JP2011172578A - エンハンサーによって増大した植物における遺伝子の発現 - Google Patents

エンハンサーによって増大した植物における遺伝子の発現 Download PDF

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Abstract

【課題】１以上の遺伝子プロモーターに対するエンハンサーの提供。
【解決手段】エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量はこのヌクレオチド配列の５０％を上回る。特定の配列はエンドウマメ・プラストシアニンプロモーターから同定され、該配列はＡ／Ｔのみのヌクレオチド配列と同様にエンハンサーとして活性である。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子の発現の増大に関し、特には、遺伝子のプロモーター活性の改変に関
する。
遺伝子操作は植物へのキメラ遺伝子の導入に依存し、導入された遺伝子の発現はそのプ
ロモーターに依存する。これらの遺伝子におけるプロモーターの有効性を改善する方法を
得ることが有利であるという多くの理由が存在する。異なるプロモーターは異なる組織に
おいて異なる効率で作動する。異なるプロモーターは同じ組織において異なる効率で作動
し、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーター（35Ｓ ＣａＭＶ）のような幾つか
のものは一般にnos遺伝子に由来するプロモーターよりも強力なプロモーターであると考
えられる。プロモーターは通常1000bpを上回るものからなり、短くした場合には作動の効
率が低下する。しかしながら、ＤＮＡの長い区画は組換えＤＮＡ技術における技術的な困
難をもたらす。したがって、改善された発現が必要となり得る多くの場合が存在する。ア
ンチセンスに関与する実験においては、商業上の成果を達成するためには可能な限り最も
高い発現が必要となることがある。したがって、適切な条件下において所定の遺伝子の発
現を高める利用可能なＤＮＡ構築体を得ることは有利である。
転写を活性化する配列はエンハンサーと呼ばれ（Simpsonら、Nature（1986）323,551-5
54）、エンハンサーとして活性である配列がＣａＭＶの35Ｓプロモーターから得られてい
る（米国特許第5,164,316号）。このエンハンサー領域を有する35Ｓプロモーターは多く
の植物において活性であり、このプロモーターは構成的で、多くの組織において作用する
ものとして説明されている。しかしながら、植物遺伝子についてエンハンサー領域が示唆
されているものの、植物プロモーターの一部が幾つかの異なる器官及び異なる種において
エンハンサー活性を有し得ることは従来認識されていない。例えば、エンドウマメ(pea)
ＲｂｃＳ遺伝子の−352〜2領域を細菌のnosプロモーターに接合すると、光合成組織にお
いて強い光誘発性発現が得られた。この要素をコード配列の下流に配置する類似の実験で
は、タバコでの発現を引き出さなかった（Fluhrら、，Science（1986）232，1106-1111）
。
エンドウマメＰｅｔＥ遺伝子がLast，D.I.及びGray，J.C.によって単離された［Plant
Molecular Biology（1989）12，655-666］。この遺伝子は、光合成電子伝達に関与する10
ｋＤａの銅タンパク質であるプラストシアニンをコードする。したがって、この遺伝子の
発現は葉及び茎のような器官、葉緑体を有する細胞において必要である。この遺伝子のプ
ロモーター領域を用いる欠失研究により、このプロモーターが葉、茎及び花では活性であ
るが根では活性ではなく、−784〜992の上流の要素が葉における発現を抑制することが示
唆された。この領域を除去することにより非常に‘強力な’プロモーターがもたらされた
（Pwee，K-H．and Gray，J.C．The Plant Journal（1993）3 437-449）。
本発明は、エンドウマメの緑色光合成組織において発現する遺伝子が、非光合成組織を
含む他の種及び他の組織において活性のエンハンサー領域を有するという驚くべき発見に
基づくものである。
本発明の目的は、エンハンサーとして活性であり、かつ緑色組織において発現されるプ
ロモーターの発現を増大させるＤＮＡ配列を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、エンハンサーとして活性であり、かつ植物の根、塊茎、茎、葉
、花又は種子の１以上において発現する任意のプロモーターの発現を増大させるＤＮＡ配
列を提供することにある。
また、該配列が得られた植物以外の植物における遺伝子の発現を高める方法を提供する
ことも本発明の目的である。
本発明は、遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法であって、エンハンサーを用い
て１以上の遺伝子のプロモーターの活性を高めることにより植物の１以上の器官における
１以上の遺伝子の発現を増大させ、該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配
列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量は該ヌクレオチド配列の50％を上回るエンハ
ンサーである方法を提供する。
本明細書中で用いられる場合、発現の増大とは、本発明のエンハンサーと共に用いた場
