CN103757020B - 用于调控烟草尼古丁合成和转运的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因技术和植物学领域，旨在提供调控烟草尼古丁合成和转运相关的非编码microRNA（miRNA）基因。该用于调控烟草尼古丁合成和转运的基因，该基因的序列是SEQ？ID？NO:1－6中的任意一种。本发明取得的6个基因可以形成稳定的发夹结构，获得的烟草非编码小RNA序列分析表明部分小RNA来自其茎部序列。这些小RNA预测其靶基因分别靶向烟草尼古丁合成和转运关键蛋白质编码基因。本发明取得的miRNA调控机制，将为烟草尼古丁合成和转运途径关键基因所扮演的角色提供一个更加深入的理解，以便可以更好的改良烟草尼古丁含量性状。

Description

用于调控烟草尼古丁合成和转运的基因及其应用
技术领域
本发明属于基因技术和植物学领域；本发明涉及到调控烟草尼古丁合成和转运相关的非编码microRNA（miRNA）基因。
背景技术
烟草尼古丁的合成和转运受到多个因素的调控，目前从分子角度对尼古丁的合成代谢途径和转运的研究还未完全透彻，虽然已经鉴别和克隆出来了一些尼古丁合成途径中的关键基因，如QPT、PMT、MPO等（Dwey和Xie,2013,Phytochemistry），但是通过miRNA调控尼古丁合成及其转运关键基因，从而影响尼古丁含量的研究未见报道。因此，本专利作为尼古丁合成和转运途径中的重要一环，对于改良烟草尼古丁含量等具有重要作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于调控烟草尼古丁含量的非编码microRNA基因及其应用。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供用于调控烟草尼古丁合成和转运的基因，该基因的序列是SEQIDNO:1－6中的任意一种。
进一步地，本发明所述的基因是将SEQIDNO:1－6中的任意一种经过1－2个碱基的取代、缺失或添加而形成；
所述碱基是指：A，T，C或G中任意至少一种；
所述取代、缺失或添加是指：A，T，C或G中任意至少一种，发生取代、缺失或添加。
本发明还提供了前述基因的用途，是将其用于调节烟草尼古丁合成和转运量，以实现对烟草中烟碱含量的调控。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明取得的6个基因可以形成稳定的发夹结构，获得的烟草非编码小RNA序列分析表明部分小RNA来自其茎部序列。这些小RNA预测其靶基因分别靶向烟草尼古丁合成和转运关键蛋白质编码基因。本发明取得的miRNA调控机制，将为烟草尼古丁合成和转运途径关键基因所扮演的角色提供一个更加深入的理解，以便可以更好的改良烟草尼古丁含量性状。
附图说明
图1为SEQIDNO：1形成的发夹结构图（MFE=-34.40）；
图2为SEQIDNO：2形成的发夹结构图（MFE=-75.81）；
图3为SEQIDNO：3形成的发夹结构图（MFE=-52.20）；
图4为SEQIDNO：4形成的发夹结构图（MFE=-97.80）；
图5为SEQIDNO：5形成的发夹结构图（MFE=-52.40）；
图6为SEQIDNO：6形成的发夹结构图（MFE=-24.82）。
图中，发夹结构茎部用线框标出的碱基部分为其成熟序列。
具体实施方式
本发明包含了从烟草中发现调控尼古丁合成途径关键基因的miRNA，为进一步的研究该基因在烟草生长发育过程中所扮演的角色提供了一个很好的基础。本发明所进行的研究能够帮助我们更好的理解该基因，并进一步应用于控制烟草合成尼古丁含量等。
材料和方法
1.植物材料和样品准备
本发明中所有的植物组织材料取自烤烟（Nicotianiatabacum）品种“红花大金元”（“HonghuaDajinyuan”）。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25℃之间，以尽量减少外界环境因素对烟草尼古丁合成过程中的影响。实验选取的烟草材料为三株生长期在40天左右，生长高度和体型相近的植株。选取其中的一株，在其生长完整和充分展开的叶片上通过打孔方式进行机械性的叶片损伤手段；对于另一株对其实行顶部摘除处理；最后一株烟草植株则作为该实验的空白对照。在对烟草植株进行了伤害处理后，所有的植株都被放回其原来的生长环境中，并培育48小时以便充分诱导其对于外界损伤机制所产生的防御性的生理反应和尼古丁的诱导合成。之后，分别从打顶伤害、叶片损伤和对照中提取了这三组处理中的烟草植株根部组织，以及从叶片损伤和空白对照中分别提取了植株叶片组织，为进行下一步的实验做好了准备。
