JP2022544099A

JP2022544099A - 転写因子ＮｔＥＲＦ２２１及びその使用方法

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Publication number: JP2022544099A
Application number: JP2022507318A
Authority: JP
Inventors: マイケルピー．ティムコ、; ハイリウ、
Original assignee: 22nd Century Limited LLC
Current assignee: 22nd Century Limited LLC
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2022-10-17
Also published as: CA3149634A1; WO2021026119A1; KR20220049531A; US20220275387A1; CN114501987A; BR112022001963A2; MX2022001491A; EP4009777A1; EP4009777A4

Abstract

本技術は、植物代謝を修飾するための転写因子およびそのような転写因子をコードする核酸分子を提供する。また、これらの核酸を使用して植物におけるアルカロイド産生を調節する方法、ならびに変化したアルカロイド含量を有する植物および植物細胞を産生する方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１９年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８２，８６０号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本技術は一般に、植物代謝を修飾するための転写因子、このような転写因子をコードする核酸分子、および植物におけるアルカロイド産生を調節するためにこれらの核酸を使用する方法、ならびに改変されたアルカロイド含有物を有する植物および植物細胞を産生するための方法に関する。

以下の記載は、読み手の理解を助けるために提供するものである。提供された情報または引用された参考文献のいずれも、先行技術であると認められていない。

ピリジンアルカロイドは、毒性化合物として草食動物および昆虫の攻撃に対する植物防御機構において重要な役割を果たす（ＳｉｓｓｏｎおよびＳｅｖｅｒｓｏｎ１９９０；Ｆａｃｃｈｉｎｉ，２００１；Ｖｏｅｌｃｋｅｌら，２００１；ＫｅｓｓｌｅｒおよびＢａｌｄｗｉｎ，２００２；Ｋｅｓｓｌｅｒら，２００４；Ｓｔｅｐｐｕｈｎら，２００４；ＤｅｗｅｙおよびＸｉｅ，２０１３）。タバコ（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）植物において、ニコチンは、通常、全アルカロイドの約９０％を占め、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンは残りの１０％の大部分を構成する（Ｓａｉｔｏｈら、１９８５）。昆虫の植食がない場合、植物は代謝のコストのために基礎レベルのニコチンしか生産しない（Ｂａｌｄｗｉｎ，１９９８）。しかし、このレベルは負傷に対応して急速に上昇する（ＳａｕｎｄｅｒｓおよびＢｕｓｈ，１９７９；Ｂａｌｄｗｉｎ，１９８８；Ｂａｌｄｗｉｎ，１９８９）。ジャスモン酸（ＪＡ）およびその誘導体、例えばメチルジャスモン酸（ＭｅＪＡ）の創傷誘導生合成および輸送は、ニコチンおよび他のアルカロイドの生合成を促進するための芽から根への損傷シグナルとして同定された（Ｂａｌｄｗｉｎ，１９８９；Ｂａｌｄｗｉｎら，１９９４）。

ニコチンはタバコの根において排他的に合成され、続いて木部を介して植物の気中部分に移動し、最終的に、多剤・毒性化合物排出（ＭＡＴＥ）輸送体によって媒介される葉肉細胞の中心空胞に動員される（Ｄａｗｓｏｎ，１９４２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９７９；Ｂａｌｄｗｉｎ１９８９；Ｋｉｔａｍｕｒａら，１９９３；ＷｉｎｋおよびＲｏｂｅｒｔｓ，１９９８；Ｍｏｒｉｔａら，２００９；Ｓｈｏｊｉら，２００９；Ｓｈｉｔａｎら，２０１４）。過去数十年にわたり、ニコチン生合成経路の酵素をコードする遺伝子が同定され、研究されている（Ｂｕｓｈら，１９９９；ＺｉｅｇｌｅｒおよびＦａｃｃｈｉｎｉ，２００８；ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ，２０１１；ＤｅｗｅｙおよびＸｉｅ，２０１３；および図１）。生化学的に、ニコチンは、ニコチン酸（ピリジン環）およびＮ－メチル－Δ^１－ピロリニウムカチオン（ピロリジン環）の縮合によって形成される（ＨａｓｈｉｍｏｔｏおよびＹａｍａｄａ、１９９４）。ピロリジン環の形成はアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）およびオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）によってアルギニンおよびオルニチンから合成されるジアミンプトレシンからのプトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）によるＮ－メチルプトレシンへの変換から開始する（Ｈｉｂｉら、１９９２；Ｉｍａｎｉｓｈｉら、１９９８；ＲｉｅｃｈｅｒｓおよびＴｉｍｋｏ、１９９９；Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｉら、２００４；Ｘｕら、２００４）。次いで、Ｎ－メチルプトレシンを酸化し、環化して、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）によってＮ－メチル－Δ^１－ピロリニウムカチオンを形成する（Ｈｅｉｍら、２００７；Ｋａｔｏｈら、２００７）。アスパラギン酸から誘導されるピリジン環はアスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、キノリン酸シンターゼ（ＱＳ）およびキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）によって制御されるニコチン酸ジヌクレオチド（ＮＡＤ）の生合成を含む（Ｓｉｎｃｌａｉｒら、２０００；Ｋａｔｏｈら、２００６；Ｒｙａｎら、２０１２）。最終的なニコチンリング状カップリングはＰＩＰファミリーイソフラボンレダクターゼ様酵素（Ａ６２２）およびベルベリン架橋酵素様酵素（ＢＢＬ）によって媒介される（ＤｅＢｏｅｒら、２００９；Ｋａｊｉｋａｗａら、２００９；Ｋａｊｉｋａｗａら、２０１１）。

ニコチン生合成の調節にはホルモンシグナル伝達と転写調節が関与している（ＤｅｗｅｙおよびＸｉｅ，２０１３）。説得力のある証拠はニコチン生合成に関与する一連の遺伝子のＪＡ誘導転写アップレギュレーションが少なくとも２つの異なる転写因子ファミリー、ＡＰ２ドメイン含有エチレン応答因子（ＥＲＦ）ファミリーおよびＭＹＣ２様塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）ファミリー（ＤｅＳｕｔｔｅｒら、２００５；Ｒｕｓｈｔｏｎら、２００８；Ｓｈｏｊｉら、２０１０；Ｔｏｄｄら、２０１０）からのメンバーによって媒介されることを示している。２つのタバコＪＡ応答性ＥＲＦ、ＥＲＦ２２１／ＯＲＣ１およびＥＲＦ１０／ＪＡＰ１はニコチン生合成における重要な酵素の１つＰＭＴの遺伝子発現をアップレギュレートする（ＤｅＳｕｔｔｅｒら、２００５）。２００８年、タバコＡＰ２／ＥＲＦスーパーファミリーを系統発生学的に研究し、群ＩＸのＥＲＦメンバーはタバコにおけるジャスモン酸応答の主な調節因子として同定されている（Ｒｕｓｈｔｏｎら、２００８）。ＥＲＦスーパーファミリーの７つの群ＩＸメンバーのクラスターはＰＭＴ、ＯＤＣ、ＭＰＯ、ＡＯ、ＱＳ、ＱＰＴ、Ａ６２２、およびＭＡＴＥなどのニコチン関連構造遺伝子の発現を活性化するＮＩＣ２座ＥＲＦとして同定されている（Ｓｈｏｊｉら、２０１０；Ｓｈｏｊｉら、２０１２）。最近、非ＮＩＣ２遺伝子座タバコＥＲＦ、ＥＲＦ３２はＢＹ－２細胞におけるＪＡ誘導ニコチン生合成を正に調節することが証明されている（Ｓｅａｒｓら、２０１４）。これらのＥＲＦのトランス活性化効果はいくつかの構造遺伝子のプロモーター領域におけるＧＣＣボックスエレメントへの結合を介すると考えられる（ＸｕおよびＴｉｍｋｏ、２００４；Ｓｈｏｊｉら、２０１０；ＤｅＢｏｅｒら、２０１１；ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、２０１２；ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、２０１３；Ｓｅａｒｓら、２０１４）。

生物活性ホルモン（＋）－７－イソ－ジャスモノイル－Ｌ－イソロイシン（ＪＡ－Ｉｌｅ）の特異的認識はＪＡＳＭＯＮＡＴＥＺＩＭＤＯＭＡＩＮ（ＪＡＺ）リプレッサーの分解を導き、シロイヌナズナにおける転写活性化のためのｂＨＬＨファミリーＭＹＣ２／３タンパク質を放出する（Ｃｈｉｎｉら、２００７；Ｔｈｉｎｅｓら、２００７；Ｂｒｏｗｓｅ、２００９）。最近、ＪＡＺタンパク質はＳｋｐ１－Ｃｕｌ１－Ｆボックスタンパク質（ＳＣＦ）ユビキチンＥ３リガーゼ複合体の基質補充サブユニットとして働くＦボックスタンパク質ＣＯＲＯＮＡＴＩＮＥＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ１（ＣＯＩ１）とのジャスモネート共受容体として明らかにされている（Ｓｈｅａｒｄら、２０１０；Ｚｈａｎｇら、２０１５）。タバコにおいて、Ｉｎｖｉｖｏ証拠はまた、ＪＡに応答するＮｔＭＹＣ活性の調節のための核内のＮｔＪＡＺおよびＮｔＭＹＣ相同体間の相互作用、ならびにそれらの近位プロモーター領域に見出されるＧボックス要素への特異的結合を介したニコチン生合成に関与する多くの構造遺伝子に対するＮｔＭＹＣ１／２のトランス活性化効果を確認した（ＸｕおよびＴｉｍｋｏ，２００４；Ｓｈｏｊｉら、２００８；ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ，２０１１ｂ；Ｚｈａｎｇら、２０１２）。ＮｔＭＹＣ２－ＲＮＡｉタバコ根細胞におけるＮＩＣ２遺伝子座ＥＲＦ遺伝子の転写レベルの抑制は、ＮｔＭＹＣが関連するＮｔＥＲＦの転写を直接調節する可能性も示した（ＳｈｏｊｉとＨａｓｈｉｍｏｔｏ，２０１１ｂ；また図２）。

累積研究結果は、ニコチン生合成に関与する構造酵素と転写因子の両方をコードする遺伝子の機能的重要性を実証した。しかし、これらの研究のほとんどは、ニコチンまたはピリジンアルカロイド産生に対する遺伝子発現のノックダウンまたは抑制効果に焦点を当てており、いくつかの研究は遺伝子形質転換のために、根培養およびＢＹ－２細胞培養などの特定の培養材料を使用した（Ｖｏｅｌｃｋｅｌら、２００１；ＣｈｉｎｔａｐａｋｏｒｎおよびＨａｍｉｌｌ、２００３；Ｗａｎｇら、２００９；Ｋａｊｉｋａｗａら、２００９；ＤｅＢｏｅｒら、２００９；ＤｅＢｏｅｒら、２０１１ａ；ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、２００８；Ｄａｌｔｏｎら、２０１６）。

植物におけるニコチン生合成を調節するための方法および組成物が当技術分野において必要とされている。本開示は、これらの必要性を満たす。

植物におけるニコチン生合成を調節するための方法および組成物が、本明細書に開示される。

１つの局面において、本開示はＮｔＥＲＦ２２１が野生型対照植物と比較して過剰発現されるように、異種プロモーターに作動可能に連結されたＮｔＥＲＦ２２１によってコードされる遺伝子産物を過剰発現するヌクレオチド配列を含むキメラ核酸構築物を含むニコチアナ植物を提供し、それによって、ニコチアナ植物はトッピングなしにその葉に商業レベルのニコチンを蓄積し、ここで、ヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；および、（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、ニコチン生合成を正に調節するＮｔＥＲＦ２２１転写因子をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、異種プロモーターが二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、グリシンマックスユビキチン３（ＧｌｙｃｉｎｅＭａｘＵｂｉｑｕｉｔｉｎ３：ＧｍＵＢＩ３）遺伝子プロモーター、および配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、異種プロモーターは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターである

いくつかの実施形態では、植物がニコチアナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）植物である。

ある実施形態において、本開示は、種子がキメラ核酸構築物を含む、植物からの種子に関する。

いくつかの実施形態では、本開示がニコチアナ植物を含むタバコ製品であって、野生型対照植物由来のタバコ製品と比較してニコチンのレベルが増加しているタバコ製品に関する。

植物のいくつかの実施形態では、タバコ葉中のニコチンの商業レベルが約２．５％～約６％の範囲である。

一態様では、本開示がＮｔＥＲＦ２２１によってコードされる遺伝子産物を過剰発現するヌクレオチド配列のホモ接合性を特徴とするタバコ植物の集団を提供し、ここで、遺伝子産物の発現は野生型対照タバコ植物と比較して、ＮｔＥＲＦ２２１が過剰発現されるような異種プロモーターによって駆動される。それにより、集団は、トッピングなしでタバコ植物の葉において市販レベルのニコチンを含む表現型を安定して示す。ここで、該ヌクレオチド配列は以下からなる群から選択される。（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；および、（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、かつニコチン生合成を正に調節するＮｔＥＲＦ２２１転写因子をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される、トッピングなしのタバコ植物葉における市販レベルのニコチンを含む表現型を安定に表示する。

いくつかの実施形態では、タバコ葉中のニコチンの商業レベルが約２．５％～約６％の範囲である。

いくつかの実施形態では、異種プロモーターが、二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、グリシンマックスユビキチン３（ＧｍＵＢＩ３）遺伝子プロモーター、および配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターからなる群より選択される。

いくつかの実施形態において、異種プロモーターは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターである

いくつかの実施形態において、本開示は植物の集団からの種子に関し、ここで、種子は、キメラ核酸構築物を含む。

いくつかの実施形態では、本開示がタバコ植物の集団を含むタバコ製品であって、野生型対照植物由来のタバコ製品と比較してニコチンのレベルが増加しているタバコ製品に関する。

１つの局面において、本開示は、（ａ）（ｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；および、（ｉｉ）（ｉ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、ニコチン生合成を正に調節する転写因子をコードするヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された異種プロモーターを含む発現ベクターをニコチアナ植物に導入すること；ならびに、（ｂ）ヌクレオチド配列からニコチン生合成を正に調節する転写因子の発現を可能にする条件下で植物を成長させ、転写因子の発現は、同様の条件下で成長させた野生型対照植物と比較して増加したニコチン含有量を有する植物をもたらす、ニコチアナ植物におけるニコチンを増加させる方法を提供する。

いくつかの実施形態では、異種プロモーターが二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、グリシンマックスユビキチン３（ＧｍＵＢＩ３）遺伝子プロモーター、および配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、異種プロモーターは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターである。

いくつかの実施形態では、該方法がＮＢＢ１、Ａ６２２、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、キノリン酸シンターゼ（ＱＳ）、またはＮ－メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの少なくとも１つをニコチアナ植物内で過剰発現することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法がニコチアナ植物内で、ニコチン生合成を正に調節する少なくとも１つのさらなる転写因子を過剰発現することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ニコチン性アルカロイド生合成を正に調節する追加の転写因子は、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、またはＮｔＭＹＣ２ｂの少なくとも１つが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ベクターが配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、本方法がタバコ植物をトッピングすること、および／または外因性ジャスモン酸で植物を処理することをさらに含む。

図１は、タバコ中のニコチンおよび関連ピリジンアルカロイドの生合成経路を示す図である（ＤｅｗｅｙおよびＸｉｅ，２０１３から適合）。タバコアルカロイドの生合成または蓄積に直接関与すると考えられる酵素または輸送体は太い字（すなわち、ＡＯ、ＱＳ、ＱＰＴ、Ａ６２２、ＢＢＬ、ＯＤＣ、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＮＮＤ）である。実線の矢印は生化学的に定義された酵素反応であり、破線の矢印は定義されていない段階であり、三角形の白色矢印の頭は自然反応である。Ａ６２２は、ニコチン酸由来前駆体の縮合反応に関与すると推定されるＰＩＰファミリー酸化還元酵素である。ＯＤＣはオルニチンデカルボキシラーゼ；ＡＤはアルギニンデカルボキシラーゼ；ＰＭＴはプトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＭＰＯはＮ－メチルプトレシンオキシダーゼ；ＡＯはアスパラギン酸オキシダーゼ；ＱＳはキノリン酸シンターゼ；ＱＰＴはクノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ；ＭＡＴＥ１／２はタバコの根におけるニコチンの液胞隔離に関与する２つの相同な多剤および毒性化合物排出（ＭＡＴＥ）型輸送体；ＳＰＤＳはスペルミジンシンターゼ；ＳＡＭＳはＳ－アデノシルメチオニンシンターゼ；およびＳＡＭＤＣはＳ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼである。