合の遺伝子の発現が、本発明のエンハンサーを用いずにその遺伝子の発現において見られ
るであろうものよりも大きいことを意味する。
都合の良いことには、エンハンサーは植物の遺伝子から得られるか、又は合成により産
生される。エンハンサーは植物遺伝子の相同体であっても、合成により産生された配列の
相同体であってもよい。
都合の良いことには、エンハンサーはエンドウマメにおいて発現する遺伝子から得られ
る。より都合の良いことには、この遺伝子はエンドウマメの緑色光合成組織、特にはエン
ドウマメ植物体の葉において発現する。
好ましくは、植物の１以上の器官に組み込まれる遺伝子の高められた発現は、そのエン
ハンサーが得られた植物とは異なる植物におけるものである。この相違は植物の型、すな
わち系統群(family)の相違であっても、又は同じ植物系統群の別の植物であってもよい。
本発明は、遺伝子プロモーターのためのエンハンサーであって、該エンハンサーはＡ及
びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量がこのヌクレ
オチド配列の50％を上回るエンハンサーを提供する。
このエンハンサー配列は単離及び／又は精製されたされた配列が適切であり得る。
好ましくは、この配列は少なくとも20％のＡ塩基及び少なくとも20％のＴ塩基を含む。
好ましくは、この配列は少なくとも25％、より好ましくは少なくとも30％、さらに好まし
くは少なくとも35％のＡ及びＴ塩基をそれぞれ含む。Ａ又はＴ塩基の一方は、この配列の
40、45％もしくは50％、又はそれを上回って存在していてもよい。この配列はＡ及びＴ塩
基のみを含んでいてもよい。
このエンハンサーは、本明細書の図面の図１の単離及び／又は精製された配列、配列番
号1、又はそれらに類似する配列であることが有利である。
このエンハンサーは、配列番号１の単離及び／又は精製されたサブ配列又はそれらに類
似する配列であって、そのサブ配列がエンハンサーとして活性であることがより有利であ
る。
好ましくは、このエンハンサーのサブ配列は本明細書において配列番号２として記述さ
れ、かつ知られる配列番号１の31bp領域、又はそれらに類似する任意の配列である。また
、このエンハンサーは、好ましくは、以下の塩基対配列：−444〜389、−388〜284、−28
3〜179、−444〜284、−388〜179又は必要とされるエンハンサー活性を有する類似の任意
の配列のいずれか１つもしくはそれ以上であってもよい。
このエンハンサーは、本明細書の図面の図８の単離及び／又は精製された配列、配列番
号3、又はそれらに類似する配列であることが有利である。
類似配列は相同体としても知られ得る。本明細書中で用いられる場合、相同体という用
語は、別のヌクレオチド配列と同一であるか又はそれに類似するヌクレオチド配列を有す
る核酸を意味する。その類似性は、そのヌクレオチド配列が本発明によるエンハンサーと
して作用可能となるのに十分なものでなければならない。
このエンハンサーは、配列番号３の精製されたサブ配列又はそれらに類似する配列であ
って、そのサブ配列がエンハンサーとして活性であることがより有利である。
好ましくは、遺伝子プロモーターは植物における遺伝子プロモーターである。好ましく
は、このエンハンサーの配列又はサブ配列は、植物の緑色又は非緑色組織、特にはそのよ
うな植物の根、塊茎、種子、茎、花又は葉において遺伝子の発現を増大させる。
都合の良いことには、このエンハンサーは、そのエンハンサーが得られる植物以外の植
物における遺伝子の発現を増大させる。
都合の良いことには、このエンハンサーは複数のエンハンサーを含んでいてもよい。こ
のエンハンサーは、正常又は逆方向の両者において適切に作動し得る。また、このエンハ
ンサーは、発現させようとする遺伝子のプロモーター又はターミネーターのいずれかに作
動可能に結合させ得ることが適切である。
また、本発明は、本発明によるエンハンサー、遺伝子プロモーター、コード配列もしく
は非コード配列及びターミネーター配列を含むキメラ遺伝子も提供する。
ここで用いられる場合、キメラ遺伝子という用語は、１種を上回る生物からの配列を有
する組換えＤＮＡ分子を意味する。
前記キメラ遺伝子は１種を上回るエンハンサー及び１種を上回るプロモーターを有して
いてもよい。
エンハンサーは、このキメラ遺伝子に含まれる場合、正常の方向であっても逆方向であ
ってもよい。
キメラ遺伝子は、レポーター配列又は識別可能な特徴を形質転換された植物に付与する
他の任意の配列を含むことが可能である。
さらに、本発明は、形質転換された植物であって、本発明の方法によって形質転換され
ていてもよく、本発明による１以上のエンハンサーを用いることによりその形質転換され
た植物中の１以上の遺伝子の発現が増大している形質転換された植物を提供する。
この形質転換された植物は、双子葉植物種、例えばジャガイモ、タバコ、綿、レタス、
メロン、カボチャ、キュウリ、エンドウマメ、セイヨウアブラナ、大豆、甜菜もしくはヒ
マワリ、又は単子葉植物種、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ、コメもしくはトウモロ
コシであり得る。このような穀物に適切な代替形質転換系は熟練した読者には公知であり
、ここで説明する必要はないであろう。
また、本発明は、本発明によるエンハンサーを用いて形質転換された植物の珠芽も提供
する。
また、本発明は、本明細書の方法又はそのエンハンサーの結果として発現が増大してい
る遺伝子を有する細胞も提供する。
本発明を容易に理解し、かつ容易に実施することができるように、例として、本明細書
の図面を参照する。