2.烟草RNA的提取和降解组测序
提取的植株组织鲜样被保存在液氮中并经研磨成细粉，通过RNA提取试剂盒（Invitrogen公司）分别提取并得到烟草植株的总RNA。经过小RNA样品制备试剂盒（Illumina公司）的进一步纯化和加工，得到四组烟草小RNA的文库，分别是叶片损伤处理的根组织和叶片组织的2个小RNA文库和打顶伤害处理和空白对照的根组织的2个文库。总RNA在15％的聚丙烯酰胺，8M尿素凝胶上进行分离，在18-25nt凝胶部分通过切除并通过核酸纯化试剂盒（Axygen公司）对小RNA进行了洗脱和纯化。得到的纯化后的小RNA样品被连接到RNA适配器：5'RNAadapter(5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’)和3'RNAadapter(5’-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGUidT-3’)。通过反转录试剂盒SuperScriptTMIII(Invitrogen公司)及15个循环的PCR反应，分别构建这四组小RNA的cDNA文库。通过对最终PCR产物进行纯化（PureLinkTMPCR纯化试剂盒，Invitrogen公司）所得到的样品将经过SOLEXA基因组分析系统进行高通量测序。其中涉及到的引物序列包括：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(RTprimer),5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(smallRNAPCRprimer1),5'-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’(smallRNAPCRprimer2)以及5'-CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3’(smallRNAsequencingprimer)。
降解组文库构建的方法主要参考German等人（2009）使用的RNA靶基因和降解组研究。通过OligotexmRNAminikit(Qiagen公司)的RNA提取试剂盒，将含有poly(A)尾巴的总RNA样品从叶片损伤处理的烟草叶片组织中分离。含poly(A)尾巴的总RNA通过连接酶连接到3’端含有MmeI限制性酶切位点的5'RNAadapter，后经oligod(T)和PCR的反转录反应，产物通过纯化和MmeI酶切后被连接到一个双链DNA适配器。经过进一步的纯化和扩增反应，产物在IlluminaGAIIplatform平台上进行降解组测序(Invitrogen公司)。
3.烟草序列分析的数据库信息概要
本发明所涉及到的参考基因组信息主要来源于目前GenBank中已知的烟草序列信息，其中包含了烟草祖先种N.sylvestris和N.tomentosiformis基因组参考序列（GenBank）。Rfam9.1（http://rfam.janelia.org/）和RepBase14.03（http://www.girinst.org）数据库用于过滤已知的RNA和重复序列。参与到烟草尼古丁合成代谢途径中的关键基因主要参考以往尼古丁合成的研究。miRBase20.0(http://www.mirbase.org/)被用来识别和检测烟草中保守miRNA。
4.miRNA的鉴别
本发明使用Perl语言脚本对高通量测序获得的小RNA序列信息进行分析。为了识别候选的miRNA，对获得的小RNA序列信息进行筛选，选取位于烟草祖先种N.sylvestris和N.tomentosiformis基因组序列中长度不超过400-nt的一组互补的小RNA序列，通过ViennaRNApackage软件的分析并预测其茎环结构(Hofackeretal.,1994)。利用该片段及其相连序列设计引物从红花大金元烟草中扩增获得普通烟草的同源序列片段。该片段通常具有一个理想的发夹结构，在该结构中包含有一对互补的小RNA序列，并且该组序列可以形成一种miRNA::miRNA*的复合体（可以包含少于4个碱基的错配）。对于一个特定的miRNA家族，在候选的miRNA间如果含有任何1个碱基错配或是在pre-miRNA序列含有超过3个碱基错配，该miRNA则被认为是属于同一家族的不同成员，而冗余的pre-miRNA序列则被淘汰。
