学的に優れたダイズ系統の開発は多世代にわたる非
常に多数の子孫のスクリーニング及び分析を必要とす
る。
【０００９】アンチセンス技術が種子の特定の貯蔵タン
パク質を減少するために用いられている。ブラシカ・ナ
プス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）において、ナピ
ン（２Ｓアルブミン）及びクルシフェリン（１１Ｓグロ
ブリン）はそれぞれ全種子タンパク質の約２５％及び６
０％を構成する２つの主要な貯蔵タンパク質である。ナ
ピンタンパク質は１６遺伝子までの大きな多重遺伝子フ
ァミリーによりコードされ、いくつかのｃＤＮＡ及びゲ
ノムクローンがシークエンスされている（Ｊｏｓｅｆｓ
ｓｏｎ、Ｌ．−Ｇ．等（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ ２６２：１２１９６−１２２０１；Ｓｃｈｏｆｉ
ｅｌｄ、Ｓ．及びＣｒｏｕｎｃｈ、Ｍ．Ｌ．（１９８
７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２２０２−１
２２０８）。これらの遺伝子はそれらのコーディング及
び隣接領域の両方で９０％より高い配列同一性を示す。
クルシフェリン遺伝子ファミリーは同様に複雑であり、
全部で８遺伝子を有する３サブファミリーを含んでなる
（Ｒｏｄｉｎ、Ｊ．等（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．２０：５５９−５６３）。Ｋｏｈｎｏ−
Ｍｕｒａｓｅ等（（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２６：１１１５−１１２４）は、ｎａｐ Ａプ
ロモーターにより導かれるｎａｐＡ遺伝子を用いるナピ
ンアンチセンス遺伝子を用いて種子がナピンをほとんど
または全く含有しないトランスジェニック植物を構築で
きることを示した。
【００１０】同じグループ（Ｋｏｈｎｏ−Ｍｕｒａｓｅ
等（１９９５）Ｔｈｅｏｒ ｅｔ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ ９１：６２７−６３１）は、ｎａｐ Ａプ
ロモータの制御下でクルシフェリン遺伝子（ｃｒｕＡ、
α２／３アイソフォームをコードする）のアンチセンス
型を発現することによりブラシカ・ナプスにおいてクル
シフェリン（１１Ｓグロブリン）を減少しようと試み
た。この場合、結果はより複雑であった。クルシフェリ
ンは配列同一性に基づいて３つのサブクラス（α１、２
／３及び４）に分けられ、これらのクラスは各々相互に
６０−７５％の配列同一性がある（Ｒｏｄｉｎ、Ｊ．等
（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：５
５９−５６３）。α２／３アイソフォームをコードする
アンチセンス遺伝子の発現はより低いレベルのα１及び
２／３型を生じた。しかしながら、α４クラスの発現の
減少はなかった。
【００１１】コメでは種子貯蔵タンパク質、グルテリン
のレベルを減少するためにアンチセンス技術が用いられ
た。全長のアンチセンスグルテリンコーディング領域に
機能的に連結された種子特異的グルテリンプロモータの
発現はグルテリンタンパク質レベルの約２５％の減少を
もたらした（米国特許番号第５,５１６,６６８号）。
【００１２】
【発明の要約】本発明はダイズにおいてグリシニンまた
はβ−コングリシニン（それぞれ、１１Ｓまたは７Ｓグ
ロブリン）種子貯蔵タンパク質の量を減少するための方
法を提供する。一つの態様として、種子タンパク質遺伝
子の７Ｓ−グロブリンクラスをコードする遺伝子の発現
を抑制するために共抑制技術が用いられた。７Ｓグロブ
リンの２個（α及びα’）または３個全てのサブクラス
（α、α’及びβ）をコードする遺伝子は、β−コング
リシニンの単一のサブクラス（α）をコードする遺伝子
の発現により抑制され、改変された種子貯蔵特性を有す
るダイズ系統を生じた。別の態様として、片方のみが種
子タンパク質遺伝子である２個の全く異なる遺伝子を抑
制するための方法が提示され、種子組成の複数の変化を
与える。意外にも、発現がトランスジェニックダイズ種
子の脂肪酸特性を変えるダイズ遺伝子のコーディング領
域に機能的に連結されたダイズ種子貯蔵タンパク質のプ
ロモーター領域を含んでなるキメラ遺伝子の発現によ
り、２つの異なる表現型形質：種子貯蔵タンパク質特性
及び種子油特性が同時に改変された。
【００１３】本明細書に教示されるダイズ種子貯蔵タン
パク質の量を減少するための方法は以下の工程： （ａ）（ｉ）ダイズ種子の細胞において機能できるプロ
モーターをコードする核酸フラグメント、（ii）（ｉ）
のプロモーターに対してセンスまたはアンチセンスの向
きに置かれたダイズ種子貯蔵タンパク質の全部または一
部をコードする核酸フラグメント及び（iii）転写終結
領域を含んでなるキメラ遺伝子を構築し、 （ｂ）（ａ）のキメラ遺伝子をダイズ細胞中に導入する
ことによりトランスジェニックダイズ細胞を作製し、そ
して （ｃ）工程（ａ）のキメラ遺伝子の発現を生じる条件下
で工程（ｂ）のトランスジェニックダイズ細胞を生育す
る ことを含んでなり、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子
を含有しないダイズに比較した場合にダイズ種子貯蔵タ
ンパク質サブユニットのあるクラスの１個またはそれ以
上のメンバーの量が減少している。
【００１４】
【発明の詳述】配列表の説明：以下の詳細な説明及び本
出願の一部を形成する配列表から本発明をより完全に理
解することができる。配列表は引用することにより本明
細書に組み込まれる３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１.８２２に定義
されるようなアミノ酸の３文字コードを含む。配列番号
１はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα
サブユニットをコードする５'→３'ヌクレオチド配列を
示す。配列番号２はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵
タンパク質のα’サブユニットをコードする５'→３'ヌ
クレオチド配列を示す。配列番号３はβ−コングリシニ
ンダイズ種子貯蔵タンパク質のβサブユニットをコード
する５'→３'ヌクレオチド配列を示す。配列番号４及び
５はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα
及びα’サブユニットをコードする核酸フラグメントを
単離するために用いられるＰＣＲプライマーＣｏｎＳ及
びＣｏｎｌ．４ａ（それぞれ）のヌクレオチド配列を示
す。配列番号６及び７はβ−コングリシニンダイズ種子
貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする
核酸フラグメントを区別するために用いられるＰＣＲプ
ライマーＣｏｎ．０９及びＣｏｎ．８（それぞれ）のヌ
クレオチド配列を示す。配列番号８及び９はβ−コング
リシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユ
ニットをコードする全長ｃＤＮＡを単離するために用い
られるＰＣＲプライマーＣｏｎＳａ及びＣｏｎ１．９ａ
（それぞれ）のヌクレオチド配列を示す。配列番号１０
はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及
びα’サブユニットをコードする全長ｃＤＮＡを確認す
るために用いられるＰＣＲプライマーＣｏｎ．１．０の
ヌクレオチド配列を示す。配列番号１１、１２及び１３
は群Ｉグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のＧｙ１、
Ｇｙ２及びＧｙ３サブユニット（それぞれ）をコードす
る５'→３'ヌクレオチド配列を示す。配列番号１４及び
１５は群IIグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のＧｙ
４及びＧｙ５サブユニット（それぞれ）をコードする
５'→３'ヌクレオチド配列を示す。配列番号１６、１７
及び１８は群Ｉグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質の
サブユニットをコードするｃＤＮＡを単離するために用
いられるＰＣＲプライマーＧ１−１、Ｇ１−１０３９及
びＧ１−１４７５（それぞれ）のヌクレオチド配列を示
す。配列番号１９、２０及び２１は群IIグリシニンダイ
ズ種子貯蔵タンパク質のサブユニットをコードするｃＤ
ＮＡを単離するために用いられるＰＣＲプライマーＧ４
−７、Ｇ４−１２５１及びＧ４−１６７０（それぞれ）
のヌクレオチド配列を示す。
【００１５】添付図面において：図１は本発明のキメラ
遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用い
られるプラスミドｐＭＬ７０の制限地図である。図２は
本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング
媒体として用いられるプラスミドｐＣＷ１０９の制限地
図である。図３は本発明のキメラ遺伝子の構築において
中間クローニング媒体として用いられるプラスミドｐＫ
Ｓ１８ＨＨの制限地図である。図４はプラスミドｐＪｏ
１の制限地図である。このプラスミドは植物転写単位Ｋ
Ｔｉプロモーター／β−コングリシニンの欠失したαサ
ブユニット／ＫＴｉ３'末端をｐＫＳ１８ＨＨのＢａｍ
ＨＩ部位にクローニングすることにより得られた。図５
はｐＪｏ１で形質転換された体細胞胚から抽出されたタ
ンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図６はプラス
ミドｐＢＳ４３の制限地図である。このプラスミドはダ
イズβ−コングリシニンプロモーターの転写制御下にグ
リシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）ミクロソーム
のデルタ−１２デサチュラーゼをコードする核酸配列を
含んでなる。図７はｐＢＳ４３で形質転換された植物よ
り得られたダイズ種子から抽出されたタンパク質のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルである。図８はプラスミドｐＪｏ３の
制限地図である。このプラスミドは植物転写単位ＫＴｉ
プロモーター／β−コングリシニンのαサブユニットの
全長ｃＤＮＡ／ＫＴｉ３'末端をｐＫＳ１８ＨＨのＨｉ
ｎｄIII部位にクローニングすることにより得られた。
図９はプラスミドｐＲＢ２０の制限地図である。このプ
ラスミドは転写単位β−コングリシニンプロモーター／
ファゼオリン３'末端をｐＫＳ１８ＨＨのＨｉｎｄIII部
位にクローニングすることにより得られた。これは本発
明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体
として用いられる。
【００１６】生物学的寄託物 以下のプラスミドはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３
０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、ＭＤ ２０８５２にブダペスト条約の条件下で寄託
されており、以下の登録番号を有する。 プラスミド 登録番号 寄託日 ｐＪｏ１ ＡＴＣＣ９７６１４ １９９６年６月１５日 ｐＢＳ４３ ＡＴＣＣ９７６１９ １９９６年６月１９日 ｐＪｏ３ ＡＴＣＣ９７６１５ １９９６年６月１５日
【００１７】定義 本開示の文脈上多数の用語が用いられる。「核酸」とい
う用語は、糖、リン酸及びプリンまたはピリミジンのい
ずれかを含有するモノマー（ヌクレオチド）からなる、
一本鎖または二本鎖であってもよい高分子をさす。「核
酸フラグメント」は与えられた核酸分子の断片である。
高等植物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が遺伝物質
であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡ中の情報の
タンパク質への転移に関与する。「ゲノム」は生物の各
細胞中に含まれる遺伝物質の全体である。「ヌクレオチ
ド配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中
に取り込むことができる合成、非天然または改変された
ヌクレオチド塩基を場合により含有していてもよい、一
本鎖または二本鎖であってもよいＤＮＡまたはＲＮＡポ
リマーの配列をさす。
【００１８】本明細書に用いられる場合、「相同な」と
いう用語は２個の核酸分子のヌクレオチド配列間または
２個のタンパク質分子のアミノ酸配列間の相関性をさ
す。そのような相同性の見積もりは当業者によく理解さ
れているようなストリンジェンシーの条件下でのＤＮＡ
−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡのいずれかのハイブリ
ダイゼーション（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ、編集
（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｓａｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、
Ｕ．Ｋ．）またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ等（（１９７０）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）の方法
のような２個の核酸またはタンパク質間の配列類似性の
比較により与えられる。
【００１９】本明細書に用いられる場合、「本質的に類
似した」はコードされるアミノ酸に変化を生じない塩基
変化を含む可能性があるか、または１個もしくはそれ以
上のアミノ酸を変える可能性があるがＤＮＡ配列により
コードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない
塩基変化を含むＤＮＡ配列をさす。従って、本発明は特
定の代表的な配列より多くを包含すると理解される。ま
た、得られるタンパク質分子の機能特性を実質的に変え
ないサイレント変化を生じる配列中の欠失、挿入または
置換のような配列の改変も意図される。例えば、遺伝暗
号の縮重を反映するかまたは与えられた部位で化学的に
同等なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の改変も意
図され、従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニ
ンのコドンをグリシン、バリン、ロイシンまたはイソロ
イシンのような別の疎水性アミノ酸残基をコードするコ
ドンで置換することができる。同様に、グルタミン酸の
代わりにアスパラギン酸のようなある負に荷電した残基
の同種のものでの置換、またはアルギニンの代わりにリ
シンのようなある正に荷電した残基の同種のものでの置
換を生じる変化も生物学的に同等な産物を生じると予想
することができる。タンパク質分子のＮ末端及びＣ末端
部分の変化を生じるヌクレオチド変化もタンパク質の活
性を変えると予想されない。ある場合では、実際、タン
パク質の生物学的活性に対する改変の影響を研究するた
めに配列の突然変異体を作製することが望ましいことが
ある。コードされる産物の生物学的活性の保持の測定の
ように、提示される改変の各々は当該技術分野の慣例技
術の十分範囲内である。さらに、本発明により包含され
る「本質的に類似した」配列を厳しい条件下（０.１×
ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６５℃）で本明細書に例示さ
れる配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても
特定できることを当業者は認識する。
【００２０】「遺伝子」はコーディング領域の前（５'
非コーディング）及び後ろ（３'非コーディング）の調
節配列を包含する、特定のタンパク質を発現する核酸フ
ラグメントをさす。「天然の」遺伝子は天然に見いださ
れるそれ自体の調節配列を有する単離された遺伝子をさ
す。「キメラ遺伝子」は天然に見いだされない異種の調
節及びコーディング配列を含んでなる遺伝子をさす。
「内在性」遺伝子はゲノム中のその天然の位置に通常見
いだされ、単離されていない天然の遺伝子をさす。「外
来」遺伝子は宿主生物で通常見いだされないが、遺伝子
導入により導入される遺伝子をさす。
【００２１】「コーディング配列」または「コーディン
グ領域」は特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を
さし、非コーディング配列を除く。それは「遮断されな
いコーディング配列」を形成してもよく、すなわち、イ
ントロンを欠いているか、または適切なスプライス連結
部により境界を定められた１個もしくはそれ以上のイン
トロンを含んでもよい。「イントロン」は一次転写産物
中に転写されるが、タンパク質に翻訳することができる
成熟ｍＲＮＡを生じるために細胞内でＲＮＡの開裂及び
再連結により除かれるヌクレオチド配列である。
【００２２】「開始コドン」及び「終止コドン」はタン
