CN114774431A

CN114774431A - 一种水稻基因OsAL7.1应用及其方法

Info

Publication number: CN114774431A
Application number: CN202210485908.0A
Authority: CN
Inventors: 余舜武; 杨访问; 杨堉楠; 李天菲; 吴金红; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2022-05-06
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2022-07-22

Abstract

本发明公开了一种水稻OsAL7.1基因的应用，水稻OsAL7.1基因用于调节水稻种子的大小与水稻的抗旱性；本发明OsAL7.1基因突变体具有增加水稻种子大小,从而改变水稻粒型和产量；本发明OsAL7.1基因突变体具有增加水稻种子大小,同时提高水稻抗旱性。

Description

一种水稻基因OsAL7.1应用及其方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻基因OsAL7.1应用及其方法。

背景技术

水稻是我国的主粮，保证我国粮食安全作物中扮演着最重要的角色。稻谷的生产需要高产抗逆水稻新品种，是我国水稻育种者长期以来所追求的育种目标。产量构成三要素粒重、穗粒数和有效穗数。其中谷粒重量主要由谷粒大小来决定，人们在水稻的驯化过程中趋向于选择大粒长粒的品种进行栽培，逐步形成了栽培种比它们的野生亲缘种籽粒偏大的状况。人们研究也发现提高粒重可以增产30％以上(马丽莲等，水稻大粒种质资源和遗传分析，植物学通报，2006,23(4):395-401)，培育大粒水稻品种也是当前水稻育种的一个重要方向。

稻谷的生产过程中极易受到自然灾害的影响。近代工业的发展和全球气温的逐步上升提高了极端气候条件频发的概率，增强植物抗逆尤其是抗旱、抗高低温的能力是当前的迫切需要。其中植物转录因子在调控植物抗逆性中发挥重要作用。2004年人们从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)盐敏感细胞培养物中发现了有助于增加苜蓿耐盐性的基因Alfin1(Winicov I,Valliyodan B,Xue L,et al.The MsPRP2 promoter enables strongheterologous gene expression in a root-specific manner and is enhanced byoverexpression of Alfin1[J].Planta.2004,219(6):925-935)。随后在其它植物中也发现了Alfin1类似蛋白，这种Alfin-like蛋白是植物特有的一种蛋白，C端包含约50个氨基酸植物同源结构域(plant homeodomain，PHD)，N端包含约150aa的未知功能的DUF3594结构域。PHD是一种高度保守的Cys4-His-Cys3(C4HC3)锌指结构域，可以识别赖氨酸甲基化的H3组蛋白(tri-and dimethylation of histone H3 at lysine 4，H3K4me2/3)并与之结合，故认为可能参与了植物的表观遗传调控。AL蛋白的N端保守的DUF3594结构域的功能虽不清楚，但其在植物种高度保守(Lee W Y,Lee D,Chung W,et al.Arabidopsis ING andAlfin1-like protein families localize to the nucleus and bind to H3K4me3/2viaplant homeodomain fingers[J].The Plant Journal.2009,58(3):511-524)。

已有的研究显示Alfin-like(AL)蛋白与非生物胁迫是紧密相关的。拟南芥中有7个AL基因，PEG和高盐能够诱导AL基因表达。其中发现过表达AL5基因能够明显在干旱和盐胁迫下增加植物的抗逆性(Wei W,Zhang Y,Tao J,et al.The Alfin-like homeodomainfinger protein AL5 suppresses multiple negative factors to confer abioticstress tolerance in Arabidopsis[J].The Plant Journal.2015,81(6):871-883)。在拟南芥中过表达大豆的GmPHD2基因，能提高拟南芥的耐盐性(Wei W,Huang J,Hao Y J,etal.Soybean GmPHD-type transcription regulators improve stress tolerance intransgenic Arabidopsis plants[J].PLoS One.2009,4(9):e7209)。此外菠菜中也存在AL基因，这些基因的表达也能响应高盐、干旱、寒冷和ABA处理。其中在拟南芥中过表达AhAL1基因增强了盐和干旱的耐受性(Tao J,Wei W,Pan W,et al.An Alfin-like gene fromAtriplex hortensis enhances salt and drought tolerance and abscisic acidresponse in transgenic Arabidopsis[J].Scientific Reports.2018,8(1),2707.)。

