KR101493981B1 - 콩 베타-콘글리시닌의 3 서브유닛들을 포함한 콩 품종 선별용 프라이머 및 이를 이용한 콩 품종 선별 방법 - Google Patents

콩 베타-콘글리시닌의 3 서브유닛들을 포함한 콩 품종 선별용 프라이머 및 이를 이용한 콩 품종 선별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-콘글리시닌의 3-서브유닛을 판별하기 위한 분자표지 마커 및 이를 이용한 선별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 하나의 분자표지 마커를 이용하여 콩 단백질의 베타-콘글리시닌의 α,α',β 세가지 서브유닛에 대한 염기서열을 선별함으로써 콩 종자를 이용하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 할 필요 없이 식물체 잎에서 바로 DNA를 추출하여 베타-콘글리시닌의 3-서브유닛의 유무를 쉽게 알 수 있으며 분자표지를 이용하여 세대단축의 효과와 정확한 개체를 선발할 수 있어 많은 노동력과 비용절감의 효과가 있다. 뿐만 아니라 베타-콘글리시닌의 α와 α' 서브유닛이 제거된 유전자원을 이용하여 국내 우수품종과 교배한 개체는 수입콩과의 차별화를 이룰 수 있는 효과가 있는 베타-콘글리시닌의 3-서브유닛을 판별하기 위한 분자표지 마커 및 이를 이용한 선별방법에 관한 것이다.

Description

콩 베타-콘글리시닌의 3 서브유닛들을 포함한 콩 품종 선별용 프라이머 및 이를 이용한 콩 품종 선별 방법{Primer for Selecting Bean Variety containing 3 Subunits of β-conglycinin and the Selecting Method thereof}
본 발명은 베타-콘글리시닌의 3-서브유닛을 판별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 콩 품종의 품종 선별 방법에 관한 것이다.
콩에는 40 ~ 50%나 되는 많은 단백질이 함유되어 있고, 다른 식물성 단백질보다 영양성, 기능성 및 경제성이 뛰어나다. 콩으로 만든 가공식품을 장기간 섭취하면 각종 성인병에 걸리지 않는다는 결과가 보고되었고 콜레스테롤 저하작용이 있는 것으로 알려졌다.
콩 단백질인 글리시닌(glycinin)은 글루불린(globulin)의 한 종류로서 오래전에는 콩 단백질 전체를 글리시닌이라고 하였으나 최근에는 주성분의 1개인 11S(glycinin) 성분을 7S 성분인 콘글리시닌(conglycinin)에 대응하여 글리시닌이라 한다.
콩 단백질은 2S, 7S(conglycinin), 11S 및 15S 분획으로 구성되어 있는데 이중 7S와 11S가 대부분을 차지하고 있다. 콘글리시닌은 α,α',β 라고 하는 3개의 당단백질 서브유닛(subunit)으로 구성되어 있는 3량체이고, 글리시닌은 산성 폴리펩티드(polypeptide), 염기성 폴리펩티드 등 2종류의 폴리펩티드로 구성되어 있는 6량체이다.
그러나 베타-콘글리시닌의 세가지 서브유닛은 콩 단백질의 잠재적인 주요 알레르기원으로 알려졌다. 또한 두부와 같은 대두 식품의 처리과정에서 베타-콘글리시닌의 서브유닛들은 겔화 특성에 미치는 영향 정도가 서로 다르기 때문에 겔 형성에 좋지 않은 영향을 가진다. 그래서 대두의 저장단백질들 중에서 콩단백질 베타-콘글리시닌의 유전자형을 분석하는 방법이 연구되어 왔으며 이때 베타-콘글리시닌의 발현 수준을 분석하기 위해 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 효소면역흡착검사법(ELISA)와 같은 항체검사가 흔히 이용되어 왔다. 그러나 상기 방법들은 많은 노동력과 분석시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 또한 베타-콘글리시닌의 세가지 서브유닛의 프라이머에 대한 분자표지 마커 연구가 미흡한 실정이다.
종래 이러한 콩과 관련된 유전자원의 분자표지는 한국공개특허 제2011-0094500호에 서열번호 1 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 Cgy-1(β-conglycinin의 α' subunit) 유전자가 결핍된 대두 돌연변이체를 선별하기 위한 공우성 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 대두 돌연변이체를 선별하는 방법이 제안되어 있다. 또한 한국공개특허 제2010-0112658호에 트랜스제닉 대두 계통 MON87769의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 프로브 및 프라이머가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-857043호에는 콩 모자이크바이러스 저항성 형질과 연관 정도가 높은 서열을 가지는 핵산의 일부인 염기 서열을 포함하는 프라이머가 개시되어 있다.