実施例１
本明細書において配列番号１（図６を参照）として認められる配列を、エンドウマメの
葉から、Last，D.I.及びGray，J.C.によって記載される方法［Plant Molecular Biology
（1989）12，655-666］で単離した。この配列を、図１に示すように、ＧＵＳレポーター
コード配列及びnosターミネーターに融合させたＰｅｔＥプロモーターの−175〜＋4の区
画に正常方向又は逆方向のいずれかで接合した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）ベクターｐＢＩＮ19（Jefferson，R.A．ら、ＥＭＢＯ J
，6，3901-3907）中で得られたキメラ遺伝子をタバコ植物体（ニコチアナ・タバクム cv.
サムスン（Nicotiana tobacum cv.Samsun））の形質転換に用いた。図１は４種類の異な
る構築体についての結果を図的に示す。各々の構築体について、幾つかの独立した形質転
換系を分析した。表１は各系について得られたＧＵＳの比活性の実際の値を示す。予想通
り、ＰｅｔＥプロモーターは葉においてのみ発現し、根においては発現しない。それにも
関わらず、活性の数値は、このプロモーターの−179〜444の上流領域がいずれの方向でも
、すなわち正常方向又は逆方向でも発現を高めるという驚くべき結果を示す。
これらの植物の生産方法を以下に詳述するが、当業者によって認識されるように、これら
の、又は他の植物の他の生産及びアッセイも等しく適切である。
トランスジェニック植物
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに結合するエンハンサー及びＰｅｔＥプロモ
ーターを有する組換え融合構築体を、Shen，W.J.及びForde，B.J.による電気穿孔法［Nuc
leic acid research（1989）17，8385］を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス
ＬＢＡ4404（Ooms，G;Hooykaas，P.J.J;Van Veen R.J.M;Van Beelen，P;Regensburg，T.J
.G;Schilpoort R.A.（1982a）Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium
tumefaciens with emphasis on the right side of the T region．Plasmid7，15-29）
に集め、形質転換したアグロバクテリウム細胞を用いて、Horsch，R.B.、Fry，J.E.、Hof
fman，N.L.、Eichholtz，D.、Rogers，S.G.及びFraley，R.T．1985［A simple and gener
al method for transferring genes into plants．Science，22，1229-1231］に従ってタ
バコの葉のディスクに感染させた。個々のカナマイシン耐性再生苗条(shoots)をカルス形
成葉ディスクから切り離し、成長調節因子を含まない培地に根付かせた。根付いたトラン
スジェニック植物を100μｇ ｍｌ-1カナマイシン及び200μｇ ｍｌ-1カルベニシリンを含
む培地における組織培養で維持し、7−8週間毎に継代培養した。ＧＵＳアッセイにおいて
用いる材料を、苗条の尖端にかなり近い幼若健常増殖葉（25−35ｍｍ長）から収穫した。
根は使用前に蒸留水で丁寧に洗浄した。
蛍光測定ＧＵＳアッセイ
ＧＵＳ酵素アッセイを、本質的にJeffersonら、1987，EMBO J，6，3901-3907に従って
行った。500μｌのＧＵＳ溶解バッファー（50ｍＭ ＮａＰi、ｐＨ7.0、10ＭＭ ＥＤＴＡ
、0.1％トリトンＸ−100、0.1％ラウリルサルコシンナトリウム、10ｍＭ 2−メルカプト
エタノール）中の10−40ｍｇの植物組織から抽出物を作製し、5−50μｌの抽出物を１ｍ
Ｍの4−メチルウンベリフェリルグルクロニドを含むアッセイの各々において用いた。Ｌ
Ｓ50蛍光分光光度計（Perkin Elmer、Connecticut、ＵＳＡ）を用いて蛍光を測定した。B
radford（1976）のミクロアッセイを用いてタンパク質を決定した。
〔表１〕
配列番号１をＰｅｔＥ最小−175／＋4プロモーター、ＧＵＳレポーター、nosターミネ
ーターの上流に両方向で有する構築体で形質転換した組織培養タバコ植物体の葉及び根抽
出物に由来するＧＵＳの比活性。
ＧＵＳの比活性
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体40
対照としてのＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター、nosターミネーター
Figure 2011172578
構築体38正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター、nosターミネーターの上流の配列番号１
Figure 2011172578
構築体39
逆方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター、nosターミネーターの上流の配列番号１
Figure 2011172578
ＭＵ＝4メチルウンベリフェロン
実施例２
さらなる実験において、配列番号１全体を用いる代わりに、配列番号１の31bp(−289〜
259)領域を用いた。この配列を、図７に示される配列番号２をもたらすように修飾した。