パク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）のそれぞれ開始及び鎖の終
結を特定するコーディング配列中の３個の隣接するヌク
レオチドの単位をさす。「読み枠」はアミノ酸配列をコ
ードする開始及び終止コドン間のイントロンにより遮断
されないコーディング配列をさす。
【００２３】「ＲＮＡ転写産物」はＲＮＡポリメラーゼ
が触媒するＤＮＡ配列の転写から生じる産物をさす。Ｒ
ＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである
場合にそれは一次転写産物と呼ばれ、またはそれは一次
転写産物の転写後プロセシングから得られるＲＮＡ配列
であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」はイントロンを含まず、細胞
によりタンパク質に翻訳することができるＲＮＡをさ
す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相補的でそれから得られ
る二本鎖のＤＮＡをさす。「センス」ＲＮＡはｍＲＮＡ
を含むＲＮＡ転写産物をさす。「アンチセンス」ＲＮＡ
は標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に
相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写
産物をさす。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定の遺伝
子転写産物のあらゆる部分、すなわち、５'非コーディ
ング配列、３'非コーディング配列、イントロンまたは
コーディング配列とであってもよい。
【００２４】本明細書に用いられる場合、「好適な調節
配列」は本発明の核酸フラグメントの発現を制御する、
本発明の核酸フラグメントの上流（５'）、内部または
下流（３'）に位置する天然またはキメラ遺伝子中のヌ
クレオチド配列をさす。「発現」という用語は、本発明
に用いられる場合、細胞のタンパク質装置と連係して改
変された表現型形質をもたらす本発明の核酸フラグメン
トから得られるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンス
ＲＮＡの転写及び安定な蓄積をさす。遺伝子の発現は遺
伝子の転写及び前駆体または成熟タンパク質へのｍＲＮ
Ａの翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は標的タンパク
質の発現を防ぐことができるアンチセンスＲＮＡ転写産
物の生産をさす。「過剰発現」は通常または非形質転換
生物における生産のレベルを上回るトラスジェニック生
物における遺伝子産物の生産をさす。「共抑制」は外来
及び内在性遺伝子の両方の発現の抑制をもたらす、内在
性遺伝子に実質的に相同な外来遺伝子の発現をさす。
「改変されたレベル」は通常または非形質転換生物のも
のと異なる量または割合のトラスジェニック生物におけ
る遺伝子産物の生産をさす。通常または非形質転換生物
に比較してトラスジェニック生物において生産される遺
伝子産物のレベルを改変することで本発明により意図さ
れる表現型の結果、すなわち、アンチセンス抑制または
共抑制によりもたらされる遺伝子発現の減少を達成でき
ることを当業者は認識する。
【００２５】「プロモーター」はＲＮＡポリメラーゼ及
び適切な転写のために必要な他の因子の認識を与えるこ
とによりコーディング配列の発現を制御する、通常その
コーディング配列の上流（５'）の、遺伝子中のＤＮＡ
配列をさす。人工ＤＮＡ構築物において、アンチセンス
ＲＮＡを転写するためにプロモーターを用いることもで
きる。また、プロモーターは生理的または発生条件に反
応して転写開始の効力を制御するタンパク質因子の結合
に関与するＤＮＡ配列を含んでもよい。また、エンハン
サー成分を含んでもよい。「エンハンサー」はプロモー
ター活性を刺激することができるＤＮＡ配列である。そ
れはプロモーターの本来の成分かまたはプロモーターの
レベルもしくは組織特異性を高めるために挿入された異
種起源の成分であってもよい。「構成的プロモーター」
は全ての組織でいつでも遺伝子発現を導くものをさす。
本明細書に関係する「組織特異的」または「発生特異
的」プロモーターは、それぞれ、葉もしくは種子のよう
な特定の組織または初期もしくは後期胚発生のような組
織の特定の発生段階でほとんど限定的に遺伝子発現を導
くものである。
【００２６】「３'非コーディング配列」はポリアデニ
ル化シグナル及びｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発
現に影響を及ぼすことができるあらゆる他の調節シグナ
ルを含む遺伝子のＤＮＡ配列部分をさす。ポリアデニル
化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３'末端へのポリ
アデニル酸領域の付加に影響を及ぼすことを特徴とす
る。
【００２７】「機能的に連結された」という用語は、片
方の機能がもう片方により影響を受けるように結合され
ている単一核酸分子上の核酸配列を指す。例えば、プロ
モーターが構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことができ
る（すなわち、構造遺伝子がプロモーターの転写制御下
にある）場合、それはその構造遺伝子と機能的に連結さ
れている。
【００２８】「形質転換」は宿主生物のゲノム中への核
酸フラグメントの導入をさし、遺伝的に安定な継承をも
たらす。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿
主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。
【００２９】本発明はトランスジェニック植物の種子貯
蔵タンパク質特性の変化をもたらすように種子貯蔵タン
パク質をコードする遺伝子の発現が改変されているトラ
ンスジェニックダイズ系統の構築に関する。種子貯蔵タ
ンパク質特性の改変により独特で有益な機能特性を有す
る新規なダイズタンパク質製品を製造することができ
る。
【００３０】植物における遺伝子発現はそのような植物
において機能できる調節配列を用いる。植物における外
来遺伝子の発現は確立されている（ＤｅＢｌａｅｒｅ等
（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：２７
７−２９１）。本発明のフラグメントの発現を導くため
に選択されるプロモーターの供給源は、標的種子貯蔵タ
ンパク質遺伝子の発現を減少することにより本発明を成
し遂げるために十分な転写活性を有するならば重要では
ない。好ましいプロモーターはカリフラワーモザイクウ
イルスにおいて１９Ｓ及び３５Ｓ転写産物を導くもの
（Ｏｄｅｌｌ）Ｊ．Ｔ．等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ
３１３：８１０−８１２；Ｈｕｌｌ等（１９８７）Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ８６：４８２−４９３）のような強力な
構成的植物プロモーターを含む。特に好ましいプロモー
ターは種子特異的発現をさせるものである。種子特異的
プロモーターの例は多くの植物において全種子タンパク
質の９０％までに相当することがある種子貯蔵タンパク
質のプロモーターを含むがそれらに限定されない。種子
貯蔵タンパク質は厳密に調節され、非常に組織特異的及
び発生段階特異的にほとんど種子においてのみ発現され
る（Ｈｉｇｇｉｎｓ等（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９１−２２１；Ｇ
ｏｌｄｂｅｒｇ等（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：１４９
−１６０）。さらに、異なる種子貯蔵タンパク質を種子
発生の異なる段階で発現することができる。
【００３１】種子特異的遺伝子の発現は非常に詳細に研
究されている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等（１９８９）Ｃｅｌ
ｌ ５６：１４９−１６０及びＨｉｇｇｉｎｓ等（１９
８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．
３５：１９１−２２１）による概説を参照）。現在、ト
ランスジェニック双子葉植物における種子貯蔵タンパク
質遺伝子（天然またはキメラ）の種子特異的発現の多数
の実施例があり、通例、時間的及び空間的発現パターン
が維持されている。そのような実施例に用いられるプロ
モーターを本発明に影響を及ぼすために用いることがで
きる可能性がある。これらはインゲンマメ β−ファゼ
オリン（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ等（１９８
５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：３３２０−３３２４；Ｈｏｆｆｍａｎ等（１９８
８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：７１７−７
２９）、インゲンマメ レクチン（Ｖｏｅｌｋｅｒ等
（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３５７１−３５７
７）、ダイズレクチン（Ｏｋａｍｕｒｏ等（１９８６）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
３：８２４０−８２４４）、ダイズクニッツ型トリプシ
ンインヒビター（Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ等（１９８９）
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：０９５−１１０９）、ダイズ
β−コングリシニン（Ｂｅａｃｈｙ等（１９８５）ＥＭ
ＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３）、エンドウマメ ビ
シリン（Ｈｉｇｇｉｎｓ等（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６８３−６９５）、エンドウマ
メ コンビシリン（Ｎｅｗｂｉｇｉｎ等（１９９０）Ｐ
ｌａｎｔａ １８０：４６１−４７０）、エンドウマメ
レグミン（Ｓｈｉｒｓａｔ等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１５：３２６−３３１）、ナ
タネ ナピン（Ｒａｄｋｅ等（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．
Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：６８５−６９４）及びシ
ロイヌナズナ ２Ｓアルブミン（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋ
ｈｏｖｅ等（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７：９２９−９３２）の双子葉植物からの遺伝子を含
む。
【００３２】本発明の核酸フラグメントの発現に特に有
用なものはクニッツ型トリプシンインヒビター（ＫＴ
ｉ；Ｊｏｆｕｋｕ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
１：１０７９−１０９３）、グリシニン（Ｎｉｅｌｓｏ
ｎ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ １：３１３−３
２８）及びβ−コングリシニン（Ｈａｒａｄａ等（１９
８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：４１５−４２５）のも
ののようないくつかのダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子
からの異種起源のプロモーターである。異なる種子プロ
モーターが有する時間的調節の違いに注意を払わなけれ
ばならないことを当業者は認識する。例えば、α−サブ
ユニット遺伝子のプロモーターはβ−サブユニット遺伝
子のものより数日前に発現され（Ｂｅａｃｈｙ等（１９
８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３）、従っ
て、β−サブユニット遺伝子の使用はα−サブユニット
発現を抑制するためには有用性が低いと思われる。
【００３３】同様に有用な可能性があるが、優先度が低
いものは脂質または炭水化物生合成のような種子代謝の
他の面に関与する遺伝子のプロモーターである。要約す
ると、十分な強さ及び適切な時間的発現パターンのあら
ゆるプロモーターを本発明を実施するために用いること
ができる可能性があることを当業者は容易に認識する。
同様に、本発明の天然またはキメラの核酸フラグメント
のプロモーター領域中にエンハンサーまたはエンハンサ
ー様成分を導入することは、本発明を達成するために増
加した発現をもたらす。これは３５Ｓプロモーターに見
いだされるもののようなウイルスのエンハンサー（Ｏｄ
ｅｌｌ等（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１０：２６３−２７２）、オピン遺伝子からのエンハン
サー（Ｆｒｏｍｍ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
１：９７７−９８４）または本発明の核酸フラグメント
に機能的に連結されたプロモーター中に置かれた場合に
増加した転写をもたらすあらゆる他の供給源からのエン
ハンサーを含む。
【００３４】特に重要なものは構成的プロモーターに対
して４０倍の種子特異的増大を与えることができるβ−
コングリシニンのα−サブユニットをコードする遺伝子
から単離されたＤＮＡ配列成分である（Ｃｈｅｎ等（１
９８９）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２−１２
２）。トランスジェニック植物においてプロモーターで
種子特異的増大発現を達成するために当業者はこの成分
を容易に単離し、それをあらゆる遺伝子のプロモーター
領域内に挿入することができる。β−コングリシニン遺
伝子と異なる時に通常発現されるあらゆる種子特異的遺
伝子中にそのような成分を挿入することにより、種子発
生中にトランスジェニック植物においてより長い期間そ
の遺伝子の発現が生じる。
【００３５】本発明を成し遂げるためにポリアデニル化
シグナル及び本発明の核酸フラグメントの適切な発現の
ために必要な可能性がある他の調節配列を与えることが
できるあらゆる３'非コーディング領域を用いることが
できる。これは天然の脂肪酸デサチュラーゼ、３５Ｓま
たは１９Ｓカリフラワーモザイクウイルス転写産物から
のようなウイルス遺伝子、オピン合成遺伝子、リブロー
ス１,５−ビスホスフェートカルボキシラーゼまたはク
ロロフィルａ／ｂ結合タンパク質からの３'末端を含
む。異なる３'非コーディング領域の有用性を教示する
当該技術分野の多数の実施例がある。
【００３６】本発明の高等植物の細胞を形質転換する様
々な方法を当業者は利用できる（欧州特許公開ＥＰ−Ａ
−第２９５,９５９号及びＥＰ−Ａ−第３１８,３４１号
を参照）。そのような方法はアグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種のＴｉ及びＲｉプラスミド
を利用する形質転換ベクターに基づくものを含む。これ
らのベクターのバイナリー型を用いることが特に好まし
い。Ｔｉ由来のベクターは単子葉及び双子葉植物を初め
とする多種多様な高等植物を形質転換する（Ｓｕｋｈａ
ｐｉｎｄａ等（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．８：２０９−２１６；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、（１９８
５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３）。
外来ＤＮＡ構築物の直接取り込み（欧州特許公開ＥＰ−
Ａ−第２９５，９５９号を参照）、エレクトロポレーシ
ョンの技術（Ｆｒｏｍｍ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄｏｎ）３１９：７９１）または核酸構築物で
被覆された金属粒子での高速弾動打ち込み（ｂａｌｌｉ
ｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｋｌｅｉｎ等
（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７
０）のような他の形質転換方法を当業者は利用できる。
いったん形質転換されると、それらの細胞を当業者は再
生することができる。特に関係するものはＭｃＣａｂｅ
等（（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：
９２３−９２６）、Ｆｉｎｅｒ等（（１９９１）Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１７