5.基于降解组测序的小RNA靶位点识别
降解组测序获得的数据经过加工和过滤，序列信息读数被映射和匹配一些非编码的看家基因，如tRNAs,rRNAs,snRNAs和snoRNAs，其中长度在20-21个核苷酸的高质量序列读数被保留并作进一步分析。miRNA的靶基因预测通过psRNATarget的方法，将我们筛选到的20-24个核苷酸长度的小RNA通过psRNATarget程序映射到烟草尼古丁调控相关基因中去。进一步分析该序列片段是否被小RNA所绑定，其中对于联配结果临界值小于7的基因片段将视为小RNA靶基因候选目标，依据降解的转录组映射到预测切割位点的相对丰度，将鉴定到的靶基因归为五个大类。
6.序列信息
通过对高通量测序获得的烟草小RNA序列数据分析结果和PCR扩增测序，获得6个基因序列，该序列可以形成稳定的发夹结构，其茎部可以产生小RNA序列（成熟序列），且经靶基因预测，其小RNA靶向烟草尼古丁合成和转运途径关键蛋白质编码基因。上述成熟序列信息见SEQIDNO:1－6。
实施实例1
基于高通量测序获得经打顶和叶片损伤的烟草根部和叶片小RNA序列以及烟草两个祖先种基因组序列，可以发现大量烟草基因序列，该序列可以形成稳定的发夹结构，其茎部可以产生或表达小RNA序列（成熟序列）。其中6个基因序列形成的发夹结构见图1-6。这些预测的发夹结构稳定（MEF值均小于-24.82）。这些基因均检测到其表达序列，特别是在打顶和叶片损伤的烟草根部和叶片中表达明显增加变化，表明这些基因很可能是受这些处理诱导表达的。
实施实例2
上述6个基因表达产生的小RNA序列经靶基因预测，均靶向烟草尼古丁合成和转运途径关键蛋白质编码基因，其中包括QPT（quinolinatephosphirobosyltransferase）、PMT（putrescineN-methyltransferase)和MATE（multiantimicrobialextrusionfamilyprotein）基因（表1）。已有大量研究表明，这些基因分别为尼古丁合成（QPT和PMT）和转运（MATE）关键功能基因（Dwey和Xie,2013,Phytochemistry）。本发明发现的6个基因与其靶基因预测值均在0－2.0之间（一般临近值为3.0，超过该值表明绑定结果不可靠），且均为剪切（cleavage）方式调控靶基因。同时，实验获得的降解组数据分析结果表明，分别检测到6-105条剪切片段（剪切位点位于miRNA10-11th之间），证实了上述调控方式（表2）。
表1.本发明发现的6个基因成熟序列与其靶基因（烟草尼古丁合成和转运途径关键蛋白质编码基因）绑定位点匹配结果。
表2.本发明中6个基因成熟序列与靶基因降解组序列数据在绑定点匹配结果。该数据提供了SEQIDNO：1-6在靶基因绑定位点剪切的降解组证据。降解组数据中检测到的靶基因剪切片段序列条数列在其序列后面括号内；SEQIDNO：1-6（miRNA）第10-11位点（剪切位点）碱基字母加粗。
SEQ_ID_NO-1 AGAAAAAAGTAGCTTCTCTCCAAA
::::::::::
t0256874 TGTGAATAGTTCTTTTTTCA（13）
SEQ_ID_NO-2 CCCCACTTGTGGGATTATACTGGG
::::::::::
t0485516 AGAAGTCTGGGGTGAACA（7）
SEQ_ID_NO-3 ATTTTTGAAGAGTTCGAGCAATAT
::::::::::
t0172286 CTGTCTCTACTAAAAACTTC（16）
SEQ_ID_NO-4 AGTGTATAGCTATAAATAGGGACC
:::::::::
t0052519 TTGTCCCTGGTAACTCTGC（33）
SEQ_ID_NO-5 AGAACTCGGGTTACTGATAATCAA
::::::::::
t0010096 GTCTTTGTAGATCTTGAGCCC（105）
SEQ_ID_NO-6 AGAAGAACTCGGGTTACTGATAAT
::::::::::
t0113943 ATGACTATTAGATATCAGAC（20）

Claims (2)

1.用于调控烟草尼古丁合成和转运的基因，其特征在于，该基因的序列是SEQIDNO:1－6中的任意一种。
2.权利要求1所述基因的用途，其特征在于，是用于调节烟草尼古丁合成和转运量，以实现对烟草中烟碱含量的调控。
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