JPH02156889A - グリシニン生産細胞及びグリシニン生産植物の育種方法並びに育種増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、グリシニン遺伝子を含む組換えプラスミド、
新たにグリシニン生産能が付与された植物細胞の創成方
法およびグリシニン生産植物の育種増殖方法に関するも
のである。

〔従来の技術〕

グリシニンは、ダイズ種子に蓄えられる主な貯蔵タンパ
ク質の一つで、子葉細胞内の細胞顆粒内に蓄えられてい
る。これらのタンパク質のプロティンスコアは高く、良
質な食品素材として利用されている。

グリシニンサブユニットについては、主なもので、これ
までに６つの酸性サブユニット（ＡＩ−、ＡＩｂ。

＾ｚ、　ＡＩ、　Ａ４．　ＡＳ）と５つの塩基性サブユ
ニット（Ｂ＋　−、Ｂ＋　ｂ、　ＢＺ、　Ｂ３．　Ｂ４
）が知られており、これらはグリシニンサブユニット前
駆体Ａ３Ｂ４．　ＡｓＡＪｚ。

ＡＪ＋−、ＡＩ−Ｂ＋ｂ、　ＡＩｂＢｚの組み合わせで
存在することが知られている。これらのグリシニンサブ
ユニット前駆体をコードするグリシニン遺伝子のｍＲＮ
Ａにつむ）ては既にＡ３Ｂ４（１）、八５Ａ４Ｂ３　”
、　ＡＪＩｍ　”ＡＩＪＩｂ”’　においてそのＲＮＡ
配列が明らかにされている。また、一般に植物由来のタ
ンパクを遺伝子工学的手法により他の植物（細胞）で発
現させる方法については、エレクトロポレーションによ
り行う方法３６）、アグロバクテリア３７）を介した方
法等の報告がある。

しかしながら、これらの方法を使った有用なダイズグリ
シニンに適用した例はなく、タンパク質の発現部位ある
いは安定性、遺伝子の組み込まれる部位の発現への影響
等の点で実際発現するかどうか予測できなかったばかり
でなく、種々の植物体でこの遺伝子がはたして発現する
かどうかという疑問があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、グリシニン遺伝子を含む組換えプラス
ミド、グリシニン生産能が新規に付与された植物細胞の
創成方法およびグリシニン生産植物の育種増殖方法を提
供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的を達成するために採用される本発明の構成は
、次の（１）〜（２６）に記載した技術的事項からなる
ものである。

（１）グリシニン遺伝子を植物用プラスミドに組み込ん
でなる組換えプラスミド。

（２）植物用プラスミドがρＬＧＶｎｅｏ１１０３であ
ることを特徴とする組換えプラスミド。

（３）グリシニン遺伝子の上流に外来プロモーターその
下流に外来ターミネータ−を連結したことを特徴とする
上記（１）記載の組換え体プラスミド。

（４）グリシニン遺伝子が次のＤＮＡ配列（矢印ａから
ｂ）を有するグリシニンサブユニット前駆体Ａ、Ｂ、で
ある上記（１）記載の組換えプラスミド。

ＣへへＴＣＡＡＧＣＡ　　ＧＡＡＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧ
ＧＴＣＡＣＡＧ　　ＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＬ；’ｌ１ｊ
ｌｉ’ｌ’ＵＬｉＬ；Ａ’ｌ”Ｉ’ＡＩＪＬ；ＡＬ；Ｌ
：［；’１’Ｌ；　　ＡＡにｆｉＧ’ｒｃＴｃＡ　　Ｃ
Ｃ：ＣＴＣＣＣＡＧＣグリシニン遺伝子が次のＤＮＡ配
列 （矢印Ｃ からｄ）を有するグリシニンサブユニット前駆 体Ａ５Ａ、Ｂ、である上記（１）記載の組換えプラスミ
ド。

ＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴ　　ＣＴＴＡＣＡＡＣＣＴ　　Ｔ
ＣＧＡＣＡＧＡＧＴ　　ＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧ八ＧＴＣ
ＴＴＣＡＣへ ＴＴＴＴＧＴＣＴＴ グリシニン遺伝子が次のＤＮＡ配列 （矢印ｅ からｆ）を有するグリシニンサブユニット前駆体ＡｚＢ
＋−である上記（１）記載の組換えプラスミド。

ＴＣＴＣＴＣＧＣＴＧ ＣＡＣＣＣＴＴＡＡＣ ＣＧＣＡＡＴＧＣＣＣ ＴＴＣＧＴＡＧＡＣＣ ＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧ ＧＡＴＧＴＧＴＴＴＡ ＧＧＧＣへへｉ”１じし し工しＡＩＪＲしＬｉ’ｌｌ ＡＡＣＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＴＡＴＧＧＡ　　ＴＣＡ
ＣＴＣＣＧＣＡ　　ＡＧＡＡＴＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＡ
ＴＴＧＡ　　ＡＴＧＧＧＣＧＧＧＣＡＴＴＧＧＴＡＣＡ
Ａ　　ＧＴＧＧＴＧＡＡＴＴグリシニン遺伝子が次のＤ
ＮＡ配列 （矢印ｇ からｈ）を有するグリシニンサブユニット前駆 体Ａ１．ＢＩｂである上記（１）記載の組換えプラスく ド。

ハしハＡ　ｌｊ　Ｌ；　Ａ　Ｌｉ　Ａ　’１ＡｔＪしら
ＡＡＡＡＡに　　ＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧ八ＧＡＡＣＧＡ
ＡＧＧ （８）次の各工程からなるグリシニン生産細胞の創成方
法。

ｉ、グリシニン遺伝子のｃＤＮＡを植物用プラスミドに
組み込み組換え体プラスミドを得る工程。

ｉｉ、前記組換え体プラスミドにより所望の植物細胞に
導入することにより、前記植物細胞を形質転換する工程
。

（９）導入を、エレクトロポレーションにより行うこと
を特徴とする上記（８）記載のグリシニン生産細胞の創
成方法。

（１０）導入を、アグロバクテリア属に属する微生物へ
の導入を介して行うことを特徴とする上記（８）記載の
グリシニン生産細胞の創成方法。

（１１）グリシニン生産細胞がナス科植物のグリシニン
生産細胞であることを特徴とする上記（８）記載のグリ
シニン生産細胞の創成方法。

（１２）ナス科植物がタバコであることを特徴とする上
記（１１）記載のグリシニン生産細胞の創成方法。

（１３）ナス科植物がバレイショであることを特徴とす
る上記（１１）記載のグリシニン生産細胞の創成方法。

（１４）グリシニン生産細胞が禾本科植物のグリシニン
生産細胞であることを特徴とする上記（８）記載のグリ
シニン生産細胞の創成方法。

（１５）禾本科植物がイネであることを特徴とする上記
（１４）記載のグリシニン生産細胞の創成方法。

（１６）グリシニン遺伝子を導入することによって形質
転換された、グリシニン生産能を有するグリシニン生産
細胞から植物体を分化せしめることを特徴とするグリシ
ニン生産植物の育種方法。