構築体110においては、１コピーの配列番号２をＰｅｔＥ−175／＋4プロモーターの上流
に結合させた。このプロモーターは、図２に示されるように、ＧＵＳレポーターコード配
列及びnosターミネーターに結合している。構築体108においては、３コピーの配列番号２
を−175〜＋4のＰｅｔＥプロモーターに結合させた。図２の集団についてタバコ植物体の
形質転換及び再生の後に得られた結果を示す。これらは、１を上回るコピー数の配列番号
２の領域がプロモーターの発現を増大させることを示す。表２は各系について得られたＧ
ＵＳ比活性の実際の値を示す。実施例１において用いられ、図２に示されるものと同じ対
照を用いた。
〔表２〕
タンパク質結合について高い親和性を示すエンドウマメ・プラストシアニンプロモータ
ーからの１コピーの31bp断片及び３コピーの31bp断片を有する構築体で形質転換したトラ
ンスジェニックタバコ植物体の葉の抽出物からのＧＵＳの比活性。
ＧＵＳの比活性
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体110
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosプロモーターの上流の
31bpオリゴヌクレオチド
Figure 2011172578
構築体108
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の
３コピーの31bpオリゴヌクレオチド
Figure 2011172578
実施例３
エンハンサー領域配列番号１が他のプロモーターに対して類似の効果を有しているかど
うかを確かめるため、配列番号１を「最小」35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーターに正常
方向及び逆方向に結合させ、この最小ＣａＭＶプロモーターを用いて調製したキメラ遺伝
子のターミネーター領域にも正常方向及び逆方向に結合させた。実施例１に記載されるよ
うにしてタバコを形質転換し、アッセイを行なった。図３は、これらの構築体で得られた
集団の平均値を示す。表３は、各系についての、（図３に示される）葉及び根両方につい
ての値を示す。ＰｅｔＥ遺伝子のエンハンサーとして識別される領域は異種ＣａＭＶプロ
モーターに対するエンハンサーとして作用し、該領域がそのプロモーターの上流に存在し
ようと、下流に存在しようと、両方向で活性である。このエンハンサーは根及び葉におい
て発現するプロモーターに関して活性であり、したがって、組織特異的ではない。
〔表３〕
最小35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、ＧＵＳレポーター、nosターミネーター及び
エンハンサー配列を有する構築体で形質転換したトランスジェニックタバコ植物体の根及
び葉の抽出物に由来するＧＵＳの比活性。
ＧＵＳの比活性
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体33
対照としての35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーター
Figure 2011172578
構築体34
正常方向の、35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の配列番号１
Figure 2011172578
構築体35
逆方向の、35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の配列番号１
Figure 2011172578
構築体36
正常方向の、35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの下流の配列番号１
Figure 2011172578
構築体37
逆方向の、35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの下流の配列番号１
Figure 2011172578
実施例４
配列番号１の、配列番号２以外の領域がエンハンサー様の活性を有しているかどうかを
確かめるため、図４に示されるように５種類のさらなるキメラ遺伝子を構築した。これら
の構築体は、配列番号２の上流及び下流の両者に存在する配列番号１の領域を用いた。実
施例１に記載されるようにしてトランスジェニックタバコ植物体を得た。これらの構築体
を有するトランスジェニック植物の分析は、選択された配列番号１のサブ領域の全てがエ
ンハンサー様の活性を有することを示し、表４は配列番号１によって示される活性の全て
が配列番号２によってもたらされるわけではないことを示す。
〔表４〕
配列番号１の断片を含む構築体で形質転換したトランスジェニックタバコ植物体の葉の
抽出物に由来するＧＵＳの比活性。
ＧＵＳの比活性
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体74
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターからの
−444〜389の断片
Figure 2011172578
構築体83
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターか
らの−388〜284の断片
Figure 2011172578
構築体90
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターか
らの−283〜179の断片
Figure 2011172578
構築体105
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターか
らの−444〜284の断片
Figure 2011172578
構築体111
正常方向の、ＰｅｔＥ−175／＋4プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターか
らの−388〜179の断片
Figure 2011172578
実施例５
エンハンサー領域が他の種において活性であるかどうかを確かめるため、−179〜444の
領域を、Mignery，G.A.；Pikaard，C.S．and Park，W.D．1988［Molecular characterisa
tion of the patatin multigene family of potato．Gene，62，27-44］に記述されるパ
タチンプロモーターPS20の−330〜＋１の領域に結合した。生成したキメラ遺伝子を形質
転換によりジャガイモに導入した。
植物材料
ジャガイモ苗条培養物を、in vitroにおいて、ムラシゲ及びスクーグ（Murashige and
Skoog）（ＭＳ）培地で、マジェンタ（Magenta）ＧＡ−7容器中、22oCで維持した（16時
間／8時間 明／暗）。これらを３週間毎に節ごとに継代培養した。
2−3インチ（5−7.5ｃｍ）の高さのin vitro苗条をレビントンズ（Levingtons）Ｆ1コン
ボストの2.5インチ（6.4ｃｍ）の鉢に植えた。これらを、増殖器（propagator）中で１週
間、成長室において18oCで引き離した（16時間／8時間 明／暗）。増殖器を取り除き、３
週間で植物を５インチ（12.7ｃｍ）の鉢に再度植えた。5−7週間で、これらの植物を形質
転換に用いた。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス
適切な株、例えば、ＬＢＡ4404、Ｃ58＃3の液体一晩培養物を、28oCで、Ｌ−ブロスに
おいて、0.8のＯＤ600（ファルマシア（Pharmacia）ＬＫＢ ＵＬＴＲＡＳＰＥＣ II）ま
で成長させた（下記参照）。
同時培養
最も若い、４枚の最も広がった葉を採取し、表面を10％市販漂白剤（ドメストス（Dome
stos）ＲＴＭ）で15分間滅菌した。葉を無菌水でよくすすいだ後、7ｍｍコルクボーダー
を用いてディスク状に切断した。これらのディスクをアグロバクテリウムと1−5分間混合
し、濾紙（ワットマン（Whatman）Ｎｏ.1）で水気をとって乾燥させた後、90ｍｍの三穴
ペトリ皿（triple vented petri dish）内のカルス形成培地（下記参照）上に下表皮を下
にして置いた。これらの90ｍｍ三穴ペトリ皿をテープで密封し、切断して気体の交換を可
能にした後、22oCでインキュベートした（16時間／8時間 明／暗）。48時間後、500μｇ
ｍｌ-1のクラホラン及び30μｇ ｍｌ-1のカナマイシンを加えたカルス形成培地にディス
クを植え継いだ(transfer)。これにより細菌が取り除かれ、形質転換細胞が選択される。
形質転換苗条の再生
１週間後、同じ抗生物質を含む苗条形成培地にディスクを植え継いだ。
Figure 2011172578
苗条を採取できるまで（通常、約４週間）同じ培地上でさらに植え継ぎを行った。カル
スを伴う苗条を、十分に換気された容器、例えばマジェンタ内のクラホラン（500μｇ／
ｍｌ）を含むＭＳ培地に植え継いだ。セホタキシムと共に数世代継代して細菌を除去した
後、形質転換体をＭＳ培地に維持した。これらをin vitroから取り除き、引き離して、植
物材料について上述される成熟度まで成長させた。このプロセスにより、同時培養したデ
ィスクの30％までの頻度で形質転換ジャガイモ植物体を得た。
アンシミドール（180μｇ／ｍｌ）の存在下においてこれらの植物体から生じた微小塊
茎を、実施例１に説明されるようにＧＵＳの活性についてアッセイを行なった。図５はそ
の結果を示すもので、いずれの方向のエンハンサー配列もパタチンプロモーターの活性を
高めることを示しており、表５は遺伝子が微小塊茎では発現するが、葉では発現しないこ
とを示す。
〔表５〕
最小パタチンプロモーター及び完全長ＰＳ20パタチンプロモーターと比較した、−330
〜＋１のパタチンクラス１プロモーターの上流の配列番号１を有するトランスジェニック
ジャガイモ植物体に誘発された微小塊茎に由来するＧＵＳの比活性。
比ＧＵＳ活性
（ピコモルＭＵ／分／タンパク質μｇ）
構築体p250
2562bpパタチンプロモーター、ＧＵＳレポーター
及びnosターミネーター
Figure 2011172578
構築体116
330／＋1bp最小パタチンプロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーター
Figure 2011172578
構築体112
正常方向の、最小パタチン−330／＋1プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターからの
−444〜179の断片
Figure 2011172578
構築体114
逆方向の、最小パタチン−330／＋1プロモーター、
ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流の、
エンドウマメ・プラストシアニンプロモーターの
−444〜179の断片
Figure 2011172578