따라서 콩 베타-콘글리시닌의 서브유닛들에 대한 유무를 확인하기 위해 단백질 전기영동을 사용할 필요 없이 식물체 잎에서 바로 DNA를 추출하여 원하는 유전자가 삽입되어 있는지에 대해 PCR을 이용한 분자표지 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 하나의 분자표지를 이용하여 콩 단백질의 베타-콘글리시닌의 α,α',β 세가지 서브유닛에 대한 염기서열을 선별함으로써 콩 종자를 이용하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 할 필요 없이 식물체 잎에서 바로 DNA를 추출하여 베타-콘글리시닌의 3-서브유닛의 유무를 쉽게 알 수 있으며 분자표지를 이용하여 세대단축의 효과와 정확한 개체를 선발할 수 있게 되었다.
이에 본 발명은 베타-콘글리시닌의 3-서브유닛을 판별하기 위한 분자표지 및 이를 이용한 선별방법을 제공하는데에 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별용 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은
(i) 콩 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(ii) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 청구항 1의 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;
를 포함하는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별 방법을 제공한다.
본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(i) 콩 베타-콘글리시닌의 3 서브유닛들을 포함한 콩 품종 선별용 프라이머를 이용하여 종자를 이용하여 단백질 전기영동 할 필요 없이 식물체 잎에서 바로 DNA를 추출하여 원하는 유전자가 삽입되었다는 것을 쉽게 알 수 있다.
(ii) 본 발명의 프라이머의 α와 α' -subunit이 제거된 유전자원을 이용하여 국내 우수품종과 교배한 개체는 수입콩과의 차별화를 이룰 수 있는 효과가 있다.
도 1은 α와 α' -subunit이 제거된 유전자원을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)으로 나타낸 것이다.
도 2는 베타콘글라이시닌관련 염기서열에 대한 프라이머 쌍으로 확인한 결과 관련 유전자부위의 삭제된 부위를 나타낸 것이다.
도 3은 서로 다른 유전자형에 대해 표 3의 영역 3번과 5번에서 프라이머 쌍이 베타콘글라이신 관련서브유닛이 제거된 유전자원에서 정확히 다르게 나타나는 것을 확인한 전기영동 사진이다.
도 4는 대원콩과 PI200485 교배 후 CS1150과 교배한 개체의 F2 집단에서 베타콘글라이신 관련분자표지가 분리가 일어나는 것을 나타낸 전기 영동 사진이다.
도 5는 분자표지로 확인한 F3 56개체를 SDS-PAGE로 저장단백질을 확인한 결과를 나타낸 것이다. α-1(1-9)의 경우 베타콘글라이신 알파 서브유닛과 알파프라임 서브유닛이 모두 제거된 호모 개체, α-2(1-15)의 경우 베타콘글라이신 알파 서브유닛이 제거된 호모와 헤테로 개체, α-3(1-14)의 경우 베타콘글라이신 알파프라임 서브유닛이 제거된 호모와 헤테로 개체, α-4(1-18)의 경우 베타콘글라이신 알파 서브유닛과 알파프라임 서브유닛이 모두 발현하는 호모와 헤테로 개체임을 나타낸 전기 영동 사진이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별용 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별용 분자 마커를 제공한다.
보다 바람직하게는 본 발명의 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별에 가장 훌륭한 분자 마커로 제공하는 것은 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 경우이다.
본 발명에서 제공하는 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은
(i) 콩 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(ii) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 청구항 1의 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;
를 포함하는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별 방법을 제공한다.
상기 (i)단계에서 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Pla nt Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., N uc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (ii)단계에서 본 명세서에 기술된 용어“증폭하는 단계”는 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR(24), 핫 스타트(hot start) PCR(25, 26), 네스티드(nested) PCR(2) 및 부스터(booster) PCR(27)이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 콩 시료에서 추출된 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함 한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5 ~ 2. 5mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비 특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충 용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94 ~ 95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변 성 및 증폭은 94 ~ 95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있다. 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 55 ~ 60℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응조건은 다음과 같다. 94℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 60초를 35 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.