図２は、ＪＡを介したニコチン生合成遺伝子のトランス活性化モデルを示す模式図である（ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ，２０１１ｂ；Ｚｈａｎｇら、２０１２より改変）。ＪＡの存在はＪＡ－Ｉｌｅの生成を導き、これは、ＮｔＪＡＺタンパク質とＳＣＦ^ＣＯＩ１ユビキチンリガーゼとの間の相互作用を促進し、２６Ｓプロテアソームを介したＮｔＪＡＺの分解を導く。これにより、ＮｔＭＹＣ２転写因子はそのプロモーター内のＧボックス様要素への結合を介してＪＡ誘導性ＴＦ（ＮｔＥＲＦ２２１など）の発現を活性化するように自由になり、これらのＴＦはその後、ＮｔＭＹＣ２と協調していくつかのニコチン生合成遺伝子（ＮｔＰＭＴ１など）の転写を調節する。

図３Ａ～３Ｂは、野生型およびトランスジェニックタバコにおけるニコチンのベクター構築および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析の概略図である。図３Ａ：タバコにおける過剰発現のために使用されるバイナリーベクター構築の概略図である。図３Ｂ：５週齢野生型およびＴ_２世代ＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ２２１、またはＮｔＭＹＣ２ａ過剰発現系統の葉におけるニコチン蓄積の検知のためのＴＬＣ検定をしめす図である。実生を０．１％ＤＭＳＯ（対照）または１００μＭＭｅＪＡで４８時間処理した後、葉組織をアルカロイド抽出のために収集した。矢印はニコチンバンドを示し、矢印の頭は内部対照としてのキナルジンを示す。

図４は、野生型およびトランスジェニックタバコにおけるＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ２２１、およびＮｔＭＹＣ２ａの転写物レベルのＲＴ－ｑＰＣＲによる検証を示す一連のチャートである。２週齢の野生型およびＴ２世代のＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ２２１、およびＮｔＭＹＣ２ａ過剰発現実生を、ＲＴ－ｑＰＣＲ実験のために収集する前に、０．１％ＤＭＳＯ（対照）または１００μＭＭｅＪＡで８時間処理した。相対発現値をＮｔＥＦ－１αに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭ（ｎ＝３ＰＣＲ反復）を示す。左から右に、各測定について、０．１％ＤＭＳＯを最初に列挙し、１００μＭＭｅＪＡを２番目に列挙する。

図５は、ＧＣ－ＭＳによる野生型およびトランスジェニックタバコ中のニコチンの定量を示すチャートである。０．１％ＤＭＳＯ（対照）または１００μＭＭｅＪＡのいずれかによる処理を、５週齢の野生型またはトランスジェニック実生に４８時間適用した。葉組織をアルカロイド抽出のために収集し、ＧＣ－ＭＳを実施してニコチン含量を定量した。各処理について、各トランスジェニック系統について６～８個体を独立に試験した。統計解析は一元配置分散分析とＴｕｋｅｙＨＳＤ検定を行い、多重対比較を行った。^＊は、調整されたｐ値に基づいた優位水準：^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５を示す。

図６は、野生型およびトランスジェニックタバコにおいてＮｔＥＲＦ２２１によってアップレギュレートされた構造遺伝子の発現レベルを示す一連のチャートである。２週齢の野生型またはＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ２２１、またはＮｔＭＣＹ２ａを過剰発現するトランスジェニックタバコ実生を、０．１％ＤＭＳＯ（対照）または１００μＭＭｅＪＡで８時間処理した。全ＲＮＡを、各系統について少なくとも５つの個々の実生から収集した。ＮｔＡＯ、ＮｔＯＤＣ、ＮｔＰＭＴ、ＮｔＱＰＴ、およびＮｔＱＳの転写レベルを、それぞれＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。相対発現値をＮｔＥＦ－１αに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭ（ｎ＝３ＰＣＲ反復）を示す。左から右に、各測定について、０．１％ＤＭＳＯを最初に列挙し、１００μＭＭｅＪＡを２番目に列挙する。

Ｉ．はじめに
本技術は、ＥＲＦ転写因子ＮｔＥＲＦ２２１のみを過剰発現する安定なタバコ植物形質転換体がトッピングのない葉に商業レベルのニコチンを蓄積するタバコ植物をもたらすという驚くべき発見に関する。さらに、実施例１が実証するように、本技術は、ＭＹＣおよび／またはＭＹＣ＋ＥＲＦ転写因子活性化の必要性を迂回して、このＥＲＦ転写因子単独の過剰発現が、タバコにおいてニコチン形成を調節し得る新規な方法を提供するという、驚くべきかつ予想外の発見に関する。

タバコにおける葉の質および生産性を改善するために、花序の最初の花が現れるとき、タバコ植物の開花頭および若葉を除去する。煙道硬化タバコのためのこの培養技術は、トッピング（または断頭）として知られている。タバコのトッピングはインドール酢酸（ＩＡＡ）およびジャスモン酸（ＪＡ）シグナル伝達経路を含む包括的な一連の生物学的プロセスを活性化し、植物における多くの生物学的プロセスを変更させることにより、その生殖相からその栄養相へ植物を切り替えることができ、ニコチン生合成および他のプロセスの変更をもたらす。ＪＡはエチレン応答エレメント結合因子（ＥＲＦ）転写因子と相互作用できるＭＹＣ転写因子の放出を刺激して、ニコチン生合成を担う遺伝子の発現を活性化し、それによって根におけるニコチンの産生と植物の葉におけるニコチンの蓄積を刺激する。ニコチン生合成の増加はトッピングに対するタバコの重要な応答であり、理論に束縛されることを望まないが、今日まで、タバコ葉における実質的なニコチン蓄積を達成する唯一の方法であると考えられてきた。

本技術の発明者らは、ニコチン生合成酵素のＪＡ調節発現に以前に関与していた転写因子（ＴＦ）をコードする転写レベルの操作が市販の煙道硬化タバコにおけるニコチンおよび関連するアルカロイドレベルを制御するための選択的戦略として使用され得るかどうかを試験した。本明細書中で実証されるように、ＡＰ２／ＥＲＦファミリーＴＦ、ＮｔＥＲＦ３２およびＮｔＥＲＦ２２１、ならびにｂＨＬＨファミリーＴＦ、ＮｔＭＹＣ２ａの特異的メンバーの過剰発現は単独で、煙道硬化タバコにおけるニコチン産生の増強をもたらし、ＮｔＥＲＦ２２１は、ＮｔＡＯ、ＮｔＯＤＣ、ＮｔＰＭＴ、ＮｔＱＰＴ、およびＮｔＱＳを含むニコチン生合成に関与する構造遺伝子のサブセットのＪＡ誘導トランス活性化の正の調節因子として特に有効である。

したがって、いくつかの実施形態では、本技術が天然にアルカロイドを産生する植物においてアルカロイド（例えば、ニコチン性アルカロイド）の合成を遺伝子操作するために使用され得る、ＮｔＥＲＦ２２１（ＯＲＣ１）（例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列）またはその生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含むタバコ植物を提供する。例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｐｐ．（例えば、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ、Ｎ．ｒｕｓｔｉｃａ、およびＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）は、天然にニコチン性アルカロイドを産生する。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍは農作物であり、この植物の生物工学的利用は増加し続けている。ＮｔＥＲＦ２２１遺伝子またはその生物学的に活性な断片は、治療的適用を有し得るニコチン性アルカロイドおよび関連化合物の合成を増加させるために、植物または植物細胞において使用され得る。

いくつかの実施形態において、本技術はＮｔＥＲＦ２２１をコードするヌクレオチド配列を含むタバコ植物を提供し、ここで、ヌクレオチド配列の発現は、ＮｔＥＲＦ２２１が野生型植物と比較して過剰発現されるように異種プロモーターによって駆動され、それによって、タバコ植物はトッピングの必要なしに、その葉に商業レベルのニコチンを蓄積する。いくつかの実施形態では、異種プロモーターが二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、グリシンマックスユビキチン３（ＧｍＵＢＩ３）遺伝子プロモーター、または配列番号２に示すヌクレオチド配列を有する新規ジャスモネート誘導性プロモーターから選択される。従って、いくつかの実施形態において、本技術は、ＮｔＥＲＦ２２１の過剰発現を遺伝子操作することによって、植物および植物細胞におけるニコチン性アルカロイド産生を増加させるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本技術は、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂからなるがこれらに限定されない関連するＮｔＭＹＣファミリーメンバーの群から選択されるＮｔＥＲＦ２２１および少なくとも１つのＭＹＣ転写因子遺伝子の過剰発現を遺伝子操作することによって、植物および植物細胞におけるニコチンアルカロイド産生を増加させるための方法を提供する。配列番号３に示されるＮｔＭＹＣ１ａ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号４に示されるポリペプチド配列をコードする。配列番号５に示されるＮｔＭＹＣ１ｂ遺伝子のＯＲＦは、配列番号６に示されるポリペプチド配列をコードする。ＮｔＭＹＣ２ａ遺伝子の全長さの配列を配列番号９に示す。ＮｔＭＹＣ２ａポリペプチド配列を配列番号１０に示す。ＮｔＭＹＣ２ｂ遺伝子の全長さの配列を配列番号９に示す。ＮｔＭＹＣ２ｂポリペプチド配列を配列番号１０に示す。いくつかの実施形態では、タバコ植物のニコチン含量がＮｔＥＲＦ２２１の過剰発現を、植物のトッピングまたは外因性ジャスモン酸での処理などの技術と組み合わせることによって、さらに増加させることができる。いくつかの実施形態では、タバコ植物のニコチン含量がＮｔＥＲＦ２２１および少なくとも１つのＭＹＣ転写因子の過剰発現を、外因性ジャスモン酸による植物のトッピングまたは処理などの技術と組み合わせることによって、さらに増加させることができる。

いくつかの実施形態において、ニコチン性アルカロイドの産生に対する相乗効果は、ＮｔＥＲＦ２２１と、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂからなる群から選択される少なくとも１つのＭＹＣ転写因子遺伝子との複合過剰発現によって生成される。ＮｔＥＲＦ２２１またはその生物学的に活性な断片はまた、ニコチン性アルカロイド合成の抑制を遺伝子操作して、植物製薬（例えば、組換えタンパク質および抗体）の生産のための低毒性生産プラットフォームとして、または工業用、食品用、およびバイオマス作物として使用するための、ゼロまたは低ニコチンレベルを含有するタバコ品種を作製するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ニコチン性アルカロイドの産生に対する相乗効果は、ＮｔＥＲＦ２２１の過剰発現と、外因性ジャスモン酸での植物のトッピングまたは処理などの技術との組み合わせによって生成される。いくつかの実施形態において、ニコチン性アルカロイドの産生に対する相乗効果は、ＮｔＥＲＦ２２１および少なくとも１つのＭＹＣ転写因子遺伝子の過剰発現の組み合わせ、ならびに外因性ジャスモン酸での植物のトッピングまたは処理のような技術によって生成される。

いくつかの実施形態では、トッピングなしで達成されるタバコ葉ニコチンの商業レベルは、少なくとも約２．５％から約６．０％以上である。いくつかの実施態様では、タバコ葉ニコチンの商業レベルは、少なくとも約３％、少なくとも約３．５％、少なくとも約４．０％、少なくとも約４．５％、少なくとも約５．０％、少なくとも約５．１％、少なくとも約５．２％、少なくとも約５．３％、少なくとも約５．４％、少なくとも約５．５％、少なくとも約５．６％、少なくとも約５．７％、少なくとも約５．８％、少なくとも約５．９％、または少なくとも約６．０％以上である。

タバコにおけるＮＩＣ２－遺伝子座ＥＲＦ遺伝子の同定以来、ＮｔＥＲＦ１８９は、培養タバコ根または培養細胞におけるアルカロイド産生およびストレス応答に及ぼす影響について広範囲に研究されてきた（Ｓｈｏｊｉら、２０１０；ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ，２０１１ａ，ｂ）。ＮｔＥＲＦ１８９のＤＮＡ結合および転写活性化特性についてもよく研究されている（ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ，２０１２）。系統発生的に、ＮｔＥＲＦ２２１およびＮｔＥＲＦ１８９ならびにいくつかの他のＮＩＣ２－遺伝子座ＥＲＦは群ＩＸＮｔＥＲＦの同様クレード／サブ群内で密接に関連している（Ｓｅａｒｓら、２０１４）。ＮｔＥＲＦ１８９はトランスジェニック有毛根において、ＮｔＰＭＴ、ＮｔＯＤＣ、ＮｔＭＰＯ、ＮｔＡＯ、ＮｔＱＳ、ＮｔＱＰＴ、ＮｔＡ６２２およびＮｔＭＡＴＥ１／２の転写レベルをアップレギュレートすることができることが示されている（Ｓｈｏｊｉら、２０１０）。いくつかのＧＣＣ－ボックス様配列は、ＮｔＰＭＴ、ＮｔＱＰＴ、ＮｔＯＤＣおよびＮｔＭＡＴＥのプロモーターにおけるＮｔＥＲＦ１８９の結合部位であることが同定された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，２０１１ａ；ＳｈｏｊｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ，２０１２）。本明細書中に記載されるように、ＮｔＥＲＦ２２１を過剰発現するトランスジェニックタバコにおいて、ＮｔＡＯ、ＮｔＯＤＣ、ＮｔＰＭＴ、ＮｔＱＰＴ、およびＮｔＱＳのＪＡ誘導転写物蓄積は、野生型と比較して大いにアップレギュレートされた（図６）。このことは、ＮｔＥＲＦ２２１とＮｔＥＲＦ１８９がニコチン生合成に関与するそれらの標的構造遺伝子のトランス活性化において類似の認識部位を共有する可能性を示唆する。

ＩＩ．植物におけるアルカロイド産生の調節
本技術の開示はＮｔＥＲＦ２２１をコードするヌクレオチド配列にホモ接合で過剰発現するタバコ植物、および植物におけるアルカロイド産生を調節するための方法におけるＮｔＥＲＦ２２１またはその生物学的に活性な断片の使用に関する。

Ａ．アルカロイド生産の増加
いくつかの実施形態では、本技術がアルカロイド産生に対する正の調節効果を有する転写因子を過剰発現することによって、植物中のアルカロイドを増加させることに関する。ＮｔＥＲＦ２２１遺伝子またはそのオープンリーディングフレーム（配列番号１）はアルカロイド、例えば、植物または植物細胞におけるニコチン性アルカロイド（例えば、ニコチン）の過剰産生を操作するために使用され得る。

ニコチンなどのアルカロイドは、アルカロイド生合成経路の酵素をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現させることによって増加させることができる。例えば、Ｓａｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１）：３６７－７２（２００１）を参照のこと。ＰＭＴを単独で過剰発現させると、根におけるＰＭＴ転写レベルが４～８倍増加したにもかかわらず、葉のニコチン含量は４０％しか増加しなかった。このことは、経路の他のステップでの制限により、より大きな効果が得られなかったことを示唆している。したがって、本技術はアルカロイド産生（例えば、ＮｔＥＲＦ２２１）および少なくとも１つのアルカロイド生合成遺伝子、例えば、Ａ６２２、ＮＢＢ１（ＢＢＬ）、キノール酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、キノリン酸シンターゼ（ＱＳ）、および／またはＮ－メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）の少なくとも１種に正の調節作用を有する転写因子を過剰発現させると、転写因子またはアルカロイド生合成遺伝子を単独でアップレギュレートするよりも、より大きなアルカロイド産生をもたらすこととなる。さらに、またはその代替として、アルカロイド産生を正に調節する転写因子（例えば、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、および／またはＮｔＭＹＣ２ｂのようなＭＹＣ転写因子）をコードする複数の追加遺伝子を過剰発現させると、植物中のアルカロイドレベルをさらに増加させることができる。