５−１８２）及びＨｉｎｃｈｅｅ、Ｍ．Ａ．Ｗ．（（１
９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９１５−
９２２）を初めとする、ダイズを形質転換するために最
近記述された方法である。いったんトランスジェニック
植物が上記の方法のいずれかにより得られると、個々の
トランスジェニック体を適切な表現型を最も効果的に示
すものに関して選別することが必要である。同じ構築物
を保有する個々のトランスジェニック植物が発現レベル
において異なる可能性があることは当業者によく知られ
ており、この減少は一般的に「位置効果」と呼ばれる。
従って、本発明において異なる個々の形質転換体が標的
種子タンパク質の抑制の効果において異なる可能性があ
る。特定の遺伝子の発現を減少するためにアンチセンス
または共抑制技術を用いることに特別な考慮が伴うこと
を当業者はよく理解している。米国特許番号第５,１９
０,９３１号、第５,１０７,０６５号及び第５,２８３,
３２３号はこれらの技術の実現可能性を示唆している
が、それらの有効性が予測できないことはよく知られて
いる。当該技術分野は特定の遺伝子に対して最も有効で
ある予測方法を教示していないので、従って、当業者は
抑制される遺伝子の１種またはそれ以上の異なる部分を
含有する多数の遺伝子構築物を作製する。さらに、最も
有効な構築物でさえ、単離された個々のトランスジェニ
ック系統の一部においてのみ効果的な抑制表現型を与え
る。例えば、国際特許公開ＷＯ第９３／１１２４５号及
びＷＯ第９４／１１５１６号は、カノラにおいて脂肪酸
デサチュラーゼ遺伝子の発現を抑制しようと試みた場合
に、実際の抑制が試験された系統の１％未満で得られた
ことを教示している。他の種ではパーセンテージは幾分
高いが、いずれの場合でもパーセンテージは１００に達
しない。このことは本発明に対する制限としてではな
く、代わりに当業者により理解され、前以て考慮される
実際問題として考えられるべきである。従って、当業者
は非常に多数の形質転換体をスクリーニングするための
方法を開発する。通常、これらのスクリーニングの種類
は実際の場で選択され、本発明の固有の部分ではない。
サンプルの大部分が陰性であると予想されるので、好ま
しい方法は非常に多数のサンプルを迅速に処理すること
ができるものである。
【００３７】共抑制の機構は不明のままであり（一つの
概説及び考察として、Ｆｌａｖｅｌｌ、Ｒ．（１９９
４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：３４９０−３４９６を参照）、それ故、必要な場
合にそれを誘導するための厳密な条件もはっきりしな
い。文献で見いだされる大部分の実施例は適切な反応を
引き起こすために共抑制される遺伝子の転写領域の全部
または大部分の使用を含む。しかしながら、少なくとも
一つの場合（Ｂｒｕｓｓｌａｎ等（１９９３）Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ ５：６６７−６７７：Ｂｒｕｓｓｌａｎ及
びＴｏｂｉｎ（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２７：８０９−８１３）、シロイヌナズナのｃａｂ
１４０遺伝子の場合で、全く関係のない遺伝子に融合さ
れた（１.３ｋｂフラグメントとしての）プロモーター
及びわずか１４ｂｐの転写領域の使用が内在性ｃａｂ１
４０遺伝子及び導入されたキメラ遺伝子の共抑制を生じ
るために十分であった。多数の他のプロモーター−リー
ダー（５'非翻訳リーダーは転写の開始と翻訳開始コド
ンの間の領域として定義される）単位がキメラ遺伝子を
導くためにうまく用いられているので、この結果は例外
的で明らかに全く予測できない。Ｆｌａｖｅｌｌは（種
子タンパク質をコードするもののような多重遺伝子ファ
ミリーのメンバーを初めとする）いくつかまたは多数の
遺伝子は共抑制の機構を回避するように進化した可能性
があり、一方、別のものはそうではなく、ゲノムが進化
するにつれて可能性のあるさらなるレベルの調節を生じ
ると予測する。従って、コングリシニン遺伝子のプロモ
ーター及びリーダーを用いて内在性コングリシンの発現
を抑制することができ、一方、（開始コドンを越える）
導入遺伝子の他の部分を用いて全く関係のない遺伝子を
抑制することができる本結果は独特である。
【００３８】
【実施例】本発明は以下の実施例によりさらに特定され
る。これらの実施例は例示のためだけに与えられ、本発
明は実施例に記述される用途に限定されないと理解され
る。改変されたレベルの各種種子貯蔵タンパク質を有す
るトランスジェニックダイズ植物を生成するために本発
明を用いることができる。上記の説明及び以下の実施例
から当業者は確認することができ、そして本発明をその
趣旨及び範囲からそれずに様々に変形及び改変し、それ
を各種用途及び条件に適用することができる。全てのそ
のような改変は意図される請求の範囲内に入ると考えら
れる。
【００３９】制限エンドヌクレアーゼ酵素、他の修飾酵
素の使用、アガロースゲル電気泳動、核酸ハイブリダイ
ゼーション及びプラスミドＤＮＡでの大腸菌の形質転換
のようなＤＮＡ操作の詳細な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ等
（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）に記述され
ている。全ての制限酵素及び他の修飾酵素をＧｉｂｃｏ
ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入
した。
【００４０】実施例１ 発生中のダイズ子葉におけるβ−コングリシニンの発現
が共抑制の標的となり得るかどうかを決定するために、
β−コングリシニンのα及びα’サブユニットの欠失ｃ
ＤＮＡフラグメントを逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
キット（ＧｅｎｅａｍｐTM（商標）ＲＮＡＰＣＲキッ
ト：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いて調
製した。上流プライマーＣｏｎＳはＥＭＢＬ／ＧｅｎＢ
ａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースから得られたα及びα’
サブユニットｃＤＮＡ配列のヌクレオチド５−１９に相
同である。クローニングを容易にするために、ＮｃｏＩ
制限部位をコードするようにさらなるヌクレオチドを
５'末端に付加した。下流プライマーＣｏｎ１．４ａ
は、それぞれα及びα’ｃＤＮＡの配列に相当する配列
番号１のヌクレオチド１３７０−１３５４及び配列番号
２の１４７２−１４５６に相補的である。クローニング
を容易にするために、ＫｐｎＩ制限部位を導入するよう
にさらなるヌクレオチドを５'末端に付加した。ＰＣＲ
プライマーＣｏｎＳ及びＣｏｎ１．４ａのヌクレォチド
配列を以下に示す。
【００４１】発生中のダイズ種子から単離されたＲＮＡ
をキットに供給されるランダムヘキサマーまたはＣｏｎ
１．４ａのいずれかを用いて製造業者のプロトコルに従
って逆転写した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＣｏ
ｎＳ及びＣｏｎ１．４ａの混合物を用いてＰＣＲ（ポリ
メラーゼ連鎖反応）反応で増幅した。反応物濃度は製造
業者のプロトコルに記述されたとおりであった。以下の
プログラム：ａ）９５℃で２分を１サイクル；ｂ）５０
℃で１.５分（アニーリング）、７０℃で５分（伸
長）、９５℃で１.５分（変性）を３５サイクル；及び
ｃ）５０℃で２分を１サイクル、続いて６８℃で１０分
を用いた。ＰＣＲ反応混合物の各々の１５μＬをアガロ
ースゲル電気泳動で分析した。反応は予想される大き
さ：α’には１.４７ｋｂそしてαには１.３７ｋｂのＰ
ＣＲ産物を生じた。反応混合物の残りから欠失ｃＤＮＡ
フラグメントをＷｉｚａｒｄTM（商標）ＰＣＲＰｒｅｐ
ｓ ＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用
いて精製した。
【００４２】用いたプライマーのために５'末端にＮｃ
ｏＩ制限部位及び３'末端にＫｐｎＩ制限部位を含むα
及びα’フラグメントを含有する精製された反応混合物
をＫｐｎＩ及びＮｃｏＩ制限酵素で消化した。α ｃＤ
ＮＡフラグメントをゲル電気泳動後に回収し、フラグメ
ントＦ８と称し、ｐＣＷ１０９（図１）及びｐＭＬ７０
（図２）中に両プラスミドに存在するＮｃｏＩ−Ｋｐｎ
Ｉ部位を用いて指向的（センス方向）にクローン化し
た。Ｃｏｎｓ及びＣｏｎ１．４ａの内側のネスティッド
プライマー組（Ｃｏｎ．０９及びＣｏｎ．８）を用いて
ＰＣＲによりＦ８をαと確認し、ｐＣＷ１０９／Ｆ８プ
ラスミドをＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ、ＫｐｎＩ及びＰｓ
ｔＩで消化することによりα’と区別した（αはＰｓｔ
Ｉ部位を含まず、一方、α’は含む）。
【００４３】ＢａｍＨＩでの制限消化によりプラスミド
ＰＭＬ７０／Ｆ８から転写単位ＫＴｉプロモーター／欠
失α／ＫＴｉ３'末端を遊離し、ゲル単離し、Ｆ１１と
称した。次に、Ｆ１１をＢａｍＨＩ部位でｐＫＳ１８Ｈ
Ｈ（図３）中にクローン化した。ｐＫＳ１８ＨＨは以下
の遺伝子成分：（ｉ）Ｔ７プロモーター／ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）／Ｔ７ター
ミネーター配列；（ii）カリフラワーモザイクウイルス
（ＣａＭＶ）からの３５Ｓプロモーター／ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）／アグロバ
クテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡからのノパ
リンシンターゼ（ＮＯＳ）３'；及び（iii）β−ラクタ
マーゼコーディング領域が除かれたｐＳＰ７２プラスミ
ドベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有するプラスミド構
築物である。分子生物学の分野の当業者はよく知られて
いるプロトコル（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を用いて単一のプ
ラスミドベクター中に上記の３成分を連結することがで
きる。
【００４４】ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ（ＨＰＴ）遺伝子をクレブシエラ菌由来のプラスミ
ドｐＪＲ２２５（Ｇｒｉｔｚ Ｌ．及びＤａｖｉｅｓ
Ｊ．（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８）を
含有する大腸菌株Ｗ６７７からＰＣＲ増幅により単離し
た。ｐＫＳ１８ＨＨはダイズのような植物におけるＨＰ
Ｔ酵素の構成的発現のためにＣａＭＶ ３５Ｓ／ＨＰＴ
／ＮＯＳカセットを含有する。また、ｐＫＳ１８ＨＨプ
ラスミドは（ｌａｃＵＶ５制御下にＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子を保有する）ラムダＤＥ３に溶原性であるＮ
ｏｖａＢｌｕｅTM（ＤＥ３）（商標）（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ）のような大腸菌のある株におけるＨＰＴ酵素の発現
のためにＴ７プロモーター／ＨＰＴ／Ｔ７ターミネータ
ーカセットも含有する。ｐＫＳ１８ＨＨはこのベクター
中に遺伝子をクローニングするために好適な３種の唯一
の制限エンドヌクレアーゼ部位も含有する。
【００４５】従って、ｐＫＳ１８ＨＨプラスミドベクタ
−は大腸菌及び植物の両方で選択のためにハイグロマイ
シンＢを用いることができる。ＨｉｎｄIIIでの消化に
よりＦ１１フラグメントの挿入及び方向を確認した。Ｆ
１１フラグメントを右回りの向きに含むクローンを選択
し、ｐＪｏ１（図４）と称した。
【００４６】体細胞胚培養物の形質転換 ダイズ体細胞胚の形質転換及び増殖のために以下のスト
ック溶液及び培地を用いた。
【００４７】
【表１】 ストック溶液 培地 ＭＳ硫酸塩100×ストック (g/L) SB55(1リットル当たり) ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ 37.0 10mLの各ＭＳストック ＭｎＳＯ4 Ｈ2Ｏ 1.69 1mLのＢ５ビタミンストック ＺｎＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ 0.86 0.8g ＮＨ4ＮＯ3 ＣｕＳＯ4 ５Ｈ2Ｏ 0.0025 3.033g ＫＮＯ3 1mL 2,4-D(10mg/mLストック)ＭＳハロゲン化物100×ストック (g/L) ＣａＣｌ2 ２Ｈ2Ｏ 44.0 0.667g アスパラギン ＫＩ 0.083 ｐＨ5.7 ＣｏＣｌ2 ６Ｈ2Ｏ 0.00125 ＫＨ2ＰＯ4 17.0 ＳＢ103(1リットル当たり) Ｈ3ＢＯ3 0.62 1pk．ムラシゲ・スクーグ塩混 合物（Gibco BRL） Ｎａ2ＭoＯ4 ２Ｈ2Ｏ 0.025 60g マルトース Ｎａ2ＥＤＴＡ 3.724 2gゲルライト ＦｅＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ 2.784 ｐＨ5.7 (木炭を加えたSB103には、5g の木炭を添加）Ｂ５ビタミンストック ＳＢ148(1リットル当たり) ミオ−イノシトール 100.0 1pk．ムラシゲ・スクーグ塩混 合物（Gibco BRL） ニコチン酸 1.0 60g マルトース ピリドキシンＨＣ１ 1.0 1mL Ｂ５ビタミンストック チアミン 10.0 7gアガロース ｐＨ5.7
【００４８】ダイズ胚懸濁培養物を１６／８時間の昼／
夜スケジュールを与える蛍光及び白熱灯の混合を用いて
２８℃で回転式振盪機（１５０ｒｐｍ）で３５ｍＬの液
体培地（ＳＢ５５）中で維持した。約３５ｍｇの組織を
３５ｍＬの液体培地中に接種することにより培養物を２
ないし３週毎に継代培養した。
【００４９】ダイズ胚懸濁培養物をパーティクルガン打
込みの方法（Ｋｌｅｉｎ等（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ
３２７：７０）によりｐＪｏ１で形質転換した。ＤｕＰ
ｏｎｔ ＢｉｏｌｉｓｔｉｃTM（商標）ＰＤＳ１０００
／Ｈｅ装置をこれらの形質転換のために用いた。
【００５０】５μＬのｐＪｏ１プラスミドＤＮＡ（１μ
ｇ／μＬ）、５０ｐＬ ＣａＣｌ2（２.５Ｍ）及び２０
μＬスペルミジン（０.１Ｍ）を５０μＬの６０ｍｇ／
ｍＬ１ｍｍ金粒子懸濁液に添加した。粒子調製物を３分
間撹拌し、微量遠心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で１０秒
間回転させ、上清を除いた。次に、ＤＮＡで被覆された
粒子を４００μＬの７０％エタノールで１回洗浄し、４
０μＬの無水エタノールに再懸濁した。ＤＮＡ／粒子懸
濁液を各１秒間３回超音波処理した。次に、５μＬのＤ
ＮＡ被覆金粒子を各マクロ担体ディスク上に添加した。
【００５１】約３００ないし４００ｍｇの２週齢の懸濁
培養物を空の６０ｍｍ×１５ｍｍペトリ皿に置き、残っ
ている液体をピペットで組織から取り除いた。組織を保
持スクリーンから約３.５インチ離して置き、２回打込
んだ。膜破壊圧力を１０００ｐｓｉに設定し、室を−２
８インチのＨｇまで排気した。実験当たり構築物当たり
２枚のプレートに打込んだ。打込み後に組織を半分に分
け、液体培地中に戻し、上記のように培養した。
【００５２】打込みの１５日後に液体培地を５０ｍｇ／
ｍＬハイグロマイシンを含有する新しいＳＢ５５に交換
した。選択培地を毎週新しくした。打込みの６週後に緑
色の形質転換された組織を単離し、フラスコに接種して
新しい形質転換された胚懸濁培養物を生成させた。
【００５３】形質転換された胚培養物を液体培養培地か
ら取り出し、０.５％の木炭を加えた固体寒天培地ＳＢ
１０３上に置いて成熟を開始した。１週後に木炭を欠い
たＳＢ１０３培地に胚を移した。ＳＢ１０３培地上で３
週後に成熟中の胚を分離し、ＳＢ１４８培地上に置い
た。胚成熟中の条件は１６／８時間の昼／夜スケジュー
ルを与える蛍光及び白熱灯の混合を用いて２６℃であっ
た。ＳＢ１４８培地上で６週後に胚をβ−コングリシニ
ンサブユニットタンパク質の発現に関して分析した。各
胚集団は５ないし２０個の体細胞胚を生じた。
【００５４】形質転換された体細胞胚の分析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により体細胞胚成熟中に
いつβ−コングリシニンのα、α’及びβサブユニット
を可視化することができるかを決定するために最初の実
験を実施した。（打込みを受けなかったことを除いて上
記のように生成された）非形質転換胚の子葉を成熟を開
始した後６、８、１０及び１２週で胚から切断し、分析
するまで−８０℃で凍結保存した。子葉組織の重さを量
り、組織１ｍｇ当たり１０μＬの抽出バッファーを添加
し、ペレット乳棒使い捨てミキサー（Ｐｅｌｌｅｔ Ｐ
ｅｓｔｌｅ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｍｉｘｅｒ）（Ｋｉ
ｍｂｌｅ／Ｋｏｎｔｅｓ）で組織をすりつぶした。抽出
バッファーは５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７.
