KR101563998B1 - 식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소 - Google Patents

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Abstract

두 개의 유전자인 A622와 NBB1은 식물에서 니코틴 알칼로이드의 감소를 달성하는데 영향을 줄 수 있다. 특히, A622와 NBB1 중 하나 또는 두 개 모두의 억제는 담배 식물에서 니코틴을 감소시키는데 사용될 수 있다.

Description

식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소{Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants}
본 출원은 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, 2005년 2월 28일에 출원된 미국 임시출원 제60/656,636호에 기초하여 우선권을 주장한다.
본 발명은 분자 생물학 분야 및 알칼로이드 합성의 하향-조절(down-regulation)에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 식물에서, 특히, 그러나 배타적이지 않게, 담배 식물에서 니코틴 알칼로이드를 감소시키는 방법 및 그 작제물(construct)에 관한 것이다.
현재, 식물에서 니코틴과 같은, 니코틴 알칼로이드를 감소시키는 수개의 방법들이 존재한다. 예를 들면, 담배의 저-니코틴 품종이 저-니코틴 재배종(cultivar)을 위한 종축(breeding stock)으로 이용되었다. Legg et al ., Crop Sci 10:212 (1970). 또한, 유전자 조작에 의한 방법(genetic engineering method)이 니코틴 수준을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,369,023호 및 미국특허 제5,260,205호는 내인성 푸트레신 메틸 트랜스퍼라제(PMT) 서열의 안티센스 표적화(targeting)를 통한 니코틴 수준의 감소를 검토한다. Voelckel et al ., Chemoecology 11: 121-126 (2001). 담배 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(quinolate phosphoribosyl transferase)(QPT) 유전자가 클로닝되었고, Sinclair et al ., Plant Mol . Biol . 44: 603-617 (2000), 그의 안티센스 억제는 형질 전환 담배 식물에서 상당한 니코틴 감소를 제공했다. Xie et al ., Recent Advances in Tobacco Science 30: 17-37 (2004). 또한, 미국특허 제6,586,661호 및 제6,423,520호를 참조한다.
수개의 니코틴 생합성 효소들이 공지되어 있다. 예를 들면, Hashimoto et al., Plant Mol . Biol . 37:25-37 (1998); Reichers ＆ Timko, Plant MoI . Biol . 41:387-401 (1999); Imanishi et al ., Plant Mol . Biol . 38:1101-1111 (1998)를 참조한다. 그러나, 니코틴 알칼로이드를 더 감소시키기 위한 추가적인 유전자 조작에 의한 방법에 대한 지속적인 요구가 있다. 담배에서, PMT만이 하향-조절되는 경우, 예를 들면, 니코틴은 감소되나, 아나타빈(anatabine)은 약 2-내지-6배 증가한다. Chintapakorn & Hamill, Plant Mol . Biol 53: 87-105 (2003); Steppuhn, et al ., PLoS Biol 2(8): e217: 1074-1080 (2004). QPT만이 하향-조절되는 경우, 상당한 양의 알칼로이드가 남는다. 미국 식물변종 등록(U.S. Plant Variety Certificate) 제200100039호를 참조한다.
담배에서 전체 알칼로이드 함량을 감소시키는 것은 생물량 (biomass) 자원으로서 담배의 가치를 제고할 것이다. 생물량을 최대화시키는 조건, 예를 들면, 높은 밀도 및 복수의 꺽꽂이(cutting)와 같은 조건에서 재배된 경우, 담배는 에이커당 8톤을 초과하는 건조 중량(dry weight)을 산출할 수 있고, 이는 생물량 용으로 이용되는 다른 농작물과 유사하다. 그러나, 기존의 담배 생물량의 대규모 재배 및 처리는 여러 단점들을 갖는다. 예를 들면, 통상적인 담배 생물량은 변종에 따라, 약 1 내지 약 5 퍼센트의 알칼로이드를 포함하기 때문에 담배 알칼로이드를 추출하고, 분리하고, 처리하기 위해 상당한 시간 및 에너지가 소요된다. 단위 에이커 기준으로, 통상적인 담배 생물량은 약 800 파운드의 알칼로이드를 포함한다. 또한, 담배를 다루는 사람들은 통상적으로 "녹색 담배 병(green tobacco disease)"이라 지칭되는, 니코틴에 대한 과다노출을 겪을 수 있다.
알칼로이드-감소(reduced-alkaloid) 담배는 비-전통적인 목적, 예를 들면, 생물량 및 유도된 제품들을 위해 보다 적합하다. 예를 들면, 에탄올 및 단백질 부산품(co-product)을 생산하기 위해 알칼로이드-감소 담배를 이용하는 것이 유리하다. 미국공개출원 제2002/0197688호. 또한, 알칼로이드-불포함(alkaloid-free) 담배 또는 그의 분획은 사초용 농작물(forage crop), 동물 사료, 또는 인간의 영양 공급원으로 이용될 수 있다. Id .
니코틴 감소와 연관된 이와 같은 잇점들 외에, 흡연자들의 금연을 보조하기 위한 보다 성공적인 방법들이 필요하다. 니코틴 대체 요법(Nicotine Replacement Therapy:NRT)은 니코틴 대체 기간의 종료로부터 6개월 내지 12개월 후에 그 성공율이 20 퍼센트 미만이기 때문에 금연 치료법으로서 매우 효과적인 것은 아니다. Bohadana et al, Arch Intern. Med. 160:3128-3134 (2000); Croghan et al, Nicotine Tobacco Res. 5:181-187 (2003); Stapleton et al, Addiction 90:31-42 (1995). 니코틴-감소 또는 니코틴-불포함 담배 궐련은 흡연자들이 니코틴을 끊으면서 흡연 행동(smoking ritual)을 할 수 있도록 허용하여, 흡연을 성공적으로 중지하도록 기여했다. 또한, 니코틴제거(denicotinized) 담배는 흡연에 대한 열망(craving) 및 기타 흡연 금단 증상들을 완화시킨다. Rose, Psychopharmacology 184: 274-285 (2006) 및 Rose et al ., Nicotine Tobacco Res . 8:89-101 (2006)을 참조한다.
따라서, 니코틴 알칼로이드 함량을 감소시키기 위해 그 발현이 영향을 받을 수 있는 추가적인 유전자을 파악하는 것에 대한 지속적인 요구가 있다.
두 개의 유전자, A622 및 NBB1은 식물에서 니코틴 알칼로이드 수준의 감소를 달성하기 위해 영향받을 수 있다. 특히, A622 및 NBB1 중 하나 또는 두 개 모두의 억제는 담배 식물에서 니코틴을 감소시키기 위해 이용될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy) 때문에 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열과 상이하고, NBB1 발현을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) 유전자 코드의 축퇴성 때문에 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열과 상이하고, A622 발현을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 이종(heterologous) 프로모터에 작동가능하도록 연결된(operatively linked) 것인 분리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 NBB1 및 A622 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, 식물에서 알칼로이드를 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 감소된 A622 발현 및 알칼로이드 함량을 갖는 형질 전환 식물, 및 감소된 NBB1 발현 및 알칼로이드 함량을 갖는 담배 식물을 제공한다. 본 발명은 또한 감소된 니코틴 및 아나타빈 함량을 갖는 유전적으로 조작된 식물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 감소된 A622 또는 NBB1 발현을 갖는 담배 식물로부터 제조된 니코틴-감소(reduced-nicotine) 담배 제품을 제공한다.
본 발명자들은 담배를 포함하나, 이에 한정되지 않는 식물에서 니코틴 알칼로이드 수준의 감소를 달성하기 위해 영향받을 수 있는 두 개의 유전자, A622 및 NBB1을 확인하였다. A622는 이전에 Hibi et al .. Plant Cell 6: 723-735 (1994)에 의해 파악되었으나, 본 발명자들은 니코틴 생합성을 감소시키는 것과 관련하여, 그 이전에는 알려지지 않았던, A622의 역할을 발견하였다. 본 발명자들의 발견 전에, 본 발명이 속하는 기술 분야는 NBB1에 대해 전혀 알지 못했고, 본 발명자들은 또한, 식물에서 니코틴 알칼로이드 함량을 감소시키는 본 발명에 따른 방법에서 NBB1의 역할을 규명하였다.
따라서, 본 발명은 A622 또는 NBB1 발현을 억제하는 것에 의해, 식물에서 니코틴 알칼로이드 함량을 감소시키는 방법 및 그 작제물을 모두 포괄한다. 즉, 니코틴 알칼로이드 수준은 A622 및 NBB1 중 하나 또는 두 개 모두를 억제하는 것에 의해 감소될 수 있다. 본 발명의 이 양태에 따라, 식물 또는 그의 부분은 그 발현이 A622 및 NBB1 중 하나 이상을 억제하고 니코틴 알칼로이드 함량을 감소시키는 것인 뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 니코틴은 니코틴 생합성 경로에서 공지된 효소, 예를 들면, QPT 또는 PMT와, A622 및 NBB1 중 하나 이상의 발현을 동시에 억제하는 것에 의해 식물에서 더 억제될 수 있다. 니코틴을 감소시키는 것 외에, 본 발명은 예를 들면, 아나타빈을 동시에 억제시키는 수단을 제공한다. 따라서, 아나타빈 수준은 QPT와 같은 니코틴 생합성 유전자, 및 A622 및 NBB1 중 하나 이상을 억제하는 것에 의해 저하될 수 있다.
식물에서 니코틴 알칼로이드의 함량을 감소시킬 목적으로, A622 및/또는 NBB1 발현에 영향을 미치는 것에 의해, 다수의 알칼로이드-감소 식물 및 부산물(by-product)이 본 발명에 따라 수득될 수 있다. 예를 들면, 억제된 A622 또는 NBB1 발현을 갖는 담배 식물은 금연용 제품으로서의 용도를 가질 수 있는 니코틴-감소 궐련을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 마찬가지로, 니코틴-감소 담배는 사초용 농작물, 동물 사료 또는 인간의 영양 공급원으로서 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명의 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내는 특정한 실시예들은 예시의 목적으로만 주어지며, 본 발명의 원리 및 범위 내의 변형 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 명백해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 기술적 용어는 생화학, 분자 생물학 및 농학에서 통상적으로 사용되며; 따라서, 그들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 이해된다. 그와 같은 기술적 용어들은 예를 들면, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel et al, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988(with periodic updates); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5th ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al, John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997에서 찾을 수 있다.
식물 생물학 기법을 포함하는 방법이 본 명세서에 기재되며 METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. Maliga et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995와 같은 방법 전문 서적에 상세히 기재된다. PCR을 이용한 다양한 기법들이 예를 들면, Innis et al, PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 1990 및 Dieffenbach and Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003에 기재된다. PCR-프라이머 쌍들은 그와 같은 목적으로 의도된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, Primer, Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA를 이용하는 것과 같은 공지된 기법에 의해 공지된 서열로부터 유래될 수 있다. 핵산의 화학적 합성 방법은 예를 들면, Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862 (1981), 및 Matteucci & Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)에서 검토된다.
제한효소 처리(restriction enzyme digestion), 인산화(phosphorylation), 라이게이션(ligation) 및 형질전환은 Sambrook et al ., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재된 바에 따라 수행하였다. 세균 세포의 성장 및 유지를 위해 사용된 모든 시약 및 재료는 달리 표시되지 않으면, Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.), DIFCO Laboratories (Detroit, Mich.), Invitrogen (Gaithersburg, Md.), 또는 Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.)로부터 구했다.
A622 발현은 담배 식물에서 NIC1 및 NIC2 유전자좌에 의해 제어된다. Hibi et al ., The Plant Cell, 6: 723-735 (1994). A622는 PMT와 동일한 발현 패턴을 보인다. Shoji, T. et al ., Plant Cell Physiol, 41:9:1072-1076 (2000a); Shoji, T., et al ., Plant Mol Biol, 50:427-440 (2002). A622 및 PMT는 모두 특히 뿌리에서, 특히, 뿌리 및 뿌리털의 정점부(apical part)의 피층 및 내피(endodermis)에서 발현된다. Shoji et al . (2002). 또한, A622 및 PMT는 NIC 조절 및 메틸-자스모네이트 자극에 대응하여 공통된 발현 패턴을 갖는다. A622는 기생 조직(aerial tissue)의 상처에 대응하여 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 뿌리에서 유도된다. Cane et al ., Functional Plant Biology, 32, 305-320 (2005). 니코티아나 글루아카(N. glauca))에서, A622는 QPT 유도를 초래하는 조건 하에서 상처난 잎에서 유도된다. Sinclair et al., Func. Plant Biol., 31:721-9 (2004).
A622의 핵산 서열(서열번호 1)이 결정되었다. Hibi et al (1994), supra. 이 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질(서열번호 2)은 이소플라본 환원효소(isoflavone reductase: IFR)를 닮으며 NADPH-결합 모티프를 포함한다. A622는 리그닌 생합성에 관여하는 담배 페닐쿠마란 벤질릭 에테르 리덕타제(phenylcoumaran benzylic ether reductase:PCBER), TP7에 대해 상동성을 보인다. Shoji et al. (2002), supra. 그러나, 대장균에서 발현된 A622가 두 개의 상이한 기질에 의해 분석된 경우, PCBER 활성이 관찰되지 않았다.
A622 및 PMT의 공동-조절 및 A622의 IFR에 대한 유사성에 근거하여, A622는 니코틴 알칼로이드 합성의 최종 단계들에서 환원효소로서 기능하는 것으로 제안되었다. Hibi et al. (1994); Shoji, et al. (2000a). 그러나, 상기 단백질이 세균에서 발현된 경우, IFR 활성은 전혀 관찰되지 않았다(id). 이전에는 A622의 기능은 알려지지 않았었고, A622가 니코틴 합성에서 역할을 수행한다는 것에 대한 이해가 없었다.
A622 발현은 서열번호 1에 의해 코딩되는 유전자 산물(gene product)의 생합성을 의미한다. A622 억제는 A622 발현의 감소를 의미한다. A622 억제는 식물 또는 식물 세포에서 니코틴 알칼로이드 함량을 하향-조절하는 능력을 갖는다.
알칼로이드는 식물에서 발견되고 이차 대사(secondary metabolism)에 의해 생산되는 니코틴-함유 염기성 화합물(nicoine-containing basic compound)이다. 니코틴 알칼로이드(nicotinic alkaloid)는 니코틴이나 또는 구조적으로 니코틴과 관련되고 니코틴 생합성 경로에서 생산되는 화합물로부터 합성되는 알칼로이드이다. 담배의 경우, 니코틴 알칼로이드 함량 및 총 알칼로이드 함량은 동의어로 사용된다.
예시적인 니코티아나(Nicotiana) 알칼로이드는 니코틴, 노르니코틴, 아나타빈, 아나바신, 아나탈린, N-메틸아나타빈, N-메틸아나바신, 미오스민, 아나바세인, N'-포르밀노르니코틴, 니코티린 및 코티닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 담배잎에 존재하는 기타 매우 미량의 알칼로이드가 예를 들면, Hecht, S. S. et al., Accounts of Chemical Research 12: 92-98 (1979); Tso, T.C., Production, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant. Ideals Inc., Beltsville, MD (1990)에서 보고된다. 여러 알칼로이드의 화학적 구조가 예를 들면, Felpin et al., J. Org. Chem. 66: 6305-6312 (2001)에 제시된다.
니코틴은 50-60 퍼센트의 다른 니코티아나 종과 함께, 니코티아나 타바쿰(N. tabacum)에서 주요한 알칼로이드이다. 잎에서의 알칼로이드 축적에 근거하여, 노르니코틴, 아나타빈, 및 아나바신이 니코티아나 타바쿰에서 나머지 주요한 알칼로이드이다. 아나타빈은 통상적으로 임의의 종에서 주요한 알칼로이드가 아니나, 3 종에서는 상대적으로 보다 높은 양으로 축적된다; 아나바신은 4 종에서 주요한 알칼로이드이다. 노르니코틴은 30 내지 40 퍼센트의 니코티아나 종에서 주요한 알칼로이드이다. 변종에 따라, 니코티아나 타바쿰에서 전체 알칼로이드의 약 85 내지 약 95 퍼센트가 니코틴이다. Bush, L.P., Tobacco Production, Chemistry and Technology, Coresta 285-291 (1999); Hoffmann, et al., Journal of Toxicology and Environmental Health, 41:1-52, (1994).
본 발명에서, 니코틴 알칼로이드 함량은 A622 및 NBB1 중 하나 이상을 하향-조절하는 것에 의해 유전적으로 조작된 식물에서 감소될 수 있다. 또한, 니코틴 알칼로이드 함량은 QPT 또는 PMT와 같은 니코틴 생합성 효소, 및 A622 및 NBB1 중 하나 이상을 하향-조절하는 것에 의해 감소될 수 있다.
아나타빈은 니코틴 알칼로이드이다. 이전의 연구들은 PMT 억제가 니코틴 함량을 감소시키나 푸트레신 및 아나타빈 수준을 증가시킨다는 것을 보여주었다. Chintapakorn & Hamill, Plant Mol. Biol. 53: 87-105 (2003); Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 367-372. (2001); Steppuhn, A., et al, PLoS Biol 2(8): e217: 1074-1080 (2004). 본 발명의 목적을 위해, 아나타빈 함량은 A622 및 NBB1 중 하나 이상을 하향-조절하는 것에 의해 유전적으로 조작된 식물에서 감소될 수 있다. 아나타빈 수준은 QPT와 같은 니코틴 생합성 효소, 및 A622 및 NBB1 중 하나 이상을 하향-조절하는 것에 의해 더 감소될 수 있다.
BY -2 담배 세포(BY-2 tobacco cell)는 담배 변종 브라이트 엘로우(Bright Yellow)-2로부터 Japan Tobacco Co., Ltd.에 의해 1960년대에 수립된 세포주(cell line)이다. 이 세포주는 조직 배양에서 매우 빠르게 성장하기 때문에, 대규모로 배양하기가 용이하고 유전적 조작에 적합하다. BY-2 담배 세포는 기초 연구에서 모델 식물 세포주로서 널리 이용된다. 표준 배지에서 배양되는 경우, BY-2 담배 세포는 니코틴 알칼로이드를 생산하지 않는다. 자스모네이트의 배양 배지로의 첨가가 니코틴 알칼로이드의 형성을 유도한다.