（１７）グリシニン生産植物がナス科植物のグリシニン
生産植物であることを特徴とする上記（１６）記載のグ
リシニン生産植物の育種方法。

（Ｉ８）ナス科植物がタバコであることを特徴とする上
記（１７）記載のグリシニン生産植物の育種方法。

（１９）ナス科植物がバレイショであることを特徴とす
る上記（１７）記載のグリシニン生産植物の育種方法。

（２０）グリシニン生産植物が禾本科植物のグリシニン
生産植物であることを特゛徴とする上記（１６）記載の
グリシニン生産植物の育種方法。

（２１）禾本科植物がイネであることを特徴とする上記
（２０）記載のグリシニン生産植物の育種方法。

（２２）グリシニン遺伝子を導入することによって形質
転換された、グリシニン生産能を有するグリシニン生産
細胞から植物体を分化せしめることによってグリシニン
生産植物を育種し、ついで、これを増殖することを特徴
とするグリシニン生産植物の育種増殖方法。

（２３）グリシニン生産植物がナス科植物のグリシニン
生産植物であることを特徴とする上記（２２）記載のグ
リシニン生産植物の育種増殖方法。

（２４）ナス科植物がタバコであることを特徴とする上
記（２３）記載のグリシニン生産植物の育種増殖方法。

（２５）ナス科植物がバレイショであることを特徴とす
る上記（２３）記載のグリシニン生産植物の育種増殖方
法。

（２６）グリシニン生産植物が禾本科植物のグリシニン
生産植物であることを特徴とする上記（２２）記載のグ
リシニン生産植物の育種増殖方法。

（２７）禾本科植物がイネであることを特徴とする上記
（２６）記載のグリシニン生産植物の育種増殖方法。

以下に本発明の詳細な説明する。

ｉ、大豆からグリシニン遺伝子のｍＲＮＡを取得する工
程は特公昭６３−５６７９９号公報に示すように行なう
。具体的には、本発明のｍＲＮＡは、ダイズ貯蔵タンパ
ク質に対応し、ショ糖密度勾配遠心法やゲル濾過法によ
る分画ならびにアガロース電気泳動法により１８５より
やや重い分画として得られるものであり、このｍＲＮＡ
はダイズ種子より抽出分離することによって製造できる
。本発明に用いるｍＲＮＡの材料としては種々の過程、
たとえば全熟期にあるダイズ種子を使用できる。

ダイズ種子よりダイズ貯蔵タンパク質に対応するｍＲＮ
Ａを抽出するには、種子の種類を問わず常法によって行
なえばよい。たとえば組繊を２〜５容のＮＰ−４０，Ｓ
ＤＳ、　Ｔｒｉｔｏｎ−１００などの界面活性剤とフェ
ノール溶液を混合してホモゲナイザーや凍結融解などの
物理的方法を用いて細胞を破砕、可溶化し、遠心した後
の上清に冷エタノールを加えてＲＮＡを沈澱させる。

また、必要に応じてダイズ貯蔵タンパク質に対する抗体
を用いてダイズ貯蔵ダンバク質合成途上のポリゾームを
沈降させ、これによりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出
する方法を行なうことができる。

また、ｍＲＮＡの精製については、オリゴｄＴ−セルロ
ース、ポリローセファロースなどの吸着カラムによる精
製法、等速（ｉｓｏｋｉｎｅｔｉｃ）なショｔＪＭ密度
勾配遠心法による分画等によって行なうことができる。

このような精製操作によってｍＲＮＡは１８Ｓよりやや
重い両分として得られる。

上記のようにして得られたｍＲＮＡが目的とするダイズ
貯蔵タンパク質に対応するものであることを確認するた
めには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させ、その抗体等
を用いてそのタンパク質を同定する等の方法−を行なえ
ばよい。たとえばｍＲＮＡを翻訳するのによく用いられ
る系である網状赤血球ライゼート（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃ
ｙｔｅ−１ｙｚａｔｅ）　、コムギ胚芽（Ｗｈｅａｔ　
ｇｅｒｍ）などの無細胞系でタンパク質に翻訳させるこ
とが行なわれる。

ｉｉ　、前記ｍＲＮＡに基づいてそのｃＤＮＡを作出す
る工程は、特公昭６３−５６７９９号公報に示すように
行なう。

このようなｃＤＮＡの合成は通常、試験管内で次のよう
な方法で行なうことができる。ｍＲＮＡを鋳型としてオ
リゴｄＴをブライマーとしてｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰの存在下で逆転写酵
素によりｍＲＮＡと相補的な単鎖ｃＤＮＡを合成し、ア
ルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解・除去した後、オリゴ
ｄＣを付加し、次いでオリゴｄＧをプライマーとして単
鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵素あるいはＤＮＡポリ
メラーゼを用いて二重１ＪｃＤＮＡを合成する。このよ
うにして得られたＤＮＡ両端を必要によりエキソヌクレ
アーゼで処理し、それぞれに適当なりＮＡを接続しある
いはアニーリング可能な組合わせの塩基を複数個重合さ
せる。

ｉｉ、植物用プラスミド 植物用プラスミドを適当な制限酵素で切断し、必要によ
り適当なリンカ−またはアニーリング可能な組み合わせ
の塩基を複数個重合させる。このように加工した植物用
プラスミドと両端を適当に加工した前記二重鎖ｃＤＮＡ
とベクターＤＮＡを混合し、リガーゼを用いて接続する
。

植物用プラスミドとしてはｐＬＧＶｎｅｏ１１０３　（
２”ＢＩＮ”、　ｐＧＡ４７１”’、　ｐＭＯＮ５０５
”）等ヲ利用ｉルことができる。これらは植物の形質転
換用ベクターとして使用できる。

本発明で使用できるプロモーターは、これまでに単離さ
れているあらゆるプロモーターを使用することが出来る
。具体的には、リブロース−１，５ニリン酸カルボキシ
ラーゼ小サブユニツトをコードする遺伝子のプロモータ
ー１）、ホルデインＢ１をコードする遺伝子のプロモー
ター３９ゝ、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓをコ
ードする遺伝子のプロモーター（Ｉｏ）等を利用できる
。

本発明で使用できるターミネータ−は、これまでに単離
されているあらゆるターミネータ−を使用することがで
きる。具体的には、ツバリン合成酵素のターミネータ−
（目１．オクトビン合成酵素のターミネータ−（″）等
を利用することができる。