５）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール（βＭＥ）
及び０.１％ＳＤＳからなった。次に、サンプルを１２,
０００ｒｐｍで１０分間微量遠心分離し、上清をピペッ
トで新しい微量遠心管へ取り出した。使用するまで抽出
物を−２０℃で凍結保存した。
【００５５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために８μＬの
（２×）ローディングバッファーを８μＬのサンプル抽
出物に添加した。（２×）ローディングバッファーは１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、４％ＳＤ
Ｓ、０.２％ブロモフェノールブルー、１５％グリセロ
ール及び２００ｍＭ βＭＥからなった。混合物を９５
℃で４分間加熱した。次に、サンプル混合物を微量遠心
分離し（１２,０００ｒｐｍ、２０秒間）、ミニ−プロ
テインII電気泳動セル（ｍｉｎｉ−ＰｒｏｔｅｉｎII
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）中に取り付けられた１０％プレキャストＲｅ
ａｄｙ ＧｅｌTM（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に添加
した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳバ
ッファーを泳動バッファーとして用い、電圧は一定の１
２５Ｖであった。サンプル抽出物に加えて、各ゲルは分
子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準、低
範囲）を含有する１レーン及び市販の脱脂ダイズ粉から
抽出された全ダイズ種子タンパク質を含有する１レーン
を含んだ。終了時にタンパク質を可視化するためにゲル
をクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色した
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。ゲルの写真をとり、水を含むシ
ールバッグに入れ、冷蔵庫で保存した。結果は、成熟の
開始後８ないし１０週の間で体細胞胚の子葉においてβ
−コングリシニンのα、α’及びβサブユニットを検出
できることを示した。
【００５６】上記の方法を用いて成熟の開始後１０週で
形質転換された胚の分析を実施した。クローン当たり２
個の胚をまず分析した。これら２個の胚でβ−コングリ
シニンサブユニットの抑制が観察された場合はさらなる
胚を分析した。表１にこの分析の結果を示し、ここで、
各β−コングリシニンサブユニットの存在または欠如は
それぞれ（＋）または（−）で示される。
【００５７】
【表２】
【００５８】７個のトランスジェニッククローンが、α
及びα’発現が抑制された胚を生じた。さらに、１個の
クローン（Ｊｏ１−４）は３種全てのβ−コングリシニ
ンサブユニットが抑制された胚を生じた。欠失したα導
入遺伝子配列は全部で１.３２ｋｂのβサブユニットｃ
ＤＮＡの０.７５ｋｂの部分のみと重複するので、この
結果は意外である。全体的に見て、欠失したα導入遺伝
子とβサブユニットｃＤＮＡの間には５２％の類似性が
あるだけである。知るかぎりでは、欠失したα導入遺伝
子はβ−コングリシニン遺伝子のβサブユニットを「共
抑制」するために十分な構造の類似性を有すると考えら
れない。
【００５９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の例を図５に示す。
レーン１−３はクローンＪｏ１−１より生じた胚から切
断された３枚の子葉の抽出物である。レーン４及び５は
それぞれタンパク質分子量標準及び種子から得られたダ
イズタンパク質標準である。レーン６−８はクローンＪ
ｏ１−４より生じた胚から切断された子葉の抽出物であ
る。レーン２のタンパク質パターンはα及びα’の両方
が共抑制されている胚の例である。レーン６及び８のタ
ンパク質パターンはβ−コングリシニンを構成する全て
のサブユニットが抑制されている胚の例である。
【００６０】実施例２ β−コングリシニンプロモーター領域を用いる共抑制に
より発生中の子葉においてβ−コングリシニンの発現を
抑制することができるかどうかを決定するために、ダイ
ズβ−コングリシニンプロモーター（Ｂｅａｃｈｙ等、
（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３）
の制御下にグリシンマックスミクロソームのデルタ−１
２デサチュラーゼｃＤＮＡ（ＧｍＦａｄ２−１）配列
（Ｈｅｐｐａｒｄ等、（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．１１０：３１１−３１９；ジーンバンク登録
番号Ｌ４３９２０）を含有するｐＢＳ４３と称するプラ
スミドを構築した。このベクターの構築は以下のプラス
ミド：ｐＭＨ４０、ｐＣＳＴ２及びＢＳ１３を用いるこ
とにより促進された。以下に詳しく述べられるプラスミ
ド構築物は米国特許出願番号ＵＳＳＮ第０８／２６２,
４０１号及び国際特許公開番号ＷＯ第９４／１１５１６
号に部分的に記述されており、それらの両方は引用する
ことにより本明細書に組み込まれる。
【００６１】ｐＭＨ４０ベクターは、大腸菌からのβ−
グルクロニダーゼ遺伝子に連結されたＣａＭＶからの
１.４ｋｂ３５Ｓプロモーター領域（Ｏｄｅｌｌ等（１
９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：８１０−８１２；Ｈａ
ｒｐｓｔｅｒ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．２１２：１８２−１９０）を挿入することにより市
販されているクローニンベクター、プラスミドｐＧＥＭ
９ｚ（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ）から得られた。
これは酵素β−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ
等（１９８６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３：８４４７−８４
５１）をコードする１.８５ｋｂフラグメント及びアグ
ロバクテリウムツメファシエンス（Ｆｒａｌｅｙ等（１
９８３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８０：４８０３−４８０７）
のＴｉ−プラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子からの
転写ターミネーターを含有する０.３ｋｂ ＤＮＡフラグ
メントであった。
【００６２】ベクターｐＣＳＴ２はベクターｐＭＬ１８
及びｐＣＷ１０９Ａから得られた。プラスミドｐＣＷ１
０９Ａはダイズβ−コングリシニンプロモーター配列及
びファゼオリン３'非翻訳領域を含有し、市販されてい
るプラスミドｐＵＣ１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）から得
られたベクターｐＣＷ１０９の改変された型である。ベ
クターｐＣＷ１０９はクローニンベクターｐＵＣ１８の
ＨｉｎｄIII部位にβ−コングリシニン遺伝子の（プロ
モーター領域を含む）５５５ｂｐの５'非コーディング
領域並びにそれに続くＮｃｏＩ、ＳａｍＩ、ＫｐｎＩ及
びＸｂａＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するマ
ルチクローニング配列を挿入し、次にそのＨｉｎｄIII
部位に１１７４ｂｐの共通のインゲンマメ ファゼオリ
ン３'非翻訳領域を挿入することにより作製された。用
いられるβ−コングリシニンプロモーター領域は２７ヌ
クレオチドの位置での違いのために公表されたβ−コン
グリシニン遺伝子（Ｄｏｙｌｅ等、（１９８６）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８）の対
立遺伝子である。この遺伝子のさらなる配列の記述を国
際特許公開ＷＯ第９１／１３９９３号に見いだすことが
できる。
【００６３】アンチセンス構築物における使用を容易に
するために、ＮｃｏＩでの消化、マングビーンエキソヌ
クレアーゼ消化及び平滑部位の再連結によりプラスミド
ｐＣＷ１０９中のＮｃｏＩ部位及び可能性のある翻訳開
始部位を破壊して改変プラスミドｐＣＷ１０９Ａを生ぜ
しめた。
【００６４】ベクターｐＭＬ１８は、ネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｂｅｃｋ等（１９８２）
Ｇｅｎｅ １９：３２７−３３６）の発現を導く非組織
特異的で構成的なカリフラワーモザイクウイルス（３５
Ｓ）プロモーター（Ｏｄｅｌｌ等、（１９８５）Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｈｕｌｌ等（１９８
７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８６：４８２−４９３）及びそ
れに続くヌクレトチド８４８〜１５５０を含むノパリン
シンターゼ遺伝子の３'末端（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ等（１
９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７
４）からなる。この転写単位を市販のクローニンベクタ
ーｐＧＥＭ９ｚ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中に挿入し、そ
れは３５Ｓプロモーターの５'末端で制限部位Ｓａｌ
Ｉ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩにその順で隣接
する。さらなるＳａｌＩ部位がＮＯＳ ３'配列の３'末
端に存在し、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位は
唯一である。ＸｂａＩ部位を除くために、プラスミドｐ
ＭＬ１８をＸｂａＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩの
クレノウフラグメントを用いて一本鎖の末端を埋め、生
成物を連結した。得られたプラスミドをｐＢＳ１６と称
した。
【００６５】プラスミドｐＣＷ１０９ＡをＨｉｎｄIII
で消化し、β−コングリシニン／アンチセンスデルタ−
１２デサチュラーゼｃＤＮＡ／ファゼオリン３'非翻訳
領域を含有する得られた１.８４ｋｂフラグメントをゲ
ル単離した。この１.８４ｋｂフラグメントをｐＢＳ１
６のＨｉｎｄIII部位中に連結した。適切な向きにイン
サートを含有するプラスミドはＫｐｎＩで消化した場合
に３.５３ｋｂ及び４.４１ｋｂフラグメントを生じ、こ
のプラスミドをｐＣＳＴ２と称した。
【００６６】ダイズミクロソームのデルタ１２−デサチ
ュラーゼをコードし、ジーンバンク登録番号Ｌ４３９２
０に開示されるような配列を保有するＧｍＦａｄ２−１
ｃＤＮＡの供給源としてベクターｐＢＳ１３を用い
た。ベクターｐＢＳ１３はベクターｐＭＬ７０（図１）
から得られ、それはＫＴｉ３プロモーター及びＫＴｉ３
３'非翻訳領域を含有し、市販されているベクターｐＴ
Ｚ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から中間プラスミドｐ
ＭＬ５１、ｐＭＬ５５、ｐＭＬ６４及びｐＭＬ６５を経
て得られた。５'非翻訳領域の２０３９ヌクレオチド全
て及びＪｏｆｕｋｕ（Ｊｏｆｕｋｕ及びＧｏｌｄｂｅｒ
ｇ（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１：１０７９−１
０９３）に記述された配列の塩基７５５〜７６１に相当
するＥｃｏＲＩ部位で終わるＫＴｉ３遺伝子のコーディ
ング配列の３９０塩基を含有する、完全なダイズＫＴｉ
３遺伝子（Ｊｏｈｕｋｕ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、上記）
の２.４ｋｂ ＢｓｔＢＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐ
ＴＺ１８ＲのＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩ部位に連結してプラ
スミドｐＭＬ５１を作製した。ＫＴｉ３インサートの
５'非翻訳領域の真ん中のＮｃｏＩ部位を破壊するため
にプラスミドｐＭＬ５１をＮｃｏＩで切断し、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて一本鎖の
末端を埋め、生成物を再連結してプラスミドｐＭＬ５５
を生ぜしめた。プラスミドｐＭＬ５５をＸｍｎＩ／Ｅｃ
ｏＲＩで部分消化して上に引用した配列の塩基７３２〜
７５５に相当する０.４２ｋｂフラグメントを遊離し、
それを廃棄した。ＸｍｎＩ部位（５'−ＴＣＴＴＣＣ−
３'）及びＮｃｏＩ部位（５'−ＣＣＡＴＧＧＧ−３'）
それに直接続くＥｃｏＲＩ部位の一部（５'−ＧＡＡＧ
Ｇ−３'）のコーディング配列からなる相補的な合成オ
リゴヌクレオチドのダイマーを作製することによりＮｃ
ｏＩ部位を含有する合成のＸｍｎＩ／ＥｃｏＲＩリンカ
ーを構築した。ＸｍｎＩ及びＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位
を短い介在配列（５'−ＡＴＡＧＣＣＣＣＣＣＡＡ−
３'）で連結した。この合成リンカーを４.９４ｋｂフラ
グメントのＸｍｎＩ／ＥｃｏＲＩ部位に連結してプラス
ミドｐＭＬ６４を作製した。プライマーＭＬ５１及びＭ
Ｌ５２を用いて標準的なＰＣＲプロトコル（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキ
ット）によりＪｏｆｕｋｕ（上記）に記述された配列か
らＫＴｉ３遺伝子の３'非翻訳領域を増幅した。プライ
マーＭＬ５１は上に引用した配列の塩基１０７２〜１０
９１に相当する２０ヌクレオチドを含有し、プライマー
の５'末端にはＥｃｏＲＶ（５'−ＧＡＴＡＴＣ−
３'）、ＮｃｏＩ（５'−ＣＣＡＴＧＧ−３'）、Ｘｂａ
Ｉ（５'−ＴＣＴＡＧＡ−３'）、ＳｍａＩ（５'−ＣＣ
ＣＧＧＧ−３'）及びＫｐｎＩ（５'−ＧＧＴＡＣＣ−
３'）部位に相当するヌクレオチドが付加されている。
プライマーＭＬ５２は上に引用した配列の塩基１２４２
〜１２５９に相当するヌクレオチドの完全な相補物を含
有し、プライマーの５'末端にはＳｍａＩ（５'−ＣＣＣ
ＧＧＧ−３'）、ＥｃｏＲＩ（５'−ＧＡＡＴＴＣ−
３'）、ＢａｍＨＩ（５'−ＧＧＡＴＣＣ−３'）及びＳ
ａｌＩ（５'−ＧＴＣＧＡＣ−３'）部位に相当するヌク
レオチドが付加されている。ＰＣＲ増幅されたＫＴｉ３
遺伝子の３'末端をｐＭＬ６４のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ
部位に連結してプラスミドｐＭＬ６５を作製した。Ｐｓ
ｔＩ（５'−ＣＴＧＣＡ−３'）、ＳａｌＩ（５'−ＧＴ
ＣＧＡＣ−３'）、ＢａｍＨＩ（５'−ＧＧＡＴＣＣ−