상보적 DNA ( cDNA )는 역 전사효소(reverse transcriptase)에 의해 mRNA 주형으로부터 형성되는 단일-가닥 DNA 분자이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 또한 그와 같은 단일-가닥 DNA 분자 및 그의 상보적인 DNA 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 분자를 표시하기 위해 "cDNA"를 사용한다. 통상적으로, mRNA의 부분에 상보적인 프라이머가 cDNA를 생성하는 역 전사(reverse transcription)의 개시를 위해 이용된다.
발현(expression)은 유전자 산물의 생합성을 의미한다. 구조 유전자의 경우에, 예를 들면, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 상기 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 해독(translation)을 포함한다.
유전자(gene)는 폴리펩티드 또는 전구체의 생산을 위해 필요한 제어 서열(control sequence) 및 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 폴리펩티드는 전장(full-length) 코딩 서열에 의해 또는 상기 코딩 서열의 일부에 의해 코딩될 수 있다. 유전자는 중단되지 않는 연속적인(uninterrupted) 코딩 서열을 구성하거나 또는 적합한 스플라이싱 접합부(splice junction)에 의해 둘러싸인 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 또한, 유전자는 코딩 서열 또는 비해독 영역(untranslated region)에 발현 산물의 생물학적 활성 또는 화학적 구조, 발현율, 또는 발현 제어의 방식에 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 그와 같은 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 삽입, 결실 및 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이와 관련하여, 그와 같은 변형된 유전자는 "원형(native)" 유전자의 "변이체(variant)"로 지칭될 수 있다.
유전자 조작(genetically engineered:GE)은 핵산 또는 특정한 돌연변이를 숙주 개체로 도입하는 임의의 방법들을 포괄한다. 예를 들면, 담배 식물이 A622 또는 NBB1과 같은 유전자의 발현을 억제하고, 그에 의해 니코틴 수준을 감소시키는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환되는 경우, 그 담배 식물은 유전적으로 조작된 것이다. 이와 대조적으로, 표적 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 비-형질전환된 담배 식물은 대조구 식물(control plant)이고 "비-형질전환(non-transformed)" 식물로 지칭된다.
본 발명에서, "유전적 조작"의 범주는 "이식 유전자성(transgenic)" 식물 및 식물 세포(하기의 정의 참조), 및 예를 들면, Beetham et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 8774-8778 (1999) 및 Zhu et al, loc. cit. at 8768-8773에 기재된 바와 같은 키메라 RNA/DNA 올리고뉴클레오티드의 사용, 또는 국제특허출원공개 WO 03/013226에 기재된 바와 같은 소위 "재조합성 올리고뉴클레오베이스(recombinagenic oligonucleobase)"의 사용을 통해 수행된 표적지향성 돌연변이생성(targeted mutagenesis)에 의해 생성된 식물 및 식물 세포를 포함한다. 마찬가지로, 유전적으로 조작된 식물 또는 식물 세포는 숙주 내에서 본 명세서에 기재된 바와 같이, 형질전환 식물에서 생성되는 것과 유사한 결과를 갖는 유전적 변형을 유발하는, 변형된 바이러스의 도입에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제4,407,956호를 참조한다. 또한, 유전적으로 조작된 식물 또는 식물세포는 숙주 식물 종으로부터 또는 생식적으로 융화가능한(sexually compatible) 식물 종으로부터 유래된 핵산 서열만을 도입하는 것에 의해 수행된, 임의의 원형의 방법(즉, 외래 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는 방법)의 산물일 수 있다. 예를 들면, 미국공개출원 제2004/0107455호를 참조한다.
게놈 라이브러리(genomic library)는 게놈 내의 본질적으로 모든 DNA 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 클론의 집합이다.
NBB1 서열은 Katoh et al, Proc. Japan Acad., 79(Ser. B): 151-154 (2003)의 프로토콜에 의해 따라, 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris)-유래의 cDNA 라이브러리로부터 제조된 cDNA 마이크로어레이에 의해 확인되었다. NBBl은 또한, 니코틴 생합성 조절 유전자좌인, NIC1 및 NIC2에 의해 제어된다. NBBl 및 PMT는 담배 식물에서 동일한 발현 패턴을 갖는다. NBB1이 니코틴 생합성에 관여된다는 것은 PMT 및 A622와 같이, NBB1이 NIC 유전자의 제어 하에 있으며 유사한 발현 패턴을 보인다는 사실에 의해 나타난다.
NBB1 발현은 서열번호 3에 의해 코딩되는 유전자 산물의 생합성을 의미한다. NBB1 억제는 NBB1 발현의 감소를 의미한다. NBB1 억제는 니코틴 알칼로이드 함량을 하향-조절하는 능력을 갖는다.
NIC1 및 NIC2 유전자 좌(loci)는 이전에는 A 및 B로 표시되었던, 니코티아나 타바쿰에 있는 두 개의 독립적인 유전자 좌이다. nic1 및 nic2의 돌연변이는 니코틴 생합성 효소의 발현 수준 및 니코틴 함량을 감소시키고, 일반적으로 니코틴 함량은 야생형(wild type) > 동형접합(homozygous) nic2 > 동형접합 nic1 > 동형접합 nicl 및 동형접합 nic2 식물의 순서이다. Legg & Collins, Can. J. Cyto. 13:287 (1971); Hibi et al, Plant Cell 6: 723-735 (1994); Reed & Jelesko, Plant Science 167:1123 (2004).
니코틴은 니코티아나 타바쿰 및 니코티아나 속의 일부 다른 종에서 주요한 알칼로이드이다. 예를 들면, 솔라나세아애(Solanaceae)의 두보이시아(Duboisia), 안토세리시스(Anthocericis) 및 살피글레시스(Salpiglessis) 속 또는 콤포시타애(Compositae)의 에클립타(Eclipta) 및 진니아(Zinnia) 속을 포함하는 다른 식물들도 니코틴-생산 능력을 갖는다.
식물(plant)은 전체 식물체, 식물 기관(예를 들면, 잎, 줄기, 뿌리, 등) 및 식물 세포 및 그의 자손을 포괄하는 용어이다. 식물 물질(plant material)은 한정 없이, 종자 현탁 배양액(seeds suspension culture), 배(embryo), 분열부(meristematic region), 캘러스 조직(callus tissue), 잎, 뿌리 및 묘조(shoot), 배우체(gametophyte), 포자체(sporophyte), 화분(pollen), 및 소포자(microspore)를 포함한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 식물의 종류는 일반적으로 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 포함하여, 형질전환 기법에 적합한 고등 식물의 종류만큼 광범위하다. 바람직한 식물은 솔라나세아애의 니코티아나, 두보이시아, 안토세리시스 및 살피글레시스 속 또는 콤포시타애의 에클립타 및 진니아 속의 니코틴-생산 능력을 갖는 식물이다.
단백질은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다.
니코틴-감소 식물(reduced-nicotine plant)은 동일한 종류의 비-형질전환 대조구 식물의 니코틴 함량의 절반 미만, 바람직하게는 25% 미만, 및 보다 바람직하게는 20% 미만 또는 10% 미만을 포함하는 유전적으로 조작된 식물을 포괄한다. 니코틴-감소 식물은 또한 대조구 식물에 비해 보다 적은 양의 총 알칼로이드를 포함하는 유전적으로 조작된 식물을 포함한다.
구조 유전자(structural gene)는 특정한 폴리펩티드의 특징적인 아미노산 서열로 해독될 메신저 RNA(mRNA)로 전사되는 DNA 서열을 의미한다. "메신저 RNA(mRNA)"는 단백질의 아미노산 서열에 대한 코딩된 정보를 갖는 RNA 분자를 나타낸다.
두 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에서 "서열 상동성(sequence identity)" 또는 "상동성(identity)"은 특정한 영역에 대해 최대한의 일치(maximum correspondence)를 위해 정렬되었을 때 동일한 두 서열 내의 잔기들에 대한 관계(reference)를 포함한다. 단백질에 대한 관계에서 서열 상동성의 백분율이 이용되는 경우, 일치하지 않는 잔기 위치들은 종종 아미노산 잔기들이 전하 및 소수성과 같은 유사한 화학적 특징을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되어, 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는 것인 보존적(conservative) 아미노산 치환에 의해 상이한 것으로 인정된다. 서열들이 보존적 치환에서 상이한 경우, 퍼센트 서열 상동성은 치환의 보존적 속성을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다. 그와 같은 치환에 의해 상이한 서열들은 "서열 유사성(sequence similarity)" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 언급된다. 이 조절을 하는 수단은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 통상적으로, 이는 보존적 치환을 완전한 미스매치(mismatch)가 아닌 부분적인 미스매치로 평가하여, 퍼센트 서열 상동성을 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 동일한 아미노산에 1점이 주어지고, 비-보존적(non-conservative) 치환에 0점이 주어지는 경우, 보존적 치환에는 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존적 치환의 평점(scoring)은 예를 들면, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA)에서 실행되는 바와 같이, Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17 (1988) 알고리즘에 따라 계산된다.
본 명세서에서 서열 상동성의 백분율의 사용은 비교 창(comparison window) 을 통해 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 것에 의해 결정된 값을 표시한며, 상기 비교 창 내의 폴리펩티드 서열의 부분은 상기 두 서열의 최적의 정렬에 대한 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 생성하는 단계, 상기 매칭된 위치의 수를 비교의 창 내의 위치들의 총 수로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 상동성의 백분율을 생성하는 단계에 의해 계산된다.
서열 상동성은 해당 기술 분야에서 인식되는 의미(art-recognized meaning)를 가지며 공개된 기법을 이용하여 계산될 수 있다. COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988), BiocoMPUTiNG: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, ed. (Academic Press, 1993), COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I5 Griffin & Griffin, eds., (Humana Press, 1994), SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed., Academic Press (1987), SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov & Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991), 및 Carillo & Lipton, SIAMJ. Applied Math. 48: 1073 (1988)를 참조한다. 두 서열 간의 상동성 또는 유사성을 결정하기 위해 통상적으로 이용되는 방법은 GUIDE To HUGE COMPUTERS, Bishop, ed., (Academic Press, 1994) 및 Carillo & Lipton, supra에 개시된 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상동성 또는 유사성을 결정하는 방법은 컴퓨터 프로그램으로 성문화된다. 두 서열 간의 상동성 또는 유사성을 결정하는 선호되는 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지(Devereux et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al, J. MoL Biol. 215: 403 (1990)), 및 FASTDB (Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
담배(tobacco)는 니코틴 알칼로이드를 생산하는 니코티아나 속의 임의의 식물을 의미한다. 담배는 또한 니코티아나 식물에 의해 생산된 물질을 포함하는 제품을 의미하고, 따라서, 예를 들면, 궐련(cigarette), 시가(cigar), 씹는 담배(chewing tobacco), 코담배(snuff) 및 금연용의 GE 니코틴 감소 담배로부터 제조된 궐련을 포함한다. 니코티아나 종의 예들은 니코티아나 알라타(N. alata), 니코티아나 글라우카(N. glauca), 니코티아나 론기플로라(N. longiflora), 니코티아나 페르시카(N. persica), 니코티아나 루스티카(N. rustica), 니코티아나 실베스트리스(N. sylvestris), 및 니코티아나 타바쿰(N. tabacum)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
담배-특이적 니트로사민(TSNA)은 큐어링(curing), 처리(processing), 및 흡연 동안 담배에서 우세하게 형성되는 일종의 발암물질(carcinogen)이다. Hoffman, D., et al, J. Natl Cancer Inst. 58, 1841-4 (1977); Wiernik A et al., Recent Adv. Tob. Sci, (1995), 21: 39-80. 4-(N-니트로소메틸아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N'-니트로소노르니코틴(NNN), N'-니트로소아나타빈(NAT), 및 N'-니트로소아나바신(NAB)와 같은 TSNA는 니코틴과 기타 미량의 니코티아나 알칼로이드, 예를 들면, 노르니코틴, 아나타빈, 및 아나바신의 N-니트로소화(nitrosation)에 의해 형성된다. 니코틴 알칼로이드를 감소시키면 담배 및 담배 제품에서 TSNA의 수준을 감소시킨다.
담배 모상근(hairy root)은 게놈 내에 통합된 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)의 Ri 플라스미드로부터의 T-DNA를 가지며 오옥신 및 기타 프로호르몬(prohormone)의 보충 없이 배양에서 성장한 담배 뿌리를 의미한다. 담배 모상근은 담배 식물의 뿌리와 같이 니코틴 알칼로이드를 생산한다.
이식 유전자성 식물(transgenic plant)은 그 자체로 다른 개체 또는 종에 존재하거나 또는 숙주 코돈 용법(host codon usage)에 대해 최적화된, 다른 개체 또는 종으로부터 유래된 핵산 서열을 포함하는 식물을 의미한다.
이식 유전자성 식물은 유전적 형질전환 방법에 의해 생산될 수 있다. 적합한 형질전환 방법은 예를 들면, 아그로박테리움-매개 형질전환, 입자 충돌법(particle bombardment), 전기 천공법(electroporation), 폴리에틸렌 글리콜 융합, 트랜스포손 태깅(transposon tagging), 및 부위-지향적 돌연변이 생성(site-directed mutagenesis)을 포함한다. 형질전환 식물의 확인 및 선택은 공지된 기법이며, 그 세부사항은 본 명세서에서 반복되지 않는다.
변이체(variant)는 특정한 유전자 또는 단백질의 표준 또는 주어진 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 벗어난 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이다. 용어 "아형(isoform)" "동형(isotype)" 또는 "유사체(analog)"도 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 "변이체" 형태를 의미한다. 하나 이상의 아미노산의 첨가, 제거 또는 치환, 또는 뉴클레오티드 서열의 변화에 의해 변형된 아미노산 서열은 "변이체" 서열로 간주될 수 있다. 변이체는 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 것인 "보존적" 변화, 예를 들면, 루이신의 이소루이신에 의한 치환을 가질 수 있다. 변이체는 "비보존적" 변화, 예를 들면, 글리신의 트립토판에 의한 치환을 가질 수 있다. 유사한 미량 변이(analogous minor variation)는 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 양자 모두를 포함할 수 있다. 어느 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는 지를 결정하는 안내(guidance)는 Vector NTI Suite (InforMax, MD) 소프트웨어와 같은 본 발명이 속한 기술 분야에서 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 이용하여 확인될 수 있다. "변이체"는 또한 Maxygen의 양도받은 특허(assigned patent)에 기재된 바와 같은 "셔플링된 유전자(shuffled gene)"을 의미할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정한 방법, 프로토콜, 벡터, 및 시약 등에 한정되지 않으며, 이는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서는 특정한 구체예를 기술할 목적으로만 전술된 용어들을 사용하며 본 발명의 범위를 한정하기 위해 사용하는 것은 아니다.
단수 형태, "하나("a," "an," 및 "the")"는 문맥상 명확하게 달리 표기되지 않으면 복수에 대한 지칭을 포함한다. 따라서, "하나의 유전자(a gene)"에 대한 지칭은 하나 이상의 유전자에 대한 지칭이고 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 그의 동등물 등을 포괄한다.
폴리뉴클레오티드 서열
니코틴 알칼로이드 생합성 유전자가 니코티아나 식물로 예시되는, 여러 식물 종에서 확인되었다. 따라서, 본 발명은 식물 종의 게놈으로부터 분리된, 니코틴 알칼로이드 생합성을 하향-조절하는 임의의 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, mRNA, 또는 cDNA 분자를 포괄한다.
예를 들면, A622 및 NBB1 중 하나 이상의 억제가 식물에서 니코틴 함량을 하향-조절하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 니코틴 알칼로이드 수준은 QPT 및 PMT 중 하나 이상과 같은 니코틴 생합성 유전자, 및 A622 및 NBB1 중 하나 이상의 발현을 억제하는 것에 의해 더 감소될 수 있다. 복수 개의 유전자의 억제를 갖는 식물이 복수 개의 유전자의 억제를 위해 유전적으로 조작된 식물 세포로부터 식물의 재생에 의해 또는 니코틴 생합성 유전자의 억제를 위해 유전적으로 조작된 제1 식물을 A622 및 NBB1 중 하나 이상의 억제를 위해 유전적으로 조작된 제2 식물을 교배하는 것에 의해 수득될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 분리된 핵산 분자; 서열번호 2에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 서열번호 1과 혼성화하고 A622 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 유전자 코드의 축퇴성 때문에 서열번호 1과 상이한 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 서열번호 1에 의해 코딩되는 펩티드는 본 발명의 또 다른 양태이고 서열번호 2로 기재된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3을 포함하는 분리된 핵산 분자; 서열번호 4에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 서열번호 3과 혼성화하고 NBBl 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 유전자 코드의 축퇴성 때문에 서열번호 3과 상이한 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 서열번호 3에 의해 코딩되는 펩티드는 본 발명의 또 다른 양태이고 서열번호 4로 기재된다.
본 발명은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 3에 상보적인 핵산, 및 하기에 기재된 바와 같은 적합한(moderate) 또는 높은 엄격성(stringency) 조건에서 서열번호 1 또는 서열번호 3에 혼성화하는 15개 이상의 연속된 염기를 포함하는 핵산을 제공한다. 본 명세서의 기재 목적으로, 서열번호 3에 혼성화하는 핵산의 범주는 공개된 국제특허출원 WO 03/097790에 개시된 서열번호 559의 서열을 갖는 핵산 및 그의 단편은 포함하지 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하나, 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 서열은 한정적이지 않다. 본 발명의 siRNA 분자는 연속적인 A622 또는 NBB1 서열, 예를 들면, 약 15개 내지 약 25개 이상, 또는 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 구체예에서도, siRNA 분자의 범주는 공개된 국제특허출원 WO 03/097790에 개시된 전술된 서열번호 559의 서열을 갖는 핵산 및 그의 단편은 포함하지 않는다.
"분리된(isolated)" 핵산 분자(들)은 그의 본래의 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들면, DNA 작제물에 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자의 다른 예들은 이종 숙주 세포 내에 유지된 재조합 DNA 분자 또는 용액에 담긴, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 DNA 분자를 포함한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 인 비트로 RNA 전사체(transcript)를 포함한다. 본 발명에 따라, 분리된 핵산 분자는 합성에 의해 생산된 그와 같은 분자들을 더 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 mRNA와 같은 RNA의 형태, 또는 예를 들면, 클로닝에 의해 수득되거나 또는 합성적으로 생산된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA의 형태일 수 있다. DNA 또는 RNA는 이중-가닥이거나 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일-가닥 DNA는 센스 스트랜드(sense strand)로도 알려진, 코딩 스트랜드일 수 있거나, 또는 안티-센스 스트랜드로도 지칭되는, 비-코딩(non-coding) 스트랜드일 수 있다.