本技術のこの局面に従って、ＮｔＥＲＦ２２１、そのオープンリーディングフレーム、またはその生物学的に活性な断片、ならびにＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＯＤＣ、ＡＯ、ＱＳ、またはＭＰＯのうちの少なくとも１つを含む核酸構築物が、植物細胞に導入される。例示的な核酸構築物は例えば、ＮｔＥＲＦ２２１またはその生物学的に活性な断片およびＱＰＴの両方を含み得る。同様に、例えば、ＮｔＥＲＦ２２１およびＱＰＴを過剰発現する遺伝子操作植物は、ＮｔＥＲＦ２２１を過剰発現するトランスジェニック植物と、ＱＰＴを過剰発現するトランスジェニック植物とを交配することによって作製することができる。交雑および選択の連続ラウンドに続いて、ＮｔＥＲＦ２２１およびＱＰＴを過剰発現する遺伝子操作された植物を選択することができる。

Ｂ．アルカロイド生成の減少
アルカロイド産生は、本技術のＮｔＥＲＦ２２１転写因子遺伝子配列を用いてアルカロイド産生を正に調節する転写因子をコードする内因性遺伝子の抑制によって、当技術分野で一般に知られている多くの方法、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術、人工マイクロＲＮＡ技術、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）技術、アンチセンス技術、共抑制技術、および標的突然変異誘発技術で低減させることができる。従って、本技術は、ＮｔＥＲＦ２２１を抑制することによって植物中のアルカロイド含量を減少させるための方法および構築物を提供する。アルカロイド産生を正に調節する転写因子をコードする複数の遺伝子（例えば、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、および／またはＮｔＭＹＣ２ｂ）を抑制すると、植物のアルカロイド濃度をさらに低下させることができる。

これまでの報告では、ニコチアナのアルカロイド生合成遺伝子を抑制すると、ニコチン性アルカロイド含量が減少することが示されている。例えば、ＱＰＴを抑制することは、ニコチンレベルを低下させる（例えば、米国特許第６，５８６，６６１号を参照のこと）。Ａ６２２またはＮＢＢ１の抑制はまた、ＰＭＴ（例えば、ＣｈｉｎｔａｐａｋｏｒｎおよびＨａｍｉｌｌ、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：８７－１０５（２００３）を参照のこと）またはＭＰＯ（例えば、ＷＯ２００８／０２０３３３およびＷＯ２００８／００８８４４；Ｋａｔｏｈら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．４８（３）：５５０－４（２００７）を参照のこと）の抑制と同様に、ニコチンレベルを低下させる（例えば、ＷＯ２００６／１０９１９７を参照のこと）。したがって、本技術はＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＯＤＣ、ＡＯ、ＱＳ、およびＭＰＯのうちの１つ以上を抑制し、ＮｔＥＲＦ２２１を抑制することによって、ニコチン性アルカロイド含量をさらに減少させることを意図する。本技術のこの局面に従って、ＮｔＥＲＦ２２１の少なくとも生物学的に活性な断片、およびＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＯＤＣ、ＡＯ、ＱＳ、およびＭＰＯのうちの１つ以上の少なくとも生物学的に活性な断片を含む核酸構築物が、細胞または植物に導入される。例示的な核酸構築物は、ＮｔＥＲＦ２２１およびＱＰＴの生物学的に活性な断片の両方を含み得る。

Ｃ．アルカロイド産生を調節する転写因子配列を用いた植物と細胞の遺伝子工学
Ｉ．転写因子配列
本技術の転写因子遺伝子は、配列番号１に記載の配列およびその生物学的に活性な断片であって、少なくとも約１５の連続した核酸から約６８０の連続する核酸まで又はこれら２つの量の間の任意の値の連続する核酸、例えば、以下に制限されるものではないが、約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約６８０などの連続した核酸を含む。いくつかの実施形態では、本技術の転写因子遺伝子は、植物における遺伝子サイレンシングの誘導に有用である様に十分な長さである、少なくとも約２１連続ヌクレオチドのその生物学的に活性な断片を含む配列番号１に記載の配列を含む（ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：９５０－９５２（１９９９））。

本技術はまた、アルカロイド生合成活性を調節するポリペプチドをコードする、１つ以上の塩基が欠失、置換、挿入、または付加された、配列番号１の「変異体」を含む。したがって、「１つ以上の塩基が欠失、置換、挿入、または付加された塩基配列」を有する配列は、コードされたアミノ酸配列が１つ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加された場合であっても、生理活性を保持する。さらに、複数の形態のＮｔＥＲＦ２２１が存在することがあり、これは、遺伝子産物の翻訳後修飾、または転写因子遺伝子の複数の形態に起因する可能性がある。このような修飾を有し、アルカロイド生合成を調節するＮｔＥＲＦ２２１転写因子をコードするヌクレオチド配列は、本技術の範囲内に含まれる。

例えば、ポリＡ末端、または５’末端もしくは３’末端の非翻訳領域を欠失させてもよく、アミノ酸が欠失する程度まで塩基を欠失させてもよい。フレームシフトが生じない限り、塩基を置換することもできる。塩基はまた、アミノ酸が付加される程度まで「付加」され得る。しかし、このような修飾があっても、アルカロイドの生合成を調節する転写因子活性が失われることはないことが必須である。この文脈における修飾ＤＮＡは例えば、コードされるポリペプチド中の特定の部位のアミノ酸が部位特異的突然変異誘発によって置換され、欠失され、挿入され、または付加されるように、本技術のＤＮＡ塩基配列を修飾することによって得ることができる。（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１０：６４８７－５００（１９８２）を参照のこと）。

転写因子配列は、例えば、本明細書に開示された適切なタンパク質配列をガイドとして、天然のＤＮＡ配列とは異なるものの、同一または類似のアミノ酸配列を有するタンパク質の生成をもたらすＤＮＡ分子を作成することにより、適切な塩基からab initioで合成することが可能である。

別段の指示がない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することによって決定される全てのヌクレオチド配列は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ３７３０ｘｌなどの自動ＤＮＡシークエンサーを使用して決定した。従って、この自動化アプローチにより決定される任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知であるように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、典型的には配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約９５％、より典型的には少なくとも約９６％～少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、本分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法などの他のアプローチによって、さらに正確に決定することが可能である。また、当該分野で公知であるように、実際の配列と比較した決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる予測されるアミノ酸配列がこのような挿入または欠失の時点で開始して、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列と完全に異なり得るように、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こす。

本技術の目的のために、２つの配列は、それらが６×ＳＳＥ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および１００μｇの非特異的キャリアＤＮＡのハイブリダイゼーション溶液中で二本鎖複合体を形成する場合、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。Ａｕｓｕｂｅｌら，ｓｕｐｒａ，ｓｅｃｔｉｏｎ２．９，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２７（１９９４）を参照されたい。配列は、６×ＳＳＥ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および１００μｇの非特異的キャリアＤＮＡのハイブリダイゼーション溶液中の６０℃の温度として定義される「中程度のストリンジェンシー」でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー」でのハイブリダイゼーションのために、温度を６８℃に上昇させる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応に続いて、ヌクレオチドを、２×ＳＳＥ＋０．０５％ＳＤＳの溶液中で、室温で５回洗浄し、続いて、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＯＳで、６０℃で１時間洗浄する。高ストリンジェンシーのために、洗浄温度を６８℃に上昇させる。この技術の目的のために、ハイブリダイズしたヌクレオチドは１０，０００ｃｐｍ／ｎｇの比放射能を有する１ｎｇの放射標識プローブを使用して検出されるものであり、ここで、ハイブリダイズしたヌクレオチドは、－７０℃で７２時間以下のＸ線フィルムへの暴露後に明確に可視化される。

本技術は、配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一である核酸分子を包含する。２つの核酸配列間の差異は参照ヌクレオチド配列の５’末端位置または３’末端位置、または参照配列中のヌクレオチド間に個々に、または参照配列中の１つ以上の連続した基に点在する、それらの末端位置間の任意の場所で生じ得る。

ＩＩ．核酸構築物
本技術のいくつかの実施形態において、アルカロイド生合成を調節する転写因子の活性を増加させる配列は、植物または細胞に導入するのに適した核酸構築物に組み込まれる。従って、このような核酸構築物は、植物または細胞において、ＮｔＥＲＦ２２１、および任意にＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＯＤＣ、ＡＯ、ＱＳ、ＭＰＯ、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、またはＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つを過剰発現するために使用され得る。

組換え核酸構築物は、標準的な技術を使用して作製され得る。例えば、転写のためのＤＮＡ配列は、その配列を含むベクターを制限酵素で処理して適切なセグメントを切り出すことによって得ることができる。転写のためのＤＮＡ配列はまた、合成オリゴヌクレオチドをアニーリングおよび連結することによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において合成オリゴヌクレオチドを使用して、各末端に適切な制限部位を与えることによって生成され得る。次いで、ＤＮＡ配列を、上流プロモーターおよび下流ターミネーター配列などの適切な調節エレメントを含むベクター中にクローン化する。

本技術のいくつかの実施形態において、核酸構築物は正常な発生または生理に過度に影響を及ぼすことなく、特定の細胞型、器官、または組織における転写因子をコードする転写の発現を駆動する、１つ以上の調節配列または制御配列に作動可能に連結されたアルカロイド生合成を調節する転写因子（すなわち、ＮｔＥＲＦ２２１）をコードする配列を含む。

アルカロイド生合成を調節する転写因子の発現を減少または増加させるために細胞に導入された核酸配列の発現に有用なプロモーターは、構成的プロモーター、例えばカーネーションエッチングリングウイルス（ＣＥＲＶ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、またはより詳細にはダブル増強カリフラワーモザイクウイルスプロモーターであって、２つのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを直列に含む（「ダブル３５Ｓ」プロモーターと称される）。いくつかの実施形態では、プロモーターがグリシンマックスユビキチン３（ＧｍＵＢＩ３）遺伝子プロモーターである。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的、および誘導性プロモーターが、特定の状況下で望ましい場合がある。例えば、組織特異的プロモーターは、他の組織における発現に影響を及ぼすことなく、特定の組織における過剰発現を可能にする。いくつかの実施形態では、本技術は、0004ＧＡＧ調節モチーフの４つのコピーおよびＮｔＰＭＴ１ａプロモーターに由来する最小プロモーターが一緒に融合されて（４ＧＡＧ）、アルカロイド形成と一致する組織特異的およびＪＡ調節発現を与える新規ジャスモネート（ＪＡ）誘導性プロモーター（配列番号２）に関する。

さらなる例示的なプロモーターはタバコＲＢ７プロモーター（例えば、Ｈｓｕら、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．４４：９－１９（１９９５）；米国特許第５，４５９，２５２号を参照のこと）；トウモロコシプロモーターＣＲＷＡＱ８１（例えば、米国特許公開第２００５／００９７６３３号を参照のこと）；シロイヌナズナＡＲＳＫ１プロモーター（例えば、ＨｗａｎｇおよびＧｏｏｄｍａｎ，ＰｌａｎｔＪ．８：３７－４３（１９９５）を参照のこと）、トウモロコシＭＲ７プロモーター（例えば、米国特許第５，８３７，８４８号を参照のこと）、トウモロコシＺＲＰ２プロモーター（例えば、米国特許第５，６３３．３６３号を参照のこと）、トウモロコシＭＴＬプロモーター（例えば、米国特許第５，４６６，７８５号および６，０１８，０９９号を参照のこと）、トウモロコシＭＲＳ１、ＭＲＳ２、ＭＲＳ３およびＭＲＳ４プロモーター（例えば、米国特許出願公開第２００５／００１０９７４号を参照のこと）、シロイヌナズナ潜伏性プロモーター（例えば、米国特許公開第２００３／０１０６１０５号を参照のこと）のような、根組織において活性であるプロモーターを含み、およびタバコＲＤ２プロモーター（例えば、米国特許第５，８３７，８７６号を参照のこと）、ＰＭＴプロモーター（例えば、Ｓｈｏｊｉら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．４１：８３１－３９（２０００）；ＷＯ２００２／０３８５８８を参照のこと）、またはＡ６２２プロモーター（例えば、Ｓｈｏｊｉら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０：４２７－４０（２００２）を参照のこと）のような、ニコチン生合成に関与する酵素の発現が上昇する条件下で活性化されるプロモーターを含む。

本技術のベクターはまた、ｍＲＮＡの転写が終結され、そしてポリＡ配列が付加されるように、本技術の核酸分子の下流に位置する終結配列を含み得る。例示的ターミネーターには、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリン合成酵素ターミネーター（Ｔｎｏｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）マンノピン合成酵素ターミネーター（Ｔｍａｓ）、およびＣａＭＶ３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）が含まれる。終結領域にはエンドウリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット終結領域（ＴｒｂｃＳ）またはＴｎｏｓ終結領域がある。発現ベクターはまた、エンハンサー、開始コドン、スプライシングシグナル配列、およびターゲティング配列を含有していてもよい。

本技術の発現ベクターはまた、形質転換された細胞が培養物中で同定され得る選択マーカーを含み得る。マーカーは異種核酸分子（すなわち、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子）に関連し得る。本明細書中で使用される場合、用語「マーカー」は、マーカーを含む植物または細胞の選択またはスクリーニングを可能にする形質または表現型をコードする遺伝子をいう。植物において、例えば、マーカー遺伝子は、抗生物質または除草剤耐性をコードする。これにより、形質転換またはトランスフェクトされていない細胞の中から形質転換細胞を選択することが可能になる。

適切な選択マーカーの例としてはアデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ヒグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン－グアニンホスホ－リボシルトランスフェラーゼ、グリホサートおよびグルホシネート耐性、ならびにアミノ－グリコシド３’－Ｏ－ホスホトランスフェラーゼ（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８耐性）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのマーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性を含み得る。この構築物はまた、グルホスフィン酸アンモニウムのような除草剤ホスフィノトリシン類似体に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子ｂａｒを含み得る。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＥＭＢＯＪ．９：２５１９－２３（１９８７）を参照のこと。当該分野で公知の他の適切な選択マーカーもまた、使用され得る。

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの可視マーカーを使用することができる。細胞分裂の制御に基づいて形質転換植物を同定または選択するための方法も記載されている。例えば、ＷＯ２０００／０５２１６８およびＷＯ２００１／０５９０８６を参照のこと。

細菌またはウイルス起源の複製配列もまた、ベクターを細菌またはファージ宿主中でクローン化することを可能にするために含まれ得る。好ましくは、広い範囲の宿主の原核生物複製起点が使用される。所望の構築物を有する細菌細胞の選択を可能にするために、細菌に対する選択マーカーを含めることができる。適切な原核生物選択マーカーには、カナマイシンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質に対する耐性も含まれる。

追加の機能をコードする他の核酸配列もまた、当該分野で公知のように、ベクター中に存在し得る。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が宿主である場合、Ｔ－ＤＮＡ配列は、植物染色体へのその後の移入および植物染色体への組み込みを容易にするために含まれ得る。

このような遺伝子構築物は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介した宿主植物への形質転換および改変アルカロイドレベルについてのスクリーニングによって、活性について適切にスクリーニングされ得る。

適切には、遺伝子のヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋ（商標）ヌクレオチドデータベースから抽出され、切断されない制限酵素について検索され得る。これらの制限部位は、ＰＣＲプライマーにこれらの部位を組み込むなどの従来の方法によって、またはサブクローニングによって、遺伝子に付加することができる。

構築物は、適切な宿主（植物）細胞における発現に適合された発現ベクターのようなベクター内に含まれ得る。導入されたＤＮＡ配列を含む植物を産生し得る任意のベクターで十分であることが理解される。

適切なベクターは当業者に周知であり、Ｐｏｕｗｅｌｓら、ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８６）のような一般的な技術参考文献に記載される。適切なベクターの例には、Ｔｉプラスミドベクターが含まれる。

いくつかの実施形態において、本技術はニコチンおよび種々のフラボノイドを含む他のアルカロイドの産生レベルを調節するために、ＮｔＥＲＦ２２１の過剰発現を可能にする発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本技術の発現ベクターはさらに、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つの過剰発現を可能にする。これらの発現ベクターは、当業者に公知の種々の方法によって、宿主植物細胞に一過性に導入され得るか、または宿主植物細胞のゲノムに安定に組み込まれて、トランスジェニック植物を生成し得る。これらの発現ベクターを宿主植物細胞のゲノムに安定に組み込み、安定な細胞株またはトランスジェニック植物を作製すると、ＮｔＥＲＦ２２１単独またはアルカロイド生合成酵素、あるいはＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、またはＮｔＭＹＣ２ｂなどの別の転写因子との組み合わせでの過剰発現を、この転写因子に応答性のある内因性プロモーターのプロモーター活性化を調節する方法として展開することができる。宿主植物細胞は、ＮｔＥＲＦ２２１に応答する異種プロモーター構築物を受容するようにさらに操作され得る。宿主植物細胞はまた、目的の異種プロモーターのコアエレメントの上流に１つ以上のＧＡＧモチーフを組み込むことによって改変された異種プロモーター構築物を受容するようにさらに操作され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターが配列番号２に記載のジャスモネート（ＪＡ）誘導性プロモーターである。