３'）及びＰｓｔＩ（５'−ＣＴＧＣＡ−３'）部位から
なる相補的な合成オリゴヌクレオチドのダイマーを作製
することにより合成のマルチクローニング部位リンカー
を構築した。そのリンカーをｐＭＬ６５のＰｓｔＩ部位
（ＫＴｉ３プロモーター領域の直接５'）に連結してプ
ラスミドｐＭＬ７０を作製した。
【００６７】ダイズデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮ
Ａ、ＧｍＦａｄ２−１（ジーンバンク登録番号Ｌ４３９
２０）からの１.４６ｋｂ ＳｍａＩ／ＫｐｎＩフラグメ
ントをｐＭＬ７０の対応する部位に連結してプラスミド
ｐＢＳ１０を生ぜしめた。デサチュラーゼｃＤＮＡフラ
グメントはｐＢＳ１０中のＫＴｉ３プロモーターに対し
て逆（アンチセンス）向きであった。プラスミドｐＢＳ
１０をＢａｍＨＩで消化し、ＫＴｉ３プロモーター／ア
ンチセンスデサチュラーゼｃＤＮＡ／ＫＴｉ３３'末端
転写単位に相当する３.４７ｋｂフラグメントをアガロ
ースゲル電気泳動により単離した。ベクターｐＭＬ１８
は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｂ
ｅｃｋ等（１９８２）Ｇｅｎｅ １９：３２７−３３
６）の発現を導く非組織特異的で構成的なカリフラワー
モザイクウイルス（３５Ｓ）プロモーター（Ｏｄｅｌｌ
等、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１
２；Ｈｕｌｌ等、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８
６：４８２−４９３）及びそれに続くヌクレオチド８４
８〜１５５０を含むノパリンシンターゼ遺伝子の３'末
端（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ等（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．１：５６１−５７４）からなる。この転写単
位を市販のベクターｐＧＥＭ９ｚ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲ
Ｌ）に挿入し、それは３５Ｓプロモーターの５'末端で
制限部位ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ
にその順で隣接する。さらなるＳａｌＩ部位がＮＯＳ
３'配列の３'末端に存在し、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及び
ＳａｌＩ部位は唯一である。ｐＢＳ１０から遊離された
３.４７ｋｂ転写単位をベクターｐＭＬ１８のＢａｍＨ
Ｉ部位に連結した。得られたプラスミドをＳｍａＩ及び
ＫｐｎＩで消化した場合に適切な向きにインサートを含
有するプラスミドは５.７４、２.６９及び１.４６ｋｂ
の３フラグメントを生じた。正しい向きに転写単位を含
むプラスミドを選択し、ｐＢＳ１３と称した。
【００６８】ｐＢＳ１３（上記）からの１.４６ｋｂ Ｘ
ｂａＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントをベクターｐＣＳＴ２
（上記）のＳｍａＩ／ＸｂａＩ部位に指向的にクローン
化してｐＢＳ３９と称するプラスミドを生ぜしめた。プ
ラスミドｐＢＳ３９の３.３ｋｂ ＨｉｎｄIIIフラグメ
ントをプラスミドｐＭＨ４０（上記）のＨｉｎｄIII部
位にクローン化して植物発現ベクターｐＢＳ４３（図
６）を生ぜしめた。
【００６９】ベクターｐＢＳ４３でのダイズの形質転換
及びトランスジェニック「トランスイッチ（Ｔｒａｎｓ
ｗｉｔｃｈ）」系統の同定 ダイズ分裂組織のパーティクル打込みの方法（Ｃｈｒｉ
ｓｔｏｕ等（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．８：１４５−１５１）を用いてベクターｐＢＳ
４３をダイズ分裂組織中に形質転換した。形質転換され
た植物（すなわち、ＧＵＳ活性に関して陽性と同定され
た植物から）の種子を脂肪酸組成に関して選別した。脂
肪酸メチルエステルを少量（約１０ｍｇ）の種子片のヘ
キサン抽出物から調製した（Ｂｒｏｗｓｅ等（１９８
６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：１４１−１４
５）。１０個の異なるトランスジェニック系統からの種
子片を分析し、２６０−０５と称するこれらの系統の１
つからのＲ１種子のいくつかはコントロール種子の約２
０％に比較して８０−８５％の全オレイン酸含有量であ
った。この表現型は内在性Ｆａｄ２−１遺伝子の共抑制
により引き起こされ、「トランスイッチ遺伝子座」（Ｋ
ｉｎｎｅｙ、Ａ．Ｊ．（１９９５）「Ｉｎｄｕｃｅｄ
Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅ
ｎｔ」中、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｔｏｍｉｃ
Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ、Ｖｉｅｎｎａ）と呼ばれ
るダイズゲノムの遺伝子座への２コピーのｐＢＳ４３の
挿入の結果である。トランスイッチ遺伝子座を含有する
系統２６０−０５からの高オレイン酸Ｒ１種子を自殖さ
せ、トランスイッチ遺伝子座がホモであるＲ２種子を選
択した。これらのＲ２ホモ種子の２つ（Ｇ９４−１、Ｇ
９４−１９）並びにＧ９４−１及びＧ９４−１９のさら
なる世代から得られた種子（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５）をさら
なる分析のために選択した。
【００７０】アイオワ及びプエルトリコの両方で生育さ
れたＧ９４−１及びＧ９４−１９植物のＲ５種子をひい
て粉末にし、約１ｇを５ｍＬのヘキサンで抽出した。遠
心分離後にヘキサンを注ぎ出し、フラスコを風乾させ
た。約１０ｍｇの脱脂粉末を上記のように抽出し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析した。両方の場所から得られた両方
のトランスジェニック系統において、β−コングリシニ
ンのα’及びαサブユニットの発現はコントロールダイ
ズ系統及び標準的なダイズ粉に比較して抑制されていた
（図７）。
【００７１】実施例３ アンチセンス技術を用いてβ−コングリシニン発現を抑
制できるかどうかを試験するために、上記のように逆転
写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いてα及びα’の全長
ｃＤＮＡを作製した。上流プライマーＣｏｎＳａはα及
びα’の両方のｃＤＮＡ配列の領域４−１９に相同であ
り、ＫｐｎＩ制限部位をコードするようにさらなるヌク
レオチドが５'末端に付加されている。用いた下流プラ
イマーＣｏｎ１．９ａはαアイソフォームに相当する配
列番号１の領域１８１８−１８０１及びα’アイソフォ
ームに相当する配列番号２の１９２０−１９０３にそれ
ぞれ相同である。次のクローニング工程を容易にするた
めに、ＮｃｏＩ制限部位をコードするようにさらなるヌ
クレオチドを５'末端に付加した。
【００７２】逆転写及び次のＰＣＲ反応を上記のように
実施した。発生中のダイズ種子から単離されたＲＮＡを
ランダムヘキサマーまたはＣｏｎ１．９ａのいずれかを
用いて逆転写した（上に詳細に記述したような方法）。
上に詳細に記述したプロトコルを用いてＣｏｎＳａ及び
Ｃｏｎ１．９ａを用いてＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅し
た。１５μＬのＰＣＲ反応混合物をアガロースゲル電気
泳動で分析した。αに対して予想される分子量の１.８
ｋｂバンドが観察された。残りの反応混合物をＷｉｚａ
ｒｄTM（商標）ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム
キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。用いたプ
ライマーのために５'末端にＫｐｎＩ部位及び３'末端に
ＮｃｏＩ部位を含むα ｃＤＮＡをＮｃｏＩ及びＫｐｎ
Ｉ制限酵素で消化した。得られたα ｃＤＮＡをゲル単
離し、Ｆ１０と称し、ｐＣＷ１０９中にプラスミドに存
在するＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ部位を用いて指向的（アン
チセンス方向）にクローン化した。ネスティッドプライ
マー（上流：Ｃｏｎ．０９（配列番号６）；下流：Ｃｏ
ｎ１．４ａ（配列番号５）及びＣｏｎ１．０（配列番号
１０））を用いてＰＣＲによりＦ１０をαと確認した。
【００７３】ＨｉｎｄIIIでの部分消化によりｐＣＷ１
０９／Ｆ１０から転写単位β−コングリシニンプロモー
ター／α ｃＤＮＡアンチセンス／ファゼオリン３'末端
を遊離した。部分消化の条件は６フラグメント（５.１
ｋｂ、３.８ｋｂ、３.６ｋｂ、２.６ｋｂ、２.４ｋｂ及
び１.２ｋｂ）を生じるようにであった。転写単位を含
有する３.６ｋｂフラグメントをゲル単離し、Ｆ１４と
称した。次に、Ｆ１４をｐＫＳ１８ＨＨのＨｉｎｄIII
にクローン化した。形質転換された細胞から作製したプ
ラスミドＤＮＡ調製物のＨｉｎｄIIIでの消化により挿
入を確認した後、陽性培養物からのプラスミドＤＮＡを
ＫｐｎＩで消化してそれらがｐＣＷ１０９／Ｆ１０のＨ
ｉｎｄIIIでの部分消化からの３.６ｋｂ Ｆ１４フラグ
メントを含有するが３.８ｋｂフラグメントを含有しな
いことを確かめた。Ｆ１４はＫｐｎＩ部位を含むが、一
方、３.８ｋｂフラグメントは含まない。確認時にｐＫ
Ｓ１８ＨＨ／Ｆ１４をｐＪｏ３（図８）と称した。ダイ
ズ胚懸濁培養物を上に詳細に記述したようにｐＪｏ３で
形質転換した。形質転換は５個の形質転換されたクロー
ンを生じ、成熟時に各クローンは４ないし８個の体細胞
胚を生じた。
【００７４】形質転換された体細胞胚のタンパク質抽出
物を先に詳細に記述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析した。結果を表２に示す。トランスジェニッククロ
ーンは全てα及びα’の両方の発現が抑制されている少
なくとも１個の体細胞胚を生じた。
【００７５】
【表３】
【００７６】実施例４ グリシニンサブユニットをコードする５個の非対立遺伝
子がある。ゲノムクローン及びｃＤＮＡのシークエンシ
ングからこれらのサブユニット遺伝子は配列類似性に基
づいて２つの群に分けられる。群ＩはＧｙ１（配列番号
１１）、Ｇｙ２（配列番号１２）及びＧｙ３（配列番号
１３）からなり、一方、群IIはＧｙ４（配列番号１４）
及びＧｙ５（配列番号１５）からなる。群内の遺伝子間
には８５％より高い類似性があるが、異なる群の遺伝子
間は４２ないし４６％の類似性があるのみである。共抑
制技術を用いることにより発生中の子葉においてグリシ
ニンの発現を抑制できるかどうかを決定するために、上
記のように逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いて群
Ｉ及び群IIのｃＤＮＡを調製した。
【００７７】群Ｉ反応のために用いる上流プライマー
（Ｇ１−１）は全ての群ＩｃＤＮＡの領域１−１９に相
同である。２種の下流プライマー：Ｇｙ１の領域１０３
８−１０２２、Ｇｙ２の１００８−９９２及びＧｙ３の
９９６−９８０と相同であるＧ１−１０３９またはＧｙ
１の領域１４７５−１４６０、Ｇｙ２の１４４５−１４
３０及びＧｙ３の１４３３−１４１８と相同であるＧ１
−１４７５を用いた。後のクローニングを容易にするた
めに、全てのプライマーはそれらの５'末端にＮｏｔＩ
制限部位をコードするさらなるヌクレオチドを含有し
た。
【００７８】発生中のダイズ種子から単離されたＲＮＡ
を反応の下流プライマーとしてランダムヘキサマーまた
はＧ１−１４７５またはＧ１−１０３９のいずれかを用
いて逆転写した。Ｇ１−１０３９またはＧ１−１４７５
のいずれかとＧ１−１の混合物を用いてｃＤＮＡフラグ
メントを増幅した。１５μＬのＰＣＲ反応混合物をアガ
ロースゲル電気泳動で分析した。ＰＣＲ反応はプライマ
ー組Ｇ１−１／Ｇ１−１０３９及びＧ１−１／Ｇ１−１
４７５に対してそれぞれ約１ｋｂ及び１.４−１.５ｋｂ
の予想される分子量の産物を生じた。反応混合物の残り
からｃＤＮＡフラグメントをＷｉｚａｒｄTM（商標）Ｐ
ＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）を用いて精製した。次に、精製されたｃＤＮＡ
をＮｏｔＩで消化し、アガロースゲル精製により単離し
た。
【００７９】群IIのＲＴ−ＰＣＲのために用いる上流プ
ライマー（Ｇ４−７）は群IIの両方のｃＤＮＡの領域７
−２２に相同である。２種の下流プライマー：Ｇｙ４の
領域１２５１−１２３４及びＧｙ５の１１５３−１１３
５と相同であるＧ４−１２５１またはＧｙ４の領域１６
６８−１６５３に相同であるＧ４−１６７０を用いた。
Ｇｙ５に類似領域はない。後のクローニングを容易にす
るために、全てのプライマーはそれらの５'末端にＮｏ
ｔＩ制限部位をコードするさらなるヌクレオチドを含有
した。
【００８０】発生中のダイズ種子から単離されたＲＮＡ
を反応の下流プライマーとしてランダムヘキサマーまた
はＧ４−１２５１またはＧ４−１６７０のいずれかを用
いて逆転写した。Ｇ４−１２５１またはＧ４−１６７０
のいずれかとＧ４−７の混合物を用いてｃＤＮＡフラグ
メントを増幅した。１５μＬのＰＣＲ反応混合物をアガ
ロースゲル電気泳動で分析した。ＰＣＲ反応はプライマ
ー組Ｇ４−７／Ｇ４−１２５１及びＧ４−７／Ｇ４−１
６７０に対してそれぞれ約１.２５ｋｂ及び１.７ｋｂの
予想される分子量の産物を生じた。反応混合物の残りか
らｃＤＮＡフラグメントをＷｉｚａｒｄTM（商標）ＰＣ
Ｒ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）を用いて精製した。次に、精製されたｃＤＮＡを
ＮｏｔＩで消化し、ゲルから単離した。
【００８１】単離された群ＩｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位で
ｐＲＢ２０（図９）にクローン化した（センス方向）。
ＮｏｔＩでの部分制限消化及び単一切断されたｐＲＢ２
０／群Ｉ直鎖状フラグメントの単離後に群IIｃＤＮＡを
添加して最終的な転写単位β−コングリシニンプロモー
ター／群ＩｃＤＮＡ（センス方向）／ファゼオリン３'
末端及びβ−コングリシニンプロモーター／群IIｃＤＮ
Ａ（センス方向）／ファゼオリン３'末端を作製した。
次に、得られたプラスミドを用いて体細胞胚懸濁培養物
を上に詳細に記述した方法を用いて形質転換する。
【００８２】