달리 표시되지 않으면, 본 명세서에서 DNA 분자의 서열결정에 의해 결정된 모든 뉴클레오티드 서열은 자동화된 DNA 시퀀서(sequencer)(예를 들면, Applied Biosystems, Inc.의 Model 373)를 이용하여 결정되었다. 따라서, 이 자동화된 방법에 의해 결정된 임의의 DNA 서열에 대해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 본 명세서에서 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 일부 오류를 포함할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열결정된 DNA 분자의 실제의 뉴클레오티드 서열에 통상적으로 약 95% 이상 동일하고, 보다 통상적으로는 약 96% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제 서열은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 수동의 DNA 서열결정 방법을 포함한 다른 방법들에 의해 보다 정확하게 결정될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 실제 서열 대비 결정된 뉴클레오티드 서열에서 단일 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 해독에서 프레임 쉬프트(frame shift)를 유발하여, 결정된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 예측된 아미노산 서열은 그와 같은 삽입 또는 결실 지점에서 시작하여, 서열결정된 DNA 분자에 의해 실제로 코딩된 아미노산 서열과 완전히 상이할 수 있다.
*또 다른 양태에서, 본 발명은 전술된 바와 같이, 엄격한 혼성화 조건에서 본 발명의 핵산 분자에서 폴리뉴클레오티드의 일부분에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 폴리뉴클레오티드의 "부분(portion)"에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 기준(reference) 폴리뉴클레오티드의 약 15개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 및 보다 훨씬 더 바람직하게는 30개를 초과하는 갯수의 뉴클레오티드와 혼성화하는, DNA 또는 RNA인, 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 6X SSC, 0.5% SDS, 5X 덴하르트 용액(Denhardt's solution) 및 lOO ㎍의 비-특이적 캐리어 DNA의 혼성화 용액에서 이중-가닥 복합체를 형성하는 경우, 두 서열은 혼성화한다. Ausubel et al, supra, at section 2.9, supplement 27 (1994)를 참조한다. 서열들은 6X SSC, 0.5% SDS, 5X 덴하르트 용액 및 lOO ㎍의 비-특이적 캐리어 DNA의 혼성화 용액에서 60℃의 온도로 정의된 "적절한 엄격성(moderate stringency)" 조건에서 혼성화한다. "높은 엄격성" 조건의 경우, 온도는 68℃까지 상승된다. 적절한 엄격성의 혼성화 반응 후에, 뉴클레오티드는 실온에서 2X SSC + 0.05% SDS 용액으로 5회 세척되고, 뒤이어 60℃에서 0.1 X SSC + 0.1% SDS 용액으로 1시간 동안 세척된다. 높은 엄격성의 경우, 온도는 68℃까지 상승된다. 본 발명의 목적을 위해, 혼성화된 뉴클레오티드는 10,000 cpm/ng의 특이적 방사성활성(specific radioactivity)를 갖는 방사성표지된 프로브 1ng을 이용하여 검출되는 뉴클레오티드이고, 이때, 상기 혼성화된 뉴클레오티드는 72시간 이하의 시간 동안 -70℃에서 X-선 필름에 대한 노출 후에 명확하게 가시화된다.
본 출원은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 핵산 서열에 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 것은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 핵산 서열에 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 핵산 분자이다. 두 개의 핵산 서열 간의 차이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치들, 또는 그와 같은 말단 위치들 사이의 임의의 위치, 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 연속된 군에서 일어날 수 있다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정한 핵산 분자가 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 지 여부는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 표준 알고리즘을 이용한 두 분자 간에 이루어진 비교를 의미하며 BLASTN 알고리즘과 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)을 참조한다.
본 발명의 안티센스 방법에서 이용되는 이종 서열은 전체 A622 또는 NBB1 mRNA 서열, 또는 그의 일부에 상보적인 RNA 산물을 생산하기 위해 선택될 수 있다. 그 서열은 천연의 메신저 RNA의 연속된 서열에 상보적일 수 있고, 즉, 5'-말단 또는 캡핑 부위(capping site)에 근접한 내인성 mRNA 서열, 캡핑 부위 하류의 내인성 mRNA 서열, 캡핑 부위와 개시 코돈 사이의 내인성 mRNA 서열에 상보적일 수 있고, 비-코딩 영역 전체 또는 그 일부만을 포함할 수 있고, 비-코딩 영역과 코딩 영역을 연결할 수 있고, 코딩 영역 전체 또는 그 일부에 상보적일 수 있고, 코딩 영역의 3'-말단에 상보적이거나 또는 mRNA의 3'-비해독 영역에 상보적일 수 있다.
적합한 안티센스 서열은 약 13개 이상 내지 약 15개의 뉴클레오티드, 약 16개 이상 내지 약 21개의 뉴클레오티드, 약 20개 이상, 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 약 75개 이상의 뉴클레오티드, 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 약 125개 이상의 뉴클레오티드, 약 150개 이상의 뉴클레오티드, 약 200개 이상의 뉴클레오티드, 또는 그 이상일 수 있다. 또한, 상기 서열은 그의 3' 또는 5' 말단에서 연장되거나 또는 단축될 수 있다.
특정한 안티센스 서열 및 상기 안티센스 서열의 길이는 예를 들면, 원하는 억제의 정도 및 안티센스 서열의 안정성에 따라, 변할 것이다. 일반적으로 이용가능한 기법 및 본 명세서에서 제공된 정보는 적합한 A622 또는 NBB1 안티센스 서열의 선택을 유도할 수 있다. 본 명세서에서 서열번호 1 또는 서열번호 3에 대해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 수용하는 식물 세포(recipient plant cell)로 형질전환되는 경우 원하는 효과를 달성하기에 충분한 길이의, 안티센스 배향(orientation)인 A622 또는 NBB1 cDNA 서열의 연속된 단편일 수 있다.
본 발명은 A622 및 NBB1 중 하나 또는 양자의 센스 공동-억제(sense co-suppression)을 고려할 수 있다. 본 발명을 실행하기 위해 이용되는 센스 폴리뉴클레오티드는, 식물 세포에서 발현되는 경우, 상기 식물 세포에서 식물의 A622 또는 NBB1 단백질의 본래의 발현을 억제하기에 충분한 길이이다. 그와 같은 센스 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 A622 또는 NBB1 효소를 코딩하는 전체의 게놈 핵산 또는 상보적인 핵산 또는 그의 단편일 수 있고, 그와 같은 단편은 통상적으로 길이가 15개 이상의 뉴클레오티드로 구성된다. 세포에서 원형의 유전자의 발현 억제를 초래하는 센스 DNA의 길이를 확인하는 기법들이 일반적으로 이용가능하다.
본 발명의 대안적인 구체예에서, 식물 세포는 효소활성의(enzymatic) RNA 분자("리보자임(ribozyme)")를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 포함하는 핵산 작제물로 형질전환되며, 상기 효소활성의 RNA 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같이, A622 또는 NBB1을 코딩하는 DNA의 mRNA 전사체에 작용한다(즉, 절단함(cleave)). 리보자임은 표적 mRNA의 접근가능한 영역에 결합하는 기질 결합 도메인, 및 RNA의 절단을 촉매하고, 해독 및 단백질 생산을 방지하는 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 표적 mRNA 서열에 상보적인 안티센스 서열을 포함할 수 있고; 촉매 모티프는 해머헤드(hammerhead) 모티브 또는 헤어핀 모티프와 같은 다른 모티프일 수 있다.
RNA 표적 내의 리보자임 절단 부위는 먼저 표적 분자를 리보자임 절단 부위(예를 들면, GUA, GUU 또는 GUC 서열)에 대해 스캐닝하는 것에 의해 확인될 수 있다. 일단 확인되면, 절단 부위를 포함하는 표적 유전자에 해당하는 15개, 20개, 30개, 또는 그 이상의 리보뉴클레오티드의 짧은 RNA 서열이 예측된 구조적 특징에 대해 평가될 수 있다.
후보 표적의 적합성은 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 리보뉴클레아제 보호 분석(ribonuclease protection assay)을 이용하여, 상보적 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대한 그들의 접근가능성(accessibility)를 테스트하는 것에 의해 평가될 수 있다. 효소활성의 RNA 분자를 코딩하는 DNA는 공지된 기법에 따라 생산될 수 있다. 예를 들면, Cecil et al, 미국특허 제4,987,071호; Keene et al, 미국특허 제5,559,021호; Donson et al, 미국특허 제5,589,367호; Torrence et al, 미국특허 제5,583,032호; Joyce, 미국특허 제5,580,967호; Gold et al, 미국특허 제5,595,877호; Wagner et al, 미국특허 제5,591,601호; 및 미국특허 제 5,622,854호를 참조한다.
식물 세포에서 그와 같은 효소활성의 RNA 분자의 생성 및 A622 또는 NBBl 단백질 생성의 중단은 안티센스 RNA 분자의 생성과 본질적으로 동일한 방식으로, 즉, 그 효소를 생산하는 세포에서 mRNA의 해독을 중단시키는 것에 의해 식물 세포에서 단백질 활성을 감소시킨다. 용어 "리보자임"은 엔도리보뉴클레아제와 같은, 효소로 작용하는 RNA-함유 핵산을 의미하며, "효소활성의 RNA 분자(enzymatic RNA molecule)"와 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 리보자임을 코딩하는 핵산, 리보자임을 코딩하고 발현 벡터에 삽입된 핵산, 그와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 식물에서 A622 및 NBB1 발현을 감소시키기 위해 리보자임을 이용하는 방법을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 RNA 간섭 유전자 사일런싱(RNA interference gene silencing)을 매개하는 이중-가닥 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 siNA 분자들은 약 15개 내지 약 30개(예를 들면, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개)의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 간에 약 15개 내지 약 30개의 염기쌍을 포함하는 이중 가닥(duplex) 분자로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 약 1개 내지 약 32개(예를 들면, 약 1개, 2개 또는 3개)의 뉴클레오티드의 오버행(overhang) 말단을 갖는 이중가닥 핵산 분자, 예를 들면, 약 19개의 염기쌍 및 3'-말단 모노뉴클레오티드, 디뉴클레오티드, 또는 트리뉴클레오티드 오버행을 갖는 약 21-뉴클레오티드 이중가닥을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 siNA 분자는 양 말단이 평활(blnt)이거나, 또는 대안적으로 하나의 말단이 평활인, 평활 말단을 갖는 이중가닥 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 siNA 분자는 RNAi를 매개하는 능력을 유지하면서, 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 안정성, 활성 및/또는 생체이용률과 같은 인 비트로 또는 인 비보 특성을 개선하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 siNA 분자는 siNA 분자에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수에 대한 백분율로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 siNA 분자는 일반적으로 약 5% 내지 약 100%의 변형된 뉴클레오티드(예를 들면, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 변형된 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 주어진 siNA 분자에 존재하는 변형된 뉴클레오티드의 실제 백분율은 siNA에 존재하는 뉴클레오티드의 총수에 의존적일 것이다. siNA 분자가 단일 가닥인 경우, 퍼센트 변형은 단일 가닥 siNA 분자에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수에 근거할 수 있다. 마찬가지로, siNA 분자가 이중 가닥인 경우, 퍼센트 변형은 센스 스트랜드, 안티센스 스트랜드, 또는 센스 및 안티센스 스트랜드 모두에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수에 근거할 수 있다.
예를 들면, A622 및 NBB1 발현은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 유전 공학 방법을 통해 감소될 수 있다. 발현은 A622 또는 NBB1을 코딩하는 서열의 부분을 포함하는 RNA의 발현을 초래하는 핵산 작제물을 도입하는 것에 의해 감소될 수 있다. 서열의 일부는 센스 또는 안티센스 배향일 수 있다. 서열의 부분은 이중-가닥 RNA 영역을 형성할 수 있는 역전된 반복서열(inverted repeats) 내에 존재할 수 있다. 발현은 A622 또는 NBB1을 코딩하는 DNA의 niRNA 전사체에 대해 작용하는 (즉, 절단하는) 효소활성의 RNA 분자(즉, "리보자임")를 코딩하는 핵산 작제물을 도입하는 것에 의해 감소될 수 있다. 발현은 내인성 유전자의 표적화된 인 시투 돌연변이 생성(in situ mutagenesis)을 유발하여, 그의 불활성화를 초래하는 A622 또는 NBB1 서열의 일부를 포함하는 핵산을 도입하는 것에 의해 감소될 수 있다.
서열 분석
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2: 482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘(local homology algorithm)에 의해; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol . 48: 443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; Pearson and Lipman, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 85: 2444 (1988)의 유사성 방법을 위한 조사에 의해; 이러한 알고리즘의 컴퓨터에 의한 수행에 의해 수행될 수 있는데, 컴퓨터에 의한 수행으로는 Intelligenetics, Mountain View, California의 PC/Gene 프로그램에서 CLUSTAL; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니고; CLUSTAL 프로그램은 Higgins and Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet et al ., Nucleic Acids Research, 16: 10881-90 (1988); Huang et al ., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), 및 Pearson et al ., Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994)에서 잘 기술되어 있다.
데이타베이스 유사성 연구를 위해 사용될 수 있는 BLAST 프로그램 분류로는 다음을 포함한다: 뉴클레오티드 데이타베이스 서열에 대해 검색을 원하는 뉴클레오티드 서열을 위한 BLASTN; 단백질 데이타베이스 서열에 대해 검색을 원하는 뉴클레오티드 서열을 위한 BLASTX; 단백질 데이타베이스 서열에 대해 검색을 원하는 단백질 서열을 위한 BLASTP; 뉴클레오티드 데이타베이스 서열에 대해 검색을 원하는 단백질 서열을 위한 TBLASTN; 및 뉴클레오티드 데이타베이스 서열에 대해 검색을 원하는 뉴클레오티드 서열을 위한 TBLASTX. Current Protocols in Molecular Biology, 제19장, Ausubel et al ., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995); Altschul et al ., J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990); 및, Altschul et al ., Nucleic Acids Res . 25:3389-3402 (1997)을 참고한다.
BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 예를 들면 미국 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공공연하게 입수가능하다. 이러한 알고리즘에는 먼저, 검색을 원하는 서열(query sequence)에서, 길이 W의 짧은 암호(word)를 확인함으로써 높은 점수를 나타내는 서열 쌍(high scoring sequence pairs, HEPSs)을 확인하는 단계를 포함하고, 이것은 데이타베이스 서열 내에서 같은 길이를 갖는 암호와 정렬되었을 때 소정의 양의 값 범위의 점수 T와 일치하거나 또는 이를 만족하게 한다. T는 이웃하는 암호 점수 범위(neighborhood word score threshold)로 칭해진다. 이러한 초기의 이웃하는 암호 히트(neighborhood word hit)는 이들을 포함하는 더 긴 HSPs를 발견하기 위한 연구를 시작하기 위한 근원으로서 작용한다. 그런 다음, 암호 히트는 누적하는 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 뉴클레오티드 서열을 위한 누적 점수는 파라미터 M(일치하는 1쌍의 잔기를 위한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(일치하지 않는 잔기를 위한 벌금 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대하여, 누적 점수를 계산하기 위해서 점수화 매트릭스(scoring matrix)가 사용된다. 각각의 방향으로 암호 히트를 확장시키는 것은 다음과 같을 때 중지된다: 누적하는 정렬 점수가 최대 도달값으로부터 양 X로 떨어질 때; 하나 이상의 음으로 점수화되는 잔기 정렬의 누적으로 인하여, 누적 점수가 0 또는 그 미만으로 갈 때; 또는 두 개의 서열 중 어느 하나의 목표가 도달되었을 때. BLAST 알고리즘 파라미터인, W, T, 및 X가 정렬의 감도(sensitivity)와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열을 위함)은 디폴트(default)로서, 암호길이(wordlength)(W) 11, 기대값(expectation) (E) 10, 차단값(cutoff) 100, M=5, N=-4, 및 두 개 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열을 위해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서, 암호길이(W) 3, 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스를 사용한다. Henikoff ＆ Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915 (1998)를 참조한다.
서열 동일성의 퍼세트를 계산하는 것뿐만 아니라, BLAST 알고리즘은 또한 두 개 서열의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다(예를 들면, Karlin ＆ Altschul, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5877 (1993)을 참조한다). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 가장 최소의 합산 확률(sum probability, (P(N))로서, 이것은 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치함이 우연에 의해 일어나는 확률 지표를 제공한다.
복수 개의 서열 정렬은 디폴트 파라미터(GAP PENALTY=1O, GAP LENGTH PENALTY=1O)를 갖는 CLUSTAL 정렬 방법(Higgins ＆ Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989))을 사용하여 수행될 수 있다. CLUSTAL 방법을 사용하는 쌍대 정렬(pairwise alignment)을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WIND0W=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다.
폴리뉴클레오티드 서열을 위한 E 값과 퍼센트 동일성에 도움이 되는, BLASTN을 사용한 정렬과 유사성을 결정하기 위해서는, 하기의 운영 파라미터가 바람직하다. 유닉스 운영 명령어(Unix running command): blastall -p blastn -d embldb -e 10 -GO -EO -r 1 -v 30 -b 30 -i queryseq -o results; 파리미터는 -p Program Name [String]; -d Database [String]; -e Expectation value (E) [Real]; -G Cost to open a gap (제로는 디폴드 행동을 유발시킨다) [Integer]; -E Cost to extend a gap (제로는 디폴드 행동을 유발시킨다) [Integer]; -r Reward for a nucleotide match (blastn에만) [Integer]; -v Number of one-line descriptions (V) [Integer]; -b Number of alignments to show (B) [Integer]; -i Query File [File In]; 및 -o BLAST report Output File [File Out] Optional.
BLASTN, FASTA, BLASTP 또는 유사한 알고리즘에 의해 만들어진 검색을 원하는 서열에 의한 한 개 이상의 데이타베이스 서열에 대한 "히트"가 정렬하고 서열 중 유사한 부분을 확인한다. 히트는 유사한 정도 및 서열이 겹쳐지는 길이(length of sequence overlap)의 순서로 배열된다. 일반적으로, 데이타베이스에 대한 히트는 검색을 원하는 서열의 서열 길이의 일 부분만에 대한 겹침을 나타낸다.