上記グリシニンｃＤＮＡ、プロモーターおよびターミネ
ータ−からなるキメラ遺伝子は少なくともプロモーター
の下流にダイズグリシニンｃＤＮＡが連結されているこ
とが必要である。

ｉｖ、前記組換えプラスミドを所望の植物細胞に導入す
ることにより、該植物細胞を形質転換する工程は次のよ
うに行なう。

前記組換えプラスミドを少なくとも再生可能な植物体に
おいては、これを導入し、発現させることができる。

前記組換えプラスミドを所望の植物細胞に導入する方法
としては、エレクトロポレーシゴンにより行なう方法１
１″′）、アグロバクテリアを介した方法（７）、マイ
クロインジェクションによる方法０等があげられる。

再分化方法については、プロトプラストからの再分化、
あるいはリースディスク３７）、チューパーディスク（
１５）等からの再分化が可能である。

以下、実施例として、禾本科植物としてイネ、ナス科植
物としてタバコ、バレイショを挙げるが本発明はこれら
に限定されるものでなく、禾本科植物、ナス科植物に属
する他の植物にも同様に適用できる。

実施例　１　タバコの例−１ イ、グリシニン遺伝子の取得工程 特公昭６３−５６７９９号に示すようにしてグリシニン
遺伝子を取得した。登熟中期（開花後３８日目）のダイ
ズ子葉からｍ　ＲＮ　Ａを調製し、この全ｍＲＮＡ標品
をショ糖密度勾配遠心法により分画し、赤血球無細胞タ
ンパク合成系における翻訳産物の免疫化学的解析でグリ
シニンｍＲＮＡ濃縮画分を同定した。特公昭６３−５６
７９９号に従ってｄｓ−ｃＤＮＡを合成し、Ｐｓｔｌ切
断３′末端オリゴｄＧ付加ｐＢＲ３２２に組込み、大腸
菌ＲＲ１（ＤＲＬ社製、カタログＮｏ、８２６１−３八
）に形質転換した。

グリシニンｍＲＮＡ濃縮画分からの３２ｐ標識プローフ
ヲ使い、コロニーハイブリダイゼーションによってグリ
シニンのクローンを選び、構造を解析した。

口０組換えプラスミドの構築工程 （１）　　グリシニンＡ２ＢｌＩＣＤＮＡの加エイで取
得した遺伝子をＰｓｔｌで切断し、ＡＪ＋−ｃＤＮＡ断
片を得た。このＤＮＡ断片５μｇにＢａ１３１　（Ｔａ
ｋａｒａ社製）１ユニツトを用いて２５°Ｃで０゜０．
５，１．０．１．５．２．０．２．５．３．５．４．５
．６．０．８．０゜１０分間反応させプリージョンを作
った。上記反応液の一部をアガロース電気泳動でチエツ
クした後、０分間、０．５〜２．５分間、３．５〜１０
分間反応させたものについて、ＤＮＡポリメラーゼ■ラ
ージフラグメント　（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて末端
をプラントエンドとした。前記ＤＮＡにＰｓｔＩリンカ
−（Ｔａｋａｒａ社製）を結合し、Ｐｓｔｌで切断した
後、このＤＮＡをｐＵｃ１９のＰｓｔ１部位にクローニ
ングした。こうして得られたグリシニンＡ、Ｂ、、　ｃ
　Ｄ　ＮＡプリージョン断片が、＃３．　＃１１３．　
ｊｌ１２９．舅１４２であり、これらの５′末端側と３
′末端側の塩基配列は第２図に示すとおりである。

（２）　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ導入ベクターの調製カリフラ
ワーモザイクウィルス３５３プロモーターを含むプラス
ミドｐＣａＰ３５Ｊ　”　’ゝをＨｉｎｄＩ［で切断し
、ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（Ｔａｋａ
ｒａ社製）を用いて、末端をプラントエンドとした。一
方、ツバリン合成酵素（以下ｎｏｓと表す）を含むプラ
スミドｐＢＩ　１０１　（Ｃ１ｏｎ　ｔｅｃｈ社製）か
らｎｏｓのターミネータ−断片を得、ＤＮＡポリメラー
ゼＩラージフラグメントを用いて、末端をプラントエン
ドとし　前述プラスミドとライゲーションを行ない、３
５３プロモーター＋　ｎｏｓターミネータ−のカセット
プラスミドを作成した。

（３）組換えプラスミドｐＫＢｃＧＡＮの作成（１）で
作成したＤＮＡ断片を（２）で作成したカセットプラス
ミドのＰｓｔｌサイトに組込み、プラスミドｐＫＢＣＧ
Ａを得た。あるいは、（１）で作成したＤＮＡ断片をプ
ラスミドｐＣａＰ３５ＪのＰｓｔｌサイトに組込み、プ
ラスミドｐＫＢＣＧを得た。このプラスミドは前記ｐＫ
ＢｃＧＡＮのうちｎｏｓターミネータ−断片を除いたも
のである。このプラスミドをＰｖｕ　Ｕ　（Ｔｏｙ。

ｂｏ社製）で切断し、３５３プロモーター＋グリシニン
八、Ｂ、、　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋ｎｏｓターミネーター
断片あるいは、３５Ｓプロモーター＋グリシニンＡ２Ｂ
１ａ　ＣＤ　ＮＡ断片を得た。一方、中間ベクターρＬ
ＧＶｎｅｏ１１０３をＡｐａ　Ｉで完全分解したのち、
ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントを用いて、末
端をプラントエンドにし、ｐＬＧＶｎｅｏ１１０３断片
と、前記の３５３プロモ一ター＋グリシニン八Ｊａｍ　
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋ｎｏｓターミネーター断片あるいは
、３５Ｓプロモーター＋グリシニンＡｚＢ＋ｉ　ｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａ断片とを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｔａ
ｋａｒａ社製）を働かせた後、大腸菌Ｃ６００に形質転
換して、植物体にグリシニンｃＤＮＡを組込むための組
換えプラスミドｐＫＢＣＧＡＮあるいはｐＫＢＣＧＮ　
（ｐＫＢＣＧＡＮにおいてｎｏｓターミネータ−断片を
除いたもの）を得た。