目前主要在双子叶植物中报道过相关Alfin-like基因的功能，但在单子叶植物中相关研究极少,是否单子叶植物中也具有相似功能？我们通过水稻在不同处理下的表达研究发现，OsAL7.1基因与水稻的抗逆紧密相关，同时基因的敲除可影响水稻种子大小，本发明通过基因编辑和改造，可用于水稻籽粒精准育种，提高水稻在干旱胁迫下的稳产高产打下基础。

发明内容

本发明的提供一种水稻基因OsAL7.1及其应用和方法。

本发明是基于一部分来源于水稻的OsAL7.1基因调控水稻抗旱性和籽粒发育的发现。本发明的目的在于提供一种OsAL7.1基因改变水稻抗旱性和种子大小的应用。

为此，本发明提供了一种通过基因编辑OsAL7.1基因来改变水稻种子大小和水稻抗旱性的方法。

一种水稻OsAL7.1基因的应用，水稻OsAL7.1基因用于调节水稻种子的大小和水稻的抗旱性。

作为优选的技术方案，所述水稻OsAL7.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选的技术方案，所述OsAL7.1基因第一外显子区域插入或缺失，该突变使基因翻译提前终止，形成OsAL7.1基因的突变体knAL7.1基因，所述的knAL7.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选的技术方案，所述水稻OsAL7.1基因引导RNA靶点序列引物在编辑水稻基因组中的应用是以OsAL7.1基因诱导RNA的核苷酸序列为OsAL7.1-sgRNA:GACTTCTCCGGCCGCCGCGC。

作为优选的技术方案，还包括添加接头利用PCR扩增的方法构建所述的OsAL7.1基因应用于生产具有抗旱性转基因植物的引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；

将sgRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到含靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体；

将靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，得到水稻OsAL7.1基因突变体knAL7.1植株。

作为优选的技术方案，所述OsAL7.1基因功能缺失可调控水稻种子的大小；所述OsAL7.1基因功能削弱可调控水稻种子的大小。

作为优选的技术方案，所述OsAL7.1基因功能缺失可改善在干旱条件下水稻抗旱性；所述OsAL7.1基因功能削弱可改善在干旱条件下水稻抗旱性。

本发明还公开了一种OsAL7.1基因突变体的应用，所述OsAL7.1基因的突变体中OsAL7.1基因突变体编码的蛋白质可调控水稻种子的大小。

本发明还公开了一种水稻OsAL7.1基因突变体在干旱条件下改善水稻抗旱性的转基因植物的方法。

同时本发明提供了一种通过人工编辑水稻基因组使产生提前终止密码来增加水稻种子大小的方法。本发明还包括采用其它的方法改造编码区5’端序列而得到的OsAL7.1基因的等位基因或衍生物。本发明通过改造OsAL7.1基因形成突变等位基因，显著改变水稻抗旱性，这些结果表明OsAL7.1基因在水稻产量育种中和抗逆性稳产育种中具有重要的应用价值。通过精确改良OsAL7.1基因，构建适当的植物表达载体，可以拓展当前植物生物技术中可应用于水稻稳产高产的基因，为改良水稻的精准育种提供精准育种手段。

本发明提供的OsAL7.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的OsAL7.1基因位点进行人工编辑形成knAL7.1基因，所述knAL7.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述水稻OsAL7.1基因引导RNA靶点序列引物在编辑水稻基因组中的应用是以OsAL7.1基因诱导RNA的核苷酸序列为OsAL7.1-sgRNA:GACTTCTCCGGCCGCCGCGC。

本发明公开了一种通过基因编辑的方式获得的水稻基因组中OsAL7.1基因等位基因knAL7.1基因的方法，构建含有OsAL7.1-sgRNA表达盒的CRISP/CAS9载体，利用水稻遗传转化在所述OsAL7.1基因第一外显子区域产生插入或缺失的水稻突变体，其第一外显子核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

由于采用了上述技术方案，一种水稻OsAL7.1基因的应用，水稻OsAL7.1基因用于调节水稻种子的大小和水稻的抗旱性。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1.本发明OsAL7.1基因突变体具有增加水稻种子大小,从而改变水稻粒型和产量。

2.本发明OsAL7.1基因突变体具有增加水稻种子大小,同时提高水稻抗旱性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为OsAL7.1基因组结构和CRISP/Cas9敲除后转化植物的序列比对图；