以下に記載される発現ベクターに関して、アルカロイド、フラボノイド、およびニコチンの産生のための生合成経路に関与する酵素をコードする種々の遺伝子は、目的のプロモーターに作動可能に連結され得る導入遺伝子として適切であり得る。

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む。別の実施形態において、植物細胞株は、ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを含む。別の実施形態において、トランスジェニック植物は、ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物がＮｔＥＲＦ２２１のホモ接合性および安定な発現によってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを導入することを含む、アルカロイド、フラボノイド、およびニコチンの産生を遺伝的に調節するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターがＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。

別の実施形態において、発現ベクターは、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｉｉ）アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。別の実施形態において、植物細胞株は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む発現ベクター、および（ｉｉ）アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。別の実施形態において、トランスジェニック植物は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む発現ベクター、および（ｉｉ）アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。別の実施形態において、（ａ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｂ）アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む発現ベクターを導入することを含む、アルカロイドの産生レベルを遺伝的に調節するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターがＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、アルカロイド生合成に関与する酵素がＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＯＤＣ、ＡＯ、ＱＳ、またはＭＰＯのうちの１つ以上を含む。

別の実施形態において、発現ベクターは、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、（ｉｉ）フラボノイドの生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。別の実施形態において、植物細胞株は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む発現ベクター、および（ｉｉ）フラボノイドの生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。別の実施形態において、トランスジェニック植物は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｉｉ）フラボノイドの生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターがＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。別の実施形態において、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｉｉ）フラボノイドの生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む発現ベクターを導入することを含む、フラボノイドの産生レベルを調節するための方法が提供される。方法のいくつかの実施形態では、発現ベクターがＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。

別の実施形態において、発現ベクターは、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｉｉ）ニコチン生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。別の実施形態において、植物細胞株は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｉｉ）ニコチン生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む発現ベクターを含む。別の実施形態において、トランスジェニック植物は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｉｉ）ニコチン生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターがＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、ニコチン生合成に関与する酵素は、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＯＤＣ、ＡＯ、ＱＳ、またはＭＰＯのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ニコチン生合成に関与する酵素はＰＭＴである。別の実施形態において、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２２１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｉｉ）ニコチン生合成に関与する酵素をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む発現ベクターを導入することを含む、ニコチンの産生レベルを遺伝的に調節するための方法が提供される。方法のいくつかの実施形態では、発現ベクターがＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。

別の実施形態は、ＮｔＥＲＦ２２１（配列番号１）をコードする単離されたｃＤＮＡ、またはその生物学的に活性な断片に関する。別の実施形態はＮｔＥＲＦ２２１をコードし、配列番号１と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡ、またはその生物学的に活性な変異体断片に関する。

別の実施形態はＮｔＥＲＦ２２１をコードし、配列番号１と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡを含む第１の配列、またはその生物学的に活性な断片を含む発現ベクターに関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードし、配列番号３、５、７、および９、またはそれらの断片に対してそれぞれ少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡを含む追加の配列を含む。

別の実施形態はＮｔＥＲＦ２２１をコードする単離されたｃＤＮＡを含み、配列番号１またはその断片に対して少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する発現ベクターを含む植物細胞株に関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードし、配列番号３、５、７、および９、またはそれらの断片に対してそれぞれ少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡを含む追加の配列を含む。

別の実施形態はＮｔＥＲＦ２２１をコードし、配列番号１と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその生物学的に活性な断片を含む発現ベクターを含む、トランスジェニック植物に関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードし、配列番号３、５、７、および９に対してそれぞれ少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性、またはそれらの断片を有する単離されたｃＤＮＡを含む第２の配列を含む。

別の実施形態はＮｔＥＲＦ２２１をコードし、配列番号１と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有するまたはその断片が単離されたｃＤＮＡを含む発現ベクターを植物に導入することを含む、植物におけるニコチンレベルを遺伝的に調節するための方法に関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターはさらに、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードし、配列番号３、５、７、および９に対してそれぞれ少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性を有するまたはそれらの断片を有する、単離されたｃＤＮＡを含む第２の配列を含む。

ＩＩＩ．アルカロイド産生を調節する転写因子を抑制する方法論
本技術のいくつかの実施形態では、アルカロイド産生を調節する転写因子を抑制し、アルカロイドレベルを変化させ、アルカロイドレベルを変化させた植物を産生するための方法および構築物が提供される。アルカロイド産生を調節する転写因子（例えば、ＮｔＥＲＦ２２１）を抑制するために使用され得る方法の例には、アンチセンス、センスコサプレッション、ＲＮＡｉ、人工マイクロＲＮＡ、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）、アンチセンス、センスコサプレッション、および標的突然変異誘発アプローチが含まれる。

ＲＮＡｉ技術は、ＲＮＡｉプラスミド構築物を使用する安定な形質転換を含む（ＨｅｌｌｉｗｅｌｌおよびＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．３９２：２４－３５（２００５））。このようなプラスミドは、逆方向反復構造においてサイレンシングされる標的遺伝子の断片から構成される。逆方向反復は、スペーサー、多くの場合はイントロンによって分離される。適当なプロモーターによって駆動されるＲＮＡｉコンストラクト、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターは植物ゲノムに組み込まれ、続いて導入遺伝子の転写により、自身で折りたたまれて二本鎖ヘアピンＲＮＡを形成するＲＮＡ分子が導かれる。この二本鎖ＲＮＡ構造は植物によって認識され、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる低分子ＲＮＡ（約２１ヌクレオチド長）に切断される。ｓｉＲＮＡは標的遺伝子のｍＲＮＡを直接分解するタンパク質複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。

人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）技術は植物および他の真核生物において内因性遺伝子をサイレンシングするように機能するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）経路を利用する（Ｓｃｈｗａｂら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１８：１１２１－３３（２００６）；Ａｌｖａｒｅｚら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１８：１１３４－５１（２００６））。この方法では、サイレンシングされる遺伝子の２１ヌクレオチド長の断片をｍｉＲＮＡ前駆体遺伝子に導入し、ａｍｉＲＮＡ前駆体の構築物を形成する。当業者に明らかな形質転換法を用いて、ｍｉＲＮＡ前駆体構築物を植物ゲノムに移す。ａｍｉＲＮＡ前駆体の転写後、プロセシングにより遺伝子を標的とするａｍｉＲＮＡが得られ、これは２１ヌクレオチドのａｍｉＲＮＡ配列とヌクレオチド相同性を共有する。

ＲＮＡｉサイレンシング技術において、２つの因子が断片の長さの選択に影響を及ぼし得る。断片が短いほど、効果的なサイレンシングが起こる頻度は低くなるが、ヘアピンが非常に長いと、細菌宿主株における組換えの機会が増える。サイレンシングの有効性も遺伝子に依存していると考えられ、または、遺伝子が活性化している細胞中の標的ｍＲＮＡとｈｐＲＮＡの相対的な量を反映している可能性がある。得られるサイレンシングの効率を最大にするためには、１００～８００ｂｐ、好ましくは３００～６００ｂｐの断片長が一般に適している。もうひとつ考慮すべきことは、標的とする遺伝子の部分である。５’ＵＴＲ、コード領域、および３’ＵＴＲ断片は、等しく良好な結果で使用され得る。サイレンシングの機構は配列相同性に依存するので、関連するｍＲＮＡ配列の交差サイレンシングの可能性がある。これが望ましくない場合、５’または３’ＵＴＲのような他の配列と低い配列類似性を有する領域が選択されるべきである。クロスホモロジーサイレンシングを避けるための規則は、構築物と非標的遺伝子配列との間に２０塩基以上の配列同一性のブロックを持たない配列を用いることである。これらの同じ原理の多くは、ａｍｉＲＮＡを設計するための標的領域の選択に適用される。

ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）技術は、植物の内在性－抗ウイルス防御を利用するＲＮＡｉ技術のバリエーションである。宿主ＤＮＡの断片を含む組換えＶＩＧＳウイルスを植物に感染させると、標的遺伝子の転写後遺伝子サイレンシングが起こる。一実施形態では、タバコガラガラウイルス（ＴＲＶ）ベースのＶＩＧＳ系を使用することができる。タバコガラガラウイルスに基づくＶＩＧＳ系は例えば、Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＰｌａｎｔＢｉｏｌ．２：１０９－１１３（１９９９）；Ｌｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ３０：２９６－３０３（２００３）；Ｒａｔｃｌｉｆｆら、ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ２５：２３７－２４５（２００１）；および米国特許第７，２２９，８２９号に記載されている。

アンチセンス技術は、目的の遺伝子によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを植物に導入することを含む。「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と相補的な塩基配列を有し、これを「センス」配列と呼ぶ。ｍＲＮＡのセンスセグメントの活性はアンチセンスｍＲＮＡセグメントによってブロックされ、それによって効果的に遺伝子発現を不活性化する。植物における遺伝子サイレンシングへのアンチセンスの適用は、Ｓｔａｍら，ＰｌａｎｔＪ．２１２７－４２（２０００）により詳細に記載されている。

センス共抑制技術は高度に発現されたセンス導入遺伝子を植物に導入し、導入遺伝子および内因性遺伝子の両方の発現を低減させることを含む（ＤｅｐｉｃｋｅｒおよびｖａｎＭｏｎｔａｇｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．９：３７３－８２（１９９７））。その効果は、導入遺伝子と内在性遺伝子の間の配列の同一性に依存する。

標的突然変異誘発技術、例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes；標的誘導局所病変）および高速中性子衝撃を使用する「ｄｅｌｅｔｅ－ａ－ｇｅｎｅ」を使用して、植物における遺伝子機能をノックアウトすることができる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１３５：６３０－６（２００４）；Ｌｉら、ＰｌａｎｔＪ．２７：２３５－２４２（２００１））。ＴＩＬＬＩＮＧでは、シードまたは個々の細胞を突然変異誘発物質で処理して点突然変異を引き起こし、次いで、シングルーヌクレオチド突然変異検出のための高感度の方法を用いて、対象となる遺伝子において発見される。所望の変異（例えば、目的の遺伝子産物の不活性化を生じる変異）の検出は例えば、ＰＣＲ法によって達成され得る。例えば、目的の遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドプライマーが調製され得、そしてＰＣＲは、変異誘発された集団における植物から目的の遺伝子の領域を増幅するために使用され得る。増幅された突然変異遺伝子を野生型遺伝子にアニーリングさせて、突然変異遺伝子と野生型遺伝子との間のミスマッチを見出すことができる。検出された差異は突然変異遺伝子を有する植物まで遡ることができ、それによって、どの突然変異誘発植物が所望の発現（例えば、目的の遺伝子のサイレンシング）を有するかを明らかにすることができる。次いで、これらの植物は、所望の発現を有する集団を産生するために選択的に繁殖され得る。ＴＩＬＬＩＮＧは、標的遺伝子の発現低下を示すミスセンス突然変異およびノックアウト突然変異を含む対立遺伝子シリーズを提供することができる。ＴＩＬＬＩＮＧは導入遺伝子の導入を伴わない遺伝子ノックアウトの可能なアプローチとして注目されており、したがって、使用者により受け入れられる可能性がある。高速中性子衝撃は植物ゲノムに突然変異、すなわち欠失を誘発し、これもＴＩＬＬＩＮＧと同様にＰＣＲを用いて検出することができる。

ＩＶ．宿主植物および細胞
いくつかの実施形態では、本技術がアルカロイド生合成を調節する転写因子（例えば、ＮｔＥＲＦ２２１）をコードするポリヌクレオチド配列を導入することによる植物または細胞の遺伝子操作に関する。従って、本技術は、植物におけるアルカロイド合成を減少または増加させるための方法論および構築物を提供する。さらに、本技術は、植物細胞においてアルカロイドおよび関連化合物を産生するための方法を提供する。

本技術において利用される植物は、単子葉植物および双子葉植物の両方、ならびに裸子植物を含む、遺伝子工学技術に従うアルカロイド産生高等植物のクラスを含む。いくつかの実施形態において、アルカロイド産生植物は、ナス科のニコチアナ（Nicotiana）属、デュボシア（Duboisia）属、ソラナム（Solanum）属、アントセルシス（Anthocercis）属、およびサルピグロシス（Salpiglossis）属や、キク科のエクリプタ（Eclipta）属およびジニア(Zinnia)属のニコチン性アルカロイド産生植物を含む。

当技術分野で知られているように、遺伝子および遺伝子構築物を植物に導入することができる多くの方法があり、植物形質転換および組織培養技術の組み合わせが、トランスジェニック作物植物を作製するための有効な戦略にうまく組み込まれている。

本技術で使用することができるこれらの方法は、他の箇所に記載されている（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２０５－２２５（１９９１）；Ｖａｓｉｌ，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：９２５－９３７（１９９４）；ＷａｌｄｅｎおよびＷｉｎｇｅｎｄｅｒ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：３２４－３３１（１９９５）；Ｓｏｎｇｓｔａｄら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，ＴｉｓｓｕｅおよびＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ４０：１－１５（１９９５））は、当業者に周知である。例えば、当業者は真空浸潤によるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩＳｃｉ．Ｖｉｅ，３１６：１１９４－１１９９（１９９３））または創傷接種（Ｋａｔａｖｉｃら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２４５：３６３－３７０（１９９４））に加えて、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｉ－プラスミド媒介形質転換（例えば、胚軸（ＤｅＢｌｏｃｋら、ｐｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４－７０１（１９８９））または子葉花弁（Ｍｏｌｏｎｅｙら、ｐｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．８：２３８－２４２（１９８９）創傷感染）、粒子衝撃／バイオリスティック法（Ｓａｎｆｏｒｄら、Ｊ．Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７－３７（１９８７）），（Ｎｅｈｒａら、ＰｌａｎｔＪ；５，２８５－２９７（１９９４）；（Ｂｅｃｋｅｒら、ＰｌａｎｔＪ．５：２９９－３０７（１９９４））またはポリエチレングリコール補助プロトプラスト形質転換法（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：２０４－２０７（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ３３５：２７４－２７６（１９８９））を使用して、他の植物種および作物種を同等に形質転換することが可能であることを確かに認識できる。

アグロバクテリウム・リゾジーン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）は例えば、Ｇｕｉｌｌｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＰｌａｎｔＢｉｏｌ．９：３４１－６（２００６）によって記載されるように、タバコを含む植物のトランスジェニック有毛根培養物を産生するために使用され得る。「タバコ毛状根」とは、ゲノムに組み込まれたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミド由来のＴ－ＤＮＡを有し、オーキシンおよび他の植物ホルモンの補充なしに培養下で増殖するタバコの根をいう。タバコの毛のある根は、タバコ植物全体の根としてニコチン性アルカロイドを産生する。

さらに、植物はＲｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、またはＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ形質転換によって形質転換される可能性がある。（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ４３３：６２９－６３３（２００５））。

植物細胞または植物の形質転換後、所望のＤＮＡが組み込まれた植物細胞または植物を接合性について評価し、抗生物質耐性、除草剤耐性、アミノ酸類似体に対する耐性などの方法によって、または表現型マーカーを使用して選択することができる（例えば、Ｐａｓｓｒｉｃｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３（３）：ｅ４５（２０１６）を参照されたい）。

植物細胞が遺伝子発現の変化を示すかどうかを決定するために、種々のアッセイ（例えば、ノーザンブロッティングまたは定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ））が使用され得る。全トランスジェニック植物は、従来の方法によって形質転換細胞から再生され得る。このようなトランスジェニック植物を増殖させ、自家受粉させて、ホモ接合系を産生することができる。このような植物は導入された形質についての遺伝子を含む種子を産生し、そして選択された表現型を産生する植物を産生するために成長され得る。