또한, BLASTN, FASTA 및 BLASTP 알고리즘은 정렬을 위한 "기대값"을 산출한다. 기대값(E)은 소정 크기의 데이타베이스를 검색할 때 당업자가 우연히 인접하는 서열의 개수를 찾도록 기대할 수 있는 히트의 개수를 나타낸다. 기대값은 바람직한 EMBL 데이타베이스와 같은, 데이타베이스에 대한 히트가 실제 유사성을 나타낼 수 있는지 여부를 결정하기 위한 유효 경계(significance threshold)로 사용된다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 히트에 지정된 E 값 0.1은 EMBL 데이타베이스 크기의 데이타베이스 내에서 당업자가 유사한 점수를 갖는 서열의 정렬된 일 부분에 대해 0.1 일치값을 단순히 우연히 찾는 것을 기대할 수 있음을 의미하는 것으로 해석된다. 이러한 기준에 의하면, 폴리뉴클레오티드 서열의 정렬되고 일치하는 부분은 90％로 동일할 확률을 갖게 된다. 정렬되고 일치하는 부분에 대해 0.01 또는 그 미만의 E 값을 갖는 서열에 대해서는, EMBL 데이타베이스에서 일치하는 부분을 우연히 발견할 확률은 BLASTN 또는 FASTA 알고리즘을 사용해서는 1％ 또는 그 미만이 된다.
하나의 실시 형태에 따르면, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 각각과 관련하여 "변이체" 폴리뉴클레오티드("variant" polynucleotide)는 바람직하게는 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 각각에 대해 동일 개수 또는 보다 더 작은 개수의 핵산을 갖고, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드과 비교될 때 0.01 또는 그 미만의 E 값을 산출하는 서열을 포함한다. 즉, 변이체 폴리뉴클레오티드는 상기 기술된 파라미터로 고정된 BLASTN, FASTA, 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 0.01 또는 그 미만의 E 값을 갖는 것으로 측정되었을 때, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드와 99％ 이상의 확률로 동일한 소정의 서열이다. 택일적으로, 본원 발명의 변이체 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건 하에서 서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상보적 서열, 역 서열(reverse sequence), 또는 이러한 서열의 역 상보적 서열(reverse complement)과 혼성화한다(hybridize).
또한, 본원 발명은 유전자 코드(genetic code)의 축퇴성(degeneracy)의 결과로서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것과 동일한 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 것을 제외하고는 개시된 서열과 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 보존적인 치환(conservative substitution)의 결과로서, 서열번호 1 또는 3에서 인용된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상보적 서열, 역 서열, 또는 그의 역 상보적 서열과 상이한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원 발명에서 고려되었고 본원 발명에 포함되었다. 추가적으로, 전체 서열 길이의 10％ 미만이 되도록 하는 결실 및/또는 삽입의 결과로서, 서열번호 1 또는 3에서 인용된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보적 서열, 그의 역 상보적 서열, 또는 그의 역 서열과 상이한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원 발명에서 고려되었고 본원 발명에 포함되었다.
본원 발명의 폴리뉴클레오티드 서열과 특정 퍼센트의 동일성을 가질 뿐만 아니라, 변이체 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 본원 발명의 폴리뉴클레오티드와 공통되는 추가적인 구조 및/또는 기능상의 특징을 갖는다. 일차적인 구조(primary structure)에서 본원 발명의 폴리뉴클레오티드와 높은 정도의 유사성을 공유할 뿐만 아니라, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드와 특정한 정도의 동일성을 갖거나 또는 본원 발명의 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는다: (i) 이들은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 기능상의 특징을 갖는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 개방 해독 프레임(open reading frame) 또는 부분적인 개방 해독 프레임을 포함한다; 또는 (ii) 이들은 공통적으로 도메인을 갖는다. 예를 들면, 변이체 폴리뉴클레오티드는 A622 또는 NBB1을 억제하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
핵산 작제물( Nucleic Acid Construct )
본원 발명의 하나의 실시 형태에 따르면, 니코틴 알칼로이드 생합성을 감소시키는 서열이 식물 형질 전환을 위해 적절한 핵산 작제물에 넣어진다. 예를 들면, 이러한 핵산 작제물은 식물에서 A622 또는 NBB1 중 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 또한, 본원 발명의 핵산 작제물은 A622 및 NBB1 발현 중 어느 하나 또는 이들 모두를 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 니코틴 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 줄일 수 있다.
따라서, 식물에서 조작되는 전사 개시 부위의 조절 하에, 니코틴 알칼로이드 생합성을 하향-조절하는(down-regulate) 서열을 포함하는 핵산 작제물이 제공되어, 상기 작제물은 숙주 식물 세포에서 RNA를 만들 수 있다.
재조합 DNA 작제물은 표준적인 기법을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 전사를 위한 DNA 서열은 상기 서열을 포함하는 벡터를, 적절한 단편으로 절단하는 제한 효소로 처리함으로써 수득될 수 있다. 또한, 전사를 위한 DNA 서열은 각각의 말단에 적절한 제한효소 부위를 제공하도록, 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 붙임으로써 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 합성 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 만들어질 수 있다. 그런 다음, DNA 서열은 상향 프로모터(upstream promoter) 및 하향 터미네이터(downstream terminator) 서열과 같은, 적절한 조절 요소를 포함하는 벡터로 클로닝된다.
적절한 조절 요소
프로모터는 전사의 개시 시점에서 전사를 개시하는 RNA 중합효소 및 다른 단백질의 인식 및 결합과 관련되는 DNA 상향(upstream)의 한 부위를 의미한다. "구조 프로모터(constitutive promoter)"는 식물의 일대기를 통해 대부분의 환경 조건에서 활성이 있는 프로모터이다. 조직-특이적, 조직에-바람직한, 세포 형태에-특이적인 및 유도성(inducible) 프로모터가 "비-구조적 프로모터(non-constitutive promoter)"의 분류를 구성한다. "작동가능하도록 연결된(operably linked)"은 프로모터와 제2 서열의 기능상 연결을 칭하고, 이때 프로모터 서열은 상기 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시하고 중재한다. 일반적으로, "작동가능하도록 연결된"은 연결되는 핵산 서열이 인접해 있음을 의미한다.
A622 또는 NBB1의 발현을 감소시키기 위해, 세포로 주입된 핵산 서열의 발현을 위해 유용한 프로모터로는 구조 프로모터, 또는 조직-특이적, 조직에-바람직한, 세포 형태에-특이적인, 및 유도성 프로모터가 될 수 있다. 바람직한 프로모터는 담배 RB7프로모터와 같이 뿌리 조직에서 활성이 있는 프로모터(Hsu et al ., Pestic. Sci . 44:9-19 (1995); 미국 특허 번호 제5,459,252), 및 담배 RD2 프로모터와 같이, 니코틴 생합성에 관여하는 효소의 높아진 발현을 산출하는 조건 하에서 활성이 있는 프로모터(미국 특허 번호 제5,837,876호), PMT 프로모터(Shoji T. et al., Plant Cell Physiol, 41 :831-839 (2000b); WO 2002/038588) 또는 A622 프로모터(Shoji T. et al ., Plant MoI Biol , 50:427-440 (2002))를 포함한다.
또한, 본원 발명의 벡터는 본원 발명의 핵산 분자의 하향(downstream)에 위치해 있는 종결 서열을 포함할 수 있어, mRNA의 전사가 종결되고 polyA 서열이 첨가된다. 이러한 터미네이터의 예로는 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S 터미네이터 및 노팔린 합성효소 유전자(nopaline synthase gene, Tnos) 터미네이터가 있다. 또한, 발현 벡터는 인핸서(enhancer), 개시 코돈(start codon), 스플라이싱 신호 서열(splicing signal sequence), 및 표적화 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본원 발명의 발현 벡터는 형질 전환된 식물 세포가 배지에서 확인될 수 있게 하는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 마커는 이종 핵산 분자, 즉 프로모터에 작동가능하도록 연결된 유전자와 회합될 수 있다(associated). 용어 "마커"가 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 마커를 포함하는 식물 또는 식물 세포의 선택 또는 스크리닝을 가능하게 하는 특징 또는 표현형을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 보통, 마커 유전자는 항생제 또는 제초제에 대한 저항성을 코딩할 것이다. 이것은 형질 전환되지 않은 또는 감염되지 않은 세포들 중에서 형질 전환된 세포를 선택하는 것을 가능하게 한다.
적절한 선택가능한 마커의 예로는 아데노신 데아미나아제(deaminase), 디히드로폴레이트 환원효소, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제(hygromycin-B-phosphotransferase), 티미딘 키나제(thymidne kinase), 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 글리포세이트 및 글루포시네이트 저항성, 및 아미노-글리코시드 3'-O-포스포트랜스퍼라제(카나마이신, 네오마이신 및 G418 저항성)를 포함한다. 이러한 마커는 G418, 하이그로마이신, 블레오마이신, 카나마이신, 및 젠타마이신에 대한 저항성을 갖고 있다. 또한, 작제물은 암모늄 글루포시네이트와 같은 제초제 활성이 있는 포스피노트리신(phosphinothricin) 유사체에 대한 저항성을 부여하는 선택가능한 마커 유전자 Bar를 포함할 수 있다. Thompson et al ., EMBO J. 9: 2519-2523 (1987). 다른 적절한 선택 마커가 또한 알려져 있다.
녹색 형광 단백질(green florescent protein, GFP)과 같은 육안으로 식별가능한 마커가 사용될 수 있다. 세포 분열의 조절에 기초하여 형질 전환된 식물을 확인하거나 또는 선택하는 방법이 기술되어 있다. WO 2000/052168과 WO 2001/059086를 참조한다.
또한, 박테리아 기원(origin)의 또는 바이러스 기원의 복제 서열이 박테리아 또는 파지 숙주에서 벡터가 클로닝되도록 포함될 수 있다. 바람직하게는, 광범위한 숙주 범위로 원핵 생물의 복제 기원이 사용된다. 박테리아를 위한 선택 가능한 마커가 바람직한 작제물을 보유한 박테리아 세포를 선택하도록 포함될 수 있다. 또한, 적절한 원핵 생물의 선택가능한 마커는 카나마이신 또는 테트라시클린과 같은 항생제에 대한 저항성을 갖는다.
당해 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 추가적인 기능을 코딩하는 다른 DNA 서열이 벡터에 존재할 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium)이 숙주일 때, T-DNA 서열은 식물 염색체로 연속적인 전달 및 통합을 용이하게 하기 위해 포함될 수 있다.
유전자 조작 식물
본원 발명은 니코틴 알칼로이드 합성을 조절하는, A622 및 NBB1과 같은 유전자의 발현을 하향-조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 주입함으로써, 니코틴 알칼로이드 합성을 억제하도록 식물의 유전자를 조작하는 것을 포함한다. 그 결과는 감소된 니코틴 알칼로이드 농도를 갖는 식물이다.
본원 명세서에서, "식물"은 소정의 니코틴 알칼로이드를 포함하는 식물 재료를 의미하는데, 이들은 유전자 조작될 수 있고, 분화된(differentiated) 또는 분화되지 않은 식물 세포, 프로토좀(protosome), 전체 식물, 식물 조직, 또는 식물 기관, 또는 잎, 줄기, 뿌리, 식물의 눈, 덩이줄기, 열매, 뿌리줄기 또는 그 등가물을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본원 발명에 따라 처리될 수 있는 식물의 예로는 담배, 감자, 토마토, 가지, 피망, 및 벨라돈나 풀(Atropa belladonna)을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
식물 형질 변환과 선택
본원 발명에 따른 작제물은 적절한 형질 전환 기법을 사용하여, 소정의 식물 세포를 형질 전환하는데 사용될 수 있다. 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물 속씨 식물 또는 겉씨 식물의 식물 세포 모두 당해 분야에서 알려져 있는 다양한 방식으로 형질 전환될 수 있다. 예를 들면, Klein et al ., Biotechnology 4: 583-590 (1993); Bechtold et al ., C. R. Acad . ScL Paris 316:1194-1199 (1993); Bent et al ., Mol. Gen . Genet. 204:383-396 (1986); Paszowski et al ., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Sagi et al ., Plant Cell Rep . 13: 262-266 (1994)을 참조한다. 예를 들면, Nagel et al ., Microbiol Lett 61: 325 (1990)에 따르면, 에이 투메파시엔(A. tumefacien)과 에이 리조겐(A. rhizogene)과 같은 아그로박테리윰 종이 사용될 수 있다. 또한, 식물은 라이조비윰(Rhizobium), 시노라이조비윰(Sinorhizobium), 또는 메조라이조비윰(Mesorhizobium) 형질 전환에 의해 형질 전환될 수 있다. Broothaerts et al ., Nature 433:629-633 (2005).
예를 들면, 아그로박테리윰은 예를 들면 전기 천공법(electroporation)에 의해 식물 발현 벡터로 형질 전환될 수 있고, 그 이후에 아그로박테리윰은 잘 알려져 있는 잎-디스크(leaf-disk) 방법에 의해 식물 세포로 주입된다. 이를 수행하는 추가적인 방법은 전기 천공법, 입자 총 충격(particle gun bombardment), 칼슘 포스페이트 침전, 및 폴리에틸렌 글리콜 융합, 발아하는 화분립(pollen grain)으로 전달, 직접적인 형질 전환(Lorz et al ., Mol. Genet. 199: 179-182 (1985)), 및 당해 분야에서 알려져 있는 다른 방법을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 카나마이신 저항성이 있는 것과 같은 선택 마커가 사용된다면, 이것은 어떤 세포가 성공적으로 형질 전환되었는지를 결정하는 것을 더 쉽게 한다.
상기 논의된 아그로박테리윰 형질 전환 방법은 쌍떡잎 식물을 형질 전환시키는데 유용하다고 알려져 있다. 또한, de Ia Pena et al ., Nature 325: 274-276 (1987), Rhodes et al ., Science 240: 204-207 (1988), 및 Shimamato et al ., Nature 328: 274-276 (1989)은 아그로박테리윰을 사용하여 곡류와 같은 외떡잎 식물을 형질 전환시켰다. 또한, 아그로박테리윰에-매개되는 형질 전환을 위해 진공 상태의 침윤을 설명하고 있는 Bechtold et al ., CR . Acad . Sci . Paris 316 (1994)을 참조한다.
본원 발명의 목적을 위해, 식물 또는 식물 세포는 각각 프로모터에 작동가능하도록 연결된 하나 이상의 서열을 포함하는 플라스미드로 형질 전환될 수 있다. 예를 들면, 예로 들 수 있는 벡터는 프로모터에 작동가능하도록 연결된 QPT 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 플라스미드는 프로모터에 작동가능하도록 연결된 QPT 서열과, 프로모터에 작동가능하도록 연결된 A622 서열을 포함할 수 있다. 택일적으로는, 식물 또는 식물 세포는 하나 이상의 플라스미드로 형질 전환될 수 있다. 예를 들면, 식물 또는 식물 세포는 프로모터에 작동가능하도록 연결된 QPT를 포함하는 제1 플라스미드로 형질 변환되는데, 이것은 A622 또는 NBB1 서열을 포함하는 제2 플라스미드와 전혀 별개의 것이다. 물론, 제1 플라스미드와 제2 플라스미드 또는 이들의 부분은 같은 식물 세포로 주입된다.
본원 발명의 유전자 조작에 의한 식물은 통상적인 육종에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 하향-조절된 QPT와 A622 활성을 갖도록 유전자 조작된 식물은 감소된 QPT 발현을 갖는 이식 유전자성 식물과 감소된 A622 발현을 갖는 이식 유전자성 식물을 교배함으로써 생성될 수 있다. 연속적인 횟수의 교배와 선택 다음에, 하향 조절된 QPT와 A622 활성을 갖는 유전자 조작에 의한 식물이 선택될 수 있다.
특정 세포에서 단백질, 폴리펩티드, 또는 핵산 분자의 존재는 예를 들면, 세포가 성공적으로 형질 전환되었는지 여부 또는 트랜스펙션되었는지 여부를 결정하기 위해 측정될 수 있다.
선택 후에 마커의 제거를 용이하게 하기 위해, 마커 유전자는 cre 또는 flp와 같은 특정 재조합 효소에 의해 인식되는 재조합 부위의 쌍 내에 포함될 수 있다. 예를 들면, 미국에서 공개된 특허 출원 제2004/0143874호를 참조한다.
마커 유전자가 없는 이식 유전자성 식물은, A622 또는 NBB1 서열을 포함하는 제1 플라스미드와는 전혀 다른, 마커를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 사용하여 생성될 수 있다. 제1 플라스미드와 제2 플라스미드 또는 이들의 일 부분이 동일한 식물 세포로 주입되어, 선택 가능한 마커 유전자가 이식 유전자에 의해 발현되고, 형질 전환된 식물 세포가 확인되고, A622 또는 NBB1 서열은 게놈으로 안정하게 삽입되고, 선택 가능한 마커 유전자는 안정하게 삽입되지 않는 형질 전환된 식물이 수득된다. 미국에서 공개된 특허 출원 제2003/0221213호를 참조한다. A622 또는 NBB1 서열을 포함하는 제1 플라스미드는 선택적으로는, 야생형 비-이식 유전자성(non-transgenic) N. tabacum 또는 유성적으로 양립가능한 담배(Nicotiana) 종에 존재하는 핵산 서열로 완전히 보충되는, T-DNA 부위를 갖는 이원 벡터(binary vector)가 될 수 있다.
식물 세포는 선택가능한 또는 육안으로 식별가능한 마커를 사용하지 않고 본원 발명의 핵산 작제물로 형질 전환될 수 있고, 이식 유전자성 식물 조직과 이식으로 재생된 식물은 PCR에 의하여 도입된 작제물의 존재를 검출함으로써 또는 특정 핵산 서열을 검출하는 다른 방법에 의해 확인될 수 있다. 형질 전환된 식물 세포의 확인은 유사한 조건 하에서 재배된 형질 전환되지 않은(non-transformed) 식물 세포의 생장 속도 또는 형태학상의 특징과 비교되는 상기 형질 변환된 식물 세포의 생장 속도 또는 형태학상의 특징의 차이를 인식함으로써 수월해 수 있다(WO 2004/076625호를 참조한다).
형질 전환된 세포 또는 배양물로부터 이식 유전자성 식물을 재생하는 방법은 식물 종에 따라 변경가능하지만, 공지된 방법에 기초한다. 예를 들면, 이식 유전자성 담배 식물을 재생하는 방법은 잘 알려져 있다.
