JP3928848B2 - 特定のクラスのダイズ種子タンパク質遺伝子の抑制 - Google Patents
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本発明は種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現がトランスジェニック植物の種子貯蔵タンパク質特性(profile)の変化をもたらすように改変されているトランスジェニックダイズ系統の構築に関する。そのように改変されたトランスジェニックダイズ系統は独特で有益な機能特性を有する新規なダイズタンパク質製品の製造のために用いられる。
【0002】
【発明の背景】
ダイズ種子は乾量に基づいて35%から55%までのタンパク質を含有する。このタンパク質の大部分は貯蔵タンパク質であり、それは発芽中に加水分解され、発生中の実生により必要とされるエネルギー及び代謝中間体を与える。収穫され、家畜類の飼料として利用される場合にダイズ種子の貯蔵タンパク質は重要な栄養供給源である。さらに、ダイズはヒト消費のためのタンパク質の最も経済的な供給源であることが現在一般的に認識されている。ダイズタンパク質またはタンパク質単離物はすでに世界の様々な地域で食品のために広く用いられている。ダイズ種子中の貯蔵タンパク質の量及び質を向上するために多くの努力が捧げられている。
【0003】
大部分の植物種の種子は当該技術分野で種子貯蔵タンパク質として知られているものを含有する。これらはそれらの大きさ及び溶解性に基づいて分類されている(Higgins、T.J.(1984)Ann.Rev.Plant Physiol.35:191−221)。全てのクラスが全ての種で見いだされるわけではないが、大部分の植物種の種子は1クラスより多くからのタンパク質を含有する。通常、特定の溶解性または大きさのクラス内のタンパク質は同じ種内の異なるクラスのメンバーよりも他の種の同じクラスのメンバーに構造的に相関している。多くの種において、一定のクラスの種子タンパク質はしばしば多重遺伝子ファミリーによりコードされ、時折、それらのファミリーを配列相同性に基づいてサブクラスに分けることができるように複雑である。
【0004】
2種の主要なダイズ種子貯蔵タンパク質:グリシニン(11Sグロブリンとしても知られている)及びβ−コングリシニン(7Sグロブリンとしても知られている)がある。これらは合わせて種子の全タンパク質の70ないし80%または種子の乾量の25ないし35%を構成する。グリシニンは約360kDaの分子量を有する大きなタンパク質である。それはG1、G2、G3、G4及びG5と同定された(一般的にサブユニットと呼ばれる)5個の主要なアイソフォームの各種組み合わせからなるヘキサマーである。各サブユニットは今度はジスルフィド結合によりつながれた1個の酸性及び1個の塩基性ポリペプチドからなる。単一のサブユニットの酸性及び塩基性ポリペプチドの両方が単一の遺伝子によりコードされる。従って、5個のグリシニンサブユニットをコードする5個の非対立遺伝子がある。これらの遺伝子はGy1、Gy2、Gy3、Gy4及びGy5と命名され、それぞれサブユニットG1、G2、G3、G4及びG5に対応する(Nielsen、N.C.等(1989)Plant Cell 1:313−328)。
【0005】
グリシニンサブユニット遺伝子のゲノムクローン及びcDNAはシークエンスされており、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の類似性に基づいて2つの群に分かれる。群IはGy1、Gy2及びGy3からなり、一方、群IIはGy4及びGy5からなる。群内の遺伝子間には85%より高い類似性がある(すなわち、Gy1、Gy2及びGy3のヌクレオチドの少なくとも85%が同一であり、Gy4及びGy5のヌクレオチドの少なくとも85%が同一である)が、群Iと群IIの遺伝子間では42%ないし46%の類似性があるのみである。
【0006】
β−コングリシニン(7Sグロブリン)は150ないし240kDaの範囲の分子量を有するヘテロ糖タンパク質である。それはα、α’及びβと同定された3個の非常に負に荷電したサブユニットの各種組み合わせからなる。α及びα’サブユニットをコードする遺伝子のコーディング領域に相当するcDNAクローンはシークエンスされており、それらは類似した大きさのものであり、配列同一性は85%に限定される。しかしながら、βサブユニットのコーディング領域に相当するcDNAの配列はα及びα’cDNAよりほぼ0.5kb小さい。この欠失を除いて、α及びα’サブユニットに対する配列同一性は75−80%である。3クラスのβ−コングリシニンサブユニットがゲノムダイズ内のいくつかの領域に集まる全部で15のサブユニット遺伝子によりコードされる(Harada、J.J.等(1989)Plant Cell 1:415−425)。
【0007】