本技術に従って実施される改変アルカロイド含量は、疾患耐性、害虫耐性、高い収率または他の形質などの他の目的の形質と組み合わせることができる。例えば、アルカロイド含量を改変する適切な導入遺伝子を含む安定な遺伝子操作された形質転換体を用いて、改変アルカロイド含量形質を所望の商業的に許容される遺伝的バックグラウンドに導入し、それによって改変アルカロイドレベルを前記所望のバックグラウンドと組み合わせる品種または類似品種を得ることができる。例えば、ニコチンが低減した遺伝子操作タバコ植物を用いて、ＴＭＶ、ブランクシャンク、またはブルーカビに対する耐性などの疾患耐性形質を有するタバコ栽培品種に、低減したニコチン形質を導入することができる。あるいは、本技術の改変アルカロイド含有植物の細胞が目的の他の形質を付与する核酸構築物で形質転換され得る。

本技術はまた、アルカロイド生合成を調節する転写因子（例えば、ＮｔＥＲＦ２２１）をコードする核酸配列を有する細胞を遺伝的に操作することを意図する。

さらに、アルカロイド生合成遺伝子を発現する細胞には、アルカロイド合成のための基質利用能を増加させるための前駆体を供給することができる。細胞は、天然に存在するアルカロイドの類似物に組み込まれ得る前駆体の類似物で供給され得る。

本技術による構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換、粒子衝撃、エレクトロポレーション、およびポリエチレングリコール融合、またはカチオン性脂質媒介トランスフェクションなどの適切な技術を使用して、任意の植物細胞に導入することができる。

このような細胞は選択マーカーまたは可視マーカーを使用することなく、本技術の核酸構築物を用いて遺伝子操作され得、そしてトランスジェニック生物が導入された構築物の存在を検出することによって同定され得る。特定の細胞におけるタンパク質、ポリペプチド、または核酸分子の存在は例えば、細胞が首尾よく形質転換またはトランスフェクトされたかどうかを決定するために測定され得る。例えば、当技術分野でルーチンであるように、導入された構築物の存在は、ＰＣＲまたは特定の核酸またはポリペプチド配列を検出するための他の適切な方法によって検出することができる。さらに、遺伝的に操作された細胞は、増殖速度と比較した増殖速度の差異、または形質転換細胞の形態学的特徴、または同様の条件下で培養された非形質転換細胞の形態学的特徴を認識することによって同定され得る。ＷＯ２００４／０７６６２５を参照されたい。

本技術はまた、本明細書中に記載される核酸分子で形質転換され、そしてＮｔＥＲＦ２２１を発現する遺伝子操作された植物細胞を含むトランスジェニック植物細胞培養物を意図する。細胞はまた、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、またはＮｔＭＹＣ２ｂなどの少なくとも１つの追加の転写因子遺伝子、および／またはＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＯＤＣ、ＡＯ、ＱＳ、またはＭＰＯなどの少なくとも１つのニコチン生合成遺伝子を発現してもよい。

本技術はまた、本明細書中に記載される核酸分子で形質転換され、そしてＮｔＥＲＦ２２１を発現する遺伝子操作された細胞を含む細胞培養系を意図する。医薬において重要なトロパンアルカロイドであるスコポラミンを大規模に商業的に製造するためには、過剰発現するトランスジェニック毛根培養（ＰＭＴ）が効果的な手段を提供することが示されている。Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：６７８６－９１（２００４）。したがって、ＮｔＥＲＦ２２１を過剰発現させることによって、タバコ毛根培養において大規模または商業的量のニコチンアルカロイドを産生することができる。同様に、本技術はＮｔＥＲＦ２２１を発現させることによって大規模または商業的量のニコチンアルカロイド、ニコチン類似体、またはニコチン前駆体を産生するための細胞培養系（例えば、細菌細胞培養物または昆虫細胞培養物）を意図する。細胞はまた、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、またはＮｔＭＹＣ２ｂなどの少なくとも１つの付加的転写因子遺伝子、および／またはＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＯＤＣ、ＡＯ、ＱＳ、またはＭＰＯなどの少なくとも１つのニコチン生合成遺伝子を発現してもよい。

Ｄ．アルカロイド含量の定量
本技術のいくつかの実施形態において、遺伝子操作された植物および細胞は、低減したアルカロイド含量によって特徴付けられる。

アルカロイドレベルの定量的減少はいくつかの方法、例えば、気液クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合イムノソルベントアッセイに基づく定量によってアッセイすることができる。

本技術の植物を記載する際に、「減少した(decreased)アルカロイド植物」または「低減した(reduced)アルカロイド植物」という語句は、同じ種または類似種の対照植物のアルカロイド含量の約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％または約１％未満のレベルまでアルカロイド含量の減少を有する植物を包含する。

本技術のいくつかの実施形態では、遺伝子操作された植物が増加したアルカロイド含量によって特徴付けられる。同様に、遺伝子操作された細胞はアルカロイド産生の増加を特徴とする。

本技術の植物を記載する際に、「増加アルカロイド植物」という語句は、同じ種またはその類似体の対照植物のアルカロイド含量の約１０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約７５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、または約２００％を超えるアルカロイド含量の増加を有する遺伝子操作植物を包含する。

遺伝子操作に成功した細胞は、アルカロイド合成の増加を特徴とする。例えば、本技術の遺伝子操作された細胞は、対照細胞と比較して、より多くのニコチンを産生し得る。

ニコチン性アルカロイドレベルの定量的増加はいくつかの方法、例えば、気液クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合イムノソルベントアッセイに基づく定量によってアッセイすることができる。

ＩＩＩ．製品
アルカロイド生合成を調節するＮｔＥＲＦ２２１転写因子をコードするポリヌクレオチド配列は、アルカロイドレベルが変化した植物の生産に使用できる可能性がある。このような植物は有用な性質、例えば、増加したアルカロイド植物の場合には害虫耐性の増加、または減少したアルカロイド植物の場合には毒性の低減および嗜好性の増加を有することができる。

本技術の植物は、植物の収穫された部分に由来する産物の産生において有用であり得る。例えば、アルカロイド減少タバコ植物は、禁煙のためのニコチン低減タバコの製造に有用であり得る。増加したアルカロイドタバコ植物は、改変された危険性のタバコ製品の製造において有用であり得る。

さらに、本技術の植物および細胞は、治療薬、殺虫剤、または合成中間体として使用され得る、ニコチン類似体を含むアルカロイドまたはアルカロイド類似体の産生において有用であり得る。この目的のために、有毛根培養物、懸濁培養物、カルス培養物、およびシュート培養物を含むがこれらに限定されない、遺伝子操作された植物、細胞、または培養系から化合物を抽出することを含む、多様な方法によって、大規模または商業的量のアルカロイドおよび関連化合物を産生することができる。

ＩＶ．定義
本明細書において使用される全ての技術用語は生化学、分子生物学および農業において一般に使用される；したがって、それらは本技術が属する分野の当業者によって理解される。これらの技術用語は例えば、分子クローニング：実験室マニュアル第３版、１－３巻、サムブロックおよびラッセル著（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., vol. 1-3, ed Sambrook and Russel (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,2001); 分子生物学における現在のプロトコル、アウスベルら著（urrent Protocols In Molecular Biology, ed. Ausubel et al.(Green Publishing AssociatesおよびWiley-Interscience, New York, 1988)（周期的更新を含む）；分子生物学におけるショートプロトコル（Short Protocols In Molecular Biology: A Compendium Of Methods From Current Protocols In Molecular Biology 5th ed., vol. 1-2, ed.Ausubelら、(John Wiley および Sons, Inc., 2002)）；ゲノム分析（Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, ed.,Greenら、(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1997)）に見出すことができる。植物生物学技術を含む方法論は、本明細書中に記載され、そしてまた、植物分子生物学における方法（Methods In Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, ed., Maligaら, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995)）のような論文に詳細に記載される。

「アルカロイド」は、植物中に見出され、二次代謝によって産生される窒素含有塩基性化合物である。「ピロリジンアルカロイド」は、その分子構造の一部としてピロリジン環を含有するアルカロイド、例えばニコチンである。ニコチンおよび関連アルカロイドはまた、公表された文献においてピリジンアルカロイドとも呼ばれる。「ピリジンアルカロイド」は、その分子構造の一部としてピリジン環を含有するアルカロイド、例えばニコチンである。「ニコチン性アルカロイド」はニコチンまたはニコチンに構造的に関連し、ニコチン生合成経路で産生される化合物から合成されるアルカロイドである。例示的なニコチン性アルカロイドとしてはニコチン、ノルニコチン、アナタビン、アナバシン、アナタリン、Ｎ－メチルアナタビン、Ｎ－メチルアナバシン、ミオスミン、アナバシン、ホルミルノルニコチン、ニコチリン、およびコチニンが挙げられるが、これらに限定されない。タバコ葉中の他の非常に少量のニコチン性アルカロイドは例えば、Hechtら、Accounts of Chemical Research 12: 92-98(1979); Tso, T.G., Production, PhysiologyおよびBiochemistry of Tobacco PlantIdeals Inc., Beltsville, MO (1990)に報告されている。

本明細書で使用される「アルカロイド含量」は例えば、ｐｇ／ｇ乾燥重量（ＤＷ）またはｎｇ／ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）に関して、植物中に見出されるアルカロイドの総量を意味する。「ニコチン含量」は植物中に見出されるニコチンの総量を、例えば、ｍｇ／ｇのＤＷまたはＦＷを意味する。
「キメラ核酸」は、コード配列が天然に存在する細胞において関連するヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列に連結されたコード配列またはその断片を含む。

用語「エンコードする」および「コードする」とは、転写および翻訳のメカニズムを介して、一連のアミノ酸を特定のアミノ酸配列に組み立てて活性な酵素を産生することができる細胞に、遺伝子が情報を提供する過程を意味する。遺伝暗号の縮重のために、ＤＮＡ配列のある種の塩基変化はタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。

「内因性核酸」または「内因性配列」は、「天然」、すなわち本来植物または生物に備わっていることを意味し、これらの植物または生物が遺伝子操作されることとなる。これは、遺伝子操作されるべき植物または生物のゲノム中に存在する核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ分子をいう。

「外因性核酸」は、ヒトの作用によって細胞（または細胞の祖先）に導入された核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡを指す。このような外因性核酸は、それが導入された細胞において天然に見出される配列のコピー、またはその断片であり得る。

本明細書中で使用される場合、「発現」は、遺伝子の転写によるＲＮＡ産物の産生、またはヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物の産生を示す。「過剰発現」または「アップレギュレーション」は、細胞または植物（その由来のすべての子孫植物を含む）における特定の遺伝子配列またはその変異体の発現が対照細胞または植物と比較して、遺伝子工学によって増加したことを示すために使用される（例えば、「ＮｔＥＲＦ２２１過剰発現」）。

「遺伝子工学」は、核酸または特異的突然変異を宿主生物に導入するための任意の方法を包含する。例えば、植物は標的遺伝子の発現が対照植物と比較して低下するように、遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド配列で形質転換される場合、遺伝子操作される。植物に新規遺伝子の発現をもたらすポリヌクレオチド配列が導入された場合、または植物に自然に見出される遺伝子産物のレベルの増加をもたらす場合に、植物を遺伝子操作する。本文脈において、「遺伝子操作された」は遺伝子組換え植物および植物細胞、ならびに、例えば、Ｂｅｅｔｈａｍら、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：８７７４－８７７８（１９９９）およびＺｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵ．Ｓ．Ａ．９６、８７６８－８７７３（１９９９）によって記載されるように、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドの使用によってもたらされる標的突然変異誘発の手段によって産生される植物および植物細胞を含み、または国際特許公開ＷＯ２００３／０１３２２６に記載されているように、いわゆる「組換えオリオンヌクレオ塩基」を含む。同様に、遺伝子操作された植物や植物細胞は改変されたウイルスの導入により賛成することもあり得、これは、次に、宿主の遺伝子の改変をもたらし、改変植物における賛成と同様の結果となる。米国特許第４，４０７，９５６号を参照のこと。例えば、さらに、遺伝子操作された植物または植物細胞は宿主植物種または性的に適合する植物種に由来する核酸配列のみを導入することによって実施される、任意の天然のアプローチ（すなわち、外来ヌクレオチド配列を含まない）の産物であり得る。例えば、米国特許出願第２００４／０１０７４５５号を参照されたい。

「異種核酸」とは、細胞（または細胞の祖先）に導入されており、それが導入される細胞において天然に見出される配列のコピーではない核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡをいう。このような異種核酸は、それが導入された細胞において天然に見出される配列のコピーであるセグメント、またはその断片を含み得る。

「ホモ接合性」および「ホモ接合性」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。相同染色体対に存在する遺伝子の対立遺伝子が同一の場合、植物はホモ接合である。この植物から生じる配偶子はすべてその遺伝子座で同一であり、そのような植物は自殖では分離しない。したがって、非分離遺伝子型はホモ接合体集団を構成する。

「単離された核酸分子」とは、その天然の環境から除去された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意図する。例えば、ＤＮＡ構築物に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本技術の目的のために単離されたと考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持された組換えＤＮＡ分子、または溶液中で部分的にもしくは実質的に精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本技術のＤＮＡ分子のインビトロＲＮＡ転写物を含む。単離された核酸分子は本技術によれば、合成的に生成されたそのような分子をさらに含む。

「植物」とは、全植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、分化または未分化の植物細胞、およびその子孫を包含する用語である。植物材料としては種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、新芽、茎、果実、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子が挙げられるが、これらに限定されない。

「植物細胞培養」は、例えば、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合子、および様々な発生段階の胚のような植物単位の培養を意味する。本技術のいくつかの実施形態ではトランスジェニック組織培養物またはトランスジェニック植物細胞培養物が提供され、トランスジェニック組織または細胞培養物は本技術の核酸分子を含む。

「減少したアルカロイド植物」または「低減したアルカロイド植物」は、同じ種または品種の対照植物のアルカロイド含量の５０％未満、好ましくは１０％、５％または１％未満のレベルまでアルカロイド含量の減少を有する遺伝子操作植物を包含する。

「増加したアルカロイド植物」は、同じ種または品種の対照植物のアルカロイド含有量の１０％を超える、好ましくは５０％、１００％、または２００％を超えるアルカロイド含有量の増加を有する遺伝子操作植物を包含する。

「プロモーター」は転写開始点から上流にあるＤＮＡ領域に注目し、これはＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与して転写を開始する。「構成的プロモーター」は、植物の生涯にわたって、そしてほとんどの環境条件下で活性であるものである。組織特異的、組織嗜好的、細胞型特異的、および誘導性プロモーターは「非構成的プロモーター」のクラスを構成し、「作動可能に連結される」とは、プロモーターと第２の配列との間の機能的結合を意味し、ここで、プロモーター配列は第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始し、媒介する。概して、「作動可能に連結された」とは、連結される核酸配列が連続していることを意味する。

２つのポリヌクレオチド（核酸）またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の領域にわたる最大の対応のために整列された場合に同じである２つの配列における残基への言及を含む。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置はしばしば、保存的アミノ酸置換によって異なり、ここで、アミノ酸残基は、電荷および疎水性のような類似の化学的特性を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質を補正するために上方に調節され得る。このような保存的置換によって異なる配列は「配列類似性」または「類似性」を有すると言われており、この調節を行うための手段は当業者に周知である。典型的には、これは完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとして保存的置換をスコア付けし、それによって配列同一性のパーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０と１との間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に実装されているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，のアルゴリズムに従って計算される（ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃＢｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１－１７（１９８８）。

配列同一性のパーセンテージの本明細書における使用は比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値を示し、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は２つの配列の最適な整列のための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは一致した位置の数を生じるために同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージとする。

用語「抑制」または「ダウンレギュレーション」は、細胞または植物（その由来のすべての子孫植物を含む）におけるその特定の遺伝子配列変異体の発現が対照細胞または植物と比較して、遺伝子工学によって低下したことを示すために同義的に使用される（例えば、「ＮｔＥＲＦ２２１ダウンレギュレーション」）。

本明細書中で使用される場合、「相乗効果」は少なくとも２つの化合物の組み合わせ（例えば、ＮｔＥＲＦ２２１のような少なくとも２つの転写因子と、これらに限られないが好ましくはＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、およびＮｔＭＹＣ２ｂからなる関連するＮｔＭＹＣファミリーメンバーの群から選択される少なくとも１つのＭＹＣ転写因子遺伝子との組み合わせ過剰発現によって生成される効果、および／またはＮｔＥＲＦ２４１のようなＥＲＦ転写）または技術（例えば、ＮｔＥＲＦ２２１のような１つ以上の転写因子の過剰発現と、タバコ植物の処理または外因性ジャスモン酸処理との組み合わせによって生成される効果）によって生成され、そしてそうでなければ個々の化合物から生じるのであろう効果（例えば、ＮｔＥＲＦ２２１単独のような単一の転写因子の過剰発現によって生成される効果）または技術を超える、相加効果をいう。