상기 (iii) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게 는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치 (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. PCR 증폭 결과는 바람직 하게는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)과 형광염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은
청구항 1의 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍, 제한 효소 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별용 키트를 제공한다.
이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합 효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확 인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
상기 제작한 분자표지가 콩 품종 및 유전자원에서 β-conglycinin의 α'과 α, β-subunit의 분석이 가능한지 검증하기 위해 PCR을 수행하였다.
① 식물재료
본 발명에 사용된 분자표지가 콩 품종에서 다형성을 나타내는지 확인하기 위해 농촌진흥청 국립식량과학원 기능성작물부에서 보유하고 있는 콩 품종 및 유전자원 16점(석량, 소담, 만리, 녹원, 태광, 진품2호, 청자, 청자3호, 대원, 예계434, CS1150, PI200485, PI567476, 단미, PI200508, PI181540)을 이용하였다.
② DNA 추출
실험에 사용될 콩의 DNA를 추출하기 위하여, 상기한 콩 품종의 어린 콩 잎 0.5 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 퀵프랩 버퍼(200mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 1.5 mL과 함께 튜브에 넣은 후, 60 ℃에 1시간 반응시켰다. 10,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 얻어진 상층액 400 ㎕를 새 튜브에 넣고, 이소프로판올(isopropanol) 300 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 -80 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후 20,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 70 % 에탄올(ethanol)을 넣고 가볍게 씻어준 후 30 분간 건조하였다. 이후 DNA 추출 버퍼(10 mM NH4OAC, 0.25 mM EDTA) 150 ㎕를 첨가한 후 잘 섞어 주었다. 이를 60 ℃에서 1 시간 반응 후 10,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 참깨 DNA인 상층액 100 ㎕을 얻었다.
③ 분자표지 분석을 위한 PCR
상기 제작한 분자 표지를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 상기에서 얻어진 콩 DNA 시료는 각 100 ng을 사용하였으며, 프라이머쌍은 각각 20 pmol 씩 사용하였다(표 2). PCR 증폭을 위해 중합효소(polymerase) 및 PCR 반응용 완충용액이 혼합되어 있는 (주)제넷바이오 premix(Cat. No. G2002)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 증폭 조건으로는 먼저 94 ℃에서 3 분 반응 후, 94 ℃에서 30 초, 52℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초간 반응하는 사이클을 34 번 반복하였고, 마지막으로 72 ℃에서 7 분간 반응하였다. PCR 증폭이 끝난 생산물은 2% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동하여 밴드를 확인하였다(EtBr 0.5 ㎍/ml, UV 상에서 확인). 품종에 따른 상기 밴드 분석 결과를 하기 도 3, 4에 나타내었다.
실험 결과
도 1은 베타-콘글리시닌의 α'(PI200485)과 α(CS1150) 서브유닛이 제거된 유전자원을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 분석한 결과이다. 1번 PI567476, 2번 진품 2호, 3번 석량풋콩, 4번 만리콩, 5번 PI200485, 6번 CS1150, 7번 태광콩, 8번 대원콩으로 각각의 저장단백질 확인 결과를 나타낸다.
도 2는 상기 태광콩의 염기서열에서 프라이머 쌍을 작성하여 확인한 결과 상기 CS1150은 α 서브유닛의 뒷부분이 제거되어 발현하지 않았고, 상기 PI200485는 α' 서브유닛의 전체 염기서열이 제거되어 발현하지 않는다는 것을 확인하였다.
상기 도 2의 결과를 확인하기 위해 베타-콘글라이시닌의 α,α' 서브유닛의 염기서열을 확인하기 위한 프라이머 쌍을 하기 표 1과 표 2에 나타내었다. 하기 표 1은 베타콘글라이시닌 알파서브유닛을 확인하기 위한 프라이머 쌍을 기재하였고, 표 2는 베타콘글라이시닌 알파프라임서브유닛을 확인하기 위한 프라이머 쌍을 기재한 것이다.