본원 발명의 목적을 위해, A622 및 NBB1 중 하나 이상의 발현을 하향-조절하도록 하는 유전자 조작에 의한 식물이 선택된다. 또한, 본원 발명의 유전자 조작에 의한 식물은 QPT 또는 PMT와 같은 니코틴 생합성 유전자, 및 A622 및 NBB1 중 하나 이상의 발현을 하향-조절할 수 있다.
니코틴은 해충에 의한 피해로부터 담배 식물의 보호를 도와주는 천연 살충제로서 작용하고, 통상적으로 육종된 또는 이식 유전자성 저-니코틴 담배의 곤충 피해에 대한 감수성은 증가되었다고 보고되었다. Legg, P.D., et al ., Can . J. Cyto., 13:287-291 (1971); Voelckel, C, et al ., Chemoecology 11 :121-126 (2001); Steppuhn, A., et al ., PLoS Biol, 2(8): e217: 1074-1080 (2004). 따라서, 본원 발명의 방법에 의해 생성된 니코틴이 감소된 식물을, Bt 살충성 단백질, 프로테이나아제(proteinase) 억제제, 또는 비오틴-결합 단백질을 코딩하는 유전자와 같은 추가적인 곤충 보호를 부여하는 삽입 유전자(transgene)를 이용하여 추가로 형질 전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 추가적인 곤충에 대한 보호를 부여하는 삽입 유전자는 이식 유전자성의 니코틴이 감소된 식물과, 곤충에 대한 저항성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 제2 이식 유전자성 식물을 교배시킴으로써 주입될 수 있다.
니코틴 알칼로이드 함량의 정량
본원 발명의 이식 유전자성 식물은 감소된 니코틴 알칼로이드 함량을 특징으로 한다. 유전자 조작에 의한 식물에서 감소된 니코틴 알칼로이드 함량은 바람직하게는 A622 또는 NBB1과 같은, 니코틴 생합성 경로 유전자의 감소된 발현을 통해 달성된다.
본원 발명의 식물을 기술할 때, 어구 "니코틴 또는 니코틴 알칼로이드 함량이 감소된"은 형질 전환되지 않은 대조군 식물에 비해, 식물에서 니코틴 알칼로이드의 함량의 정량적인 감소를 지칭한다. 니코틴 알칼로이드 농도의 정량적인 감소는 여러 방법에 의해 분석될 수 있는데, 예를 들면 기체-액체 크로마토그래피, 고 성능 액체 크로마토그래피, 방사 면역 측정법, 및 효소 결합 면역 흡수 분석법에 의해 분석될 수 있다. 본원 발명에서, 니코틴 알칼로이드 농도는 Hibi, N. et al., Plant Physiology 100: 826-835 (1992)에서 기술된 바와 같이, 미세 컬럼과 FID 검출기가 장착되어 있는 기체-액체 크로마토그래피에 의해 측정되었다.
니코틴-알칼로이드가 감소된 제품
본원 발명은 니코틴-알칼로이드가 감소된 농도를 갖는 이식 유전자성 식물을 제공한다. 예를 들면, 본원 발명은 A622 및 NBB1 중 하나 이상의 발현을 억제함으로써 니코틴 농도를 감소시키는 것을 고려하였다. 억제된 A622 또는 NBB1 발현 및 니코틴 함량이 감소된 이식 유전자성 식물을 선택한 다음에, 이러한 식물로부터 다양한 제품이 만들어질 수 있다.
본원 발명은 알칼로이드를 줄이는 방법을 제공하기 때문에, TSNA가 또한 줄어들 수 있는데, 왜냐하면 담배에서 알칼로이드 함량과 TSNA 누적 사이에는 유효하고, 명확한 상호 관계가 있기 때문이다. 예를 들면, 아나타빈(anatabine)과 NAT 간의 유효 상호 계수는 0.76이었다. Djordjevic et al ., J. Agric . Food Chem ., 37: 752-756 (1989). TSNA는 보존하는 동안에, 제조하는 동안에, 및 흡연하는 동안에 담배에서 주로 형성되는 발암성 물질의 한 분류이다. 그러나, TSNA는 자라는 상태에 있는 담배 식물 또는 절단한 지 얼마되지 않은 신선한 담배에는 작은 함량으로 존재한다. Hecht ＆ Hoffman, J. Natl . Cancer Inst . 58, 1841-4 (1977); Wiernik et al ., Recent Adv . Tob . Sci , 21 : 39-80 (1995). 유기성 작용기인 N-N=O를 포함하는 니트로사민(Nitrosamine)은 니트로소화 제제(nitrosating agent)에 의해 2차 또는 3차 아민의 질소로 N=O 작용기의 수월한 첨가로부터 형성된다. 이러한 특정 분류의 발암성 물질은 잠재적으로는 다른 니코틴을 포함하는 식물에서 발생할 수도 있지만, 담배에서만 발견된다.
TSNA는 담배 흡연시 가장 많이 나타나는 발암성 물질이라고 고려되고 있고, 이들의 발암성은 잘 증명되어 있다. Hecht, S. Mutat . Res. 424:127-42 (1999); Hecht, S. Toxicol . 11, 559-603 (1998); Hecht, S., et al ., Cancer Surv . 8, 273-294 (1989)을 참조한다. TSNA는 구강암, 식도암, 췌장암, 및 폐암의 원인으로 언급되어 있다(Hecht ＆ Hoffman, IARC Sci . Publ. 54-61 (1991)). 특히, TSNA는 담배 흡연과 관련된 선암 및 폐암의 극적인 증가를 일으키는 원인 물질로 관련되어 있다(Hoffmann et al ., Crit . Rev . Toxicol . 26, 199-211 (1996)).
노출 농도 및 발암 가능성에서 가장 중요하다고 고려되고 있고, 인간에 대해 아마도 발암 가능성이 있다고 보고된 4개의 TSNA는 N'-니트로소노르니코틴 (NNN), 4-메틸니트로소아미노-1-(3-피리딜)-1-부타논 (NNK), N'-니트로소아나타빈 (NAT) 및 N'-니트로소아나바신 (NAB)이다. 인간에 대한 화학 물질의 발암성 위험에 대한 평가시 IARC 연구 논문에서 검토되었다. Lyon (France) VoI 37, pp.205-208 (1985). 이러한 TSNA는 니코틴의 N-니트로소화 반응 및 노르니코틴, 아나타빈, 및 아나바신을 포함하는 미량의 담배 알칼로이드의 N-니트로소화 반응에 의해 형성된다.
필터가 없는 궐련의 주요 연기에서, 알칼로이드 화합물에 대해 하기의 농도가 보고되었다(㎍/궐련으로 측정됨): 니코틴: 100-3000, 노르니코틴: 5-150, 아나타빈: 5-15, 아나바신: 5-12 (Hoffmann et al ., Chem . Res , Toxicol . 14:7:767-790 (2000)). 필터 팁이 있거나 또는 없는 미국 궐련의 주요 연기는 다음을 포함한다(ng/궐련으로 측정됨): 9-180 ng NNK, 50-500 ng NNN, 3-25 ng NAB 및 55-300 ng NAT. Hoffmann, et al ., J. Toxicol . Environ . Health 41 :1- 52 (1994). 부수적인 연기에서 이러한 TSNA의 농도는 주요 연기에서의 농도에 5-10배가 됨을 주목하는 것이 중요하다. Hoffmann, et al (1994).
Xie et al. (2004)은 QPT의 하향-조절에 의한 GE 니코틴이 감소된 궐련인 Vector 21-41가 야생형 담배의 10 퍼센트 미만인 약 2300 ppm의 전체 알칼로이드 농도를 가진다고 보고하였다. Vector 21-41 궐련으로부터 나오는 주요 연기는 야생형 담배로부터 나오는 표준 상태의 완전한 담배 맛에서의 농도에 비해 NNN, NAT, NAB 및 NNK가 10 퍼센트 미만의 농도를 가졌다.
상응하는 담배 알칼로이드 전구체를 줄임으로써 TSNA를 줄이고자 하는 방법이 현재 농화학 분야의 담배 연구에서 주요 핵심이 되고 있다. Siminszky et al ., Proc. Nat . Acad . Set USA 102(41) 14919-14924 (2005). 따라서, 모든 TSNA의 형성을 감소시키기 위하여, 유전자 조작에 의해 가능한 많은 니코틴 알칼로이드 전구체를 줄이고자 하는 시급한 필요성이 있어 왔다.
다른 것들 중에서도, 미국 등록 특허 제5,803,081호, 제6,135,121호, 제6,805,134호, 제6,907,887호 및 제6,959,712호와 미국에서 공개된 특허 출원 제2005/0034365호와 제2005/0072047는 담배에 특이적인 니트로사민(TSNA)을 줄이는 방법을 논의하고 있다.
니코틴이 감소된 담배 제품은 잎 담배, 조각 담배, 절단 담배 및 담배 부분의 형태로 될 수 있다. 니코틴이 감소된 담배 제품은 궐련 담배, 시가 담배, 스너프(snuff), 씹는 담배, 파이프 담배 및 금연에서 사용하기 위해 GE 니코틴이 감소된 담배로부터 만들어진 궐련을 포함할 수 있다.
또한, 니코틴이 감소된 담배는 재구성된(reconstituted) 담배를 제조하기 위해 사용될 수 있다(Recon, 레콘). 레콘은 통상적인 종이 제조와 매우 유사한 공정에 의해 담배 줄기 및/또는 더 작은 잎 조각으로부터 만들어진다. 이러한 공정은 레콘으로 만들어지게 될 다양한 담배 부분을 제조하는 단계와 담배 전체 잎으로부터 만들어진 컷 래그(cut rag) 담배와 유사한 크기 및 형태로 담배를 세절하는 단계를 포함한다. 그런 다음, 이러한 세절된 레콘은 컷-래그 담배와 혼합되어, 궐련 제조를 위해 준비된다.
궐련 및 시가 담배와 같은 전통적인 담배 제품뿐만 아니라, 니코틴이 감소된 담배는 단백질, 섬유, 에탄올, 및 동물 사료의 급원으로서 사용될 수 있다. 미국에서 공개된 특허 출원 제2002/0197688호를 참조한다. 예를 들면, 니코틴이 감소된 담배는 루비스코(Rubisco)(리불로스 비스포스페이트 카르복실라아제-옥시게나아제 또는 부분 1 단백질)의 급원으로서 사용될 수 있는데, 왜냐하면 다른 식물과는 달리, 담배로부터-유래된 루비스코는 결정 형태로 쉽게 추출될 수 있기 때문이다. 메티오닌의 극히 낮은 농도의 예외로, 루비스코의 필수 아미노산의 함량은 FAO 임시적인 패턴과 동일하거나 또는 이를 초과한다. Ershoff, B.H., et al ., Society for Experimental Biology and Medicine 157:626-630 (1978); Wildman, S.G. Photosynthesis Research 73:243-250 (2002)).
재생될 수 없는 에너지 급원에 대한 세계 의존도의 상당한 부분을 대신하는 생물 연료를 위해, 루비스코와 같은 부산품은 이러한 재생가능한 에너지의 생산 비용의 지출을 도와주기 위해 필요하다. Greene et al ,. Growing Energy . How Biofuels Can End America's Oil Dependence; National Resources Defense Counsel (2004). 따라서, 담배에 있는 니코틴 알칼로이드가 더 많이 감소할수록, 성공적인 담배 생물량 시스템의 가능성은 더 커지게 된다.
도 1은 니코틴 생합성 경로를 도시한다. 약자는 다음과 같다: AO = 아스파테이트 옥시다제, QS = 퀴놀리네이트 신타제, QPT = 퀴놀리네이트 포스포리보실 트랜스퍼라제, ODC = 오르니틴 데카르복시라제, PMT = 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제, 및 DAO = 디아민 옥시다제.
도 2a는 pHANNIBAL을 개략적으로 도시한다.
도 2b는 멀티링커 부위(multilinker site)가 변형된 것인 pHANNIBAL-X를 개략적으로 도시한다.
도 3은 변형된 pHANNIBAL-X를 중간 플라스미드(intermediate plasmid)로 이용하여 식물 RNAi 이원 벡터(binary vector)를 제조하는 개요를 도시한다.
도 4는 pRNAi-A622의 T-DNA 영역을 도시한다.
도 5는 BY-2 세포, A622-사일런싱된(silenced) BY-2 세포, 및 NBB1-사일런싱된 BY-2 세포에서 니코틴 알칼로이드 축적을 도시한다.
도 6은 야생형 BY-2 세포, 622-사일런싱된 BY-2 세포, 및 NBB1-사일런싱된 BY-2 세포에서 A622, NBB1, 및 니코틴 생합성 경로의 공지된 효소에 대한 유전자의 발현을 도시한다.
도 7은 유도성 A622 발현 벡터 pXVE-A622RNAi의 T-DNA 영역을 도시한다.
도 8a는 에스트라디올에 의해 억제를 유도한 후 유도성 A622 억제 작제물(inducible A622 suppression construct)로 형질전환된 모상근 세포주에서 A622의 특이적 억제를 도시한다.
도 8b는 에스트라디올에 의해 억제를 유도한 후 유도성 A622 억제 작제물로 형질전환된 모상근 계통에서 감소된 니코틴 함량을 보여준다.
도 9는 야생형 담배 및 nic1, nic2 및 nic1nic2 돌연변이체의 뿌리 및 잎 조직에서 NBB1 발현 및 PMT 발현의 RNA 블랏 분석을 도시한다.
도 10은 NBB1과 에스콜리아 칼리포르니카 베르베린 브릿지 효소(Eschscholzia californica berberine bridge enzyme:EcBBE)의 정렬을 도시한다.
도 11은 NBB1 및 식물 BBE-유사 단백질 서열을 이용하여 작성된 계통수(phylogenetic tree)를 도시한다.
도 12는 NBB1 억제 벡터 pHANNIBAL-NBBl 3'의 T-DNA 영역을 도시한다.
도 13은 NBB1이 억제된 담배 모상근에서 니코틴 알칼로이드 합성의 감소를 도시한다.
도 14는 NBB1-사일런싱된 모상근 계통 및 대조구 모상근 계통에서 NBB1, A622 및 니코틴 생합성에 관여하는 공지된 효소의 발현을 도시한다.
도 15는 NBB1 억제 벡터 pANDA-NBB1full의 T-DNA 영역을 도시한다.
도 16은 NBB1 억제 벡터 pANDA-NBB1full로 형질전환된 계통으로부터의 니코티아나 타바쿰 식물의 잎에서 니코틴 수준을 도시한다.
니코틴에 관련되는 효소를 코딩하는 서열을 확인하는 방법뿐만 아니라, 식물 형질 전환을 생성하기 위해 표적 유전자를 주입하는 방법이, 특정 실시예에 의해 하기에서 제시된다. 이들은 설명을 위해 의도된 것이고, 본원 발명에 대한 제한을 의미하지 않는다.
실시예 1: A622 발현을 하향-조절함으로써 알칼로이드 함량을 줄이기 위한 pRNAi-A622 벡터의 제조
Wesley et al ., Plant J. 27: 581-590 (2001)에 의해 참조되는 바와 같이, 플라스미드 pHANNIBAL을 변형시켜, 도 2에서 보여지는 바와 같은 플라스미드 pHANNIBAL-X를 만들었다. 앰피실린 저항성 유전자(Amp)와 35S 프로모터 사이의 SacI 제한효소 부위를 SacI 절단(cutting)에 의해 제거하였고 및 뒤이어 DNA 블런팅(blunting)과 라이게이션(ligation) 하였다. 멀티-클로닝 부위(multi-cloning site, MCS)를 하기와 같이 변형하였다. XhoI와 EcoRI 부위 사이에 어댑터(adaptor)(5' TCGAACGGGATCCCGCCGCTCGAGCGG)를 첨가함으로써, 프로모터와 Pdk 인트론(intron) 사이에 있는 MCS로 Bam H I 제한효소 부위를 첨가하였다. BamH1 부위가 제거되었고, BamHI과 XbaI 부위 사이에 어댑터(5' GATCAGCTCTAGAGCCGAGCTCGC)를 삽입함으로써, 인트론과 터미네이터 사이에 있는 MCS로 Sac I 부위를 삽입하였다.
식물 RNAi 이원 벡터는 도 3에서 도시화된 개요를 사용하고 pHANNIBAL-X를 사용하여 제조하였는데, 도 3에서 별개의 "센스"와 "안티센스" 단편은 먼저 관심이 있는 유전자 단편의 말단에 특정 제한 효소 부위를 첨가함으로써 수득하였고, 그런 다음 센스와 안티센스 단편을 변형된 pHANNIBAL-X 플라스미드에서 바람직한 배열(orientation)로 삽입하였다.
센스와 안티센스 단편 및 사이에 끼여 있는(intervening) Pdk 인트론을 포함하는 DNA 단편을 pBI121의 GUS 코딩 부위와 치환하여, RNAi 이원 벡터를 만들었다(Wesley et al ., 2001).
A622 cDNA의 814 bp-1160 bp 부위를 dsRNA 형성 부위(forming region)로 사용하였다(센스 체인, 안티센스 체인). 지시된 제한 효소 부위를 코딩하는 추가적인 염기와 함께, 주형으로서 pcDNAII에서 클로닝된 A622 cDNA와 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였고, 표적 DNA 단편을 포집하였고, TA를 pGEM-T 벡터로 클로닝하였다.
사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다:
센스 체인 A622 F814-XhoI - A622 R1160-KpnI
A622 F814-XhoI 5' CCGCTCGAGCGGTCAGAGGAAGATATTCTCCA 3'
A622 R1160-KpnI 5' GGGGTACCCCTGGAATAAGACGAAAAATAG 3'
안티센스 체인 A622 F814-XbaI - A622 R1160-ClaI
A622 F814-XbaI 5 ' GCTCTAGAGCTCAGAGGAAGATATTCTCCA 3 '
A622 R1160-ClaI 5 ' CCATCGATGGTGGAATAAGACGAAAAATAG 3 '
변형된 pHANNIBAL-X를 이용한 재조합은 센스 체인으로부터 출발하여 그 다음에 안티센스 체인으로 수행하였다. TA 클로닝된 DNA 단편을 적절한 제한 효소로 절단하였고, 포집하였고, 동일한 제한 효소로 절단된 pHANNIBAL-X와 연결시켰다(ligate). 그 결과로 얻은 플라스미드는 Pdk 인트론에 의해 분리되는 A622 단편의 역전된 반복 서열(inverted repeat)을 갖는 DNA 서열을 포함한다.