「タバコ」または「タバコ植物」は、以下を含むがこれらに限定されないニコチアナアルカロイドを産生するニコチアナ属の任意の種を指す：Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｃａｕｌｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｃｕｍｉｎａｔａｖａｒ．ｍｕｌｔｚｊｌｏｒａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｆｒｉｃａｎａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｌａｔａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｒｅｎｔｓｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｔｔｅｎｕａｔａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｉｇｅｌｏｖｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｃａｖｉｃｏｌａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｃｏｒｙｍｂｏｓａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｄｅｂｎｅｙｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅｘｃｅｌｓｉｏｒ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｆｏｒｇｅｔｉａｎａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｆｒａｇｒａｎｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｇｌａｕｃａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｇｌｕｔｉｎｏｓａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｇｏｓｓｅｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｈｙｂｒｉｄ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｉｎｇｕｌｂａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｋａｗａｋａｍｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｋｎｉｇｈｔｉａｎａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｌａｎｇｓｄｏｒｆｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｌｉｎｅａｒｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍａｒｉｔｉｍａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｅｒｓｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｈｅｓｐｅｒｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｏｔｏｐｈｏｒａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐａｎｉｃｕｌａｔａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐａｕｃｚｊｌｏｒａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｒａｉｍｏｎｄｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｒｅｐａｎｄａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｒｏｓｕｌａｔａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｒｏｓｕｌａｔａｓｕｂｓｐ．ｉｎｇｕｌｂａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｒｕｓｔｉｃａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｉｍｕｌａｎｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｐｅｇａｕｉｎｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔｏｍｅｎｔｏｓａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｍｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｕｍｂｒａｔｉｃａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｕｎｄｕｌａｔａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｖｅｌｕｔｉｎａ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ，及び上記の種間雑種。

「タバコ製品」は例えば、カットタバコ、細断タバコ、ニコチンガム、および禁煙用パッチ、膨張（膨化）および再構成タバコを含むシガレットタバコ、シガータバコ、パイプタバコ、シガレット、シガー、ならびに咀嚼タバコ、嗅ぎタバコ、およびロゼンジなどのすべての形態の無煙タバコを含む、ニコチアナ植物によって生成される材料を含む製品を指す。

「転写因子」はＤＮＡ領域、典型的にはプロモーター領域に結合するタンパク質であり、ＤＮＡ結合ドメインを用いて、特定の遺伝子の転写を増加または減少させる。転写因子の発現がアルカロイド生合成酵素をコードする１つ以上の遺伝子の転写を増加させ、アルカロイド産生を増加させるならば、転写因子はアルカロイド生合成を「正に調節」する。転写因子の発現がアルカロイド生合成酵素をコードする１つ以上の遺伝子の転写を減少させ、アルカロイド産生を減少させるならば、転写因子はアルカロイド生合成を「負に調節」する。転写因子はそのＤＮＡ結合ドメインの類似性に基づいて分類される。（例えば、Ｓｔｅｇｍａｉｅｒら、ＧｅｎｏｍｅＩｎｆｏｒｍ．１５（２）：２７６－８６（（２００４）を参照のこと）。植物転写因子のクラスには、ＥＲＦ転写因子；Ｍｙｃ塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子；ホメオドメインロイシンジッパー転写因子；ＡＰ２エチレン応答因子転写因子；およびＢ３ドメイン、オーキシン応答因子転写因子が含まれる。

「変異体」は、特定の遺伝子またはポリペプチドの標準または所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列から逸脱するヌクレオチドまたはアミノ酸配列である。用語「アイソフォーム」、「アイソタイプ」、および「類似物」はまた、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「改変体」形態をいう。１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換、またはヌクレオチド配列の変化によって改変されるアミノ酸配列は、変異体配列と考えられ得る。ポリペプチド変異体は、「保存的」変化を有し得、ここで、置換されたアミノ酸は類似の構造的または化学的特性（例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換）を有する。ポリペプチド改変体は「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンへの置換）を有し得る。類似の小さな変異はまた、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方を含み得る。どのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失され得るかを決定する際の手引きは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＳｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，ＭＤ）ソフトウェアのような当該分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出され得る。変異体はまた、Ｍａｘｙｇｅｎがアサインした特許（例えば、米国特許第６，６０２，９８６号を参照のこと）に記載されるような「シャッフルされた遺伝子」をいう。

本明細書で使用されるように、用語「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。用語の使用がそれが使用される文脈を与えられた当業者に明らかでない場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。

「生物学的に活性な断片」という語は例えば、全長さのＮｔＥＲＦ２２１にも結合する抗体に結合することができるＮｔＥＲＦ２２１の断片を意味する。用語「生物学的に活性な断片」はまた、例えば、植物における遺伝子サイレンシングの誘導において有用であり得る、ＮｔＥＲＦ２２１の断片を意味し得る。いくつかの実施形態において、ＮｔＥＲＦ２２１の生物学的に活性な断片は、オープンリーディングフレーム配列（アミノ酸または核酸のいずれか）の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％であり得る。配列番号１は、コード領域ならびにその５’および３’上流および下流調節配列を含む、ＮｔＥＲＦ２２１のＯＲＦを示す。配列番号１は、６８４塩基対の長さである。ある実施形態において、ＮｔＥＲＦ２２１の生物学的に活性な核酸断片は例えば、少なくとも約１５の連続した核酸であり得る。さらに他の実施形態ではＮｔＥＲＦ２２１の生物学的に活性な核酸断片が約１５から約６８０までの連続核酸、またはこれらの２つの量の間の任意の値の連続核酸、例えば、限定されないが、約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、または約６７５の連続核酸であり得る。

以下の実施例は、例示のためだけに提供され、限定のためではない。当業者は、本質的に同じまたは類似の結果をもたらすように変更または修正することができる様々な重要でないパラメータを容易に認識するのであろう。実施例は添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本技術の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。

材料及び方法
植物材料および形質転換。
タバコ植物（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．ｖａｒ．Ｋ３２６）を、本明細書中に記載される全ての試験および遺伝子形質転換のために使用した。野生型またはトランスジェニック種子をＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（ＭＳ）プレート上で発芽させた。定量的ＲＴ－ＰＣＲのために、発芽した小さな実生をより大きなＭＳプレート上に移し、２週齢まで垂直に成長させた後、０．１％ＤＭＳＯ（対照）または１００μＭＭｅＪＡで処理した。ＴＬＣおよびＧＣ－ＭＳ分析のために、発芽した実生を土壌に移し、ＤＭＳＯまたはＭｅＪＡ処理の５週齢まで通常の条件下で成長させた。各トランスジェニックベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４を、以前に記載された実験手順（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５）に従って、タバコの遺伝子形質転換のために使用した。少なくとも８つのＴ_０遺伝子導入植物をゲノムＤＮＡＰＣＲによって確認し、次いで自家受粉させてＴ_１世代を生じさせた。Ｔ_１植物を、５０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシンを含むＭＳプレート上でスクリーニングし、ゲノムＤＮＡＰＣＲによって検証し、次いで温室内で増殖させ、自家受粉させて、Ｔ_２世代を生じさせた。本研究では、非分離Ｔ_２タバコ種子を使用した。

非分離Ｔ_２トランスジェニックタバコ種子の選択。
まず、８～１０個のＴ_０遺伝子組換え植物をゲノムＤＮＡＰＣＲにより遺伝子組換え断片の有無を確認した。次いで、それらを温室内で増殖させ、自家受粉させて、Ｔ_１世代種子を生成し、続いて、選択的抗生物質であるヒグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含む発芽培地上でスクリーニングした。発芽実生はゲノムＤＮＡＰＣＲによりさらに検証した。その後、これらのＴ_１世代はＴ_２世代の種子を作り出すために、温室内で成長させ、自主受粉させた。分離試験のために、ヒグロマイシンを含む同じ発芽培地で、異なるＴ_２世代の種子ロットを試験した。本研究では、非分離Ｔ_２遺伝子導入タバコ実生を用いた。

ＤＮＡクローニングおよびベクター構築。
ＮｔＥＲＦ１０（ＣＱ８０８８４５）、ＮｔＥＲＦ３２（ＡＢ８２８１５４）、ＮｔＥＲＦ１２１（ＡＹ６５５７３８）、ＮｔＥＲＦ２２１（ＣＱ８０８９８２）、およびＮｔＭＹＣ２ａ（ＨＭ４６６９７４）のコード領域（ＣＤＳ）を、ＰｈｕｓｉｏｎＨｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、配列確認のためにＢＰ組換え反応を介してＧａｔｅｗａｙｐＤＯＮＲ２２１ベクターに導入した。グリシンマックスユビキチン３（ＧｍＵＢＩ３）遺伝子のＰＣＲ増幅プロモーター配列とＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＰＭＴ１ａ（ＮｔＰＭＴ１ａ）遺伝子（配列番号２）に由来する合成された４ＧＡＧプロモーターを用いて、Ｇａｔｅｗａｙ適合のためにバイナリーベクターｐＭＤＣ３２中の元の二重カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（２Ｘ３５Ｓ）、すなわちｐＧｍＵＢＩ３－ＭＤＣとｐ４ＧＡＧ－ＭＤＣをそれぞれ置換した。次いで、ｐＤＯＮＲ２２１における配列検証された遺伝子を、それぞれｐＭＤＣ３２、ｐＧｍＵＢＩ３－ＭＤＣおよびｐ４ＧＡＧ－ＭＤＣにサブクローニングした。得られた構築物を３５Ｓ：ＥＲＦ１０、３５Ｓ：ＥＲＦ３２、３５Ｓ：ＥＲＦ１２１、３５Ｓ：ＥＲＦ２２１、３５Ｓ：ＭＹＣ２ａ、ＧｍＵＢＩ３：ＥＲＦ１０、ＧｍＵＢＩ３：ＥＲＦ３２、ＧｍＵＢＩ３：ＥＲＦ１２１、ＧｍＵＢＩ３：ＥＲＦ２２１、ＧｍＵＢＩ３：ＭＹＣ２ａ、４ＧＡＧ：ＥＲＦ１０、４ＧＡＧ：ＥＲＦ３２、４ＧＡＧ：ＥＲＦ１２１、４ＧＡＧ：ＥＲＦ２２１、および４ＧＡＧ：ＭＹＣ２ａと命名した。

ＲＮＡ単離および定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）。
遺伝子発現解析のために、ＲＮＡ単離のための１サンプルとして５～６の２週齢実生を一緒に採取した。全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の指示に従って単離した。ＤＮＡ混入物を、ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて全ＲＮＡから除去した。次いで、ＤＮＡが除去された全ＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写した。定量ＰＣＲは、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上で、ｉＴａｑ（商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎスーパーミックス（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行った。各遺伝子の相対的発現量をＮ．ｔａｂａｃｕｍＥｌｏｎｇａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ１－ａｌｐｈａ（ＮｔＥＦ－１α，ＳｃｈｍｉｄｔおよびＤｅｌａｎｅｙ，２０１０）で標準化した。

アルカロイド抽出および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）。
アルカロイド抽出は、Ｇｏｏｓｓｅｎｓら（２００３）によって記載されているように行った。簡潔には、ＤＭＳＯまたはＭｅＪＡ処理の４８時間後の５週齢野生型またはトランスジェニック実生からの葉を収集し、凍結乾燥した。１０ｍｇの凍結乾燥組織を液体窒素中でホモジナイズし、１０％ＮＨ_４ＯＨで塩基性化し、１００μｇのキナルジンを内標準物質として加えた。全アルカロイドをＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、減圧濃縮し、２００μＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に再懸濁した。ＴＬＣアッセイのために、各系統の３つの個体からのアルカロイド抽出物を一緒に混合し、次いで、異なる系統からの同量の抽出物をシリカゲルＴＬＣプレート（ＵＶ２５４、Ａｎａｌｔｅｃｈ）にスポットした。分離はジクロロメタン：メタノール：１０％ＮＨ_４ＯＨ（１２５：１５：２）からなる移動相で行い、スポットは、ドラゲンドルフ（Dragendorff）試薬（シグマ－アルドリッチ）を用いた噴霧によって可視化した。

ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）。
ニコチンのＧＣ－ＭＳ分析のために、内部標準としてナフタレン－ｄ８でアルカロイドを抽出した。各トランスジェニック系統について、全アルカロイドを６～８匹の５週齢の独立した個体から抽出した。ニコチン濃度は、以前に開発されたプロトコル（Ｇｏｏｓｓｅｎｓら，（２００３）；Ｚｈａｎｇら，（２０１２））を用いて、島津製作所製ＧＣＭＳＱＰ２０１０プラスシステムで測定した。統計的検定は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＲ（バージョン３．４．４）を用いたＴｕｋｅｙの正常有意差（ＴｕｋｅｙＨＳＤ）検定によって行った。

実施例１：ＮｔＥＲＦ２２１、ＮｔＥＲＦ３２、およびＮｔＭＹＣ２ａの過剰発現によるニコチン産生の増加
市販グレードのタバコ植物における実際のニコチン蓄積に及ぼすニコチン生合成に密接に関連する遺伝子のそれぞれの影響を明らかにするために、インフルエンザ硬化タバコ品種Ｋ３２６における異なるプロモーターの制御下で遺伝子をクローニングし、過剰発現させた。これらの遺伝子には、ニコチン生合成の制御に以前から関与している５つの転写因子（ＴＦ）遺伝子、すなわちＮｔＥＲＦ１０、ＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ１２１、ＮｔＥＲＦ２２１およびＮｔＭＹＣ２ａが含まれていた（表１）。

構築物は３つの異なるプロモーターを採用した：（ａ）２重増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（２Ｘ３５Ｓ）が明確な高レベル構成的発現を与える、（ｂ）以前にタバコで高発現することが示された構成的ＧｍＵＢＩ３遺伝子プロモーター（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｇａｒｃｉａら，２０１０），（ｃ）新規ジャスモネート（ＪＡ）誘導性プロモーターであるＧＡＧ調節モチーフの４コピーとＮｔＰＭＴ１ａプロモーターに由来する最小プロモーターが融合（４ＧＡＧ）してアルカロイド形成と一致する組織特異的およびＪＡ調節発現を与える（配列番号２）。

各遺伝子を、それぞれ、上記の３つの異なるプロモーターの制御下で、３つの異なる発現構築物に入れた（図３Ａ）。インフルエンザ治癒タバコＮ．ｔａｂａｃｕｍＫ３２６によるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換により形質転換体を作製した。各構築物について、少なくとも８系統がゲノムＰＣＲによりゲノムに安定的に組み込まれた導入遺伝子を有することが確認され、導入遺伝子の無傷構造が検証され、標準的な実践として遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲにより測定された導入遺伝子発現の相対レベルが確認された。野生型よりも高いニコチン蓄積を有する形質転換体を迅速に同定するために、ニコチンのレベルをＴＬＣ分析によって評価した。高められたニコチン表現型に基づいて選択された個体はＴ_０からＴ_１世代に進むために、温室で成長され、手動で自家受粉され、結果として得られたＴ_１植物は、分離されていない子孫についてスクリーニングされた。Ｔ_１系統も同様に自家受粉を行い、結果として得られたＴ_２植物を分析した。Ｔ_２形質転換遺伝子導入植物からのＴＬＣ結果は、ＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ２２１、およびＮｔＭＹＣ２ａ導入遺伝子の過剰発現が構成的または条件的な導入遺伝子の過剰発現の結果としてニコチン蓄積を有意に上昇させることを明らかにした（図３Ｂ）。Ｔ_２形質転換系統におけるそれぞれの遺伝子の転写産物量も、ＲＴ－ｑＰＣＲにより野生型のそれと比較した。図４に示すように、ＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ２２１、またはＮｔＭＹＣ２ａの構成的過剰発現は、ＭｅＪＡ刺激の有無にかかわらず、野生型と比較した場合、その高い転写レベルで持続した。４ＧＡＧプロモーターによって制御されると、これら３つの遺伝子はＭｅＪＡによって誘導された発現パターンを示したが、各遺伝子の基礎転写レベルも野生型より高く（図４）、４ＧＡＧプロモーターは細胞内ＪＡの基礎／自然レベルに非常に感受性である可能性が示唆された。