実施例６
ここで配列番号３として認められる配列（図８を参照）は硬貨を投げて(coin flipping
)設計し、いかなるＧ／Ｃ bpの介在もなく多量体化できるように5’末端にＥｃｏＲＩ突
出部を有する２つの相補的オリゴヌクレオチド（5’AAT TAT AAT ATA ATT TTA ATT TAA A
A3’）及び（5’AAT TTT TTA AAT TAA AAT TAT ATT AT 3’）から構築した。オリゴヌク
レオチドをアニールしてリン酸化し、鎖状体をｐＩＣ19Ｈ（Marshら、1984）のＥｃｏＲ
Ｉ部位に挿入した。配列決定により、それぞれこのオリゴヌクレオチドの4、２及び１コ
ピーのインサートを含む３種類のプラスミドを同定した。インサートをHindIII-SalI断片
として切り出し、ここでｐＪＳＳ22として認められるｐＫＨｄ7（Pwee，K-H and Gray，J
.C.（1993）The Plant Journal）に挿入して、それぞれ2、１及び４コピーを含むｐＪＳ
Ｓ139、ｐＪＳＳ140及びｐＪＳＳ141を得た。
得られたキメラ遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンスベクターｐＢＩＮ19中
で用いて、上述の方法に従ってタバコ植物体（ニコチアナ・タバクム cv．サムスン）を
形質転換した。図９は、５種類の異なる構築体についての結果を図示する。各々の構築体
について、幾つかの独立した形質転換系統を分析した。表６は、各系列について得られた
ＧＵＳの比活性の実際の値を示す。予想通り、ＰｅｔＥプロモーターは葉において発現し
たが、複数の配列番号３が用量に関連して発現を高めるという驚くべき結果も示される。
〔表６〕
ｐｅｔＥ最小−175／＋4プロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流
にあるＥｃｏＲＩ部位に１コピーの26merオリゴヌクレオチドを有する構築体で形質転換
されたトランスジェニックタバコ植物体の葉の抽出物に由来する比ＧＵＳ活性。
Figure 2011172578
実施例７
配列番号１が他のプロモーターに関して活性であることをさらに確かめるため、本明細
書においてＰｓＭＴA(Marta Evans，I.，ら、ＦＥＢＳ 262（1）29-32)として認められる
エンドウマメメタロチオネインプロモーターを得た。このプロモーターの−806〜１の領
域を、イントロン（Vancanneyt，G．ら、(1990)Mol.Gen.Genet 220 245-250）及びnosタ
ーミネーターを有するＧＵＳコード領域にライゲートし、それにより構築体ｐＫＳ 21040
を得た（図10を参照）。配列番号１をこのキメラ遺伝子の5’末端に、正常方向又は逆方
向のいずれかで結合した。このエンハンサー−プロモーター−ＧＵＳ−nosターミネータ
ー融合体を図10に示されるバイナリーベクターｐＡＴＣ（改変制限部位を有するｐＢＩＮ
19誘導体）に導入した。これにより構築体ｐＡＴＣ25040及びｐＡＴＣ26040がそれぞれ得
られ（図11を参照）、これらを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＲ1000でニ
コチアナ・タバクム cv ヘビー・ウェスタン（Nicotiana tabacum cv Heavy Western）タ
バコを形質転換して毛状根を生成させた。
毛状根の形質転換：
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＲ1000（McAfee，Bら、Plant Cell Tissue and
Organ Culture（1993）34，53.62）を電気穿孔法（Shen，W.J．and Forde，B.J．Nuclei
c acid research（1989）17，8385）を形質転換し、得られた細菌を葉ディスク法（Horsc
h，R.B.;Fry，E.J.;Hoffinan，N.L.;Eichholtz，D;Rogers，S.G:Fraley，R.T．Science（
1985）22，1229-1231）によるニコチアナ・タバクムの形質転換に用いた。カナマイシン
に対して耐性である根をディスクから切り離し、100μｇ／ｍｌカナマイシン及び500μｇ
／ｍｌクラホランを含む組織培養培地に移した。根をこの培地に維持し、３週間毎に継代
培養した。その後、根を100μｇ／ｍｌカナマイシン及び200μｇ／ｍｌクラホランを含む
培地に植え継いだ。さらに７日後、これらの根をクラホラン(claforan)を含まない培地に
植え継ぎ、毎週継代培養した。
実施例８
合成オリゴマー（配列番号３）のモノマー、ダイマー及びテトラマーを、ｐＩＣ19Ｈ（
Marshら、(1984)Gene 32，481-485）のＥｃｏＲＩ部位にライゲートすることができるよ
うにＥｃｏＲＩ突出部を含めて合成した。得られたプラスミドからXhoI-SalI断片を切り
出し、ｐＫＳ21040の対応部位にライゲートした。この合成オリゴマープロモーター−Ｇ
ＵＳ−nosターミネーター融合体をバイナリーベクターｐＡＴＣに導入した。得られた構
築体ｐＡＴＣ27040、ｐＡＴＣ28040及びｐＡＴＣ29040（図11を参照）をニコチアナ・タ
バクム cv ヘビー・ウェスタンの形質転換に用いて毛状根を生成させた。
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Ooms，G；Hooykaas，R.J.J.;Van Veen R.J.M；Van Beelen，P；Regensburg，T.J.G；Schi