以上の組換えプラスミドの構築過程及び組換えプラスミ
ドｐＫＢＣＧＡＮの構造を第１図に示す。

ハ０組換えプラスミドｐＫＢＣＧＡＮ　（あるいはｐＫ
ＢＣＧＮ）のアグロバクテリウムへの導入 組換えプラスミドｐＫＢＣＧＡＮを接合によりアグロバ
クテリウムに移し、Ｔｉプラスミドベクターに組換えプ
ラスミドｐＫＢＣＧＡＮ（あるいはｐＫＢＣＧＮ）を組
込んだ。組換えプラスミドｐＫＢＣＧＡＮを持つ大腸菌
Ｃ６００と、ヘルパープラスミドを持つ大腸菌ＧＪ２３
株との培養液を等量ずつ混合し、抗生物質の入っていな
い培地上に３７°Ｃ２時間保ったのち、アンピシリン（
シグマ社製）　（１００μｇ／ｍｊ）　、カナマイシン
（和光純薬社製）（２５μｇ／ｍ／）　、テトラサイク
リン（シグマ社製）（１０μｇ／ｎ／）の入った培地上
にまいて、組換えプラスミドｐＫＢＣＧＡＮ　（あるい
はｐＫＢＣＧＮ）とヘルパープラスミドの双方を持つ大
腸菌を選択した。次に、この大腸菌の培養液と、腫瘍形
成遺伝子が除去された改変ＴｉプラスミドベクターｐＧ
Ｖ３８５０を持つアグロバクテリウム、チュメファシエ
ンスＣ５８ＣＩ　Ｒ３ｆ’株の培養液とを等量ずつ混合
し、抗生物質の入っていない培地上で３７°Ｃ２時間、
ついで２８°Ｃに一夜保ったのち、リファンピシン（シ
グマ社製）　（１００μｇ／ｎｌ）とカナマイシン（２
５ｕ　ｇ／−）とを含む培地上にまき、ｐＧＶ３８５０
に組換えベクターｐＫＢＣＧＡＮ　（あるいはｐＫＢＣ
ＧＮ）を組込んだプラスミドを持つアグロバクテリウム
を選択した。

二、タバコ細胞への導入および再分化 タバコへの導入には、リーフディスク法を用いた。タバ
コ　（品種サムスン）の葉を直径１ｃｍの円形に打ちぬ
き、これをｐＧＶ８８５０　ニｐＫＢＣＧＡＮ（あルイ
はｐＫＢｃＧＮ）に組込んだプラスミドを持つアグロバ
クテリウムの培養液中に浸した。数分後に引き上げ、抗
生物質を含まないＭｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ（Ｍ
、Ｓ）培地（１？ｌ　（第１表）上に４８時間おいた後
、カナマイシン（１００μｇ／ｍ／）とタラフォラン（
ヘキストジャパン）　（５００μｇ／ｍＺ）を含むＭ、
Ｓ培地（ホルモン；ベンジルアデニン１μｇ／＋ｎ／、
ナフタリン酢酸０．１μｇ／−）上に置いて、２５°Ｃ
（１６時間接期、８間接暗期）でインキュベートした。

抗生物質のうちカナマイシンは形質転換植物を選択する
ため、また、クラフオランはアグロバクテリウムを殺菌
するためである。３〜４週間後、葉片の周辺部にカルス
が形成された。このカルス、タバコＥｌｆ　胞ＫＢｃＧ
ＡＮＬ１３１５は工業技術院微生物工業技術研究所（以
下、微工研という）に微工研条寄第２１７７号として寄
託されている。次いでこのカルスから不定芽が誘導され
る。この不定芽を切り取り、ホルモンを含まないＭ、Ｓ
培地（抗生物質は上と同様）に移して、上記と同じ条件
下に保った。約２週間後に発根してくる植物体を形質転
換タバコ植物体とした。

ホ、上記二の工程で得た植物体でのグリシニン発現の確
認 上記のようにして得た形質転換植物体のゲノムＤＮＡ中
にサザン分析法″８′によりグリシニンＣＤＮＡが１コ
ピーから数コピー組こまれていることを確認した。この
結果は第３図に示す通りである。

第３図において、ｌｃ、５ｃはそれぞれグリシニンＡ２
ＢＩｍ　ＣＤ　ＮＡのコピー数を表し、１〜６は独立に
得た形質転換体を表す。プローブはα”　Ｐ−ｄＣＴＰ
で標識したグリシニンＡ、Ｂ、、ｃＤＮＡ断片を用いた
。コピー数を調べるために組換えプラスミドｐＫＢｃＤ
ＡＮ１１３をＰｖｕ　Ｔｌを切断したものを使いコント
ロール及び形質転換体からのＤＮＡもＰｖｕ　Ｉｆで切
断した。なお、第３図において矢印はグリシニン遺伝子
の位置を示す。また、ウェスタン分析法（＋９）により
、タバコ形質転換植物体においてタンパク質を確認した
。この結果は第４図に示す通りである。

第４図において、コントロールの葉ではグリシニンＢに
対する抗体に特異的に反応するものは見られない。また
、形質転換体の葉でグリシニンＢに対する抗体にわずか
に反応するもの、強く反応する６２ＫＤのｕｎｐｒｏｃ
ｅｓｓｅｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅがみられる。

その発現率は全タンパク質の約０．２％程度であった。

実施例　２　タバコの例−２ （１）　　タバコ葉肉プロトプラストの単離法タバコ葉
肉プロトプラストは、無菌的に培養しているタバコＮ１
ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ、　Ｌ、　ｃｖ、　”
ＰｅｔｉｔＨａｖａｎａ”　５Ｒ−１または、Ｎ１ｃｏ
ｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ、　Ｌ、　ｃｖ。

°“Ｓａｍｓｕｎ　”“の試験管内幼植物個体より単離
した。

すなわち、タバコ種子を７０％エタノールに３０秒、１
％次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０〜１５分間浸し滅菌
した後に、滅菌水で３回洗い、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆
Ｓｋｏｏｇの基本培地（Ｍ、Ｓ培地ν２０）（第１表）
上で発芽させ、発芽後１〜２週間目の幼植物の先端部を
切りとり新しいＭ、Ｓ培地に植えかえて植物体を成長さ
せた。

充分に展開した葉を切り取り葉脈に沿って切れ目を入れ
Ｎａｇａｔａ　Ａ　Ｔａｋｅｂｅの培地（Ｎ、Ｔ培地）
（第２表）に、１．４％セルラーゼオノズカＲ−１０（
ヤクルト本社）と０．４マセロザイムＲ−１０（ヤクル
ト本社）を溶かし、ｐＨを５．７に調整した酵素溶液に
浮かべ、２６°Ｃ暗所で一晩静置してプロトプラストを
単離した。プロトプラストは、３００μｍのナイロンメ
ツシュで濾過し、濾液に５０ｍＭ塩化カルシウムを含む
０．０５％ＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉ
ｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）　（
ｐ　Ｈ５，８）を加え、５００Ｘｇで５分間遠心分離を
行なった。プロトプラスト層より細胞を回収しもう一度
ＭＥＳ緩衝液を同量加え遠心分離処理を行い細胞を洗浄
した。プロドプラ７ストを０．５Ｍマニトール溶液に懸
濁し細胞数を測定後実験に用いた。タバコ葉肉プロトプ
ラストはＮ、Ｔ培地に懸濁して２６°Ｃ暗所で培養した
。