トランスジェニック系統と野生型との間の比較のためにニコチン濃度をさらに定量するために、ＧＣ－ＭＳ分析を、ＤＭＳＯ（対照）またはＭｅＪＡで処理した５週齢野生型またはトランスジェニック植物の葉組織から抽出した全アルカロイドを用いて分析した。異なるトランスジェニック系統の中で、ＮｔＥＲＦ２２１の過剰発現は、葉において最高のニコチン濃度を与えた（図５）。野生型と比較して、ＧｍＵＢＩ３：ＥＲＦ２２１の系統＃５は、ＭｅＪＡ誘発なしで約４．５倍高いニコチン濃度を与え、ＭｅＪＡで処理した場合、約９倍高いニコチン濃度を与えた。ＮｔＭＹＣ２ａを過剰発現するトランスジェニック系統では、野生型と比較して約１．５～３倍のニコチン蓄積の増加が認められた（図５）。３５Ｓ：ＭＹＣ２ａ系統はＧｍＵＢＩ３：ＭＹＣ２ａおよび４ＧＡＧ：ＭＹＣ２ａ系統よりもわずかに高いニコチン濃度を有したが、大部分のＮｔＥＲＦ２２１過剰発現系統における濃度ほど高くはなかった。ＪＡ誘導性４ＧＡＧプロモーターと比較して、両方の構成的プロモーターは、ＭｅＪＡ処理後に平均してより高いニコチン産生を与えた（図５）。

したがって、これらの結果は、ＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ２２１またはＮｔＭＹＣ２ａ導入遺伝子を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物が植物における構成的または条件的導入遺伝子の過剰発現の結果としてニコチン蓄積を有意に上昇させることを実証する。

実施例２：ＮｔＥＲＦ２２１によるニコチン生合成に関与する遺伝子の調節制御
ＮｔＥＲＦ３２、ＮｔＥＲＦ２２１、またはＮｔＭＹＣ２ａを過剰発現するトランスジェニック材料におけるニコチン生合成遺伝子の発現レベルに関する研究は、ＴＦとニコチン生合成酵素間の関係および動態をよりよく理解するための手がかりを提供した。図６に示すように、ＮｔＡＯ、ＮｔＯＤＣ、ＮｔＰＭＴ、ＮｔＱＰＴ、およびＮｔＱＳのＪＡ誘導転写物蓄積は、ＮｔＥＲＦ２２１を過剰発現するトランスジェニックタバコでは試験した野生型または他のトランスジェニックタバコよりもはるかに大きかった。これら５つの構造遺伝子の発現はすべてＭｅＪＡ処理に応答性であったが、これら５つの遺伝子のＭｅＪＡ誘導転写物アップレギュレーションにおける明らかな違いは野生型とＮｔＥＲＦ３２またはＮｔＭＹＣ２ａトランスジェニックタバコの間で観察できなかった（図６）。

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同等物
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配列番号１（６８４bp）
NtERF２２１（XM＿０１６６２２８１９）の開読み出しフレーム（ORF）：
atgaatcccgctaatgcaaccttctctttctctgagcttgatttccttcaatcaatagaaaaccatcttctgaattatgattccgatttttctgaaattttttcgccgatgagttcaagtaacgcattgcctaatagtcctagctcaagttttggcagcttcccttcagcagaaaatagcttggatacctctctttgggatgaaaactttgaggaaacaatacaaaatctcgaagaaaagtccgagtccgaggaggaaacaaaggggcatgtcgtggcgcgtgagaaaaacgcgacacaagattggagacggtacataggagttaaacggcggccgtgggggacgttttcggcggagataagggacccggagagaagaggcgcgagattatggctaggaacttacgagaccccagaggacgcagcattggcttacgatcaagccgctttcaaaatccgcggctcgagagctcggctcaattttcctcacttaattggatcaaacattcctaagccggctagagttacagcgagacgtagccgtacgcgctcaccccagccatcgtcttcttcatgtacctcatcatcagaaaatgggacaagaaaaaggaaaatagatttgataaattccatagccaaagcaaaatttattcgtcatagctggaacctacaaatgttgctataa
配列番号２（３７８bp）
４ X GAGプロモーターのDNA配列：
CTAACCCTGCACGTTGTAATGAATTTTTAACTATTATATTATATCGAGTTGCGCCCTCCACTTCTAGTCTAACCCTGCACGTTGTAATGAATTTTTAACTATTATATTATATCGAGTTGCGCCCTCCACTTCTAGTCTAACCCTGCACGTTGTAATGAATTTTTAACTATTATATTATATCGAGTTGCGCCCTCCACTTCTAGTCTAACCCTGCACGTTGTAATGAATTTTTAACTATTATATTATATCGAGTTGCGCCCTCCACTTCTAGAAATTGTATTTAAATGCATAGATGTTTATTGGGAGTGTACAGCAATCTTTCGGAAAATACAAACCATAATACTTTCTCTTCTTCAATTTGTTTAGTTTAATTTTGAA
BOLD = Gボックス
ITALICS = GCCモチーフ
BOLD UNDERLINED = TATAボックス
BOLD ITALICS UNDERLINED = 転写開始部位
配列番号３（２０４６bp）
NtMYC１aのORF
１ atgactgatt acagcttacc caccatgaat ttgtggaata ctagtggtac taccgatgac
６１ aacgttacta tgatggaagc ttttatgtct tctgatctca cttcattttg ggctacttct
１２１ aattctactg ctgttgctgc tgttacctct aattctaatc atattccagt taatacccca
１８１ acggttcttc ttccgtcttc ttgtgcctct actgtcacag ctgtggctgt cgatgcttca
２４１ aaatccatgt cttttttcaa ccaagaaacc cttcaacagc gtcttcaaac gctcattgat
３０１ ggtgctcgtg agacgtggac ctatgccatc ttttggcagt catccgccgt tgatttaacg
３６１ agtccgtttg tgttgggctg gggagatggt tactacaaag gtgaagaaga taaagccaat
４２１ aggaaattag ctgtttcttc tcctgcttat atagctgagc aagaacaccg gaaaaaggtt
４８１ ctccgggagc tgaattcgtt gatttccggc acgcaaaccg gcactgatga tgccgtcgat
５４１ gaagaagtta ccgacactga atggttcttc cttatttcca tgacccagtc gtttgttaac
６０１ ggaagtgggc ttccgggtca ggccttatac aattccagcc ctatttgggt cgccggagca
６６１ gagaaattgg cagcttccca ctgcgaacgg gctcggcagg cccagggatt cgggcttcag
７２１ acgatggttt gtattccttc agcaaacggc gtggttgaat tgggctccac ggagttgatt
７８１ attcagagtt ctgatctcat gaacaaggtt agagtattgt ttaacttcaa taatgatttg
８４１ ggctctggtt cgtgggctgt gcaacccgag agcgatccgt ccgctctttg gctcactgat
９０１ ccatcgtctg cagctgtaca agtcaaagat ttaaatacag ttgaggcaaa ttcagttcca
９６１ tcaagtaata gtagtaagca agttgtattt gataatgaga ataatggtca cagttgtgat
１０２１ aatcagcaac agcaccattc tcggcaacaa acacaaggat tttttacaag ggagttgaac
１０８１ ttttcagaat tcgggtttga tggaagtagt aataatagga atgggaattc atcactttct
１１４１ tgcaagccag agtcggggga aatcttgaat tttggtgata gcactaagaa aagtgcaaat
１２０１ gggaacttat tttccggtca gtcccatttt ggtgcagggg aggagaataa gaagaagaaa
１２６１ aggtcacctg cttccagagg aagcaatgaa gaaggaatgc tttcatttgt ttcaggtaca
１３２１ atcttgcctg cagcttctgg tgcgatgaag tcaagtggat gtgtcggtga agactcctct
１３８１ gatcattcgg atcttgaggc ctcagtggtg aaagaagctg aaagtagtag agttgtagaa
１４４１ cccgaaaaga ggccaaagaa gcgaggaagg aagccagcaa atggacgtga ggaacctttg
１５０１ aatcacgtcg aagcagagag gcaaaggaga gagaaattaa accaaaggtt ctacgcttta
１５６１ agagctgttg ttccgaatgt gtccaagatg gacaaggcat cactgcttgg agatgcaatt
１６２１ tcatatatta atgagctgaa gttgaagctt caaactacag aaacagatag agaagacttg
１６８１ aagagccaaa tagaagattt gaagaaagaa ttagatagta aagactcaag gcgccctggt
１７４１ cctccaccac caaatcaaga tcacaagatg tctagccata ctggaagcaa gattgtagat
１８０１ gtggatatag atgttaagat aattggatgg gatgcgatga ttcgtataca atgtaataaa
１８６１ aagaaccatc cagctgcaag gttaatggta gccctcaagg agttagatct agatgtgcac
１９２１ catgccagtg tttcagtggt gaatgatttg atgatccaac aagccacagt gaaaatgggt
１９８１ agcagacttt acacggaaga gcaacttagg atagcattga catccagagt tgctgaaaca
２０４１ cgctaa
配列番号４（６８１ AA）
NtMYC１aポリペプチド
１ mtdyslptmn lwntsgttdd nvtmmeafms sdltsfwats nstavaavts nsnhipvntp
６１ tvllpsscas tvtavavdas ksmsffnqet lqqrlqtlid garetwtyai fwqssavdlt
１２１ spfvlgwgdg yykgeedkan rklavsspay iaeqehrkkv lrelnslisg tqtgtddavd
１８１ eevtdtewff lismtqsfvn gsglpgqaly nsspiwvaga eklaashcer arqaqgfglq
２４１ tmvcipsang vvelgsteli iqssdlmnkv rvlfnfnndl gsgswavqpe sdpsalwltd
３０１ pssaavqvkd lntveansvp ssnsskqvvf dnennghscd nqqqhhsrqq tqgfftreln
３６１ fsefgfdgss nnrngnssls ckpesgeiln fgdstkksan gnlfsgqshf gageenkkkk
４２１ rspasrgsne egmlsfvsgt ilpaasgamk ssgcvgedss dhsdleasvv keaessrvve
４８１ pekrpkkrgr kpangreepl nhveaerqrr eklnqrfyal ravvpnvskm dkasllgdai
５４１ syinelklkl qttetdredl ksqiedlkke ldskdsrrpg ppppnqdhkm sshtgskivd
６０１ vdidvkiigw damiriqcnk knhpaarlmv alkeldldvh hasvsvvndl miqqatvkmg
６６１ srlyteeqlr ialtsrvaet r
配列番号５（２０４０bp）
NtMYC１b ORF
１ cgcagacccc tcttttcacc catttctctc tctctctctc tctctctctc tatatatata
６１ tatatctttc acgccaccat atccaactgt ttgtgctggg tttatggaat gactgattac
１２１ agcttaccca ccatgaattt gtggaatact agtggtacta ccgatgacaa cgtttctatg
１８１ atggaatctt ttatgtcttc tgatctcact tcattttggg ctacttctaa ttctactact
２４１ gctgctgtta cctctaattc taatcttatt ccagttaata ccctaactgt tcttcttccg
３０１ tcttcttgtg cttctactgt cacagctgtg gctgtcgatg cttcaaaatc catgtctttt
３６１ ttcaaccaag aaactcttca gcagcgtctt caaaccctca ttgatggtgc tcgtgagacg
４２１ tggacctatg ccatcttttg gcagtcatcc gtcgttgatt tatcgagtcc gtttgtgttg
４８１ ggctggggag atggttacta caaaggtgaa gaagataaag ccaataggaa attagctgtt
５４１ tcttctcctg cttatattgc tgagcaagaa caccgaaaaa aggttctccg ggagctgaat
６０１ tcgttgatct ccggcacgca aaccggcact gatgatgccg tcgatgaaga agttaccgac
６６１ actgaatggt tcttccttat ttccatgacc caatcgtttg ttaacggaag tgggcttccg
７２１ ggtcaggcct tatacaattc cagccctatt tgggtcgccg gagcagagaa attggcagct
７８１ tcccactgcg aacgggctcg gcaggcccag ggattcgggc ttcagacgat ggtttgtatt
８４１ ccttcagcaa acggcgtggt tgaattgggc tccacggagt tgataatcca gagttgtgat
９０１ ctcatgaaca aggttagagt attgtttaac ttcaataatg atttgggctc tggttcgtgg
９６１ gctgtgcagc ccgagagcga tccgtccgct ctttggctca ctgatccatc gtctgcagct
１０２１ gtagaagtcc aagatttaaa tacagttaag gcaaattcag ttccatcaag taatagtagt
１０８１ aagcaagttg tgtttgataa tgagaataat ggtcacagtt ctgataatca gcaacagcag
１１４１ cattctaagc atgaaacaca aggatttttc acaagggagt tgaatttttc agaatttggg
１２０１ tttgatggaa gtagtaataa taggaatggg aattcatcac tttcttgcaa gccagagtcg
１２６１ ggggaaatct tgaattttgg tgatagtact aagaaaagtg caaatgggaa cttattttcg
１３２１ ggtcagtccc attttggggc aggggaggag aataagaaca agaaaaggtc acctgcttcc
１３８１ agaggaagca atgaagaagg aatgctttca tttgtttcgg gtacaatctt gcctgcagct
１４４１ tctggtgcga tgaagtcaag tggaggtgta ggtgaagact ctgatcattc ggatcttgag
１５０１ gcctcagtgg tgaaagaagc tgaaagtagt agagttgtag aacccgaaaa gaggccaaag
１５６１ aagcgaggaa ggaagccagc aaatggacgg gaggaacctt tgaatcacgt cgaagcagag
１６２１ aggcaaagga gagagaaatt aaaccaaagg ttctacgcat taagagctgt tgttccgaat
１６８１ gtgtccaaga tggacaaggc atcactgctt ggagatgcaa tttcatatat taatgagctg
１７４１ aagttgaagc ttcaaaatac agaaacagat agagaagaat tgaagagcca aatagaagat
１８０１ ttaaagaaag aattagttag taaagactca aggcgccctg gtcctccacc atcaaatcat
１８６１ gatcacaaga tgtctagcca tactggaagc aagattgtag acgtggatat agatgttaag
１９２１ ataattggat gggatgcgat gattcgtata caatgtaata aaaagaatca tccagctgca
１９８１ aggttaatgg tagccctcaa ggagttagat ctagatgtgc accatgccag tgtttcagtg
２０４１ gtgaacgatt tgatgatcca acaagccact gtgaaaatgg gtagcagact ttacacggaa
２１０１ gagcaactta ggatagcatt gacatccaga gttgctgaaa cacgctaa
配列番号６（６７９ AA）
NtMYC１bポリペプチド
１ mtdyslptmn lwntsgttdd nvsmmesfms sdltsfwats nsttaavtsn snlipvntlt
６１ vllpsscast vtavavdask smsffnqetl qqrlqtlidg aretwtyaif wqssvvdlss
１２１ pfvlgwgdgy ykgeedkanr klavsspayi aeqehrkkvl relnslisgt qtgtddavde
１８１ evtdtewffl ismtqsfvng sglpgqalyn sspiwvagae klaashcera rqaqgfglqt
２４１ mvcipsangv velgstelii qscdlmnkvr vlfnfnndlg sgswavqpes dpsalwltdp
３０１ ssaavevqdl ntvkansvps snsskqvvfd nennghssdn qqqqhskhet qgfftrelnf
３６１ sefgfdgssn nrngnsslsc kpesgeilnf gdstkksang nlfsgqshfg ageenknkkr
４２１ spasrgsnee gmlsfvsgti lpaasgamks sggvgedsdh sdleasvvke aessrvvepe
４８１ krpkkrgrkp angreeplnh veaerqrrek lnqrfyalra vvpnvskmdk asllgdaisy
５４１ inelklklqn tetdreelks qiedlkkelv skdsrrpgpp psnhdhkmss htgskivdvd
６０１ idvkiigwda miriqcnkkn hpaarlmval keldldvhha svsvvndlmi qqatvkmgsr
６６１ lyteeqlria ltsrvaetr