【配列表】 (１) 一般的な情報： (ｉ) 出願人：E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY (ii) 発明の名称：特定のクラスのダイズ種子タンパク質遺伝子の抑制 (iii) 整理番号：ＳＰ−１２５１Ａ (iv) 先行する出願 (Ａ) 出願番号：６０／０１９，９４０ (Ｂ) 出願日：１９９６年６月１４日 (ｖ) 配列の数：２１ (２) 配列番号１： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１８１８塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (xi) 配列： ATGATGAGAG CACGGTTCCC ATTACTGTTG CTGGGACTTG TTTTCCTGGC TTCAGTTTCT 60 GTCTCATTTG GCATTGCTTA CTGGGAAAAA GAGAACCCCA AACACAACAA GTGTCTCCAG 120 AGTTGCAATA GCGAGAGAGA CTCGTACAGG AACCAAGCAT GCCACGCTCG TTGCAACCTC 180 CTTAAGGTGG AGAAAGAAGA ATGTGAAGAA GGTGAAATTC CACGACCACG ACCACGACCA 240 CAACACCCGG AGAGGGAACC TCAGCAACCC GGTGAGAAGG AGGAAGACGA AGATGAGCAA 300 CCACGTCCAA TCCCATTCCC ACGCCCACAA CCTCGTCAAG AAGAAGAGCA CGAGCAGAGA 360 GAGGAACAGG AATGGCCTCG CAAGGAGGAA AAACGCGGAG AAAAGGGAAG TGAAGAGGAA 420 GATGAGGATG AGGATGAGGA ACAAGATGAA CGTCAATTCC CATTCCCACG CCCACCTCAT 480 CAGAAGGAAG AGCGAAACGA AGAGGAAGAT GAGGATGAGG AGCAGCAGCG AGAGAGCGAA 540 GAAAGTGAAG ATTCTGAGTT ACGAAGACAT AAGAATAAGA ACCCTTTTCT CTTCGGCTCT 600 AACAGGTTCG AAACTCTCTT CAAAAACCAA TATGGTCGCA TTCGCGTCCT CCAGAGGTTC 660 AACCAACGCT CCCCACAACT TCAGAATCTC CGAGACTACC GCATTTTGGA GTTCAACTCC 720 AAACCCAACA CCCTCCTTCT CCCCAACCAT GCTGACGCTG ATTACCTCAT CGTTATCCTT 780 AACGGGACTG CCATTCTTTC CTTGGTGAAC AACGACGACA GAGACTCCTA CAGACTTCAA 840 TCTGGTGATG CCCTGAGAGT CCCCTCAGGA ACCACATACT ATGTGGTCAA CCCTGACAAC 900 AACGAAAATC TCAGATTAAT AACACTCGCC ATACCCGTTA ACAAGCCTGG TAGATTTGAG 960 AGTTTCTTCC TATCTAGCAC TGAAGCTCAA CAATCCTACT TGCAAGGATT CAGCAGGAAC 1020 ATTTTAGAGG CCTCCTACGA TACCAAATTC GAGGAGATAA ACAAGGTTCT GTTTAGTAGA 1080 GAGGAAGGGC AGCAGCAAGG GGAGCAGAGG CTGCAAGAGA GCGTGATTGT GGAAATCTCG 1140 AAGGAACAGA TTCGGGCACT GAGCAAACGT GCCAAATCTA GTTCAAGGAA AACCATTTCT 1200 TCTGAAGATA AACCTTTTAA CTTGAGAAGC CGCGACCCCA TCTACTCCAA CAAGCTTGGC 1260 AAGTTCTTTG AGATCACCCC AGAGAAAAAC CCCCAGCTTC GGGACTTGGA TATCTTCCTC 1320 AGTATTGTGG ATATGAACGA GGGAGCTCTT CTTCTACCAC ACTTCAATTC AAAGGCGATA 1380 GTGATACTGG TAATTAATGA AGGAGATGCA AACATTGAAC TTGTTGGCCT AAAAGAACAA 1440 CAACAGGAGC AGCAACAGGA AGAGCAACCT TTGGAAGTGC GGAAATATAG AGCCGAATTG 1500 TCTGAACAAG ATATATTTGT AATCCCAGCA GGTTATCCAG TTGTGGTCAA CGCTACCTCA 1560 AATCTGAATT TCTTTGCTAT TGGTATTAAT GCCGAGAACA ACCAGAGGAA CTTCCTCGCA 1620 GGTTCGCAAG ACAATGTGAT AAGCCAGATA CCTAGTCAAG TGCAGGAGCT TGCATTCCCT 1680 GGGTCTGCAC AAGCTGTTGA GAAGCTATTA AAGAACCAAA GAGAATCCTA CTTTGTGGAT 1740 GCTCAGCCTA AGAAGAAAGA GGAGGGGAAT AAGGGAAGAA AGGGTCCTTT GTCTTCAATT 1800 TTGAGGGCTT TTTACTGA 1818 （２） 配列番号２： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１９２０塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (xi) 配列 ATGATGAGAG CGCGGTTCCC ATTACTGTTG CTGGGAGTTG TTTTCCTAGC ATCAGTTTCT 60 GTCTCATTTG GCATTGCGTA TTGGGAAAAG CAGAACCCCA GTCACAACAA GTGCCTCCGA 120 AGTTGCAATA GCGAGAAAGA CTCCTACAGG AACCAAGCAT GCCACGCTCG TTGCAACCTC 180 CTTAAGGTGG AGGAAGAAGA AGAATGCGAA GAAGGTCAAA TTCCACGACC ACGACCACAA 240 CACCCGGAGA GGGAACGTCA GCAACACGGT GAGAAGGAGG AAGACGAAGG TGAGCAGCCA 300 CGTCCATTCC CATTCCCACG CCCACGCCAA CCTCATCAAG AGGAAGAGCA CGAGCAGAAG 360 GAGGAACACG AATGGCATCG CAAGGAGGAA AAACACGGAG GAAAGGGAAG TGAAGAGGAA 420 CAAGATGAAC GTGAACACCC ACGCCCACAC CAACCTCATC AAAAGGAAGA GGAAAAGCAC 480 GAATGGCAAC ACAAGCAGGA AAAGCACCAA GGAAAGGAAA GTGAAGAAGA AGAAGAAGAC 540 CAAGACGAGG ATGAGGAGCA AGACAAAGAG AGCCAAGAAA GTGAAGGTTC TGAGTCTCAA 600 AGAGAACCAC GAAGACATAA GAATAAGAAC CCTTTTCACT TCAACTCTAA AAGGTTCCAA 660 ACTCTCTTCA AAAACCAATA TGGCCACGTT CGCGTCCTCC AGAGGTTCAA CAAACGCTCC 720 CAACAGCTTC AGAATCTCCG AGACTACCGC ATTTTGGAGT TCAACTCCAA ACCCAACACC 780 CTTCTTCTCC CCCACCATGC TGACGCTGAT TACCTCATCG TTATCCTTAA CGGGACTGCC 840 ATTCTTACCT TGGTGAACAA CGACGACCGA GACTCTTACA ACCTTCAATC TGGCGATGCC 900 CTAAGAGTCC CTGCAGGAAC CACATTCTAT GTGGTTAACC CTGACAACGA CGAGAATCTC 960 AGAATGATAG CAGGAACCAC ATTCTATGTG GTTAACCCTG ACAACGACGA GAATCTCAGA 1020 ATGATAACAC TCGCCATACC CGTTAACAAA CCCGGTAGAT TTGAGAGTTT CTTCCTATCT 1080 AGCACTCAAG CTCAACAGTC CTACTTGCAA GGGTTCAGCA AGAATATTCT AGAGGCCTCA 1140 TACGACACCA AATTCGAGGA GATAAACAAG GTTCTGTTTG GTAGAGAGGA GGGGCAGCAA 1200 CAAGGGGAGG AGAGGCTGCA AGAGAGTGTG ATTGTGGAAA TCTCAAAGAA ACAAATTCGG 1260 GAACTGAGCA AACATGCCAA ATCTAGTTCA AGGAAAACCA TTTCTTCTGA AGATAAACCT 1320 TTCAACTTGG GAAGCCGCGA CCCCATCTAT TCCAACAAGC TTGGCAAGTT GTTTGAGATT 1380 ACCCAGAGAA ACCCTCAGCT TCGGGACTTG GATGTCTTCC TCAGTGTTGT GGATATGAAC 1440 GAGGGAGCTC TTTTTCTACC ACACTTCAAT TCAAAGGCCA TAGTGGTACT AGTGATTAAT 1500 GAAGGAGAAG CAAACATTGA ACTTGTTGGC ATTAAAGAAC AACAACAGAG GCAGCAACAG 1560 GAAGAGCAAC CTTTGGAAGT GCGGAAATAT AGAGCTGAAT TGTCTGAACA AGATATATTT 1620 GTAATCCCAG CAGGTTATCC AGTTATGGTC AACGCTACCT CAGATCTGAA TTTCTTTGCT 1680 TTTGGTATCA ATGCCGAGAA CAACCAGAGG AACTTCCTTG CAGGTTCGAA AGACAATGTG 1740 ATAAGCCAGA TACCTAGTCA AGTGCAGGAG CTTGCGTTCC CTAGGTCTGC AAAAGATATT 1800 GAGAACCTAA TAAAGAGCCA AAGTGAGTCC TACTTTGTGG ATGCTCAGCC TCAGCAGAAA 1860 GAGGAGGGGA ACAAGGGAAG AAAGGGTCCT TTGTCTTCAA TTTTGAGGGC TTTTTACTGA 1920 (２) 配列番号：３ (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１３２０塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (xi) 配列： ATGATGAGAG TGCGGTTTCC TTTGTTGGTG TTGCTGGGAA CTGTTTTCCT GGCATCAGTT 60 TGTGTCTCAT TAAAGGTGAG AGAGGATGAG AATAACCCTT TCTACTTTAG AAGCTCTAAC 120 AGCTTCCAAA CTCTCTTTGA GAACCAAAAC GTTCGCATTC GTCTCCTCCA GAGATTCAAC 180 AAACGCTCCC CACAACTTGA GAACCTTCGA GACTACCGGA TTGTCCAGTT TCAGTCAAAA 240 CCCAACACAA TCCTTCTCCC CCACCATGCT GACGCCGATT TCCTCCTCTT TGTCCTTAGC 300 GGGAGAGCCA TACTTACCTT GGTGAACAAC GACGACAGAG ACTCCTACAA CCTTCACCCT 360 GGCGATGCCC AGAGAATCCC AGCTGGAACC ACTTACTATT TGGTTAACCC TCACGACCAC 420 CAGAATCTCA AAATAATCAA ACTTGCCATA CCCGTCAACA AACCTGGCAG ATATGATGAT 480 TTCTTCTTAT CTAGCACTCA AGCCCAACAG TCCTACTTGC AAGGCTTCAG CCATAATATT 540 CTAGAGACCT CCTTCCATAG CGAATTCGAG GAGATAAACA GGGTTTTGTT TGGAGAGGAA 600 GAGGAGCAGA GGCAGCAAGA GGGAGTGATC GTGGAACTCT CAAAGGAACA AATTCGGCAA 660 CTGAGCAGAC GTGCCAAATC TAGTTCAAGG AAAACCATTT CCTCCGAAGA TGAACCATTC 720 AACTTGAGAA GCCGCAACCC CATCTATTCC AACAACTTTG GAAAGTTCTT TGAGATCACC 780 CCTGAGAAAA ACCCACAGCT TCGGGACTTG GATATCTTCC TCAGTTCTGT GGATATCAAC 840 GAAGGAGCTC TTCTTCTACC ACACTTCAAT TCAAAGGCCA TAGTGATACT AGTGATTAAT 900 GAAGGAGATG CAAACATTGA ACTTGTTGGC ATTAAAGAAC AACAACAGAA GCAGAAACAG 960 GAAGAGGAAC CTTTGGAAGT GCAAAGGTAC AGAGCTGAAT TGTCTGAAGA CGATGTATTT 1020 GTAATTCCAG CAGCTTATCC ATTTGTCGTC AACGCTACCT CAAACCTCAA TTTCCTTGCT 1080 TTTGGTATCA ATGCTGAGAA CAACCAGAGG AACTTCCTTG CAGGCGAGAA AGACAATGTG 1140 GTAAGGCAGA TAGAAAGACA AGTGCAGGAG CTTGCGTTCC CTGGGTCTGC ACAAGATGTT 1200 GAGAGGCTAT TAAAGAAGCA GAGGGAATCC TACTTTGTTG ATGCTCAGCC TCAGCAGAAG 1260 GAGGAGGGGA GTAAGGGAAG AAAGGGTCCT TTTCCTTCAA TCTTAGGTGC TCTCTACTGA 1320 (２) 配列番号４： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２５塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： CGTACCATGG TGAGAGCGCG GTTCC 25 (２) 配列番号５： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２４塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： CGGTACCGAA TTGAAGTGTG GTAG 24 (２) 配列番号６： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： TCGTCCATGG AGCGCGGTTC CCATTAC 27 (２) 配列番号７： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： TCTCGGTCGT