第１表　Ｍ、　Ｓ培地 Ｈ４ＮＯ３ Ｎ０ｊ ＣａＣ１ｚ・２ＨｚＯ ＭｇＳＯａ−７Ｈ２Ｏ Ｋ）１２Ｐｏ。

ＦｅＳＯ４４ＨｚＯ Ｎａｚ・　ＥＤＴＡ ３ＢＯ３ ＺｎＳ０４４ＨｚＯ ＭｎＳＯｎ・４８ｚＯ Ｋｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２ＥＩｚＯ ＣｕＳＯ４・５ＨｔＯ ＣｏＣ１ｚ・６ＨｚＯ １６５０■７２ ９００ｍｇ＃！ ４４０■／１ ３７０■／１ １７０■／１ ２７．８■／１ ３７．３■／２ ６．２■７２ ８．６■／１ ２２．３■／２ ０．８３■／Ｉ！。

０．２５ｍｇ／　１ ０．０２５■／１ ０．０２５■／Ｉ１ ｍ−１ｎｏｓｉｔｏｌ Ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣＩ Ｐｙｒｉｄｏｘｌｌｍ−１ｎｏ ｓｉｔｏｌＴｈｉａ　　ａｃｉｄ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｂａｃｔｏ　　ａｇａｒ ｐＨ 第２表　Ｎ。

Ｎ１（ａＮＯ３ ＮＯ３ ＣａＣ１ｚ・２ＨｚＯ ＭｇＳＯｌ・７Ｈ２０ ＫＨ２ＰＯ。

ＦｅＳＯ４４ＨｚＯ Ｎａｚ・　ＥＤＴＡ ＪＯ３ ＺｎＳＯ４・７ＨｚＯ ＭｎＳＯ４−４Ｈｚ０ １００■／１ Ｏ０１■／１ ０．５■／ｊ！ ０．５■／１ ２ｍｇ／１ ３％ ０．８％ ５．８ Ｔ培地 ８２５ｍｇ＃！ ９５０■／ｐ ２２０■／Ｉ！。

１２３３■／２ ６８０■／１ ２７．８■／！ ３７．３■７２ ６．２ｍｇ／Ｉ！。

８．６■／！ ２２．３■／！ Ｋｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，８
３■／２ＮａｚＭＯＯ４・２ＨｚＯ０，２５ｍｇ／　ｉ
！。

Ｃｕ５０４−５ＨｚＯ０，２５ｍｇ／　ｌＣｏＣ１ｚ・
６ＨｚＯｏ、ｏ３■／λ ｍ４ｎｏｓｉｔｏ１　　　　　　　　　　１００ｍｇ／
　ＩＴｈｉａｍｉｎ−ＨＣＩ　　　　　　　　　　　　
　　　　１ｍｇ／　ｌ５ｕｃｒｏｓｅ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１％Ｄ−ｍａｎｎｉｔｏ１　
　　　　　　　　　　　　　　　０．６ＭＮＡＡ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１■／１６−Ｂ
ＡＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１■７１ｐＨ５，８ （２）エレクトロポレーションによる遺伝子導入と形質
転換体の選抜 エレクトロポレーションは特開昭６２−２２８２７７号
で述べた装置を用いて行い、細胞へのダメージが少なく
、遺伝子の導入効率の良い条件をＴＭＶ−ＲＮＡを用い
て決定した。ＤＮＡの導入に関してはＴＭＶ−ＲＮＡの
条件を基に、１０μｇ　ノｐＣＧＡＮ３゜１１３、１２
９．１４２にキャリアーＤＮＡとしテｓｏｕｇのウシ細
胞由来ＤＮＡを用いて行なった。形質転換クローンの選
抜は、プラスミドＤＮＡ中にコードされているマーカー
遺伝子を利用する、抗生物質Ｇ４１８とＧ４１８を分解
する酵素ＮＰＴ−１１の組み合わせによる方法で行なっ
た。すなわち、エレクトロポレーション処理を行なった
プロトプラストを培養し、数１０細胞のコロニーにまで
増殖させた後に５μｇ／−の濃度でＧ４１８を含むＮ、
　Ｔ培地で選抜を行なった。エレクトロポレーションの
条件も特開昭６２−２２８２７７号に従って行ったが、
電位勾配を５００Ｖ／Ｃ１１１、細胞密度を５Ｘ１０’
個／ｍｌに改変した条件が良かった。

（３）カルスからの植物体再生 タバコ・カルスからの植物体再生はＮａｇａ　ｔａらの
方法（Ｎａｇａｔａ　Ｔ、　＆　Ｔａｋｅｂｅ　１．１
９７Ｌ前出）に従った。すなわち、数胴にまで増殖した
コロニーをＭ、Ｓ培地に植物成長物質として４ｍｇ／ｌ
のインドール３−酢酸（以下ＩＡＡと略す）と２．５６
■／ｌのカイネチンを加えた培地で培養し不定芽を分化
させ、それを切り取りホルモンを含まないＭ、Ｓ培地に
移し、根を分化させ、植物個体を得た。

（４）植物体でのグリシニン発現の確認グリシニン、タ
ンパク質の検出は、Ｔｉの例と同様に、ウェスタンブロ
ッティング法を用いて行った。この結果は、第７図及び
はちずに示す。

第７図において、コントロールの葉、種子ともに、抗グ
リシニンＡ抗体と特異的に反応するものは見られないが
、形質転換植物の葉、茎、根（種子にもわずか）　ｕｎ
ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　ｔｙｐｅの６２ＫＯ，タンパクが
見られる。種子には、プロセスされたグリシニンＡが見
られる。

第８図において、コントロールの葉、種子ともに、抗グ
リシニンＢ抗体と特異的に反応するものは見られないが
、形質転換体の茎、根（種子と葉ではわずかに）で６２
ＫＤのｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄタンパクが見られる。種
子、茎、根（わずか）プロセスされたグリシニンＢが見
られる。