图1A：OsAL7.1基因组结构，方框表示外显子，深色方框表示基因编码区，直线表示内含子；图1B：序列比对图，ZH11表示受体亲本中花11部分片段序列，knAL7.1表示敲除株系部分片段序列。

图2为表达载体pCBH04-OsAL7.1的构建示意图。

图3为CRISP/Cas9植物转化载体构建示意图。

图4为超表达转基因植株抗旱性鉴定图；其中，处理前表示在正常灌溉条件下生长，复水后表示在幼苗生出3片叶后停止灌溉进行干旱处理10天后，重新灌溉生长5天；ZH11表示受体亲本，OE表示超表达OsAL7.1转基因植株，**表示t-test分析p<0.01。

图5为基因编辑突变植株抗旱性鉴定图；其中，处理前表示在正常灌溉条件下生长，复水后表示在幼苗生出3片叶后停止灌溉进行干旱处理10天后，重新灌溉生长5天；ZH11表示受体亲本，knAL7.1表示基因编辑突变植株，**表示t-test分析p<0.01。

图6为knAL7.1基因编辑突变植株的种子大小统计图；图6A：10粒横排；图6B：5粒竖排；图6C：粒长：图6D：粒宽：图6E：长宽比；其中，knAL7.1表示OsAL7.1基因编辑后功能缺失突变体，ZH11表示受体亲本中花11，***表示t-test分析p<0.001。

具体实施方式

在本文，术语“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。

通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。

用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，携带本发明的核酸序列的重组表达载体可以使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,AcademyPress,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。

含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3',5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段，然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段，然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。

其它新发展的技术利用同源重组方法，将携带有特定序列接头或同源序列接头的多核苷酸与载体进行同源重组，将欲插入载体DNA内的DNA区段与同样携带有特定序列或同源序列的载体通过重组酶的作用形成重组DNA分子。

多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上，启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子；其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA,UGA或UAG)。

如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括编码抗生素的抗性基因，例如：新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphotransferase)基因nptⅡ、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因hpt和二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase)基因dhfr；另一类是编码除草剂抗性基因，例如，草丁膦乙酰转移酶(Phosphinothricin acetyltransferase)基因bar、5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶(5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因epsps。适当宿主的代表性例子包括但不限于：原生质体细胞和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。

目的基因或目的多核苷酸的转化方法：一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。

本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞或生物体。

本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高。通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明所述核苷酸序列的重组载体的细胞或生物体。

为了弥补以上不足，本发明提供了一种水稻基因OsAL7.1应用及其方法以解决上述背景技术中的问题。

所述水稻OsAL7.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述OsAL7.1基因第一外显子区域插入或缺失，该突变使基因翻译提前终止，形成OsAL7.1基因的突变体knAL7.1基因，所述的knAL7.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

还包括添加接头利用PCR扩增的方法构建所述的OsAL7.1基因应用于生产具有抗旱性转基因植物的引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；

所述OsAL7.1基因功能缺失可调控水稻种子的大小；所述OsAL7.1基因功能削弱可调控水稻种子的大小。

所述OsAL7.1基因功能缺失可改善在干旱条件下水稻抗旱性；所述OsAL7.1基因功能削弱可改善在干旱条件下水稻抗旱性。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：分离克隆OsAL7.1基因

1.1OsAL7.1基因克隆

依据Rice Genome Annotation Project website(http://rice.uga.edu/)数据库提供的OsAL7.1(LOC_Os07g12910)基因数据，分别设计引物合成两个剪切本编码cDNA序列。OsAL7.1对应的引物为OsAL7.1F(5’-ATGGAGATGGCCGCCCCC-3’)和OsAL7.1R(5’-TTATTGCCTACTCTTCTTGGAGC-3’)。取水稻叶片，采用TRIzol试剂(GIBCO BRL,USA)抽提总RNA。利用反转录酶MLV(Tiangen，China)将其反转录成cDNA。引物OsAL7.1.1F和引物OsAL7.1R，扩增出基因的全长OsAL7.1.1编码cDNA，引物OsAL7.1.2F和引物OsAL7.1R，扩增出基因的全长OsAL7.1.2编码cDNA。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃60sec共35个循环；72℃延伸1min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(Promega,USA),筛选阳性克隆并测序，获得OsAL7.1基因的cDNA序列(SEQ ID NO.1)。OsAL7.1推测的蛋白序列进行同源基因的比对分析，发现所得序列与网上公开的OsAL7.1基因序列一致，编码蛋白在N端保守的DUF3594结构域和C端保守的PHD结构域的转录因子。故推测这种序列的差异对两个剪切本的基因功能产生了影响。