CGTTGTT 17 (２) 配列番号８： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２５塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： ACGGTACCGA TGAGAGCGCG GTTCC 25 (２) 配列番号９： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： AACCCATGGT CAGTAAAAAG CCCTCAA 27 (２) 配列番号１０： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： CGGGTATGGC GAGTGTT 17 (２) 配列番号１１： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１４８８塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (xi) 配列： ATGGCCAAGC TAGTTTTTTC CCTTTGTTTT CTGCTTTTCA GTGGCTGCTG CTTCGCTTTC 60 AGTTCCAGAG AGCAGCCTCA GCAAAACGAG TGCCAGATCC AAAAACTCAA TGCCCTCAAA 120 CCGGATAACC GTATAGAGTC AGAAGGAGGG CTCATTGAGA CATGGAACCC TAACAACAAG 180 CCATTCCAGT GTGCCGGTGT TGCCCTCTCT CGCTGCACCC TCAACCGCAA CGCCCTTCGT 240 AGACCTTCCT ACACCAACGG TCCCCAGGAA ATCTACATCC AACAAGGTAA GGGTATTTTT 300 GGCATGATAT ACCCGGGTTG TCCTAGCACA TTTGAAGAGC CTCAACAACC TCAACAAAGA 360 GGACAAAGCA GCAGACCACA AGACCGTCAC CAGAAGATCT ATAACTTCAG AGAGGGTGAT 420 TTGATCGCAG TGCCTACTGG TGTTGCATGG TGGATGTACA ACAATGAAGA CACTCCTGTT 480 GTTGCCGTTT CTATTATTGA CACCAACAGC TTGGAGAACC AGCTCGACCA GATGCCTAGG 540 AGATTCTATC TTGCTGGGAA CCAAGAGCAA GAGTTTCTAA AATATCAGCA AGAGCAAGGA 600 GGTCATCAAA GCCAGAAAGG AAAGCATCAG CAAGAAGAAG AAAACGAAGG AGGCAGCATA 660 TTGAGTGGCT TCACCCTGGA ATTCTTGGAA CATGCATTCA GCGTGGACAA GCAGATAGCG 720 AAAAACCTAC AAGGAGAGAA CGAAGGGGAA GACAAGGGAG CCATTGTGAC AGTGAAAGGA 780 GGTCTGAGCG TGATAAAACC ACCCACGGAC GAGCAGCAAC AAAGACCCCA GGAAGAGGAA 840 GAAGAAGAAG AGGATGAGAA GCCACAGTGC AAGGGTAAAG ACAAACACTG CCAACGCCCC 900 CGAGGAAGCC AAAGCAAAAG CAGAAGAAAT GGCATTGACG AGACCATATG CACCATGAGA 960 CTTCGCCACA ACATTGGCCA GACTTCATCA CCTGACATCT ACAACCCTCA AGCCGGTAGC 1020 GTCACAACCG CCACCAGCCT TGACTTCCCA GCCCTCTCGT GGCTCAGACT CAGTGCTGAG 1080 TTTGGATCTC TCCGCAAGAA TGCAATGTTC GTGCCACACT ACAACCTGAA CGCGAACAGC 1140 ATAATATACG CATTGAATGG ACGGGCATTG ATACAAGTGG TGAATTGCAA CGGTGAGAGA 1200 GTGTTTGATG GAGAGCTGCA AGAGGGACGG GTGCTGATCG TGCCACAAAA CTTTGTGGTG 1260 GCTGCAAGAT CACAGAGTGA CAACTTCGAG TATGTGTCAT TCAAGACCAA TGATACACCC 1320 ATGATCGGCA CTCTTGCAGG GGCAAACTCA TTGTTGAACG CATTACCAGA GGAAGTGATT 1380 CAGCACACTT TCAACCTAAA AAGCCAGCAG GCCAGGCAGA TAAAGAACAA CAACCCTTTC 1440 AAGTTCCTGG TTCCACCTCA GGAGTCTCAG AAGAGAGCTG TGGCTTAG 1488 (２) 配列番号１２： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１４５８塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (xi) 配列： ATGGCCAAGC TTGTTCTTTC CCTTTGTTTC CTTCTTTTCA GTGGCTGCTT CGCTCTGAGA 60 GAGCAGGCAC AGCAAAATGA GTGCCAGATC CAAAAGCTGA ATGCCCTCAA ACCGGATAAC 120 CGTATAGAGT CGGAAGGTGG GTTCATTGAG ACATGGAACC CTAACAACAA GCCATTCCAG 180 TGTGCCGGTG TTGCCCTCTC TCGCTGCACC CTTAACCGCA ATGCCCTTCG TAGACCTTCC 240 TACACCAACG GTCCCCAGGA AATCTACATA CAACAAGGTA ATGGTATTTT TGGCATGATA 300 TTCCCGGGTT GTCCTAGCAC TTATCAAGAG CCGCAAGAAT CTCAGCAACG AGGACGAAGC 360 CAGAGGCCCC AAGACCGTCA CCAAAAGGTA CATCGCTTCA GAGAGGGTGA TTTGATCGCA 420 GTGCCTACTG GTGTTGCATG GTGGATGTAC AACAATGAAG ACACTCCTGT TGTTGCCGTT 480 TCTATTATTG ACACCAACAG CTTGGAGAAC CAGCTCGACC AGATGCCTAG GAGATTCTAT 540 CTTGCTGGGA ACCAAGAGCA AGAGTTTCTA AAATATCAGC AGCAGCAGCA AGGAGGTTCC 600 CAAAGCCAGA AAGGAAAGCA ACAAGAAGAA GAAAACGAAG GAAGCAACAT ATTGAGTGGC 660 TTCGCCCCTG AATTCTTGAA AGAAGCGTTC GGCGTGAACA TGCAGATAGT GAGAAACCTA 720 CAAGGTGAGA ACGAAGAGGA GGATAGTGGA GCCATTGTGA CAGTGAAAGG AGGTCTAAGA 780 GTCACAGCTC CAGCCATGAG GAAGCCACAG CAAGAAGAAG ATGATGATGA TGAGGAAGAG 840 CAGCCACAGT GCGTGGAGAC AGACAAAGGT TGCCAACGCC AAAGCAAAAG GAGCAGAAAT 900 GGCATTGATG AGACCATTTG CACAATGAGA CTTCGCCAAA ACATTGGTCA GAATTCATCA 960 CCTGACATCT ACAACCCTCA AGCTGGTAGC ATCACAACCG CCACCAGCCT TGACTTCCCA 1020 GCCCTCTGGC TTCTCAAACT CAGTGCCCAG TATGGATCAC TCCGCAAGAA TGCTATGTTC 1080 GTGCCACACT ACACCCTGAA CGCGAACAGC ATAATATACG CATTGAATGG GCGGGCATTG 1140 GTACAAGTGG TGAATTGCAA TGGTGAGAGA GTGTTTGATG GAGAGCTGCA AGAGGGAGGG 1200 GTGCTGATCG TTCCACAAAA CTTTGCGGTG GCTGCAAAAT CCCAGAGCGA TAACTTTGAG 1260 TATGTGTCAT TCAAGACCAA TGATAGACCC TCGATCGGAA ACCTTGCAGG GGCAAACTCA 1320 TTGTTGAACG CATTGCCAGA GGAAGTGATT CAGCACACTT TTAACCTAAA GAGCCAGCAG 1380 GCCAGGCAGG TGAAGAACAA CAACCCTTTC AGCTTCCTTG TTCCACCTCA GGAGTCTCAG 1440 AGGAGAGCTG TGGCTTAG 1458 (２) 配列番号１３： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１４４６塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (xi) 配列： ATGGCTAAGC TTGTTCTTTC CCTTTGTTTT CTGCTTTTCA GTGGCTGCTG CTTCGCTTTC 60 AGTTTCAGAG AGCAGCCACA GCAAAACGAG TGCCAGATCC AACGCCTCAA TGCCCTAAAA 120 CCGGATAACC GTATAGAGTC AGAAGGTGGC TTCATTGAGA CATGGAACCC TAACAACAAG 180 CCATTCCAGT GTGCCGGTGT TGCCCTCTCT CGCTGCACCC TCAACCGCAA CGCCCTTCGC 240 AGACCTTCCT ACACCAACGC TCCCCAGGAG ATCTACATCC AACAAGGTAG TGGTATTTTT 300 GGCATGATAT TCCCGGGTTG TCCTAGCACA TTTGAAGAGC CTCAACAAAA AGGACAAAGC 360 AGCAGGCCCC AAGACCGTCA CCAGAAGATC TATCACTTCA GAGAGGGTGA TTTGATTGCA 420 GTGCCAACCG GTTTTGCATA CTGGATGTAC AACAATGAAG ACACTCCTGT TGTTGCCGTT 480 TCTCTTATTG ACACCAACAG CTTCCAGAAC CAGCTCGACC AGATGCCTAG GAGATTCTAT 540 CTTGCTGGGA ACCAAGAGCA AGAGTTTCTA CAGTATCAGC CACAGAAGCA GCAAGGAGGT 600 ACTCAAAGCC AGAAAGGAAA GCGTCAGCAA GAAGAAGAAA ACGAAGGAGG CAGCATATTG 660 AGTGGCTTCG CCCCGGAATT CTTGGAACAT GCGTTCGTCG TGGACAGGCA GATAGTGAGA 720 AAGCTACAAG GTGAGAACGA AGAGGAAGAG AAGGGTGCCA TTGTGACAGT GAAAGGAGGT 780 CTCAGCGTGA TAAGCCCACC CACGGAAGAG CAGCAACAAA GACCCGAGGA AGAGGAGAAG 840 CCAGATTGTG ACGAGAAAGA CAAACATTGC CAAAGCCAAA GCAGAAATGG CATTGACGAG 900 ACCATTTGCA CAATGAGACT TCGCCACAAC ATTGGCCAGA CTTCATCACC TGACATCTTC 960 AACCCTCAAG CTGGTAGCAT CACAACCGCT ACCAGCCTCG ACTTCCCAGC CCTCTCGTGG 1020 CTCAAACTCA GTGCCCAGTT TGGATCACTC CGCAAGAATG CTATGTTCGT GCCACACTAC 1080 AACCTGAACG CAAACAGCAT AATATACGCA TTGAATGGAC GGGCATTGGT ACAAGTGGTG 1140 AATTGCAATG GTGAGAGAGT GTTTGATGGA GAGCTGCAAG AGGGACAGGT GTTAATTGTG 1200 CCACAAAACT TTGCGGTGGC TGCAAGATCA CAGAGCGACA ACTTCGAGTA TGTTTCATTC 1260 AAGACCAATG ATAGACCCTC GATCGGCAAC CTTGCAGGTG CAAACTCATT GTTGAACGCA 1320 TTGCCGGAGG AAGTGATTCA GCAAACTTTT AACCTAAGGA GGCAGCAGGC CAGGCAGGTC 1300 AAGAACAACA ACCCTTTCAG CTTCCTGGTT CCACCTAAGG AGTCTCAGAG GAGAGTTGTG 1440 GCTTAG 1446 (２) 配列番号１４： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１６８９塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (xi) 配列： ATGGGGAAGC CCTTCACTCT CTCTCTTTCT TCCCTTTGCT TGCTACTCTT GTCGAGTGCA 60 TGCTTTGCTA TTAGCTCCAG CAAGCTCAAC GAGTGCCAAC TCAACAACCT CAACGCGTTG 120 GAACCCGACC ACCGCGTTGA GTTCGAAGGT GGTTTGATTC AAACATGGAA CTCTCAACAC 180 CCTGAGCTGA AATGCGCCGG TGTCACTGTT TCCAAACTCA CCCTCAACCG CAATGGCCTC 240 CACTTGCCAT CTTACTCACC TTATCCCCGG ATGATCATCA TCGCCCAAGG GAAAGGAGCA 300 CTGCAGTGCA AGCCAGGATG TCCTGAGACG TTTGAGGAGC CACAAGAACA ATCAAACAGA 360 AGAGGCTCAA GGTCGCAGAA GCAGCAGCTA CAGGACAGTC ACCAGAAGAT TCGTCACTTC 420 AATGAAGGAG ACGTACTCGT GATTCCTCCT GGTGTTCCTT ACTGGACCTA TAACACTGGC 480 GATGAACCAG TTGTTGCCAT CAGTCTTCTT GACACCTCTA ACTTCAATAA CCAGCTTGAT 540 CAAACCCCTA GGGTATTTTA CCTTGCTGGG AACCCAGATA TAGAGTACCC AGAGACCATG 600 CAACAACAAC