実施例３　バレイショの例 イ、バレイショ細胞への導入および再分化グリシニン遺
伝子のバレイショへの導入は、チューパーディスク法（
９）を用いた。バレイショ（品種　男爵、メークイン、
農林−号、紅丸、デジマ等）の塊茎の皮をむき、数滴の
ツウィーン２０を含む１％次亜塩素酸ソーダ溶液で５分
間殺菌し、殺菌蒸留水で３〜４回洗った。この塊茎ある
いは無菌的に培養したマイクロチューバーから殺菌した
コルクポーラ−で約１　ｃｍの円柱を打ち抜き、２〜３
薗の厚さのディスクに切り、実施例１で作成したｐＧＶ
３８５０　ニｐＫＢＣＧＡＮ　（あるいは、ｐＫＢＣＧ
Ｎ）を組込んだプラスミドを持つアグロバクテリウムの
培養液中に浸した。数十秒後にパイレショカルスから誘
導した懸濁培養液１ｒｒｉをフィーダーとしたＭ、Ｓ修
正培地（２％ショ糖、インドール酢酸０．１μｇ／−、
ゼアチン１μｇ／ｍＯ上に４８時間置床した後、フィー
ダを除き、カナマイシン（１００μｓ／ｍ／）とクラフ
ォラン（５００μｇ／ｍ／）を含むＭ、Ｓ修正培地（ホ
ルモンは上と同じ）上に置いて、２５°Ｃ（１６時間明
朗、８間接暗期）でインキュベートした。３〜４週間後
、ディスク表面からカルスが形成され、不定芽が誘導さ
れたし、直接不定芽が形成される場合もあった。この不
定芽を切り取り、ホルモンを含まないＭＳ培地（抗生物
質は上と同じ）条件下に保った。１〜２週間後に発根し
てきた植物体を形質転換バレイショ植物体とした。

口、上記イの工程で得た植物体でのグリシニン発現の確
認 上記のようにして得た形質転換植物体をサザン分析法に
より解析し、グリシニンのｃＤＮＡが数コピーから数十
コピー組込まれていることを確認した。この結果は、第
５図に示す通りである。

第５図において、Ｉ　Ｃ，５Ｃ，１０ｃはそれぞれグリ
シニンＡＪ＋ｍ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのコピー数ヲ表し、１
〜５は独立に得た形質転換体を表す。プローブはｔｘ　
−”　Ｐ−ｄＣＴＰで標識したグリシニンＡ２Ｂ＋、ｃ
ＤＮＡ断片を用いた。コピー数を調べるために組換えプ
ラスミドｐＫＢｃＤＡＮ１１３をＰｖｕ　ＩＩを切断し
たものを使いコントロール及び形質転換体からのＤＮＡ
もＰｖｕ　ＩＩで切断した。なお、第５図において矢印
はグリシニン遺伝子の位置を示す。またウェスタン分析
法によりバレイショ形質転換植物体の葉、茎、塊茎のい
ずれにもタンパク質が発現していることを確認した。こ
の結果は第６図に示す。

第６図において、コントロールの塊茎では、グリシニン
Ｂに対する抗体に特異的に反応するものは見られない。

形質転換体の塊茎でグリシニンＢに対する抗体に特異的
に反応する６２ＫＤのｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　ｐｏｌ
ｙｐｅｐｔｉｄｅが見られる。グリシニンの発現を確認
したカルス（バレイショ細胞ＫＢＣＧＮ１１３−１　）
は微工研に微工研条寄第２１７６号として寄託されてい
る。

実施例４　イネの例 イ、イネ・プロトプラストの単離 イネ・プロトプラストは、懸濁培養細胞より単離した。

すなわち、イネ種子をタバコ同様に滅菌し、２　ｐｐｍ
の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を含むＭ、Ｓ培地（
第１表）上におき、根や芽が伸びて来たら、それらを切
り取って除き、培養し、カルスを誘導させる。カルスを
アミノ酸をＮ源としたＡ、　Ａ溶液培地（第３表）に植
えなおし、懸濁培養細胞を調製する。Ａ、Ａ培地で継代
培養を２〜３カ月行い、成長することを確認した懸濁培
養細胞から、プロトプラストを単離した。細胞を１０１
０００Ｘ　２分の遠心で集め、０．４門マニトールに懸
濁し、再び遠心し、細胞を洗浄した。細胞を２％セルラ
ーゼオノズカＲＳ、０．１％ペクトリアーゼＹ２３及び
０．５％硫酸デキストラン・カリウム（重合度２〜３）
を含む０．４Ｍマニトール溶液（ｐＨ５，５）中に懸濁
し、３０°Ｃで、１時間処理し、プロトプラストを単離
した。２０分ごとにピペッティングし、プロトプラスト
の遊離を促した。懸濁液を７０．３０．２０μｍのナイ
ロンメツシュで濾過し、プロトプラストを分離精製した
。ｌｏｏｏｘｇ、２分の遠心でプロトプラストを集め、
０．４Ｍマニトールに懸濁した。

プロトプラストはＲ−２０にの（第４表）培地に懸濁し
て培養した。

口、エレクトロポレーション エレクトロポレーションは、特開昭６２−２２８２７７
号に従って行った。ただし、用いたＤＮＡは前述したプ
ラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｐＫＢＣＧＡＮの、カナマイシン
耐性遺伝子部分をハイグロマイシン耐性遺伝子に置き換
えたちの１０μｇとウシ胸腺由来ＤＮＡ５０μεを混合
し、用いた。

ハ、形質転換体の選抜 イネ・コロニーが、数１０細胞まで増殖したら、培地中
に４０μｇ／ｍの濃度でハイグロマイシンを入れ、１力
月培養し、その後、改変Ｍ、Ｓ培地（第５表）に埋め込
むと、耐性クローンが１０−４〜１０−５のヒン度で得
られた。

第３表　Ａ、　Ａ培地 ＣａＣ１ｚ４ＨｚＯ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ Ｋｌ（、ＰＯ。

Ｃｌ ＦｅＳＯ４−７ＨｚＯ Ｎａｚ・　ＥＤＴ＾ Ｈ，ＢＯ。

ＺｎＳＯＺｎＳＯ４ ４ＨｚＯ，・４ＨｚＯ Ｉ ＮａＪｏ０４・２ＨｚＯ ＣｕＳＯ，・５Ｈ，０ ４４０■／１ ３７０■／Ｐ １７０■／！ ２９３９ｍｇ／　１ ２７．８■／１ ３７．３■／！ ６．２ｍｇ／４２ ８．６■／ｉ！。