实施例2：OsAL7.1基因相关表达载体的构建

2.1含目的基因超表达载体的构建：

根据OsAL7.1基因的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物和下游引物上分别添加接头引物，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经高保真Taq酶pfu酶(Tiangen，China)进行PCR扩增后，将实施例1中获得的全长cDNA克隆至中间载体(如pDONR207)，进一步转化大肠杆菌DH5α，在保证阅读框架正确的前提下鉴定中间载体，然后抽提质粒，然后使用LR Clonase重组酶与包含启动子和终止子蛋白植物表达载体载体pCBH04进行重组反应，构成了一个完整的表达单元(见图2)，转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。

2.2CRISP/Cas9植物转化载体构建

2.2.1、引导RNA靶点序列选择与引物设计

根据控制水稻基因OsAL7.1的基因组序列，设计基因OsAL7.1的sgRNA。20nt的核苷酸sgRNA靶点序列按照5’-N20-NGG-3’序列进行设计，同时设计靶点序列引物gRT+和OsU6aT-，其3’端有15-17nt分别与sgRNA和U6a启动子配对。具体靶点核苷酸序列如下。

OsAL7.1-sgRNA:GACTTCTCCGGCCGCCGCGC

gRT+:5’-ATCACTATGAACCGCACgttttagagctagaaat-3’

OsU6aT-:5’-GTGCGGTTCATAGTGATggcagccaagccagca-3’

2.2.2、靶点序列sgRNA表达盒的构建

参考Ma等人的方法(Ma et al.,2015,Molecular Plant,8(8):1274-1284)，取2-5ng pYLgRNA-OsU6a/LacZ质粒(1ul)为模板，在两个反应体系中分别进行PCR扩增：U-F和OsU6aT-用于扩增OsU6a-靶点片段，gR-R和gRT+用于扩增sgRNA-靶点片段。一般使用KODplus聚合酶(TOYOBO)，反应体系为1ul质粒模板，2.5uL 10×Buffer，0.5uL KOD plus聚合酶，1ul 25mM的MgSO4，2.5uL 2mM的dNTPs，10uM的前后引物各0.5uL，补充dd H2O至25uL；PCR扩增程序为：95℃2min，98℃10s，58℃15s，68℃20s 25个循环。电泳检测PCR产物，OsU6a-靶点片段为700bp左右，gRNA-靶点片段为131bp左右。取第一轮两个PCR产物各1μl为模板，用引物U-GAL和Pgs-GAR按以上步骤进行第二轮PCR,30循环。产物大小为830bp左右。凝胶电泳检测，切胶回收，此产物即为基因OsAL7.1靶点序列-sgRNA表达盒。

所述的Gibson assembly的引物为：

U-F:5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’

gR-R:5’-cggaggaaaattccatccac-3’

U-GAL:5’-accggtaaggcgcgccgtagtgctcgactagtatggaatcggcagcaaagg-3’

Pgs-GAR:5’

-tagctcgagaggcgcgccaatgataccgacgcgtatccatccactccaagctcttg-3’

2.2.3、靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体构建

组装靶点序列sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体，以南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress快速克隆重组酶为例：4μl 5×CE II Buffer，200ng线性化pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒，上面回收的含OsAL7.1靶点序列-sgRNA的PCR产物200ng，2μlExnaseTM II，最后加水到20μl，37℃温浴30min，将5μl反应混合物转化大肠杆菌，涂布含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日挑取阳性单克隆进行测序验证并抽提质粒保存。质粒所示载体示意见图3，转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。其所获得的转基因植株命名为knAL7.1。

实施例3：水稻遗传转化

3.1种子消毒

成熟的日本晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75％酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗2次；再用30％NaClO消毒30min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L)上，每皿约30粒，于28℃暗培养。

3.2继代培养

经过近1月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L)上进行继代。每2周继代一次，继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。