Primer name Sequence(5’ → 3’) Product
position		 Product
size (bp)
서열번호 1: alphaseq-F1
서열번호 2: alphaseq-R1		 GCAACCATATCAGCATATCA
GGAATTTCACCTTCTTCACA		 3-710 708
서열번호 3: alphaseq-F2
서열번호 4: alphaseq-R2		 ACAAGATGAACGTCAATTCC
TCCTTGCAAGTAGGATTGTT		 930-1668 739
서열번호 5: alphaseq-F3
서열번호 6: alphaseq-R3		 GTGCCAAATCTAGTTCAAGG
CCTCCTCTTTCTTCTTAGGC		 1954-2802 849
서열번호 7: alphaseq-F4
서열번호 8: alphaseq-R4		 AGAAAGGGTCCTTTGTCTTC
CTCGCAAAGAAAGGAAAATA		 2814-3521 708
서열번호 9: alphaseq-F5
서열번호 10: alphaseq-R5		 GAAGGTGAAATTCCACGAC
TTCAGAAGAAATGGTTTTCC		 697-1991 1295
서열번호 11: alphaseq-F6
서열번호 12: alphaseq-R6		 TATTAATGCCGAGAACAACC GAAGGACACAAAACAAAAGC 2501-2990 490
서열번호 13: alphaseq-F7
서열번호 14: alphaseq-R7		 CTTCGACAAAGTGTCTAGGA TTTCAATAAGTTGGGGATCA 3138-3603 466
Primer name Sequence(5’ → 3’) Product position Product
size (bp)
서열번호 1: alphaprimeseq-F1
서열번호 2: alphaprimeseq-R1		 GCAACCATATCAGCATATCA
GGAATTTCACCTTCTTCACA		 3-710 708
서열번호 3: alphaprimeseq-F2
서열번호 4: alphaprimeseq-R2		 ACAAGATGAACGTCAATTCC
TCCTTGCAAGTAGGATTGTT		 930-1668 739
서열번호 5: alphaprimeseq-F3
서열번호 6: alphaprimeseq-R3		 GTGCCAAATCTAGTTCAAGG
CCTCCTCTTTCTTCTTAGGC		 1954-2802 849
서열번호 7: alphprimeaseq-F4
서열번호 8: alphaprimeseq-R4		 AGAAAGGGTCCTTTGTCTTC
CTCGCAAAGAAAGGAAAATA		 2814-3521 708
서열번호 9: alphaprimeseq-F5
서열번호 10: alphaprimeseq-R5		 GAAGGTGAAATTCCACGAC
TTCAGAAGAAATGGTTTTCC		 697-1991 1295
서열번호 11: alphaprimeseq-F6
서열번호 12: alphaprimeseq-R6		 TATTAATGCCGAGAACAACC GAAGGACACAAAACAAAAGC 2501-2990 490
상기 표 1과 상기 표 2에서 제거된 베타-콘글리시닌의 α,α' 또는 β 세가지 서브유닛의 3-subunit의 15bp 이상 공통영역이 13 영역에서 발견된 부분의 공통 염기서열을 확인한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Region α-subunit of position α'-subunit of position β- subunit of position Consensus sequence Segment Length
1 1374- 2013- 1517- CCTTGGTGAACAACGACGAC 20
2 1831- 2488- 1990- AATTCGAGGAGATAAACA 18
3 1955- 2612- 2099- TGCCAAATCTAGTTCAAGGAAAACCATTTC 30
4 2079- 2733- 2223- CAGCTTCGGGACTTGGAT 18
5 2242- 2879- 2396- TTTGTTCACAAATATAGGGAGCTCTT 26
6 2269- 2906- 2423- TTCTACCACACTTCAATTCAAAGGC 25
7 2325- 2962- 2479- GCAAACATTGAACTTGTTGGC 21
8 2349- 2986- 2503- AAAGAACAACAACAG 15
9 2383- 3020- 2537- AACCTTTGGAAGTGC 15
10 2463- 3100- 2617- GTCAACGCTACCTCA 15
11 2511- 3148- 2665- GAGAACAACCAGAGGAACTTCCT 23
12 2694- 3343- 2827- CAAGTGCAGGAGCTTGC 17
13 2808- 3457- 2941- AAGGGAAGAAAGGGTCCTTT 20
도 3은 상기 표 1에 작성한 영역 3번(정방향 염기서열)과 5번(역방향 염기서열)인 분자표지를 서로 다른 유전자형과 비교한 결과 상기 영역의 분자표지와 정확히 일치하는 확인하였다. 상기 베타-콘글리시닌의 α,α' 또는 β 세가지 서브유닛은 각각 11번 CS1150, 12번 PI200485, 10번 예계 434로 나타내었고, 상기 다른 유전자형으로 1번 석량, 2번 소담, 3번 만리, 4번 녹원, 5번 태광, 6번 진품 2호, 7번 청자, 8번 청자 3호, 9번 대원, 13번 PI567476, 14번 단미, 15번 PI200508, 16번 PI181540를 각각 나타내었다.