２２．３■／ρ ０．８３■／１ ０．２５■）１ ０．０２５■／２ ＣｏＣ１ｚ・６ＨｚＯ ｍ４ｎｏｓｉｔｏｌ Ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣＩ Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣＩ Ｎｉｔｏｔｉｎｉｃ　　ａｃｉｄ ２．４−Ｄ ＫｉｎｅＬｉｎｅ Ａ３ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ａｓｐａｒｔｉｃ　　ａｃｉｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｓｕｃｒｏｓｅ ｐＨ 第４表　Ｒ （ＮＨ４）　ｚｓＯａ Ｎ０３ ＣａＣ１ｚ・２ＨｚＯ ＭｇＳＯｎ・７Ｈ２０ ０，０２５■／１ ２０■７２ ０．２■７１ ０．１■／１ ０．５■／２ １ｍｇ／４２ ０．２■／！ ０．１■／１ ８７０ｍｇ＃！ ２７０■／２ １７０■／！ ７■／１ ２％ ５．８ ２０に培地 ３７０■／２ ３９９０■／２ １４５．２■／！ ２４４．２■／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ Ｆｅ５０．．７Ｈ２Ｏ Ｎａｚ−ＥＤＴＡ ３ＢＯ３ ＺｎＳＯａ４Ｈｚ０ １’Ｉｎ５Ｏｎ・４１１ｚＯ ＮａＪｏＯａ−２ＨｚＯ ＣｕＳＯ４・５ＨｚＯ ｍ４ｎｏｓｉｔｏｌ Ｔｈｉａｍｉｎ　・ＨＣＩ Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣＩ Ｎｉｔｏｔｉｎｉｃ　　ａｃｉｄ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｓｕｃｒｏｓｅ ２、　４−Ｄ ＳｅａＰｌａｑｕｅ　　Ａｇａｒｏｓｅｐ）Ｉ ３７０■／１ ５５．６■７１ ７４．６ｍｇ／ｆｆ１ ０．５■／ｉ！。

０．５■／１ ０．５■／ρ ０．０５ｍｇ＃！ ０．０５■／１ １００ｍｇ／１ ０．１■／！ ０．５ｍｇ＃！ ０．５ｍｇ＃！ ２■７２ ０．４Ｍ ２ｍｇ／β ０．６％ ５．６ ＨＪＯｉ 第５表　改変Ｍ、Ｓ培地 １６５０■／１ ＫＮＯ：ｌ ＣａＣ１ｚ・２ＨｚＯ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ＫＨ，ＰＯ４ ＦｅＳＯ４４ＨｚＯ Ｎａｚ＝　　ＥＤＴＡ Ｈ３ＢＯ。

ＺｎＳＯｎＺｎＳ ０ｎ４ＨＪ・４ＨｚＯ Ｉ ＮａｚＭｏＯ４・２ＨｚＯ ＣｕＳＯ４・５ＨｚＯ ＣｏＣ１ｚ・６ＨｚＯ ｍ−１ｎｏｓｉｔｏｌ Ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣＩ Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−１（ＣＩ Ｎｉｔｏｔｉｎｉｃ　　ａｃｉｄ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉｎｅｔｉｎ Ａｂｓｃｉｓｉｃ　　ａｃｉｄ １９００■／１ ４４０■／１ ３７０■／Ｉ！。

１７０■／！ ２７．８■／１ ３７．３■７２ ６．２■７２ ８．６■７２ ２２．３■７２ ０．８３■／２ ０．２５■７２ ０．０２５■／ｊ２ ０．０２５■／λ ３００■／１ ５６１■／ｌ Ｏ，５■７１ ０．５■／１ ２■／１ Ｏ０５■／Ｉ！。

０．１■／１ ２−　［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｌ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　　　　　　
　　　　　Ｏ，２％５ｕｃｒｏｓｅ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　３％Ａｇａｒ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｏ，８％ｐＨ５，８ 二、イネ・カルス中でのグリシニン発現の確認イネ・カ
ルス中でのグリシニンの発現は前述したタバコ同様にウ
ェスタンプロット法により行った。イネ・カルスより全
タンパク質を抽出し、ウェスタンプロットにより抗グリ
シニンＢａ５ｉｃｓｕｂｕｎｉｔ抗体と反応するタンパ
ク質を検出することができた。この結果は第９図に示す
通りである。

第９図において、コントロール、（日本晴カルス）、形
質転換カルス１，３からは抗グリシニンＢ抗体と反応す
るタンパク質は検出されないが、形質転換カルス２、及
び４からは抗グリシニンＢ抗体と反応し、グリシニンＢ
と同じ分子量のタンパク質が検出された。このイネ・カ
ルス（日本晴Ｓ、Ｓ−００１）は微工研に微工研条寄第
２１７５号として寄託されている。

（１）Ｆｕｋａｚａｗａ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、（１９８５
）　　；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６０．６２３４−６２３９゜ （２）　　Ｍｏｍｍａ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）
　；Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１４９．４９１−４９６゜ （３）　　Ｍａｍｍａ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）
　；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　　１９゜１１７−１２２
１゜ （４）　　Ｎｅｇｏｒｏ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５
）；　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１３．６７１９−６７３１゜ （６）　　Ｆｒｏｍｍ　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）
；　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　８２．　５８２４−５８２８　
　。

（７）　　Ｈｏｒｓｃｈ　　Ｒ，Ｂ　ｅｔ　ａｌ、（１
９８５）；　　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７゜１２２９−１
２３１゜ （８）　　Ｆｌｕｈｒ、Ｒ，、Ｃｈｎａ、Ｎ、−Ｈ，（
１９８６）；　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．２３５８−２３６２
（９）Ｆｏｒｄｅ　ＢＧ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）；
　　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１３．７３２７−７３３９ （１０）　　Ｇｕｉｌｌｅｙ、　　ｅｔ　ａｌ、（１９
８２）；　Ｃｅ１ｌ　　３０．　７６３−７７３（１１
）　　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　Ａ、、　　ｅｔ　ａｌ、（１
９８２）；　　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎ、１，５６１−５７３ （１２）　　Ｇｉｅｌｅｎ　　Ｊ、、　　ｅｔ　ａｌ、
（１９８４）；　　ＥＭＢＯＪ、３．　８３５−（１３
）Ｆｒｏｍｍ　Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）；　　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８２．　５Ｂ２４−５８２８（１４
）　　Ｃｒｏｓｓｗａｙ　Ａ、＋　　ｅｔ　ａｌ、（１
９８６）；　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ２０２．１７
９ｌ７９− １８５（１５）Ｓｈｅｅｒ　Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、（１９
８８）；　　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ　７
．　１３−１６ １３−１６（１６）Ｙａ　Ｊ、、　　ｅｔ　ａｌ、（１
９８８）；　　Ｍｏｌ　　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ２１Ｌ　
　５２０−５２５ （１７）　　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ、　　Ｔ、　　＆　Ｆ
、Ｓｋｏｏｇ（１９６２）；　　Ｐｈｙｓｉｏ−１ｏｇ
ｉａ　Ｐｌｏｎｔａｒｔｕｍ　１５＋　　４７３−４７
７（１Ｂ）　５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｎ、（１９７５
）；Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９８゜（１９）高倍昭
洋（１９８７）　；蛋白質核酸酵素、別冊Ｎα３０．１
８６−１９０ （２０）　Ｎａｇａｔａ　Ｔ、　ａｎｄ　１．　Ｔａｋ
ａｂｅ（１９７１）；　Ｐｌａｎｔａ９９、１２ （２１）　Ｈａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　；Ｍ
ｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１９９゜１６１−１６８
゜ （２２）　Ｂｅｖａｎ＋　Ｍ　（１９８４）　；Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２゜８７１１−８
７２１゜ （２３）　Ａｎ　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）；Ｅ
ＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４．　２７７２８４゜ （２４）　　Ｈｏｒｓｃｈ、　　Ｒ，、Ｋｌｅｅ、　　
ＩＩ　　（１９８６）　；　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、八、　　８３．　
４４２８−４４３２゜〔発明の効果〕 本発明によれば、ダイズグリシニンを形質転換させた植
物体に産生させることができる。このことにより、作物
のアミノ酸組成が変わりが該作物の栄養価が改善され、
あるいはその香味が改善される。