3.3农杆菌的培养

在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，终浓度100uM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基(含AS 100uM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600＝0.5-1，此时可用来转化愈伤组织。AS＝acetosringone。

3.4共培养

将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+AS 100uM)上，28℃暗培养三天。

3.5洗菌

共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef/CN 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。

3.6选择培养

将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef400mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 50mg/L+Cef 250mg/L)上，再选择2周。

3.7分化培养

将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef 200mg/L+琼脂9g/L+蔗糖45g/L)上暗培养10天左右，再转到分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。

3.8生根培养

约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS+Hyg 15mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。

3.9转基因苗的移栽

当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

实施例4：OsAL7.1基因在转基因植株中的表达分析

4.1材料准备

转基因T1代水稻种子发芽后，移植于液体培养基(自来水配制成1/5MS大量元素)。幼苗生长15d后，剪取叶片快速投入液氮保存，用于RNA的抽提。

4.2无DNA的总RNA制备

按上海全式金生物技术有限公司提供的植物叶RNA小量抽提试剂盒使用说明书抽提。使用Beckman

紫外分光光度计测定RNA浓度。为除去残留在RNA中的DNA，每个总RNA样品取5μg，加入1μL DNAase I(美国Invitrogen公司)和1μL10×反应缓冲液，补足体积至10μL，常温反应30min，然后每管加入1μL 2mmol L-1EDTA终止反应，最后在70℃加热10min使DNAase I失活。

4.3第一链cDNA的合成

将上述RNA样品各取2μL，按美国Promega公司反转录试剂盒提供的试剂依次添加4μL 25mmol L-1MgCl2，2μL10×RT缓冲液，2μL dNTP混和液和1μL oligo(dT)15，加水补足体积到18.5μL，在70℃加热变性10min，快速在冰上冷却。然后加0.5μL RNase inhibitor和1μL AMVRTase，在42℃水浴60min，70℃下加热10min终止反应。

4.4定量PCR

根据基因OsAL7.1的序列设计特异性引物，正向引物为QF:5’-GTGGTTCCACGGCAAATGC-3’，反向引物为QR:5’-GCCTACTCTTCTTGGAGCTG-3’，用于荧光定量PCR，根据水稻Actin基因(GenBank accession No.AY212324)的cDNA序列设计特异性引物AF:5’-cttcctcatgccatcctgc-3’，AR:5’-gcaagcttctccttgatgtcc-3’，用于参照基因的荧光定量PCR。PCR使用美国BioRad定量PCR仪，每一个PCR设置3次重复。反应体系包含TiangenSYBR Premix Taq^TM(2×)10μL，正反向引物各0.5μL，各种处理的cDNA模板1μL，加水补足体积至25μL。反应程序为：95℃30s，然后在95℃10s，61℃34s下循环40次，设定在每个循环中60℃34s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他操作详见仪器使用说明书。为了检测RNA样品中是否存在DNA的污染，随机选取3个样品，各取1μL RNA作为模板进行PCR，方法同上。

4.5分析方法

Ct是通过BioRad定量PCR仪软件在PCR的荧光域值自动产生的，将数据输入到EXCEL进行计算分析。数据分析采用方法为2^-ΔΔCT，然后利用EXCEL表作表达差异柱状图。

4.6分析结果

以空白非转基因日本晴品种为参照，分别检测了3个独立的转基因株系OE1-3，发现转基因株系均有较强的增强表达，其中OsAL7.1增强表达倍数最高超过20倍以上，OsAL7.1增强表达倍数最高超过20倍以上(见图4B)，说明该基因导入到水稻后在叶片中得到明显的增强表达，可应用于进一步的转基因水稻研究。

实施例5：knAL7.1植株鉴定

按照基因组结构，见图1，在基因编辑位点两端分别设计引物CasF：5’-CGACGCCGATGGAGATGGC-3’，CasR：5’-TACCCTCATCAGATCCGATCC-3’，用于扩增编辑区域片段。将CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻所获得的转基因植株移栽，剪切20mg叶片，按照快捷型植物基因组DNA提取系统(Tiangen，China)提供的说明方法，提取叶片DNA，取1-2ul DNA为模板，经Taq酶(Tiangen，China)进行PCR扩增后，回收纯化PCR片段，提交公司测序，寻找位点纯合突变的单株。通过序列分析，发现在OsAL7.1基因翻译密码起始位点下游61的位置缺失个碱基T(见SEQ ID NO.3)，导致发生移码突变，引起转录本的提前终止，形成125个氨基酸多肽，而全长OsAL7.1蛋白序列257个氨基酸。推测基因编辑后OsAL7.1基因可能由于移码突变提前终止而使该基因丧失功能(见图1B)，故该试验中所产生的knock-out突变体植株可为功能敲除缺失突变植株进行下一步研究工作，形成植株命名为knAL7.1。