BamH I와 Sac I으로 처리함으로써, 통합된 센스 체인과 안티센스 체인을 갖는 pHANNIBAL-X로부터 RNAi 부위를 잘라내었고, GUS 코딩 부위를 유사한 처리에 의해 제거한 pBI121와 연결시켜 식물 형질 전환을 위한 이원 벡터 pRNAi-A622를 만들었고, 이것은 nptII 선택가능한 마커 카세트(cassette)와 A622 RNAi 카세트를 포함하는 T-DNA 단편을 포함한다(도 4).
실시예 2: 담배 BY -2 세포에서 A622의 억제
담배 BY-2 세포 배양물이 정상적으로 니코틴 알칼로이드를 합성하지 않는 반면에, 메틸 자스모네이트 처리는 니코틴 생합성 경로에서 알려져 있는 효소의 유전자 발현을 유도하여, 니코틴 알칼로이드의 생성을 이끌어낸다.
A622의 기능을 추론하기 위하여, pRNAi-A622로부터 나온 mRNA가 배양시킨 담배 BY-2 세포에서 발현되어 A622를 억제하는, RNAi 변종 배양시킨 세포를 제조하였다.
농업상 형질 전환( agrotransformation )
벡터(pRNAi-A622)가 아그로박테리윰 투메파시엔(Agrobacteriiim tumefaciens) 변종 EH105로 형질 전환되었고, 이것을 담배 BY-2 세포를 형질 전환하는데 사용하였다. 담배 BY-2 세포를 감염시키고 선택하는 방법은 하기와 같다.
Imanishi et al ., Plant MoI . Biol ., 38: 1101-1111 (1998)에서 보여지는 바와 같이, 변형된 LS 배지 100 ml에서 7일 동안 배양시킨 BY-2 세포 4 ml를 변형된 LS 배지 100 ml로 계대 배양하였고, 4일 동안 배양하였다.
YEB 배지에서 1일 동안 배양시킨 A. tumefacien 용액 100 마이크로리터를 4일 동안 배양시켰던 세포 4 ml에 첨가하였고, 이 두 개를 40시간 동안 암 조건에서 27℃에서 배양하였다.
배양시킨 후에, 세포를 변형된 LS 배지로 2회 수세하여 아그로박테리아(Agrobacteria)를 제거하였다.
수세된 세포를, 카나마이신(50 mg/l)과 카르베니실린(250 mg/l)을 포함하는 변형된 LS 선택 배지에 펼쳐놓았고, 형질 전환된 세포를 선택하였다.
약 2주 동안 암 조건에서 27℃에서 배양시킨 후에, 형질 전환된 세포를 신선한 변형된 LS 선택 배지에 옮겼고, 암 조건에서 1주 동안 27℃에서 배양하였다.
형질 전환된 세포를 암 조건에서 27℃에서 1주 동안 액체형 변형된 LS 배지 30 ml에서 현탁성 배양(suspension culture)으로 키웠다.
배양시킨 형질 전환된 세포 1 ml를 변형된 LS 배지 100 ml로 계대 배양하였다. 형질 전환된 세포를 야생형 세포와 동일한 방식으로 7일마다 계대 배양하였다.
알칼로이드 합성
7일 동안 배양시켰던 형질 전환된 BY-2 세포 10 ml와, 대조군으로서 녹색 형광성 단백질(GFP) 발현 벡터를 사용하여 형질 전환시킨 배양시킨 담배 세포 10 ml 각각을, 2,4-D를 포함하지 않은 변형된 LS 배지로 2회 수세하였고, 2,4-D를 포함하지 않고 전체 100 ml가 되는 변형된 LS 배지를 첨가한 후에, 27℃에서 12시간 동안 현탁 배양시켰다.
DMSO로 50μM까지 희석시킨 메틸 자스모네이트(MeJa) 100 ㎕를 첨가한 후에, 세포를 48시간 동안 27℃에서 현탁 배양시켰다.
자스모네이트로 처리된 세포를 여과하였고, 포집하였고, 동결 건조하였다. 0.1 N의 황산 3 ml를 동결 건조된 시료 50 mg에 첨가하였다. 얻은 혼합물을 15분 동안 소니케이션시켰고, 여과하였다. 28％ 암모늄 용액을 여과액 1 ml에 첨가하였고, 10분 동안 15000 rpm에서 원심분리하였다.
상층액 1 ml를 Extrelut-1 컬럼(Merck)에 첨가하였고 5분 동안 방치하였다. 이것을 클로로포름 6 ml로 용리하였다. 그런 다음 용리액을 증발기(Taitec Concentrator TC-8)를 사용하여 감압 하에서 37℃에서 건조시켰다.
건조시킨 시료를 0.1％ 도데칸을 포함하는 에탄올 용액 50㎕에 녹였다. 모세관 컬럼과 FID 검출기가 장착된 기체 크로마토그래프(GC-14B)를 사용하여 시료를 분석하였다. RESTEC Rtx-5 아민 컬럼(Restec)을 모세관 컬럼으로 사용하였다. 컬럼 온도를 100℃에서 10분 동안 유지하였고, 25℃/분으로 150℃까지 높였고, 1분 동안 150℃에서 유지하였고, 1℃/분으로 170℃까지 높였고, 2분 동안 170℃에서 유지하였고, 30℃/분으로 300℃까지 높였고, 10분 동안 300℃에서 유지하였다. 주입과 검출기의 온도는 300℃이었다. 각각의 시료 1㎕를 주입하였고, 내부 표준 방법에 의하여 니코틴 알칼로이드를 정량하였다.
도 5에서 보여지는 바와 같이, A622 유전자 발현이 RNAi에 의해 억제되었던 이식 유전자성 BY-2 세포주에서(A3, A21 A33 및 A43 세포 주), 대조군 세포주에 비해, 자스모네이트 유도는 아나타빈(유도된 배양 세포에서 주요 알칼로이드), 아나탈린, 니코틴, 또는 아나바신을 상당히 축적시키지 않았다.
RNA 발현
A622-RNAi 세포주에서 알칼로이드 누적의 감소가 니코틴 생합성 경로에서 알려져 있는 효소의 유전자 발현 정도에 대한 간접적인 효과라기 보다는, A622 발현의 감소와 특히 관련되어 있는지 여부를 결정하기 위하여, A622와 다른 유전자의 발현 정도를 메틸 자스모네이트 처리 세포 주, 이식 유전자성 세포 주, 및 대조군 세포 주에서 측정하였다.
야생형, 및 48시간 동안 50μM MeJA로 처리된 이식 유전자성 BY-2 세포주로부터 전체 RNA를 분리하였다. 특정 유전자의 RNA 농도를 RT-PCR에 의해 결정하였다. RNeasy Plant 미니 키트(mini kit)(Qiagen)를 사용하여 제조자의 지시 사항에 따라 RNA를 추출하였다. RT-PCR(Invitrogen)을 위한 랜덤 헥사머와 Superscript First-Strand Synthesis System을 사용하여 cDNA를 합성하였다. TaKaRa ExTaq (Takara Bio)를 사용하고 주형으로서 cDNA 5 ng으로 하기의 조건 하에서 RT-PCR을 수행하였다: A622, NBB1, AO, QS, QPT, ODC의 검출을 위해, 30초 동안 94℃에서, 30초 동안 57℃에서, 및 30초 동안 72℃에서 22 사이클, PMT 검출을 위해, 1분 동안 94℃에서, 30초 동안 52℃에서, 및 1분 동안 72℃에서 24 사이클.
A622 프라이머:
A622-07F 5' ATGGTTGTATCAGAGAAAAG
A622-05R 5' CCTTCTGCCTCTATCATCCTCCTG
NBB1 프라이머:
NBB1-O1F 5'ATGTTTCCGCTC ATAATTCTG
NBB1-1365 5'TCTTCGCCCATGGCTTTTCGGTCT
AO 프라이머:
AO RT-1 5' CAAAACCAGATCGCTTGGTC
AO RT-2 5' CACAGCACTTACACCACCTT
QS 프라이머:
QS RT-1 5' CGGTGGAGCAAAAGTAAGTG
QS RT-2 5' GAAACGGAACAATCAAAGCA
QPT 프라이머:
QPT RT-1 5' TCACTGCTACAGTGCATCCT
QPT RT-2 5' TTAGAGCTTTGCCGACACCT
ODC 프라이머:
ODC RT-1 5' CGTCTCATTCCACATCGGTAGC
ODC RT-2 5' GGTGAGTAACAATGGCGGAAGT
PMT 프라이머:
PMT RT-I 5' GCCATGATAATGGCAACGAG
PMT RT-2 5' TTAGCAGCGAGATAAGGGAA
도 6에서 보여지는 바와 같이, A622는 A622-무활동 상태인 세포 주(silenced line)에서 유도되지 않는다. 알려져 있는 니코틴 생합성 경로 효소의 다른 유전자들은 유도되었다. 이러한 결과는 A622가 니코틴 알칼로이드 생합성 경로에 포함된다는 증거를 제공하고, 니코틴 알칼로이드 함량 특히 니코틴을 생성하는 능력을 가진 식물 세포의 니코틴 함량이 A622 발현을 하향-조절함으로써 감소될 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 유도성 A622 RNAi 벡터의 작제
담배 모상근에서 A622 발현의 구조적 억제(constitutive suppression)는 뿌리 생장을 상당히 억제시켜, 니코틴 알칼로이드 분석을 불가능하게 하였다. 이를 벗어나기 위하여, 에스트라디올-유도성 유전자 발현 시스템(XVE system)을 개발하였다. XVE 시스템은 RNAi 헤어핀 분자(hairpin molecule)를 만들어내고 배양 배지로 인듀서(inducer)(베타-에스트라디올)을 첨가한 후에만 표적 유전자를 억제한다.
A622 센스 및 안티센스 DNA 단편을 포함하는 RNAi 부위를 Xho I와 Xba I를 가지고 pHANNIBAL-X 플라스미드로부터 잘라내었고, Xho I와 Xba I로 침지시킨(digest) pBluescript KS로 연결시켰다. 그런 다음, RNAi 부위를 Xho I와 Spe I로 잘라내었고, XVE 벡터 pER8의 MCS에 있는 XhoI와 SpeI 부위 사이에서 서브클로닝하여(Zuo J. et al ., Plant J., 24: 265-273 (2000)), 이원 벡터 pXVE-A622RNAi를 만들었다.
pXVE-A622RNAi의 T-DNA 부위는 키메릭 전사 팩터 XVE의 에스트라디올-유도성 발현을 위한 카세트, hpt 선택가능한 마커 카세트, 및 A622 RNAi의 발현이 XVE에 의해 활성화되는 LexA-46 프로모터의 조절 하에 있는 카세트를 포함한다(도 7).
실시예 4: 담배 모상근에서 A622 의 억제
이원 벡터 pXVE-A622RNAi를 전기 침공법에 의하여 아그로박테리윰 리조겐(Agrobacterium rhizogenes) 변종 15834로 주입하였다. N. tabacum cv . Petit Havana SR1 식물을 Kanegae et al ., Plant Physiol . 105(2):483-90. (1994)에서 기술된 바와 같이, 잎-디스크 방법을 사용하여 A. rhizogenes에 의해 형질 전환시켰다. 형질 전환된 뿌리를 선택하기 위해 하이그로마이신 저항성(B5 배지에서 15 mg/L)을 사용하였다. 이식 유전자성 모상근를 27℃에서 암 조건에서 길렀다.
pXVE-A622RNAi로부터 나온 T-DNA를 전달하는 이식 유전자성 모상근를 B5 배지에서 10일 동안 길렀고, 그런 다음 4일 동안 17-베타-에스트라디올 (2 μM)의 첨가에 의해 유전자 사일런싱(gene silencing)을 유도하였다. RT-PCR 분석은 에스트라디올을 첨가한 후에, 에스트라디올-유도성 A622 억제 작제물로 형질 전환된 담배 모상근 세포 주 A8과 A1O에서 A622 발현이 효과적으로 억제되었음을 보여주었다. 도 8A를 참조한다.
RNeasy Plant 미니 키트(Qiagen)를 사용하여, 모상근로부터 전체 RNA를 추출하였다. RT-PCR(Invitrogen)을 위한 랜덤 헥사머와 Superscript First-Strand Synthesis System을 사용하여 cDNA를 합성하였다. TaKaRa ExTaq(Takara Bio)를 사용하고 주형으로서 cDNA 5 ng으로 하기의 조건 하에서 RT-PCR을 수행하였다: A622, NBB1, AO, QS, QPT, ODC의 검출을 위해, 30초 동안 94℃에서, 30초 동안 57℃에서, 및 30초 동안 72℃에서 22 사이클, PMT 검출을 위해 1분 동안 94℃에서, 30초 동안 52℃에서, 및 1분 동안 72℃에서 24 사이클.
A622 검출을 위한 프라이머;
A622-07F 5' ATGGTTGTATC AGAGAAAAG
A622-05R 5' CCTTCTGCCTCTATCATCCTCCTG
α-튜블린 검출을 위한 프라미어;
Tub RT-1 5' AGTTGGAGGAGGTGATGATG
Tub RT-2 5' TATGTGGGTCGCTCAATGTC
에스트라디올에 의한 억제 유도 없이(-) 및 억제 유도를 한(+) 후에, 유도성 A622 억제 작제물로 형질 전환된 모상근 주에서 니코틴 함량을 측정하였다. 도 8B에서 보여지는 RT-PCR 그래프는 에스트라디올 유도 전에 A622 발현이 이미 부분적으로 억제되었음을 보여준다. 이것은 특히 번호 8 주에서 사실로 나타난다. 니코틴 함량은 A622 억제된 주에서 변화하였지만, 야생형 모상근에서보다 A622 억제된 주에서 더 낮았다.
실시예 5: NIC loci 에 의해 조절되는 유전자로서 NBB1 의 확인
니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris)로부터 유래되는 cDNA 라이브러리로부터 제조된 cDNA 마이크로-어레이(Katoh et al ., Proc . Japan Acad ., Vol. 79, Ser. B5 No. 6, pp. 151-154 (2003))를 사용하여, 니코틴 생합성을 조절하는 NIC loci에 의해 조절되는 신규 유전자를 조사하였다.
N. sylvestris cDNA를 PCR에 의해 증폭하였고, Amersham Lucidea 어레이 스포터(array spotter)를 사용함으로써 거울-코팅된 슬라이드(타입 7 star, Amersham)에 스팟을 만들었다. UV 가교(120 mJ/m2)에 의해 DNA를 슬라이드 표면에 고정시켰다. Agripot 용기(Kirin)에서 수크로스 1.5％ (W/V)와 젤란검(Wako) 0.35％ (W/V)를 보충한 반쪽-강도의 B5 배지에서 N. tabacum Burley 21 묘목(WT와 nic1nic2)을 길렀다.
8주 자란 묘목의 뿌리를 수확하였고, 액체 질소로 즉시 동결시켰고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 동결시킨 뿌리로부터 Plant RNeasy Mini kit(Qiagen)를 사용하여 전체 RNA를 분리하였고, GenElute mRNA Miniprep kit (Sigma)를 사용하여 mRNA를 정제하였다. Cy3 또는 Cy5-dCTP(Amersham) 존재 하에서, LabelStar Array Kit (Qiagen)를 사용하여 정제된 mRNA 0.4 ㎍으로부터 cDNA를 합성하였다. 마이크로어레이 슬라이드로 cDNA를 혼성화 및 혼성화한 후 수세를 Lucida Pro hybrid-machine (Amersham)를 사용하여 수행하였다. FLA-8000 스캐너(Fujifilm)를 사용하여 마이크로어레이를 스캐닝하였다. 얻은 어레이 이미지를 ArrayGauge 소프트웨어(Fujifilm)를 이용하여 신호 강도로 정량하였다. 상호 쌍대 결합(pair-wise combination)에서 야생형 및 nic1nic2 담배로부터 나온 cDNA 프로브를 Cy3과 Cy5으로 표지화하였다. 혼성화 신호를 염료의 전체 신호 강도를 밝힘으로써 표준화하였다. nic1nic2에 비해 두 배 이상 강한 야생형 프로브로 혼성화한 cDNA 클론을 확인하였고, 이것은 NBB1을 포함한다.
SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech)를 사용함으로써, N. tabacum의 전체 RNA로부터 5'- 및 3'- RACE에 의해 완전한 전체 길이의 NBB1 cDNA를 얻었다.
NBB1 cDNA 삽입물(insert)의 뉴클레오티드 서열을 ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)와 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)를 사용하여 양쪽 가닥으로 결정하였다. NBB1의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3에서 규정된다. 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 4에서 규정된다. 단백질 서열은 FAD-결합 모티프를 포함한다. 추정되는 액포의 신호 펩티드는 N-말단에 위치하고 있다.
실시예 6: NBB1 의 규명
노던 블롯 분석에 의해, 담배 식물에서 NBB1 발현을 조사하였다.
Nicotiana tabacum cv . Burley 21(하기에서 WT라고 줄여 씀) 및 Burley 21 백그라운드(background)에서 도입된 돌연변이를 갖는 돌연변이 nic1, nic2 및 nic1 nic2를 사용하여, 메틸 자스모네이트 증기로 처리된 식물 몸체로부터 RNA를 추출하였다. 멸균되고 밀봉된 환경에서 경작하였고, 식물을 2달 동안 25℃에서 150 μmole 광자/m2의 빛으로(16시간 명 조건, 8시간 암 조건), B5 배지(3％ 수크로스, 0.3％ 젤란 검)에서 길렀다. 식물을 포함하고 고체형 배지 용량 80 cm3 및 기체 용량 250 cm3인 Agripot 용기(Kirin, Tokyo)에 메틸 자스모네이트 100 μM 0.5 mL를 첨가함으로써 메틸 자스모네이트 처리를 수행하였다. 처리 시간은 0시간과 24시간으로 정하였다. 뿌리 부분과 잎 부분을 식물 몸체로부터 포집하였고(전체적으로 7개 내지 10개의 잎을 갖는 식물 몸체로부터 2번째 내지 6번째의 잎), 액체형 질소를 사용하여 즉시 동결시켜 보관하였다.