【図面の簡単な説明】

第１図は植物体にグリシニンｃＤＮＡを組込むための組
換えプラスミドを構築する過程を示す図、第２図はグリ
シニンＡｚＢ＋ｉ　ＣＤ　Ｎ　ＡのＰｓｔｌ断片からＢ
ａ１３１をつかって作成したプリージョンの５′末端側
と３′末端側の塩基配列を示す図、第３図はタバコ形質
転換体のサザン分析を示す図、第４図はグリシニンＢに
対する抗体を用いたタバコ形質転換体の葉におけるウェ
スタン分析を示す図、第５図はバレイショ形質転換体の
サザン分析を示す図、第６図はグリシニンＢに対する抗
体を持ちたいバレイショ形質転換体の塊茎におけるウェ
スタン分析を示す図、第７図はグリシニンＡに対する抗
体を用いたタバコ形質転換体のウェスタン分析を示す図
、第８図はグリシニンＢに対する抗体を用いたタバコ形
質転換体のウェスタン分析を示す図、第９図はグリシニ
ンＢに対する抗体を持ちたいイネ形質転換カルスのウェ
スタン分析を示す図である。 第　１　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グリシニン遺伝子を植物用プラスミドに組み込んで
   なる組換えプラスミド。 ２、植物用プラスミドがｐＬＧＶｎｅｏ１１０３である
   請求項１記載の組換えプラスミド。 ３、グリシニン遺伝子の上流に外来プロモーター、その
   下流に外来ターミネーターを連結したことを特徴とする
   請求項１記載の組換えプラスミド。 ４、グリシニン遺伝子が次のＤＮＡ配列（矢印ａからｂ
   ）を有するグリシニンサブユニット前駆体Ａ＿３Ｂ＿４
   である請求項１記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】 ５、グリシニン遺伝子が次のＤＮＡ配列を（矢印ｃから
   ｄ）有するグリシニンサブユニット前駆体Ａ＿５Ａ＿４
   Ｂ＿３である請求項１記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】 ６、グリシニン遺伝子が次のＤＮＡ配列（矢印ｅからｆ
   ）を有するグリシニンサブユニット前駆体Ａ＿２Ｂ＿１
   ＿ａである請求項１記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】 ７、グリシニン遺伝子が次のＤＮＡ配列（矢印ｇからｈ
   ）を有するグリシニンサブユニット前駆体Ａ＿１＿ａＢ
   ＿１＿ｂである請求項１記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】 ８、次の各工程からなるグリシニン生産細胞の創成方法
   。 ｉ、グリシニン遺伝子のｃＤＮＡを植物用プラスミドに
   組み込み組換え体プラスミドを得る工程。 ｉｉ、前記組換え体プラスミドにより所望の植物細胞に
   導入することにより、前記植物細胞を形質転換する工程
   。 ９、導入を、エレクトロポレーションにより行うことを
   特徴とする請求項８記載のグリシニン生産細胞の創成方
   法。 １０、導入を、アグロバクテリア属に属する微生物への
   導入を介して行うことを特徴とする請求項８記載のグリ
   シニン生産細胞の創成方法。 １１、グリシニン生産細胞がナス科植物のグリシニン生
   産細胞であることを特徴とする請求項８記載のグリシニ
   ン生産細胞の創成方法。 １２、ナス科植物がタバコであることを特徴とする請求
   項１１記載のグリシニン生産細胞の創成方法。 １３、ナス科植物がバレイショであることを特徴とする
   請求項１１記載のグリシニン生産細胞の創成方法。 １４、グリシニン生産細胞が禾本科植物のグリシニン生
   産細胞であることを特徴とする請求項８記載のグリシニ
   ン生産細胞の創成方法。 １５、禾本科植物がイネであることを特徴とする請求項
   １４記載のグリシニン生産細胞の創成方法。 １６、グリシニン遺伝子を導入することによって形質転
   換された、グリシニン生産能を有するグリシニン生産細
   胞から植物体を分化せしめることを特徴とするグリシニ
   ン生産植物の育種方法。 １７、グリシニン生産植物がナス科植物のグリシニン生
   産植物であることを特徴とする請求項１６記載のグリシ
   ニン生産植物の育種方法。 １８、ナス科植物がタバコであることを特徴とする請求
   項１７記載のグリシニン生産植物の育種方法。 １９、ナス科植物がバレイショであることを特徴とする
   請求項１７記載のグリシニン生産植物の育種方法。 ２０、グリシニン生産植物が禾本科植物のグリシニン生
   産植物であることを特徴とする請求項１６記載のグリシ
   ニン生産植物の育種方法。 ２１、禾本科植物がイネであることを特徴とする請求項
   ２０記載のグリシニン生産植物の育種方法。 ２２、グリシニン遺伝子を導入することによって形質転
   換された、グリシニン生産能を有するグリシニン生産細
   胞から植物体を分化せしめることによってグリシニン生
   産植物を育種し、ついで、これを増殖することを特徴と
   するグリシニン生産植物の育種増殖方法。 ２３、グリシニン生産植物がナス科植物のグリシニン生
   産植物であることを特徴とする請求項２２記載のグリシ
   ニン生産植物の育種増殖方法。 ２４、ナス科植物がタバコであることを特徴とする請求
   項２３記載のグリシニン生産植物の育種増殖方法。 ２５、ナス科植物がバレイショであることを特徴とする
   請求項２３記載のグリシニン生産植物の育種増殖方法。 ２６、グリシニン生産植物が禾本科植物のグリシニン生
   産植物であることを特徴とする請求項２２記載のグリシ
   ニン生産植物の育種増殖方法。 ２７、禾本科植物がイネであることを特徴とする請求項
   ２６記載のグリシニン生産植物の育種増殖方法。