实施例6：OsAL7.1转基因植株在苗期干旱胁迫条件下的生长状况

分别选取了实施例4中OsAL7.1超表达植株OE1和knAL7.1基因编辑植株进行了苗期干旱胁迫实验。具体步骤如下：在每份材料种子播种在小桶土壤中，当植株长至3叶期时，停止灌溉进行干旱处理，10天后幼苗严重卷曲，进行灌溉复水处理，正常生长5天，观察转基因植株的生长状况。结果表明，本发明克隆的OsAL7.1基因超表达的转基因植株、knAL7.1基因编辑植株和受体亲本在正常条件下与对照无显著差异，但在干旱处理后，叶片都明显卷曲，在处理10天后，复水条件下，OsAL7.1超表达植株的成活率明显低于非转基因对照植株(见图4)，而knAL7.1基因编辑植株成活率明显高于非转基因对照植株(见图5)，说明了超表达OsAL7.1降低了水稻耐旱能力，OsAL7.1功能缺失提高了植株的抗旱能力，也表明该基因负调控水稻的抗旱性。

实施例7：OsAL7.1基因功能敲除突变体的种子大小鉴定

选取了3个实施例5中所获得的knAL7.1转基因T1代植株和受体中花11在大田种植，到植株生长成熟时收获转基因T2代植株种子，对种子大小进行观察测量。

将野生型水稻和敲除knAL7.1种子放在一起进行拍照和统计，我们发现敲除knAL7.1种子呈明显变大，尤其是粒长发生了显著变化，粒宽没有发生显著变化，最后导致长宽比明显高于对照(见图6)。同时也观察了超表达转基因材料的种子大小，没有发生明显变化。

综上所述，敲除OsAL7.1基因功能，使水稻种子变大。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市农业生物基因中心

上海市农业生物基因中心

<120> 一种水稻基因OsAL7.1的应用及其方法

<130> 2

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 735

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(735)

<400> 1

atg gag atg gcc gcc ccc gtc tcc ccc gcg ccg cgc acc gtc gag gac 48

Met Glu Met Ala Ala Pro Val Ser Pro Ala Pro Arg Thr Val Glu Asp

1 5 10 15

atc ttc aag gac ttc tcc ggc cgc cgc gcc ggc ctc gtc cgc gcc ctc 96

Ile Phe Lys Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu

20 25 30

acc gtc gat gtg gat gag ttc tac gga ttc tgc gac cca gag aag gag 144

Thr Val Asp Val Asp Glu Phe Tyr Gly Phe Cys Asp Pro Glu Lys Glu

35 40 45

aat ttg tgc ctg tac ggg cac ccg aac ggg cgg tgg gag gtg gcg ctg 192

Asn Leu Cys Leu Tyr Gly His Pro Asn Gly Arg Trp Glu Val Ala Leu

50 55 60

ccg gcg gag gag gtg ccg ccg gag ctg ccg gag ccg gcg ctc ggg atc 240

Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile

65 70 75 80

aac ttc gcc agg gac ggg atg cac cgc cgc gac tgg ctc tcg ctc gtc 288

Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met His Arg Arg Asp Trp Leu Ser Leu Val

85 90 95

gcc gtc cac tcc gac tcg tgg ctg ctc tcc gtc gcc ttc ttc ttc ggc 336

Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Phe Phe Gly

100 105 110

gcg cgc ctc aac ggc aac gag agg aag cgc tta ttc agc ttg atc aat 384

Ala Arg Leu Asn Gly Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Ser Leu Ile Asn