AACAGCAGAA AAGTCATGGT GGACGCAAGC AGGGGCAACA CCAGCAGGAG 660 GAAGAGGAAG AAGGTGGCAG CGTGCTCAGT GGCTTCAGCA AACACTTCTT GGCACAATCC 720 TTCAACACCA ACGAGGACAT AGCTGAGAAA CTTCAGTCTC CAGACGACGA AAGGAAGCAG 780 ATCGTGACAG TGGAAGGAGG TCTCAGCGTT ATCAGCCCCA AGTGGCAAGA ACAACAAGAT 840 GAAGATGAAG ATGAAGACGA AGATGATGAA GATGAACAAA TTCCCTCTCA CCCTCCTCGC 900 CGACCAAGCC ATGGAAAGCG TGAACAAGAC GAGGACGAGG ACGAAGATGA AGATAAACCT 960 CGTCCTAGTC GACCAAGCCA AGGAAAGCGT GAACAAGACC AGGACCAGGA CGAGGACGAA 1020 GATGAAGATG AAGATCAACC TCGCAAGAGC CGCGAATGGA GATCGAAAAA GACACAACCC 1080 AGAAGACCTA GACAAGAAGA ACCACGTGAA AGAGGATGCG AGACAAGAAA CGGGGTTGAG 1140 GAAAATATCT GCACCTTGAA GCTTCACGAG AACATTGCTC GCCCTTCACG CGCTGACTTC 1200 TACAACCCTA AAGCTGGTCG CATTAGTACC CTCAACAGCC TCACCCTCCC AGCCCTCCGC 1260 CAATTCCAAC TCAGTGCCCA ATATGTTGTC CTCTACAAGA ATGGAATTTA CTCTCCACAT 1320 TGGAATCTGA ATGCAAACAG TGTGATCTAT GTGACTCGAG GACAAGGAAA GGTTAGAGTT 1380 GTGAACTGCC AAGGGAATGC AGTGTTCGAC GGTGAGCTTA GGAGGGGACA ATTGCTGGTG 1440 GTACCACAGA ACTTCGTGGT GGCGGAGCAA GCCGGAGAAC AAGGATTCGA ATACATAGTA 1500 TTCAAGACAC ACCACAACGC AGTCACTAGC TACTTGAAGG ATGTGTTTAG GGCAATTCCC 1560 TCAGAGGTTC TTGCCCATTC TTACAACCTT CGACAGAGTC AAGTGTCTGA GCTTAAGTAT 1620 GAAGGAAATT GGGGTCCTTT GGTCAACCCT GAGTCTCAAC AAGGCTCACC CCGTGTTAAA 1680 GTCGCATAA 1689 (２) 配列番号１５： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：１５５１塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (xi) 配列： ATGGGGAAGC CCTTCTTCAC TCTCTCTCTT TCTTCCCTTT GCTTGCTACT CTTGTCGAGT 60 GCATGCTTTG CTATTACCTC CAGCAAGTTC AACGAGTGCC AACTCAACAA CCTCAACGCG 120 TTGGAACCCG ACCACCGCGT TGAGTCCGAA GGTGGTCTTA TTGAAACATG GAACTCTCAA 180 CACCCTGAGC TGCAATGCGC CGGTGTCACT GTTTCCAAAC GCACCCTCAA CCGCAACGGC 240 TCCCACTTGC CATCTTACTT ACCTTATCCC CAAATGATCA TTGTCGTTCA AGGGAAGGGA 300 GCAATTGGAT TTGCATTTCC GGGATGTCCC GAGACGTTTG AGAAGCCACA ACAACAATCA 360 AGCAGAAGAG GCTCAAGGTC ACAGCAGCAA CTACAAGACA GTCACCAGAA GATTCGTCAC 420 TTCAATGAAG GAGACGTACT AGTGATTCCT CTTGGTGTTC CTTACTGGAC CTATAACACT 480 GGCGATGAAC CAGTTGTTGC CATCAGTCCT CTTGACACCT CCAACTTCAA CAATCAGCTT 540 GATCAAAACC CCAGAGTATT TTACCTTGCT GGGAACCCAG ATATAGAGCA TCCCGAGACC 600 ATGCAACAAC AGCAGCAGCA GAAGAGTCAT GGTGGACGCA AGCAGGGGCA ACACCGACAG 660 CAGGAGGAAG AAGGTGGCAG TGTGCTCAGT GGCTTCAGCA AACATTTCTT AGCACAATCC 720 TTCAACACCA ACGAGGACAC AGCTGAGAAA CTTCGGTCTC CAGATGACGA AAGGAAGCAG 780 ATCGTGACAG TGGAGGGAGG CCTCAGCGTT ATCAGCCCCA AGTGGCAAGA ACAAGAAGAC 840 GAAGACGAAG ACGAAGACGA AGAATATGGA CGGACGCCCT CTTATCCTCC ACGACGACCA 900 AGCCATGGAA AGCATGAAGA TGACGAGGAC GAGGACGAAG AAGAAGATCA ACCTCGTCCT 960 GATCACCCTC CACAGCGACC AAGCAGGCCC GAACAACAAG AACCACGTGG AAGAGGATGT 1020 CAGACTAGAA ATGGGGTTGA GGAAAATATT TGCACCATGA AGCTTCACGA GAACATTGCT 1080 CGCCCTTCAC GTGCTGACTT CTACAACCCA AAAGCTGGTC GCATTAGCAC CCTCAACAGT 1140 CTCACCCTCC CAGCCCTCCG CCAATTCGGA CTCAGTGCCC AATATGTTGT CCTCTACAGG 1200 AATGGAATTT ACTCTCCAGA TTGGAACTTG AACGCGAACA GTGTGACGAT GACTCGAGGG 1260 AAAGGAAGAG TTAGAGTGGT GAACTGCCAA GGGAATGCAG TGTTCGACGG TGAGCTAAGG 1320 AGGGGACAAT TGCTAGTGGT GCCGCAGAAC CCCGCGGTGG CTGAGCAAGG GGGAGAACAA 1380 GGATTGGAAT ATGTAGTGTT CAAGACACAC CACAACGCCG TGAGCAGCTA CATTAAGGAT 1440 GTGTTTAGGG TAATCCCTTC GGAGGTTCTT TCCAATTCTT ACAACCTTGG CCAGAGTCAA 1500 GTGCGTCAGC TCAAGTATCA AGGAAACTCC GGCCCTTTGG TCAACCCATA A 1551 (２) 配列番号１６： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： GCGGCCGCAT GGCCAAGCTA GTTTTTT 27 (２) 配列番号１７： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２３塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： GCGGCCGCTG GTGGCGTTTG TGA 23 (２) 配列番号１８： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２３塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： GCGGCCGCTC TTCTGAGACT CCT 23 (２) 配列番号１９： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２４塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： GCGGCCGCAT GCCCTTCACT CTCT 24 (２) 配列番号２０： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２６塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： GCGGCCGCTG GGAGGGTGAG GCTGTT 26 (２) 配列番号２１： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 配列の長さ：２４塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (xi) 配列： GCGGCCGCTG AGCCTTGTTG AGAC 24
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クロ
ーニング媒体として用いられるプラスミドｐＭＬ７０の
制限地図である。
【図２】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クロ
ーニング媒体として用いられるプラスミドｐＣＷ１０９
の制限地図である。
【図３】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クロ
ーニング媒体として用いられるプラスミドｐＫＳ１８Ｈ
Ｈの制限地図である。
【図４】プラスミドｐＪｏ１の制限地図である。
【図５】ｐＪｏ１で形質転換された体細胞胚から抽出さ
れたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図６】プラスミドｐＢＳ４３の制限地図である。
【図７】ｐＢＳ４３で形質転換された植物より得られた
ダイズ種子から抽出されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲルである。
【図８】プラスミドｐＪｏ３の制限地図である。
【図９】プラスミドｐＲＢ２０の制限地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フエイダー，ゲイリー・マイケル アメリカ合衆国ペンシルベニア州19350ラ ンデンバーグ・ウツズレイン100 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA79 CA04 DA01 EA04 GA11 HA01 4B065 AA89X AA89Y AB01 BA02 CA53

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）（ｉ）ダイズ種子貯蔵タンパク質
    遺伝子からのプロモーター領域をコードする核酸フラグ
    メント；及び（ii）（ｉ）のダイズ種子貯蔵タンパク質
    ではないダイズタンパク質の全部または一部をコードす
    る核酸フラグメント、該核酸フラグメントが（ｉ）のプ
    ロモーターに対してセンスまたはアンチセンスの向きに
    置かれる；及び（iii）転写終結領域；を含んでなるキ
    メラ遺伝子を構築し、 （ｂ）（ａ）のキメラ遺伝子をダイズ種子中に導入する
    ことによりトランスジェニックダイズ種子を作製し、そ
    して（ｃ）工程（ａ）のキメラ遺伝子の発現をもたらす
    条件下で工程（ｂ）のトランスジェニックダイズ種子を
    生育することを含んでなり、ここで、工程（ａ）のキメ
    ラ遺伝子を含有しないダイズに比較した場合にダイズ種
    子貯蔵タンパク質サブユニットのあるクラスの１個また
    はそれ以上のメンバーの量及び（ａ)(ii）の核酸フラグ
    メントによりコードされるタンパク質の量が減少してい
    る、２種のダイズ遺伝子の発現を同時に減少するための
    方法。
  2. 【請求項２】 （ａ）(ｉ)のダイズ種子貯蔵タンパク質
    ではないダイズタンパク質の全部または一部をコードす
    る核酸フラグメントがプロモーター領域に対してセンス
    の向きに置かれる請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 （ａ）(ｉ)のダイズ種子貯蔵タンパク質
    ではないダイズタンパク質の全部または一部をコードす
    る核酸フラグメントがプロモーター領域に対してアンチ
    センスの向きに置かれる請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 プロモーターがβ−コングリシニンダイ
    ズ種子貯蔵タンパク質のαサブユニットをコードする遺
    伝子から得られる請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 （ａ）(ｉ)のダイズ種子貯蔵タンパク質
    ではないダイズタンパク質の全部または一部をコードす
    る核酸フラグメントが脂肪酸生合成に関与する遺伝子を
    コードする請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 工程（ａ）のキメラ遺伝子を含有しない
    ダイズに比較した場合にダイズ種子貯蔵タンパク質サブ
    ユニットのあるクラスの１個またはそれ以上のメンバー
    の量及び（ａ）(ii)の核酸フラグメントによりコードさ
    れるタンパク質の量が減少している請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 工程（ａ）のキメラ遺伝子を含有しない
    ダイズ種子に比較した場合にダイズ種子貯蔵タンパク質
    サブユニットのあるクラスの少なくとも２個のメンバー
    が減少し且つ工程（ａ）のキメラ遺伝子を含有しないダ
    イズ種子に比較した場合に工程（ａ）のキメラ遺伝子を
    含有するダイズ種子の脂肪酸特性が改変されている請求
    項１の方法。
  8. 【請求項８】 請求項１の方法により製造されるトラン
    スジェニックダイズ植物。
  9. 【請求項９】 請求項８の植物から得られるトランスジ
    ェニック種子。
  10. 【請求項１０】 （ｉ）ダイズ種子貯蔵タンパク質サブ
    ユニットのあるクラスの１個またはそれ以上のメンバー
    の量が減少し；且つ（ii）非トランスジェニックダイズ
    植物から得られる種子に比較した場合にトランスジェニ
    ックダイズ植物の種子において他の脂肪酸の含有量に対
    してオレイン酸含有量が増加しているトランスジェニッ
    クダイズ植物。
  11. 【請求項１１】 請求項１０の植物から得られるトラン
    スジェニック種子。
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