도 4는 대원콩을 상기 PI200485와 교배 후 여기서 얻어진 F1 개체를 상기 CS1150로 교배한 후 개발한 분자표지로 다형성을 나타낸 것이다. 이때 4번, 8번, 19번, 24번, 29번, 41번, 44번은 상기 베타-콘글리시닌의 α와 α' 서브유닛이 모두 제거된 것을 나타내었다. 따라서 상기 대원콩의 교배조합에서 특이분자표지를 나타내는 유전자형을 정확하게 선발할 수 있는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 분자표지로 선발한 F3 56개체를 SDS-PAGE로 저장단백질을 확인한 결과를 나타낸 것이다. A(1-9)의 경우 베타콘글라이신 알파 서브유닛과 알파프라임 서브유닛이 모두 제거된 호모 개체임을 확인, B(1-15)의 경우 베타콘글라이신 알파 서브유닛이 제거된 호모와 헤테로 개체를 확인, C(1-14)의 경우 베타콘글라이신 알파프라임 서브유닛이 제거된 호모와 헤테로 개체를 확인, D(1-18)의 경우 베타콘글라이신 알파 서브유닛과 알파프라임 서브유닛이 모두 발현하는 호모와 헤테로 개체를 확인할 수 있었다.
<110> Republic of Korea (Management: Rural Development Administration) <120> Primer for Selecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin and the Selecting Method thereof <130> DP-2011-0671 <140> 10-2011-0144350 <141> 2011-12-28 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 : forward primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 1 gcaaccatat cagcatatca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 : reverse primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 2 ggaatttcac cttcttcaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 : forward primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 3 acaagatgaa cgtcaattcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 : reverse primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 4 tccttgcaag taggattgtt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 : forward primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 5 gtgccaaatc tagttcaagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R3 : reverse primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 6 cctcctcttt cttcttaggc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4 : forward primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 7 agaaagggtc ctttgtcttc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R4 : reverse primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 8 ctcgcaaaga aaggaaaata 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F5 : forward primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 9 gaaggtgaaa ttccacgac 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R5 : reverse primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 10 ttcagaagaa atggttttcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F6 : forward primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 11 tattaatgcc gagaacaacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R6 : reverse primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 12 gaaggacaca aaacaaaagc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F7 : forward primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 13 cttcgacaaa gtgtctagga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R7 : reverse primer for detecting Bean Variety containing 3 Subunits of beta-conglycinin <400> 14 tttcaataag ttggggatca 20

Claims (11)

  1. 서열번호 3 및 5로 표시되는 프라이머쌍에 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍;
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별용 프라이머쌍.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 베타-콘글리시닌은 α,α',β 라고 하는 3개의 당단백질 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머쌍.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 베타-콘글리시닌의 α' 서브유닛은 PI200485 위치인 것을 특징으로 하는 프라이머쌍.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 베타-콘글리시닌의 α 서브유닛은 CS1150 위치인 것을 특징으로 하는 프라이머쌍.
  5. 서열번호 3 및 5로 표시되는 프라이머쌍에 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍;
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별용 분자 마커 조성물.
  6. (i) 콩 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
    (ii) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 청구항 1의 프라이머쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (iii) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;
    를 포함하는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 베타-콘글리시닌은 α,α',β 라고 하는 3개의 당단백질 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 베타-콘글리시닌의 α' 서브유닛은 PI200485 위치인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 베타-콘글리시닌의 α 서브유닛은 CS1150 위치인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별 방법은 하나의 분자표지마커로 상기 베타-콘글리시닌의 α,α',β 세 가지 서브유닛에 대한 염기서열을 동시에 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 서열번호 3 및 5로 표시되는 프라이머쌍에 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍;
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 추가적으로 포함하는 하나 이상의 프라이머쌍, 제한 효소 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 콩 베타-콘글리시닌 서브유닛을 판별하는 콩 품종 선별용 키트.
KR20110144350A 2011-12-28 2011-12-28 콩 베타-콘글리시닌의 3 서브유닛들을 포함한 콩 품종 선별용 프라이머 및 이를 이용한 콩 품종 선별 방법 KR101493981B1 (ko)

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Breeding Science, Vol. 52, pp. 285-292 (2002.12.31.) *

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