115 120 125

gac cat cca acc gtg ctt gaa gca ctg tct gat agg aag cat gga agg 432

Asp His Pro Thr Val Leu Glu Ala Leu Ser Asp Arg Lys His Gly Arg

130 135 140

gat aat aaa tct ggt gcc gac aat ggc agc aaa tcc agg cac tca gga 480

Asp Asn Lys Ser Gly Ala Asp Asn Gly Ser Lys Ser Arg His Ser Gly

145 150 155 160

aag cga gca aat gac gtg cag aca aaa acc tcg agg cca gca gtt gtt 528

Lys Arg Ala Asn Asp Val Gln Thr Lys Thr Ser Arg Pro Ala Val Val

165 170 175

gac gat ggg tac gat gaa gaa gaa cac agt gaa acc cta tgt gga acc 576

Asp Asp Gly Tyr Asp Glu Glu Glu His Ser Glu Thr Leu Cys Gly Thr

180 185 190

tgc ggt ggc cgc tac aac gcc aac gag ttt tgg att ggg tgc gac att 624

Cys Gly Gly Arg Tyr Asn Ala Asn Glu Phe Trp Ile Gly Cys Asp Ile

195 200 205

tgc gag cgg tgg ttc cac ggc aaa tgc gtt agg ata aca cca gcg aaa 672

Cys Glu Arg Trp Phe His Gly Lys Cys Val Arg Ile Thr Pro Ala Lys

210 215 220

gcg gaa cac ata aag cac tac aag tgc cct gat tgc agc agc tcc aag 720

Ala Glu His Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Ser Ser Ser Lys

225 230 235 240

aag agt agg caa taa 735

Lys Ser Arg Gln

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Glu Met Ala Ala Pro Val Ser Pro Ala Pro Arg Thr Val Glu Asp

1 5 10 15

Ile Phe Lys Asp Phe Ser Gly Arg Arg Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu

20 25 30

Thr Val Asp Val Asp Glu Phe Tyr Gly Phe Cys Asp Pro Glu Lys Glu

35 40 45

Asn Leu Cys Leu Tyr Gly His Pro Asn Gly Arg Trp Glu Val Ala Leu

50 55 60

Pro Ala Glu Glu Val Pro Pro Glu Leu Pro Glu Pro Ala Leu Gly Ile

65 70 75 80

Asn Phe Ala Arg Asp Gly Met His Arg Arg Asp Trp Leu Ser Leu Val

85 90 95

Ala Val His Ser Asp Ser Trp Leu Leu Ser Val Ala Phe Phe Phe Gly

100 105 110

Ala Arg Leu Asn Gly Asn Glu Arg Lys Arg Leu Phe Ser Leu Ile Asn

115 120 125

Asp His Pro Thr Val Leu Glu Ala Leu Ser Asp Arg Lys His Gly Arg

130 135 140

Asp Asn Lys Ser Gly Ala Asp Asn Gly Ser Lys Ser Arg His Ser Gly

145 150 155 160

Lys Arg Ala Asn Asp Val Gln Thr Lys Thr Ser Arg Pro Ala Val Val

165 170 175

Asp Asp Gly Tyr Asp Glu Glu Glu His Ser Glu Thr Leu Cys Gly Thr

180 185 190

Cys Gly Gly Arg Tyr Asn Ala Asn Glu Phe Trp Ile Gly Cys Asp Ile

195 200 205

Cys Glu Arg Trp Phe His Gly Lys Cys Val Arg Ile Thr Pro Ala Lys

210 215 220

Ala Glu His Ile Lys His Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Ser Ser Ser Lys

225 230 235 240

Lys Ser Arg Gln

<210> 3

<211> 734

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(375)

<400> 3

atg gag atg gcc gcc ccc gtc tcc ccc gcg ccg cgc acc gtc gag gac 48

Met Glu Met Ala Ala Pro Val Ser Pro Ala Pro Arg Thr Val Glu Asp

1 5 10 15

atc ttc aag gac tct ccg gcc gcc gcg ccg gcc tcg tcc gcg ccc tca 96

Ile Phe Lys Asp Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ser Ser Ala Pro Ser