配列番号７（２２１４bp）
NtMYC２a gene
CACACACTCTCTCCATTTTCACTCACTCCTTATCACCAAACAATTCTTGGGTGTTTGAATATATACCCGAAATAATTTCCTCTCTGTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTTGTCTGTTTTTTTTTCTTGATTTTGTTATATGGAATGACGGATTATAGAATACCAACGATGACTAATATATGGAGCAATACTACATCCGATGATAATATGATGGAAGCTTTTTTATCTTCTGATCCGTCGTCGTTTTGGCCCGGAACAACTACTACACCAACTCCCCGGAGTTCAGTTTCTCCAGCGCCGGCGCCGGTGACGGGGATTGCCGGAGACCCATTAAAGTCTATGCCATATTTCAACCAAGAGTCACTGCAACAGCGACTCCAGACTTTAATCGATGGGGCTCGCAAAGGGTGGACGTATGCCATATTTTGGCAATCGTCTGTTGTGGATTTCGCGAGCCCCTCGGTTTTGGGGTGGGGAGATGGGTATTATAAAGGTGAAGAAGATAAAAATAAGCGTAAAACGGCGTCGTTTTCGCCTGACTTTATCACGGAACAAGCACACCGGAAAAAGGTTCTCCGGGAGCTGAATTCTTTAATTTCCGGCACACAAACCGGTGGTGAAAATGATGCTGTAGATGAAGAAGTAACTGATACTGAATGGTTTTTTCTGATTTCCATGACACAATCGTTTGTTAACGGAAGCGGGCTTCCGGGCCTGGCGATGTATAGTTCAAGCCCGATTTGGGTTACTGGAACAGAGAGATTAGCTGTTTCTCACTGTGAACGGGCCCGACAGGCCCAAGGTTTCGGGCTTCAGACTATTGTTTGTATTCCTTCAGCTAATGGTGTTGTTGAGCTCGGGTCAACTGAGTTGATATTCCAGACTGCTGATTTAATGAACAAGGTTAAAGTTTTGTTTAATTTTAATATTGATATGGGTGCGACTACGGGCTCAGGATCGGGCTCATGTGCTATTCAGGCCGAGCCCGATCCTTCAGCCCTTTGGCTGACTGATCCGGCTTCTTCAGTTGTGGAAGTCAAGGATTCGTCGAATACAGTTCCTTCAAGGAATACCAGTAAGCAACTTGTGTTTGGAAATGAGAATTCTGAAAATGGTAATCAAAATTCTCAGCAAACACAAGGATTTTTCACTAGGGAGTTGAATTTTTCCGAATATGGATTTGATGGAAGTAATACTCGGTATGGAAATGGGAATGCGAATTCTTCGCGTTCTTGCAAGCCTGAGTCTGGTGAAATCTTGAATTTTGGTGATAGTACTAAGAGGAGTGCTTGCAGTGCAAATGGGAGCTTGTTTTCGGGCCAATCACAGTTCGGGCCCGGGCCTGCGGAGGAGAACAAGAACAAGAACAAGAAAAGGTCACCTGCATCAAGAGGAAGCAACGATGAAGGAATCCTTTCATTTGTTTCGGGTGTGATTTTGCCAAGTTCAAACACGGGGAAGTCCGGTGGAGGTGGCGATTCGGATCAATCAGATCTCGAGGCTTCGGTGGTGAAGGAGGCGGATAGTAGTAGAGTTGTAGACCCCGAGAAGAAGCCGAGGAAACGAGGGAGGAAACCGGCTAACGGGAGAGAGGAGCCATTGAATCATGTGGAGGCAGAGAGACAAAGGAGGGAGAAATTGAATCAAAGATTCTATGCACTTAGAGCTGTTGTACCAAATGTGTCAAAAATGGATAAAGCATCACTTCTTGGTGATGCAATTGCATTTATCAATGAGTTGAAATCAAAGGTTCAGAATTCTGACTCAGATAAAGAGGACTTGAGGAACCAAATCGAATCTTTAAGGAATGAATTAGCCAACAAGGGATCAAACTATACCGGTCCTCCCCCGTCAAATCAAGAACTCAAGATTGTAGATATGGACATCGACGTTAAGGTGATCGGATGGGATGCTATGATTCGTATACAATCTAATAAAAAGAACCATCCAGCCGCGAGGTTAATGACCGCTCTCATGGAATTGGACTTAGATGTGCACCATGCTAGTGTTTCAGTTGTCAACGAGTTGATGATCCAACAAGCGACTGTGAAAATGGGAAGCCGGCTTTACACGCAAGAACAACTTCGGATATCATTGACATCCAGAATTGCTGAATCGCGATGAAGAGAAATACAGTAAATGGAAATTATCATAGTGAGCTCTGAATAATGTTATCTTTCATTGAGCTATTTTAAGAGAATTTCTCCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
配列番号８（６５９ AA）
NtMYC２aポリペプチド
１ mtdyriptmt niwsnttsdd nmmeaflssd pssfwpgttt tptprssvsp apapvtgiag
６１ dplksmpyfn qeslqqrlqt lidgarkgwt yaifwqssvv dfaspsvlgw gdgyykgeed
１２１ knkrktasfs pdfiteqahr kkvlrelnsl isgtqtggen davdeevtdt ewfflismtq
１８１ sfvngsglpg lamyssspiw vtgterlavs hcerarqaqg fglqtivcip sangvvelgs
２４１ telifqtadl mnkvkvlfnf nidmgattgs gsgscaiqae pdpsalwltd passvvevkd
３０１ ssntvpsrnt skqlvfgnen senvnqnsqq tqgfftreln fseygfdgsn trygngnans
３６１ srsckpesge ilnfgdstkr sacsangslf sgqsqfgpgp aeenknknkk rspasrgsnd
４２１ egilsfvsgv ilpssntgks ggggdsdqsd leasvvkead ssrvvdpekk prkrgrkpan
４８１ greeplnhve aerqrrekln qrfyalravv pnvskmdkas llgdaiafin elkskvqnsd
５４１ sdkedlrnqi eslrnelank gsnytgppps nqelkivdmd idvkvigwda miriqsnkkn
６０１ hpaarlmtal meldldvhha svsvvnelmi qqatvkmgsr lytqeqlris ltsriaesr
配列番号９（２３９１bp）
NtMYC２b gene
GTAACAAACCCTCTCCATTTTCACTCACTCCAAAAAACTTTCCTCTCTATTTTTTCTCTCTGTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTTGGGAGTTTTTTTTCTTCTTGTTTTTGTTATATGGAATGACGGACTATAGAATACCAACGATGACTAATATATGGAGCAATACAACATCCGACGATAACATGATGGAAGCTTTTTTATCTTCTGATCCGTCGTCGTTTTGGGCCGGAACAAATACACCAACTCCACGGAGTTCAGTTTCTCCGGCGCCGGCGCCGGTGACGGGGATTGCCGGAGACCCATTAAAGTCGATGCCGTATTTCAACCAAGAGTCGCTGCAACAGCGACTCCAGACGTTAATCGACGGGGCTCGCGAAGCGTGGACTTACGCCATATTCTGGCAATCGTCTGTTGTGGATTTCGTGAGCCCCTCGGTGTTGGGGTGGGGAGATGGATATTATAAAGGAGAAGAAGACAAGAATAAGCGTAAAACGGCGGCGTTTTCGCCTGATTTTATTACGGAGCAAGAACACCGGAAAAAAGTTCTCCGGGAGCTGAATTCTTTAATTTCCGGCACACAAACTGGTGGTGAAAATGATGCTGTAGATGAAGAAGTAACGGATACTGAATGGTTTTTTCTGATTTCAATGACTCAATCGTTTGTTAACGGAAGCGGGCTTCCGGGCCTGGCTATGTACAGCTCAAGCCCGATTTGGGTTACTGGAAGAGAAAGATTAGCTGCTTCTCACTGTGAACGGGCCCGACAGGCCCAAGGTTTCGGGCTTCAGACTATGGTTTGTATTCCTTCAGCTAATGGTGTTGTTGAGCTCGGGTCAACTGAGTTGATATTCCAGAGCGCTGATTTAATGAACAAGGTTAAAATCTTGTTTGATTTTAATATTGATATGGGCGCGACTACGGGCTCAGGTTCGGGCTCATGTGCTATTCAGGCTGAGCCCGATCCTTCAACCCTTTGGCTTACGGATCCACCTTCCTCAGTTGTGGAAGTCAAGGATTCGTCGAATACAGTTCCTTCAAGTAATAGTAGTAAGCAACTTGTGTTTGGAAATGAGAATTCTGAAAATGTTAATCAAAATTCTCAGCAAACACAAGGATTTTTCACTAGGGAGTTGAATTTTTCCGAATATGGATTTGATGGAAGTAATACTAGGAGTGGAAATGGGAATGTGAATTCTTCGCGTTCTTGCAAGCCTAGAAATGCTTCAAGTGCAAATGGGAGCTTGTTTTCGGGCCAATCGCAGTTCGGTCCCGGGCCTGCGGAGGAGAACAAGAACAAGAACAAGAAAAGGTCACCTGCATCAAGAGGAAGCAATGAAGAAGGAATGCTTTCATTTGTTTCGGGTGTGATCTTGCCAAGTTCAAACACGGGGAAGTCCGGTGGAGGTGGCGATTCGGATCATTCAGATCTCGAGGCTTCGGTGGTGAAGGAGGCGGATAGTAGTAGAGTTGTAGACCCCGAGAAGAGGCCGAGGAAACGAGGAAGGAAACCGGCTAACGGGAGAGAGGAGCCATTGAATCATGTGGAGGCAGAGAGGCAAAGGAGGGAGAAATTGAATCAAAGATTCTATGCACTTAGAGCTGTTGTACCAAATGTGTCAAAAATGGATAAAGCATCACTTCTTGGTGATGCAATTGCATTTATCAATGAGTTGAAATCAAAGGTTCAGAATTCTGACTCAGATAAAGATGAGTTGAGGAACCAAATTGAATCTTTAAGGAATGAATTAGCCAACAAGGGATCAAACTATACCGGTCCTCCACCGCCAAATCAAGATCTCAAGATTGTAGATATGGATATCGACGTTAAAGTCATCGGATGGGATGCTATGATTCGTATACAATCTAATAAAAAGAACCATCCAGCCGCGAGGTTAATGGCCGCTCTCATGGAATTGGACTTAGATGTGCACCATGCTAGTGTTTCAGTTGTCAACGAGTTGATGATCCAACAAGCGACAGTGAAAATGGGGAGCCGGCTTTACACGCAAGAGCAGCTTCGGATATCATTGACATCCAGAATTGCTGAATCGCGATGAAGAGAAATACAGTAAATGGAAATTATTAGTGAGCTCTGAATAATGTTATCTTTCATTGAGCTATTTTAAGAGAATTTCTCCTATAGTTAGATCTTGAGATTAAGGCTACTTAAAAGTGGAAAGTTGATTGAGCTTTCCTCTTAGTTTTTTGGGTATTTTTCAACTTTTATATCTAGTTTGTTTTCCACATTTTCTGTACATATAATGTGAAACCAATACTAGATCTCAAGATCTGGTTTTTAGTTCTGTAATTAGAAATAAATATGCAGCTTCATCTTTTTCTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
配列番号１０（６５８ AA）
NtMYC２bポリペプチド
１mtdyriptmt niwsnttsdd nmmeaflssd pssfwagtnt ptprssvspa papvtgiagd
６１ plksmpyfnq eslqqrlqtl idgareawty aifwqssvvd fvspsvlgwg dgyykgeedk
１２１nkrktaafsp dfiteqehrk kvlrelnsli sgtqtggend avdeevtdte wfflismtqs
１８１fvngsglpgl amyssspiwv tgrerlaash cerarqaqgf glqtmvcips angvvelgst
２４１elifqsadlm nkvkilfdfn idmgattgsg sgscaiqaep dpstlwltdp pssvvevkds
３０１sntvpssnss kqlvfgnens envnqnsqqt qgfftrelnf seygfdgsnt rsgngnvnss
３６１rsckpesgei lnfgdstkrn assangslfs gqsqfgpgpa eenknknkkr spasrgsnee
４２１gmlsfvsgvi lpssntgksg gggdsdhsdl easvvkeads srvvdpekrp rkrgrkpang
４８１reeplnhvea erqrreklnq rfyalravvp nvskmdkasl lgdaiafine lkskvqnsds
５４１dkdelrnqie slrnelankg snytgppppn qdlkivdmdi dvkvigwdam iriqsnkknh
６０１paarlmaalm eldldvhhas vsvvnelmiq qatvkmgsrl ytqeqlrisl tsriaesr

Claims

野生型対照植物と比較してＮｔＥＲＦ２２１が過剰発現されるように、異種プロモーターに作動可能に連結されたＮｔＥＲＦ２２１によってコードされる遺伝子産物を過剰発現するヌクレオチド配列を含むキメラ核酸構築物を含むニコチアナ植物であって、該ニコチアナ植物はトッピングすることなく、その葉に商業レベルのニコチンを蓄積し、該ヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される、ニコチアナ植物：
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、かつニコチン生合成を正に調節するＮｔＥＲＦ２２１転写因子をコードするヌクレオチド配列。
異種プロモーターが、二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、グリシンマックスユビキチン３（ＧｍＵＢＩ３）遺伝子プロモーター、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載のニコチアナ植物。
異種プロモーターが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターである、請求項２に記載のニコチアナ植物。
植物がＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ植物である、請求項１～３のいずれか１項に記載のニコチアナ植物。
キメラ核酸構築物を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の植物由来の種子。
タバコ製品が、野生型対照植物からのタバコ製品と比較して増加したニコチンレベルを有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のニコチアナ植物を含むタバコ製品。
葉中のニコチンの商業レベルが約２．５％から約６％の間にある請求項１～４のいずれか１項に記載のたばこ植物。
ＮｔＥＲＦ２２１によってコードされる遺伝子産物を過剰発現するヌクレオチド配列についてのホモ接合性を特徴とするタバコ植物の集団であって、ＮｔＥＲＦ２２１が野生型対照タバコ植物と比較して過剰発現されるように、遺伝子産物の発現が異種プロモーターによって駆動され、それによって、集団はトッピングなしにタバコ植物葉中に商業レベルのニコチンを含む表現型を安定に示し、ヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される、集団：
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、かつニコチン生合成を正に調節するＮｔＥＲＦ２２１転写因子をコードするヌクレオチド配列。
タバコ葉中のニコチンの商業レベルが約２．５％～約６％の範囲である、請求項８に記載の集団。
異種プロモーターが、二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、グリシンマックスユビキチン３（ＧｍＵＢＩ３）遺伝子プロモーター、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項８または９に記載の集団。
異種プロモーターが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターである、請求項１０に記載の集団。
植物がＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ植物である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の集団。
キメラ核酸構築物を含む、請求項８～１１のいずれか１項に記載の集団由来の種子。
製品が、野生型対照植物由来のタバコ製品と比較して増加したレベルのニコチンを有する、請求項８～１３のいずれか１項に記載のタバコ植物の集団を含むタバコ製品。
ニコチアナ植物においてニコチンを増加させる方法であって：
（ａ）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ植物に、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された異種プロモーターを含む発現ベクターを導入すること：
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）（ｉ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、かつニコチン生合成を正に調節する転写因子をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ヌクレオチド配列からのニコチン生合成を正に調節する転写因子の発現を可能にする条件下で植物を成長させること；を含み、
ここで、転写因子の発現は、同様の条件下で成長した野生型対照植物と比較して、増加したニコチン含量を有する植物をもたらす、
方法。
異種プロモーターが、二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、グリシンマックスユビキチン３（ＧｍＵＢＩ３）遺伝子プロモーター、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
異種プロモーターが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するジャスモネート誘導性プロモーターである、請求項１６に記載の方法。
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ植物内で、ＮＢＢ１、Ａ６２２、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、キノリン酸シンターゼ（ＱＳ）、またはＮ－メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）の少なくとも１つを過剰発現することをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
ニコチン生合成を正に調節する少なくとも１つの追加の転写因子をＮｉｃｏｔｉａｎａ植物内で過剰発現することをさらに含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
ニコチン性アルカロイド生合成を正に調節するさらなる転写因子が、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、またはＮｔＭＹＣ２ｂの少なくとも１つである、請求項１９に記載の方法。
ベクターが配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
タバコ植物をトッピングすること、および／または外因性ジャスモン酸で植物を処理することをさらに含む、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。