lpoort R.A.（1982a）Ｔ領域の右側が強調された、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スのオクトパイン(Octopine)Ｔｉ−プラスミド欠失変異体。Plasmid 7、15−29。
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発しない。The Plant Journal 3、437−449
Shen，W.J.及びForde，B.J.（1989）高電圧によるアグロバクテリウム種の効率的な形質
転換。Nucleic acid research 17、8385。
Simpson，J.、Schell，J.、Van Montagu，M.及びHerrera-Estrella，L.（1986）光誘発性
及び組織特異的エンドウマメlhcp遺伝子の発現はエンハンサー及びサイレンサー様の特性
を併せ持つ上流要素に関与する。Nature 323、551−554。
Vancanneyt，G.、Schmidt，R.、O'Connor-Sanchez，A.、Willmitzer，L.及びRochsa-Sosa
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ントロンのスプライシング及びアグロバクテリウム媒介植物形質転換における初期現象の
モニタリングでのそれらの使用。Mol．Gen．Genet．220、245−250。
最小ＰｅｔＥプロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに対して正常方向及び逆方向で融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の葉においてエンハンサーとして挙動する、配列番号１の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。 最小ＰｅｔＥプロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の葉においてエンハンサーとして挙動する、単一及び複数コピーの、配列番号２の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。 最小35Ｓ ＣａＭＶ（−90）プロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターの上流又は下流に正常方向及び逆方向で融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の根においてエンハンサーとして挙動する、配列番号１の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。 最小ＰｅｔＥプロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の葉においてエンハンサーとして挙動する、正常方向の配列番号１のサブ配列の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。 最小もしくは完全長パタチン(patatin)プロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに対して正常方向及び逆方向で融合させた場合の、トランスジェニックジャガイモ植物体の微小塊茎においてエンハンサーとして挙動する、配列番号１の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。 本明細書において配列番号１としても認められる、エンドウマメ・プラストシアニンプロモーター（−444〜179）配列のコード配列を示す。 配列番号２としても認められる、図６のエンドウマメ・プラストシアニンプロモーターのサブ配列のコード配列を示す。 エンハンサーとして活性であり、かつ本明細書において配列番号３として認められるヌクレオチド配列を示す。 最小ＰｅｔＥプロモーター、ＧＵＳレポーター及びnosターミネーターに融合させた場合の、トランスジェニックタバコ植物体の葉においてエンハンサーとして挙動する、配列番号３の棒グラフの形態にあるＧＵＳの比活性を示す。 構築体ｐＡＴＣを示す。 構築体ｐＫＳ 21040、ｐＡＴＣ 25040、ｐＡＴＣ 26040、ｐＡＴＣ 27040、ｐＡＴＣ28040及びｐＡＴＣ 29040を示す。

Claims (26)

  1. 遺伝子プロモーターの発現を増大させるエンハンサーの配列を含んでなる核酸であって、
    該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配列であり、その含有するＡ及びＴ塩
    基の総量は該ヌクレオチド配列の５０％を上回り、該エンハンサーは本明細書の図面の図
    ６の配列番号１、エンハンサー活性を有する配列番号１のサブ配列、本明細書の図面の図
    ７の配列番号２、及び、配列番号１由来のヌクレオチド塩基対配列である−３８８〜１７
    ９からなる群の１以上から選択される単離された配列であり、さらに該エンハンサーは、
    天然のエンドウマメ・プラストシアニン遺伝子の５’非翻訳領域の該エンハンサーの隣に
    位置するヌクレオチド配列に結合していない、核酸。
  2. 前記エンハンサーがＡ及びＴ塩基をそれぞれ少なくとも３５％有する、請求項１記載の核
    酸。
  3. Ａ又はＴ塩基の一方が前記エンハンサーの４０、４５％もしくは５０％、又はそれ以上存