20 25 30

ccg tcg atg tgg atg agt tct acg gat tct gcg acc cag aga agg aga 144

Pro Ser Met Trp Met Ser Ser Thr Asp Ser Ala Thr Gln Arg Arg Arg

35 40 45

att tgt gcc tgt acg ggc acc cga acg ggc ggt ggg agg tgg cgc tgc 192

Ile Cys Ala Cys Thr Gly Thr Arg Thr Gly Gly Gly Arg Trp Arg Cys

50 55 60

cgg cgg agg agg tgc cgc cgg agc tgc cgg agc cgg cgc tcg gga tca 240

Arg Arg Arg Arg Cys Arg Arg Ser Cys Arg Ser Arg Arg Ser Gly Ser

65 70 75 80

act tcg cca ggg acg gga tgc acc gcc gcg act ggc tct cgc tcg tcg 288

Thr Ser Pro Gly Thr Gly Cys Thr Ala Ala Thr Gly Ser Arg Ser Ser

85 90 95

ccg tcc act ccg act cgt ggc tgc tct ccg tcg cct tct tct tcg gcg 336

Pro Ser Thr Pro Thr Arg Gly Cys Ser Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala

100 105 110

cgc gcc tca acg gca acg aga gga agc gct tat tca gct tgatcaatga 385

Arg Ala Ser Thr Ala Thr Arg Gly Ser Ala Tyr Ser Ala

115 120 125

ccatccaacc gtgcttgaag cactgtctga taggaagcat ggaagggata ataaatctgg 445

tgccgacaat ggcagcaaat ccaggcactc aggaaagcga gcaaatgacg tgcagacaaa 505

aacctcgagg ccagcagttg ttgacgatgg gtacgatgaa gaagaacaca gtgaaaccct 565

atgtggaacc tgcggtggcc gctacaacgc caacgagttt tggattgggt gcgacatttg 625

cgagcggtgg ttccacggca aatgcgttag gataacacca gcgaaagcgg aacacataaa 685

gcactacaag tgccctgatt gcagcagctc caagaagagt aggcaataa 734

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 4

Met Glu Met Ala Ala Pro Val Ser Pro Ala Pro Arg Thr Val Glu Asp

1 5 10 15

Ile Phe Lys Asp Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ser Ser Ala Pro Ser

20 25 30

Pro Ser Met Trp Met Ser Ser Thr Asp Ser Ala Thr Gln Arg Arg Arg

35 40 45

Ile Cys Ala Cys Thr Gly Thr Arg Thr Gly Gly Gly Arg Trp Arg Cys

50 55 60

Arg Arg Arg Arg Cys Arg Arg Ser Cys Arg Ser Arg Arg Ser Gly Ser

65 70 75 80

Thr Ser Pro Gly Thr Gly Cys Thr Ala Ala Thr Gly Ser Arg Ser Ser

85 90 95

Pro Ser Thr Pro Thr Arg Gly Cys Ser Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala

100 105 110

Arg Ala Ser Thr Ala Thr Arg Gly Ser Ala Tyr Ser Ala

115 120 125

Claims

1.一种水稻OsAL7.1基因的应用，其特征在于：水稻OsAL7.1基因用于调节水稻种子的大小与水稻的抗旱性。

2.如权利要求1所述的一种水稻OsAL7.1基因的应用，其特征在于：所述水稻OsAL7.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求2所述的一种水稻OsAL7.1基因的应用，其特征在于：所述水稻OsAL7.1基因的第一外显子区域插入或缺失，该突变使基因翻译提前终止，形成OsAL7.1基因的突变体knAL7.1基因，所述的knAL7.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求3所述的一种水稻OsAL7.1基因的应用，其特征在于：所述水稻OsAL7.1基因引导RNA靶点序列引物在编辑水稻基因组中的应用是以OsAL7.1基因诱导RNA的核苷酸序列为OsAL7.1-sgRNA:GACTTCTCCGGCCGCCGCGC。

5.如权利要求3所述的一种水稻OsAL7.1基因的应用，其特征在于：还包括添加接头利用PCR扩增的方法构建所述的OsAL7.1基因应用于生产具有抗旱性转基因植物的引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；

将含靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，得到水稻OsAL7.1基因突变体knAL7.1植株。

6.一种如权利要求3所述的水稻OsAL7.1基因编辑产生突变体的应用，其特征在于：所述OsAL7.1基因功能缺失可调控水稻种子的大小；所述OsAL7.1基因功能削弱可调控水稻种子的大小。

7.一种如权利要求3所述的水稻OsAL7.1基因编辑产生突变体的应用，其特征在于：所述OsAL7.1基因功能缺失可改善在干旱条件下水稻抗旱性；所述OsAL7.1基因功能削弱可改善在干旱条件下水稻抗旱性。