제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy Midi Kit (Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 그러나, 폴리비닐 피롤리딘이 RLT에 대해 1％ 농도까지 첨가되었다. RNA의 순도를 높이기 위해 컬럼 조작을 2회 수행하였다.
Sambrook과 Russell에 의해 제공된 통상적인 방법에 따라 RNA 블롯팅(RNA blotting)을 수행하였다(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 제 7장 (2001)).
1278 bp로부터 NBB1 뉴클레오티드 서열의 말단(1759 bp)을 통한 서열 단편(서열 번호 3)을 프로브 주형으로 사용하였다. 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 사용하여 cDNA 클론의 증폭에 의해 주형을 제조하였다.
프라이머 1: GGAAAACTAACAACGGAATCTCT
프라이머 2: GATCAAGCTATTGCTTTCCCT
제조자의 지시 사항에 따라 Bcabest labeling kit (Takara)를 사용하여 프로브를 32P로 표지화하였다. 제조자의 프로콜에 따라 완충제로서 ULTRAhyb (Ambion)을 사용하여 혼성화를 수행하였다.
E. coli에서 pcDNAII 벡터로 클로닝된 PMT 서열로부터 PMT 프로브를 제조하였다(Hibi et al ., 1994). QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)을 사용하여 E. coli로부터 플라스미드를 추출하였고, 정제하였고, 통상적인 방법에 의하여 제한 효소 XbaI과 HindIII로 처리하였고, 아가로스 겔 전기영동을 시켜 약 1.5 kb DNA 단편을 포집하였다. IAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)을 포집하는데 사용하였다. 포집된 DNA 단편은 NBB1 프로브를 위해 사용된 것과 동일한 방법에 의해 32P로 표지화되었고, 혼성화하였다. 그 결과를 도 9에서 보여준다.
도 9에서 명백하게 보여주는 바와 같이, NBB1과 PMT는 담배 식물에서 동일한 발현 패턴을 갖는다. NBB1이 니코틴 생합성에 관여한다는 증거는, PMT 및 A622와 마찬가지로, NBB1이 NIC 유전자의 조절 하에 있으며, 이것은 PMT 및 A622와 유사한 발현 패턴을 나타낸다는 것이다.
실시예 7: NBB1 의 계통 발생적 분석
NBB1 폴리펩티드는 캘리포니아 황금양귀비 베르베린 브릿지 효소(berberine bridge enzyme, BBE)와 25%의 동일성 및 60%의 상동성을 갖는다(Dittrich H. et al., Proc . Natl . Acad . ScI USA, Vol. 88, 9969-9973 (1991)). NBB1 폴리펩티드와 EcBBE의 배열이 도 10에서 보여진다.
NBB1 폴리펩티드와 식물 BBE-유사 폴리펩티드의 서열을 사용하여, 계통수(phylogenetic tree)를 만들었다(Carter and Thornburg, Plant Physiol. 134, 460-469 (2004)에 기초함). CLUSTAL W 프로그램을 갖는 이웃-인접 방법(neighbor-joining method)을 사용하여 계통학적 분석을 수행하였다. 숫자는 1000 개의 복제물로부터 부트스트랩(bootstrap) 값을 나타낸다. 사용된 서열은 다음과 같다: EcBBE, 금영화 BBE (GenBank accession no. AF005655); PsBBE, 양귀비 (양귀비, Papaver somniferum) 가능한 레티큐린 옥시다아제(reticuline oxidase) (AF025430); BsBBE, 바베리(barberry) (Berberis stolonifera) BBE (AF049347); VuCPRD2, 동부(cowpea) (Vigna unguiculata) 가뭄으로 유도된 단백질 (AB056448); NspNEC5, Nicotiana sp . 넥타린(Nectarin) V (AF503441/AF503442); HaCHOX, 해바라기 (Helianthus annum) 카보히드레이트 옥시다아제 (AF472609); LsCHOX, 상추 (Lactuca sativa) 카보히드레이트 옥시다아제 (AF472608); 및 27 애기장대(Arabidopsis) 유전자 (At1g01980, At1g11770, At1g26380, At1g26390, At1g26400, At1g26410, At1g26420, At1g30700, At1g30710, At1g30720, At1g30730, At1g30740, At1g30760, At1g34575, At2g34790, At2g34810, At4g20800, At4g20820, At4g20830, At4g20840, At4g20860, At5g44360, At5g44380, At5g44390, At5g44400, At5g44410, 및 At5g44440).
그 결과를 도 11에서 보여준다. 세 개의 알려져 있는 BBE가 별개의 계통(clade)을 형성하고, 강조되어 있으며, "True BBE"로 나타내어져 있다. NBB1의 서열은 BBE 또는 BBE-유사 단백질과 매우 유사하지 않고, 계통수의 밑에서 다른 서열과 떨어져 있다. Nicotiana, 넥타린(nectarin) V 속으로부터 기술된 유일한 다른 BBE 유사 단백질, 히브리드 관상용 Nicotiana langsdorffii X N. sanderae의 넥터(nectar)에서 기술된 단백질, Carter and Thornburg (2004)은 동부 가뭄으로 유도된 단백질 및 애기장대로부터 나온 여러 개의 추정상의 BBE-유사 단백질과 군을 형성한다. 관상용 담배의 넥터는 알칼로이드가 부족하고, 넥타린 V는 글루코스 옥시다아제 활성을 갖고 있기 때문에, 넥타린 V는 꽃에서 항균제 방어에 관여하고 알칼로이드 합성에 소정의 역활을 할 것 같지 않다고 결론내릴 수 있다. Id .
실시예 8: NBB1 억제 작제물의 제조
NBB1 cDNA의 342-bp DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하였고, 하기의 프라이머를 사용하여 pGEM-T 벡터로 클로닝하였다.
안티센스 체인
NBB1-20F-EcoRI 5' CCGGAATTCGCACAGTGGAATGAAGAGGACG 3'
NBB1-18R-XhoI 5' CCGCTCGAGGCGTTGAACCAAGCATAGGAGG 3'
센스 체인
NBB1-16F-ClaI 5' CCATCGATGCACAGTGGAATGAAGAGGACG 3'
NBB1-19R-XbaI 5' GCTCTAGAGCGTTGAACCAAGCATAGGAGG 3'
결과로 나온 PCR 생성물을 안티센스 삽입을 위해 EcoRI과 XhoI으로, 센스 체인 삽입을 위해 ClaI과 XbaI으로 침지시켰다(digest). 센스 NDA 단편을 pHANNIBAL-X로 서브클로닝하였고, 다음에 안티센스 단편의 삽입을 수행하였다. 그 결과 플라스미드는 NBB1 단편의 역전된 반복 서열을 포함하였고, Pdk 인트론에 의해 분리되었다.
BamH I과 Sac I으로 pHANNIBAL-X로부터 RNAi 부위를 잘라내었고, pBI121으로 연결시켜, GUS 코딩 부위를 대체하고 이원 벡터 pRNAi-NBB1을 만들었다. pHANNIBAL-NBB1 3'의 T-DNA 부위(도 12를 참조)는 nptII 선택가능한 마커 카세트와, NBB1의 3' 단편에 상응하는 이중-가닥 부위의 헤어핀 RNAi의 발현을 위한 카세트를 포함한다.
실시예 9: 담배 BY -2 세포의 NBB1 억제
담배 BY-2 세포의 메틸 자스모네이트 처리는 니코틴 생합성 경로에서 알려져 있는 효소의 유전자 발현뿐만 아니라 NBB1 발현을 유도한다. NBB1 억제 효과를 BY-2 세포에서 테스트하였다.
벡터 pRNAi-NBB1을 A. tumefaciens 변종 EHA105으로 주입하였고, 이것을 담배 BY-2 세포를 형질 전환하는데 사용하였다. BY-2 세포를 변형된 LS 배지 100 ml에서 배양하였다. YEB 배지에 있는 아그로박테리윰 투메파시엔(Agrobacterium tumefaciens) 세포(100 ㎕)를 BY-2 세포 4 ml에 첨가하였고, 40 시간 동안 암 조건에서 27℃에서 배양하였다. 감염된 담배 세포를 변형된 LS 배지로 2회 수세한 후에, 수세된 담배 세포를 카나마이신(50 mg/l)과 카르베니실린(250 mg/l)을 포함하는 변형된 LS 아가 배지에 펼쳐 놓았다. 암 조건으로 27℃에서 2주 지난 후에, 기른 담배 캘러스를 동일한 항생제를 포함하는 신선한 LS 선택 배지로 옮겼고, 암 조건에서 27℃에서 1주 이상 동안 배양하였다. 기른 담배 세포를 항생제가 없는 액체형 변형된 LS 배지에 옮겼다. 형질 전환된 담배 세포를 7일 간격으로 서브 배양하였다(subculture).
배양시킨 담배 세포를 2,4-D가 없는 변형된 LS 배지로 27℃에서 12시간 동안 배양하였다. DMSO에 녹인 메틸 자스모네이트(MeJA) 100 ㎕를 담배 현탁 배양물 100 ml에 첨가하여 최종 농도가 50 μM이 되도록 만든 후에, 담배 세포를 추가로 48시간 동안 배양하였다. MeJA-처리된 세포를 여과하였고, 포집하였고, 동결 건조시켰다. 0.1 N의 황산 3 ml를 동결 건조된 시료 100 mg에 첨가하였다. 얻은 혼합물을 15분 동안 소니케이션시켰고, 여과하였다. 28％ 암모늄 용액을 여과액 1 ml에 첨가하였고, 10분 동안 15000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액 1 ml를 Extrelut-1 컬럼(Merck)에 첨가하였고, 5분 동안 방치하였다. 이것을 클로로포름 6 ml로 용리하였다. 그런 다음 용리액을 증발기(Taitec Concentrator TC-8)를 사용하여 감압 하에서 37℃에서 건조시켰다. 건조시킨 시료를 0.1％ 도데칸을 포함하는 에탄올 용액 50㎕에 녹였다. 모세관 컬럼과 FID 검출기가 장착된 기체 크로마토그래프(GC-14B)를 사용하여 시료를 분석하였다. RESTEC Rtx-5 아민 컬럼(Restec)을 모세관 컬럼으로 사용하였다. 컬럼 온도를 100℃에서 10분 동안 유지하였고, 25℃/분으로 150℃까지 높였고, 1분 동안 150℃에서 유지하였고, 1℃/분으로 170℃까지 높였고, 2분 동안 170℃에서 유지하였고, 30℃/분으로 300℃까지 높였고, 10분 동안 300℃에서 유지하였다. 주입과 검출기의 온도는 300℃ 이었다. 각각의 시료 1㎕를 주입하였고, 내부 표준 방법에 의하여 니코틴 알칼로이드를 정량하였다.
메틸 자스모네이트 유도에 따른 니코틴 알칼로이드의 축적이 야생형 담배 세포에 비해 NBB1-억제된 BY-2 세포 주(N37와 N40)에서 상당히 감소되었다(도 5를 참조한다).
NBB1-RNAi 세포주에서 알칼로이드 누적의 감소가 니코틴 생합성 경로에서 알려져 있는 효소의 유전자 발현 정도에 대한 간접적인 효과라기 보다는, NBB1 발현의 감소와 특히 관련되어 있는지 여부를 결정하기 위하여, NBB1과 다른 유전자의 발현 정도를 메틸 자스모네이트 처리 주 및 대조군 주에서 측정하였다.
야생형, 및 48시간 동안 50 uM MeJA로 처리된 이식 유전자성 BY-2 세포 주로부터 전체 RNA를 분리하였다. 특정 유전자의 RNA 농도를 RT-PCR에 의해 측정하였다. 그 결과는 도 6에서 보여진다.
NBB1이 활동하지 않는 세포 주(silenced line)에서, NBB1의 유도는 관찰되지 않았지만, A622의 유도뿐만 아니라, 니코틴 생합성 경로에서 알려져 있는 유전자의 유도는 여전히 나타난다. 또한, NBB1의 유도가 A622-억제된 세포 주에서 영향을 받지 않음을 주목한다.
이러한 결과는 NBB1 환원 효소가 니코틴 알칼로이드 생합성 경로에 포함되고, 니코틴 알칼로이드 함량, 특히 니코틴을 생성하는 능력을 갖는 식물 세포의 니코틴 함량이 NBB1 발현을 하향-조절함으로써 감소될 수 있음을 입증한다.
실시예 10: 담배 모상근에서 NBB1 억제
담배 SR-I 모상근는 주요 알칼로이드로서 니코틴을 축적한다. 모상근에서 알칼로이드 축적에 대한 NBB1 억제 효과를 조사하였다.
이원 벡터 pRNAi-NBB1 3'을 전기 침공법에 의해 A. rhizogenes 변종 15834로 주입하였다. 담배 모상근에서 A622의 억제를 위해 상기에서 기술된 바와 같이, 잎-디스크 방법을 사용하여 N. tabacum cv . Petit Havana SR1 식물을 A. rhizogenes에 의해 형질 전환시켰다. 모상근를 선택하였고, 배양하였고, 알칼로이드를 상기에서 기술한 바와 같이 추출하였고, 정제하였고 분석하였다.
NBB1 발현이 RNAi에 의해 억제되었을 때, 이식 유전자성 뿌리 세포 주(HN6, HN19, HN20 및 HN29)는 대조군 세포 주에 비해 상당히 감소된 니코틴 농도를 포함하고 있고, 감소된 아나타빈 농도를 포함하고 있다(도 13을 참조).
pHANNIBAL-NBB1 3'을 보유하는 이식 유전자성 모상근를 B5 배지에서 2주 동안 길렀고, RT-PCR에 의해 유전자 발현을 분석하였다. NBB1 발현은 4개의 이식 유전자성 세포 주에서 특히 억제되었다(도 14를 참조). 니코틴 생합성 경로에 있는 효소의 다른 유전자에 대한 NBB1 발현은 영향을 받지 않았다.
상기 결과는 니코틴이 감소된 축적은 니코틴 생합성 경로에서 알려져 있는 효소의 유전자의 발현의 부족에 의해서가 아니라, 감소된 NBB1 발현으로부터 기인함을 입증한다.
실시예 11: 이식 유전자성 담배 식물에서 NBB1 억제
NBB1-aatB1과 attB1 어댑터 한 쌍의 프라이머 세트와 NBB1-attB2와 attB2 어댑터 한 쌍을 사용하여, pGEM-T 벡터에서 NBB1 cDNA로부터 두 개의 attB-NBB1 단편을 증폭시켰다.
유전자 특이적 프라이머:
NBB1-attB1 5'
AAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGTTCCGCTCATAATTCTG
ATCAGCTT
NBB1-attB2 5' AGAAAGCTGGGTCTTCACTGCTATACTTGTGCTCTTGA
어댑터 프라이머:
attB1 어댑터 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
attB2 어댑터 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
사용된 PCR 조건은 제조자에 의해 추천되는 것이다. attB-NBB1 PCR 생성물과 pDONR221 간의 BP 재조합 반응에 의해 엔트리 클론(entry clone) pDONR221-NBB1-1을 생성하였다(Invitrogen).
NBB1 ORF를 pDONR221-NBB1-1 벡터로부터, LR 반응에 의해 CaMV35S 프로모터 (Dr. Ko Shimamoto, NAIST) 하에 GUS 부분 단편과 함께 dsRNA를 발현하도록 설계된 GATEWAY 이원 벡터 pANDA 35HK로 옮겼다. 그 결과물인 NBB1 RNAi 벡터를 pAND A-NBB1full로 칭한다.
pANDA-NBB1full의 T-DNA는 nptII 선택가능한 마커 카세트, NBB1의 완전한 길이의 코딩 부위는 GUS 링커에 의해 분리된 역전된 반복 서열에서 존재하는 NBB1 RNAi 카세트, 및 hpt 선택가능한 마커 카세트를 포함한다.
이원 벡터 pANDA-NBB1full를 전기 침공법에 의해 A. tumefaciens으로 주입하였다. Kanegae et al ., Plant Physiol. 105, 483-490 (1994)에 의해 기본적으로 기술된 바와 같이, N. tabacum cv . Petit Havana SR1 식물을 잎-디스크 방법을 사용하여 A. tumefaciens에 의해 형질 전환시켰다. 선택을 위해 하이그로마이신 저항성(MS 배지에서 30 mg/L)을 사용하였다. 기술한 바에 따라 이식 유전자성 식물을 잎 디스크로부터 재생하였고, 성장 챔버에서 연속적인 명 조건 하에 27℃에서 식물을 길렀다.
36일 동안 기른 TO 발생 식물로부터 잎 조직을 포집하였다. 상기 기술한 바와 같이, 알칼로이드를 추출하였고, 정제하였고, 분석하였다. NBB1 억제 벡터 pANDA-NBB1full로 형질 전환된 세포 주로부터 식물의 잎에 있는 니코틴의 농도는 야생형에 비해 감소하였다(도 16 참조). 이식 유전자성 세포 주의 잎(6번, 14번 및 22번)은 야생형 식물의 잎에 있는 농도의 약 16% 농도의 니코틴을 포함하였다.