    在する、請求項１又は２に記載の核酸。
  4. 前記エンハンサーがＡ及びＴ塩基のみを含む、請求項１記載の核酸。
  5. 遺伝子プロモータ一の発現を増大させる方法であって、エンハンサーを用いて１以上の遺
    伝子のプロモーターの活性を高めることにより植物の１以上の器官における１以上の遺伝
    子の発現を増大させる方法であり、該エンハンサーはＡ及びＴ塩基に富むヌクレオチド配
    列であり、その含有するＡ及びＴ塩基の総量は該ヌクレオチド配列の５０％を上回り、該
    エンハンサーは本明細書の図面の図６の配列番号１、エンハンサー活性を有する配列番号
    １のサブ配列、本明細書の図面の図７の配列番号２、及び、配列番号１由来のヌクレオチ
    ド塩基対配列である−３８８〜１７９からなる群の１以上から選択される単離された配列
    であり、さらに該エンハンサーは、天然のエンドウマメ・プラストシアニン遺伝子の５’
    非翻訳領域の該エンハンサーの隣に位置するヌクレオチド配列に結合していないエンハン
    サーである方法。
  6. 前記エンハンサーがＡ及びＴ塩基をそれぞれ少なくとも３５％有する、請求項５に記載の
    方法。
  7. Ａ又はＴ塩基の一方が前記エンハンサーの４０、４５％もしくは５０％、又はそれ以上存
    在する、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 前記エンハンサーがＡ及びＴ塩基のみを含む、請求項５に記載の方法。
  9. 前記エンハンサーが植物遺伝子から得られるか、又は合成により生成される、請求項５に
    記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
  10. 前記エンハンサーが植物遺伝子の相同体であるか、又は合成により生成した配列である、
    請求項９に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
  11. 前記遺伝子プロモーターが植物における遺伝子プロモーターである、請求項５〜１０のい
    ずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
  12. 前記エンハンサーの配列又はサブ配列が植物の緑色又は非緑色組織における遺伝子の発現
    を増大させる、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大
    させる方法。
  13. 増大した発現が前記植物の根、塊茎、種子、茎、花又は葉で生じる、請求項１２に記載の
    遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
  14. 前記エンハンサーが複数のエンハンサーを含んでなる、請求項５〜１３のいずれか１項に
    記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
  15. 前記エンハンサーが正常方向及び逆方向の両者で作動する、請求項５〜１４のいずれか１
    項に記載の遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法。
  16. 前記エンハンサーが、発現させようとする遺伝子のプロモーター又はターミネーターのい
    ずれかに結合する、請求項５〜１５のいずれか１項に記載の遺伝子プロモーターの発現を
    増大させる方法。
  17. エンハンサー、異種遺伝子プロモーター、コード配列もしくは非コード配列及びターミネ
    ーター配列を含むキメラ遺伝子であって、該エンハンサーは、本明細書の図面の図６の配
    列番号１、エンハンサー活性を有する配列番号１のサブ配列、本明細書の図面の図７の配
    列番号２、及び、配列番号１由来のヌクレオチド塩基対配列である−３８８〜１７９から
    なる群の１以上から選択される単離された配列であるキメラ遺伝子。
  18. 前記キメラ遺伝子が１を上回る前記エンハンサー及び１を上回るプロモーターを含む、請
    求項１７に記載のキメラ遺伝子。
  19. 前記エンハンサーが複数のエンハンサーを含んでなる、請求項１７に記載のキメラ遺伝子
    。
  20. 前記エンハンサーが前記プロモーターに作動的に結合し、該エンハンサーは、正常の方向
    または逆方向である請求項１７又は１８に記載のキメラ遺伝子。
  21. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸の１以上を用いることにより、１以上の遺伝子
    の発現が高められた植物。
  22. 形質転換された植物が双子葉植物種又は単子葉植物種である請求項２１に記載の植物。
  23. 前記植物がジャガイモ、タバコ、綿、レタス、メロン、カボチャ、キュウリ、エンドウマ
    メ、セイヨウアブラナ、大豆、甜菜、ヒマワリ、コムギ、オオムギ、ライムギ、コメもし
    くはトウモロコシである、請求項２２に記載の植物。
  24. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を用いて形質転換された植物の珠芽。
  25. 請求項５〜１６のいずれか１項の方法の結果として発現が高められた遺伝子を有する細胞
    。
  26. 請求項１〜４のいずれか１項の核酸を有する細胞。
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