<110> NARA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> REDUCING LEVELS OF NICOTINIC ALKALOIDS IN PLANTS <130> PM030223 <150> 60/656,636 <151> 2005-02-28 <160> 37 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 1179 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 aaaaatccga tttaattcct agtttctagc ccctccacct taacccgaag ctactttttt 60 tcttccccta ggagtaaaat ggttgtatca gagaaaagca agatcttaat aattggaggc 120 acaggctaca taggaaaata cttggtggag acaagtgcaa aatctgggca tccaactttc 180 gctcttatca gagaaagcac actcaaaaac cccgagaaat caaaactcat cgacacattc 240 aagagttatg gggttacgct actttttgga gatatatcca atcaagagag cttactcaag 300 gcaatcaagc aagttgatgt ggtgatttcc actgtcggag gacagcaatt tactgatcaa 360 gtgaacatca tcaaagcaat taaagaagct ggaaatatca agagatttct tccttcagaa 420 tttggatttg atgtggatca tgctcgtgca attgaaccag ctgcatcact cttcgctcta 480 aaggtaagaa tcaggaggat gatagaggca gaaggaattc catacacata tgtaatctgc 540 aattggtttg cagatttctt cttgcccaac ttggggcagt tagaggccaa aacccctcct 600 agagacaaag ttgtcatttt tggcgatgga aatcccaaag caatatatgt gaaggaagaa 660 gacatagcga catacactat cgaagcagta gatgatccac ggacattgaa taagactctt 720 cacatgagac cacctgccaa tattctatcc ttcaacgaga tagtgtcctt gtgggaggac 780 aaaattggga agaccctcga gaagttatat ctatcagagg aagatattct ccagattgta 840 caagagggac ctctgccatt aaggactaat ttggccatat gccattcagt ttttgttaat 900 ggagattctg caaactttga ggttcagcct cctacaggtg tcgaagccac tgagctatat 960 ccaaaagtga aatacacaac cgtcgacgag ttctacaaca aatttgtcta gtttgtcgat 1020 atcaatctgc ggtgactcta tcaaacttgt tgtttctatg aatctattga gtgtaattgc 1080 aataattttc gcttcagtgc ttttgcaact gaaatgtact agctagttga acgctagcta 1140 aattctttac tgttgttttc tatttttcgt cttattcca 1179 <210> 2 <211> 310 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 2 Met Val Val Ser Glu Lys Ser Lys Ile Leu Ile Ile Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Ile Gly Lys Tyr Leu Val Glu Thr Ser Ala Lys Ser Gly His Pro 20 25 30 Thr Phe Ala Leu Ile Arg Glu Ser Thr Leu Lys Asn Pro Glu Lys Ser 35 40 45 Lys Leu Ile Asp Thr Phe Lys Ser Tyr Gly Val Thr Leu Leu Phe Gly 50 55 60 Asp Ile Ser Asn Gln Glu Ser Leu Leu Lys Ala Ile Lys Gln Val Asp 65 70 75 80 Val Val Ile Ser Thr Val Gly Gly Gln Gln Phe Thr Asp Gln Val Asn 85 90 95 Ile Ile Lys Ala Ile Lys Glu Ala Gly Asn Ile Lys Arg Phe Leu Pro 100 105 110 Ser Glu Phe Gly Phe Asp Val Asp His Ala Arg Ala Ile Glu Pro Ala 115 120 125 Ala Ser Leu Phe Ala Leu Lys Val Arg Ile Arg Arg Met Ile Glu Ala 130 135 140 Glu Gly Ile Pro Tyr Thr Tyr Val Ile Cys Asn Trp Phe Ala Asp Phe 145 150 155 160 Phe Leu Pro Asn Leu Gly Gln Leu Glu Ala Lys Thr Pro Pro Arg Asp 165 170 175 Lys Val Val Ile Phe Gly Asp Gly Asn Pro Lys Ala Ile Tyr Val Lys 180 185 190 Glu Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Thr Ile Glu Ala Val Asp Asp Pro Arg 195 200 205 Thr Leu Asn Lys Thr Leu His Met Arg Pro Pro Ala Asn Ile Leu Ser 210 215 220 Phe Asn Glu Ile Val Ser Leu Trp Glu Asp Lys Ile Gly Lys Thr Leu 225 230 235 240 Glu Lys Leu Tyr Leu Ser Glu Glu Asp Ile Leu Gln Ile Val Gln Glu 245 250 255 Gly Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asn Leu Ala Ile Cys His Ser Val Phe 260 265 270 Val Asn Gly Asp Ser Ala Asn Phe Glu Val Gln Pro Pro Thr Gly Val 275 280 285 Glu Ala Thr Glu Leu Tyr Pro Lys Val Lys Tyr Thr Thr Val Asp Glu 290 295 300 Phe Tyr Asn Lys Phe Val 305 310 <210> 3 <211> 1749 <212> DNA <213> Nicotiana sylvestris <400> 3 acgcggggag aaatacatac aacatgtttc cgctcataat tctgatcagc ttttcacttg 60 cttccttgtc tgaaactgct actggagctg ttacaaatct ttcagcctgc ttaatcaacc 120 acaatgtcca taacttctct atttacccca caagtagaaa ttactttaac ttgctccact 180 tctcccttca aaatcttcgc tttgctgcac ctttcatgcc gaaaccaacc ttcattatcc 240 taccaagcag taaggaggag ctcgtgagca ccattttttg ttgcagaaaa gcatcttatg 300 aaatcagagt aaggtgcggc ggacacagtt acgaaggaac ttcttacgtt tcctttgacg 360 cttctccatt cgtgatcgtt gacttgatga aattagacga cgtttcagta gatttggatt 420 ctgaaacagc ttgggctcag ggcggcgcaa caattggcca aatttattat gccattgcca 480 aggtaagtga cgttcatgca ttttcagcag gttcgggacc aacagtagga tctggaggtc 540 atatttcagg tggtggattt ggacttttat ctagaaaatt cggacttgct gctgataatg 600 tcgttgatgc tcttcttatt gatgctgatg gacggttatt agaccgaaaa gccatgggcg 660 aagacgtgtt ttgggcaatc agaggtggcg gcggtggaaa ttggggcatt gtttatgcct 720 ggaaaattcg attactcaaa gtgcctaaaa tcgtaacaac ttgtatgatc tataggcctg 780 gatccaaaca atacgtggct caaatacttg agaaatggca aatagttact ccaaatttgg 840 tcgatgattt tactctagga gtactgctga gacctgcaga tctacccgcg gatatgaaat 900 atggtaatac tactcctatt gaaatatttc cccaattcaa tgcactttat ttgggtccaa 960 aaactgaagt tctttccata tcgaatgaga catttccgga gctaggcgtt aagaatgatg 1020 agtgcaagga aatgacttgg gtagagtcag cacttttctt ctccgaatta gctgacgtta 1080 acgggaactc gactggtgat atctcccgtc tgaaagaacg ttacatggac ggaaaaggtt 1140 ttttcaaagg caaaacggac tacgtgaaga agccagtttc aatggatggg atgctaacat 1200 ttcttgtgga actcgagaaa aacccgaagg gatatcttgt ctttgatcct tatggcggag 1260 ccatggacaa gattagtgat caagctattg ctttccctca tagaaaaggt aaccttttcg 1320 cgattcagta tctagcacag tggaatgaag aggacgatta catgagcgac gtttacatgg 1380 agtggataag aggattttac aatacaatga cgccctttgt ttcaagctcg ccaaggggag 1440 cttatatcaa ctacttggat atggatcttg gagtgaatat ggtcgacgac tacttattgc 1500 gaaatgctag tagcagtagt ccttcttcct ctgttgatgc tgtggagaga gctagagcgt 1560 ggggtgagat gtatttcttg cataactatg ataggttggt taaagctaag acacaaattg 1620 atccactaaa tgtttttcga catgaacaga gtattcctcc tatgcttggt tcaacgcaag 1680 agcacaagta tagcagtgaa tgagatttaa aatgtactac cttgagagag attccgttgt 1740 tagttttcc 1749 <210> 4 <211> 559 <212> PRT <213> Nicotiana sylvestris <400> 4 Met Phe Pro Leu Ile Ile Leu Ile Ser Phe Ser Leu Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Gly Ala Val Thr Asn Leu Ser Ala Cys Leu Ile Asn 20 25 30 His Asn Val His Asn Phe Ser Ile Tyr Pro Thr Ser Arg Asn Tyr Phe 35 40 45 Asn Leu Leu His Phe Ser Leu Gln Asn Leu Arg Phe Ala Ala Pro Phe 50 55 60 Met Pro Lys Pro Thr Phe Ile Ile Leu Pro Ser Ser Lys Glu Glu Leu 65 70 75 80 Val Ser Thr Ile Phe Cys Cys Arg Lys Ala Ser Tyr Glu Ile Arg Val 85 90 95 Arg Cys Gly Gly His Ser Tyr Glu Gly Thr Ser Tyr Val Ser Phe Asp 100 105 110 Ala Ser Pro Phe Val Ile Val Asp Leu Met Lys Leu Asp Asp Val Ser 115 120 125 Val Asp Leu Asp Ser Glu Thr Ala Trp Ala Gln Gly Gly Ala Thr Ile 130 135 140 Gly Gln Ile Tyr Tyr Ala Ile Ala Lys Val Ser Asp Val His Ala Phe 145 150 155 160 Ser Ala Gly Ser Gly Pro Thr Val Gly Ser Gly Gly His Ile Ser Gly 165 170 175 Gly Gly Phe Gly Leu Leu Ser Arg Lys Phe Gly Leu Ala Ala Asp Asn 180 185 190 Val Val Asp Ala Leu Leu Ile Asp Ala Asp Gly Arg Leu Leu Asp Arg 195 200 205 Lys Ala Met Gly Glu Asp Val Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Asn Trp Gly Ile Val Tyr Ala Trp Lys Ile Arg Leu Leu Lys Val 225 230 235 240 Pro Lys Ile Val Thr Thr Cys Met Ile Tyr Arg Pro Gly Ser Lys Gln 245 250 255 Tyr Val Ala Gln Ile Leu Glu Lys Trp Gln Ile Val Thr Pro Asn Leu 260 265 270 Val Asp Asp Phe Thr Leu Gly Val Leu Leu Arg Pro Ala Asp Leu Pro 275 280 285 Ala Asp Met Lys Tyr Gly Asn Thr Thr Pro Ile Glu Ile Phe Pro Gln 290 295 300 Phe Asn Ala Leu Tyr Leu Gly Pro Lys Thr Glu Val Leu Ser Ile Ser 305 310 315 320 Asn Glu Thr Phe Pro Glu Leu Gly Val Lys Asn Asp Glu Cys Lys Glu 325 330 335 Met Thr Trp Val Glu Ser Ala Leu Phe Phe Ser Glu Leu Ala Asp Val 340 345 350 Asn Gly Asn Ser Thr Gly Asp Ile Ser Arg Leu Lys Glu Arg Tyr Met 355 360 365 Asp Gly Lys Gly Phe Phe Lys Gly Lys Thr Asp Tyr Val Lys Lys Pro 370 375 380 Val Ser Met Asp Gly Met Leu Thr Phe Leu Val Glu Leu Glu Lys Asn 385 390 395 400 Pro Lys Gly Tyr Leu Val Phe Asp Pro Tyr Gly Gly Ala Met Asp Lys 405 410 415 Ile Ser Asp Gln Ala Ile Ala Phe Pro His Arg Lys Gly Asn Leu Phe 420 425 430 Ala Ile Gln Tyr Leu Ala Gln Trp Asn Glu Glu Asp Asp Tyr Met Ser 435 440 445 Asp Val Tyr Met Glu Trp Ile Arg Gly Phe Tyr Asn Thr Met Thr Pro 450 455 460 Phe Val Ser Ser Ser Pro Arg Gly Ala Tyr Ile Asn Tyr Leu Asp Met 465 470 475 480 Asp Leu Gly Val Asn Met Val Asp Asp Tyr Leu Leu Arg Asn Ala Ser 485 490 495 Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Val Asp Ala Val Glu Arg Ala Arg Ala 500 505 510 Trp Gly Glu Met Tyr Phe Leu His Asn Tyr Asp Arg Leu Val Lys Ala 515 520 525 Lys Thr Gln Ile Asp Pro Leu Asn Val Phe Arg His Glu Gln Ser Ile 530 535 540 Pro Pro Met Leu Gly Ser Thr Gln Glu His Lys Tyr Ser Ser Glu 545 550 555 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 5 tcgaacggga tcccgccgct cgagcgg 27 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 6 gatcagctct agagccgagc tcgc 24 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 7 ccgctcgagc ggtcagagga agatattctc ca 32 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 8 ggggtacccc tggaataaga cgaaaaatag 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 9 gctctagagc tcagaggaag atattctcca 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 10 ccatcgatgg 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acaccacctt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 17 cggtggagca aaagtaagtg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 18 gaaacggaac aatcaaagca 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 19 tcactgctac agtgcatcct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 20 ttagagcttt gccgacacct 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 21 cgtctcattc cacatcggta gc 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 22 ggtgagtaac aatggcggaa gt 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 23 gccatgataa tggcaacgag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 24 ttagcagcga gataagggaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 25 agttggagga ggtgatgatg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 26 tatgtgggtc gctcaatgtc 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 27 ggaaaactaa caacggaatc tct 23 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 28 gatcaagcta ttgctttccc t 21 <210> 29 <211> 31 <212> DNA 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<400> 34 agaaagctgg gtcttcactg ctatacttgt gctcttga 38 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 35 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 36 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 37 <211> 538 <212> PRT <213> Eschscholzia californica <400> 37 Met Glu Asn Lys Thr Pro Ile Phe Phe Ser Leu Ser Ile Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Leu Asn Cys Ala Leu Gly Gly Asn Asp Leu Leu Ser Cys Leu Thr 20 25 30 Phe Asn Gly Val Arg Asn His Thr Val Phe Ser Ala Asp Ser Asp Ser 35 40 45 Asp Phe Asn Arg Phe Leu His Leu Ser Ile Gln Asn Pro Leu Phe Gln 50 55 60 Asn Ser Leu Ile Ser Lys Pro Ser Ala Ile Ile Leu Pro Gly Ser Lys 65 70 75 80 Glu Glu Leu Ser Asn Thr Ile Arg Cys Ile Arg Lys Gly Ser Trp Thr 85 90 95 Ile Arg Leu Arg Ser Gly Gly His Ser Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Thr 100 105 110 Ser Asp Thr Pro Phe Ile Leu Ile Asp Leu Met Asn Leu Asn Arg Val 115 120 125 Ser Ile Asp Leu Glu Ser Glu Thr Ala Trp Val Glu Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Thr Glu Ser Ser Ser Lys Leu Gly 145 150 155 160 Phe Thr Ala Gly Trp Cys Pro Thr Val Gly Thr Gly Gly His Ile Ser 165 170 175 Gly Gly Gly Phe Gly Met Met Ser Arg Lys Tyr Gly Leu Ala Ala Asp 180 185 190 Asn Val Val Asp Ala Ile Leu Ile Asp Ala Asn Gly Ala Ile Leu Asp 195 200 205 Arg Gln Ala Met Gly Glu Asp Val Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Val Trp Gly Ala Ile Tyr Ala Trp Lys Ile Lys Leu Leu Pro 225 230 235 240 Val Pro Glu Lys Val Thr Val Phe Arg Val Thr Lys Asn Val Ala Ile 245 250 255 Asp Glu Ala Thr Ser Leu Leu His Lys Trp Gln Phe Val Ala Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Glu Asp Phe Thr Leu Ser Val Leu Gly Gly Ala Asp Glu Lys 275 280 285 Gln Val Trp Leu Thr Met Leu Gly Pro His Phe Gly Leu Lys Thr Val 290 295 300 Ala Lys Ser Thr Phe Asp Leu Leu Phe Pro Glu Leu Gly Leu Val Glu 305 310 315 320 Glu Asp Tyr Leu Glu Met Ser Trp Gly Glu Ser Phe Ala Tyr Leu Ala 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Val Ser Gln Leu Asn Asn Arg Phe Leu Lys Phe Asp 340 345 350 Glu Arg Ala Phe Lys Thr Lys Val Asp Leu Thr Lys Glu Pro Leu Pro 355 360 365 Ser Lys Ala Phe Tyr Gly Leu Leu Glu Arg Leu Ser Lys Glu Pro Asn 370 375 380 Gly Phe Ile Ala Leu Asn Gly Phe Gly Gly Gln Met Ser Lys Ile Ser 385 390 395 400 Ser Asp Phe Thr Pro Phe Pro His Arg Ser Gly Thr Arg Leu Met Val 405 410 415 Glu Tyr Ile Val Ala Trp Asn Gln Ser Glu Gln Lys Lys Lys Thr Glu 420 425 430 Phe Leu Asp Trp Leu Glu Lys Val Tyr Glu Phe Met Lys Pro Phe Val 435 440 445 Ser Lys Asn Pro Arg Leu Gly Tyr Val Asn His Ile Asp Leu Asp Leu 450 455 460 Gly Gly Ile Asp Trp Gly Asn Lys Thr Val Val Asn Asn Ala Ile Glu 465 470 475 480 Ile Ser Arg Ser Trp Gly Glu Ser Tyr Phe Leu Ser Asn Tyr Glu Arg 485 490 495 Leu Ile Arg Ala Lys Thr Leu Ile Asp Pro Asn Asn Val Phe Asn His 500 505 510 Pro Gln Ser Ile Pro Pro Met Ala Asn Phe Asp Tyr Leu Glu Lys Thr 515 520 525 Leu Gly Ser Asp Gly Gly Glu Val Val Ile 530 535

Claims (17)

  1. (a) 하나 이상의 식물로부터 핵산 시료를 수득하는 단계;
    (b) 상기 시료와 A622의 15개 이상의 연속된(contiguous) 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 프로브를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 서열번호 1과 80% 이상 동일한 핵산 서열을 갖는 시료를 확인하는 단계를 포함하는, 표적화된 돌연변이 생성에 의해 대조군 식물에 비해 A622 발현이 감소된 식물을 확인하는 것을 포함하는, 식물에서 아나타빈을 감소시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 확인하는 단계는 서열번호 1과 80% 이상 동일한 돌연변이 핵산 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 확인하는 단계는 서열번호 1과 80% 이상 동일한 돌연변이 핵산 서열을 포함하는 이형 2중가닥(heteroduplex)의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 서열번호 1과 80% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는 A622의 돌연변이 대립유전자를 포함하는, 청구항 1의 방법에 의해 확인된 식물.
  9. A622의 돌연변이 대립유전자를 포함하는, 청구항 8의 식물로부터 단리된 식물 세포.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 서열번호 1 또는 그의 상보체(complement)에 대하여 90% 이상 동일성을 갖는 표적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 위치-지정 돌연변이를 위한 시약을 식물 세포 집단으로 도입하는 단계를 포함하는, A622 유전자의 표적화된 돌연변이 생성에 의해 아나타빈 수준이 감소된 식물 세포를 생산하는 방법.
  13. 청구항 12의 방법에 의해 생산되는, 유전적으로 조작된 식물 세포.
  14. 청구항 13의 식물 세포로부터 생산되는, 감소된 아나타빈 수준을 갖는 식물.
  15. 삭제
  16. 담배 제품, 식품, 식품 성분, 사료 제품, 사료 성분, 영양 보충물, 및 생물연료(biofuel)로 구성된 군으로부터 선택되는, 청구항 8의 식물로부터 생산되는 감소된 아나타빈 산물.
  17. 담배 제품, 식품, 식품 성분, 사료 제품, 사료 성분, 영양 보충물, 및 생물연료로 구성된 군으로부터 선택되는, 청구항 14의 식물로부터 생산되는 감소된 아나타빈 산물.
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