タンパク質濃縮物、単離物及び人造肉(textured protein)製品のような新規なダイズに基づく製品は伝統的な東洋のダイズに基づく食品を必ずしも受け入れない国々でますます利用される。しかしながら、食品用途におけるこれらの新規な製品の使用は、局所的嗜好及び製法条件に関連したタンパク質製品の機能特性による。過去10年にわたって、ダイズタンパク質の機能特性の理解にかなりの努力が向けられている。機能特性の例は水吸着パラメーター、湿潤性、膨潤、水分保持、溶解性、増粘、粘性、凝固、ゲル化特性及び乳化特性を含む。この研究の本体の大部分はβ−コングリシリン及びグリシニンタンパク質の個々の研究並びにこれらのタンパク質の各々が全体としてダイズタンパク質系にどのように影響を及ぼすかに集中している(Kinsel1a、J.E.等(1985)New Protein Foods 5:107−179;Morr、C.V.(1987)JAOCS 67:265−271;Peng、L.C.等(1984)Cereal Chem 61:480−489)。機能特性はタンパク質の物理化学特性に直接関係するので、β−コングリシリン及びグリシニンの構造的違いにより著しく異なる機能特性を有するこれら2つのタンパク質が生じる。熱凝集、乳化特性及び水分保持能力の違いが報告されている。さらに、ゲル化特性も同様に異なり、グリシニンはより大きい引張歪、応力及び剪断強度、より優れた溶媒保持能力並びにより低い濁度を有するゲルを形成する。しかしながら、現在製造されているダイズタンパク質製品はグリシニン及びβ−コングリシリンの両方のブレンドであり、それ故、グリシニン及びβ−コングリシリンの個々の特性のブレンドによる機能特性を有する。例えば、グリシニンは100℃に加熱されると約50%のタンパク質が可溶性凝集体に迅速に転化される。さらなる加熱は凝集体の増大及びそれらの沈殿を生じる。沈殿物はグリシニンの塩基性ポリペプチドからなり、酸性ポリペプチドは可溶性のままである。β−コングリシリンが存在すると塩基性ポリペプチドと可溶性複合体を形成することによりそれらの沈殿を防ぐ。熱変性が望ましいかどうかは意図される用途による。ただ1種または他の貯蔵タンパク質を含有するダイズタンパク質製品を製造できる場合、特定のダイズタンパク質に由来する特定の物理特性を必要とする製品が利用できるようになり、またはそれらは製造するためにより経済的である。
【0008】
過去20年にわたって、各種貯蔵タンパク質サブユニットの1種またはそれ以上を欠いているダイズ系統(ヌル突然変異)がダイズ胚原質で同定されるかまたは突然変異育種技術を用いて製造されている。突然変異事象を組み合わせる育種努力により、通常の約半分量のβ−コングリシニンを種子が含有するダイズ系統が生じている(Takahashi、K.等(1994)Breeding Science 44:65−66;Kitamura、J.(1995)JARQ 29:1−8)。β−コングリシニンの減少は3種の独立した劣性突然変異により制御される。グリシニンサブユニットヌル突然変異の組み換えにより、著しく減少した量のグリシニンを種子が含有する系統が生じている(Kitamura、J.(1995)JARQ 29:1−8)。ここでも、減少は3種の独立した劣性突然変異により制御される。上記の系統から作物栽培学的に生育できるダイズ変種で、種子がグリシニンまたはβ−コングリシニンのみを含有するものを開発することは時間がかかり、多大の費用を要する。各異種交配は3種の突然変異事象の独立した分離を生じる。さらに、各突然変異事象はホモの状態であることが必要である。高収率の作物栽培学的に優れたダイズ系統の開発は多世代にわたる非常に多数の子孫のスクリーニング及び分析を必要とする。
【0009】
アンチセンス技術が種子の特定の貯蔵タンパク質を減少するために用いられている。ブラシカ・ナプス(Brassica napus)において、ナピン(2Sアルブミン)及びクルシフェリン(11Sグロブリン)はそれぞれ全種子タンパク質の約25%及び60%を構成する2つの主要な貯蔵タンパク質である。ナピンタンパク質は16遺伝子までの大きな多重遺伝子ファミリーによりコードされ、いくつかのcDNA及びゲノムクローンがシークエンスされている(Josefsson、L.−G.等(1987)J.Biol.Chem 262:12196−12201;Schofield、S.及びCrounch、M.L.(1987)J.Biol.Chem.262:12202−12208)。これらの遺伝子はそれらのコーディング及び隣接領域の両方で90%より高い配列同一性を示す。クルシフェリン遺伝子ファミリーは同様に複雑であり、全部で8遺伝子を有する3サブファミリーを含んでなる(Rodin、J.等(1992)Plant Mol.Biol.20:559−563)。Kohno−Murase等((1994)Plant Mol.Biol.26:1115−1124)は、nap Aプロモーターにより導かれるnapA遺伝子を用いるナピンアンチセンス遺伝子を用いて種子がナピンをほとんどまたは全く含有しないトランスジェニック植物を構築できることを示した。
【0010】
同じグループ(Kohno−Murase等(1995)Theor et.Applied Genetics 91:627−631)は、nap Aプロモータの制御下でクルシフェリン遺伝子(cruA、α2/3アイソフォームをコードする)のアンチセンス型を発現することによりブラシカ・ナプスにおいてクルシフェリン(11Sグロブリン)を減少しようと試みた。この場合、結果はより複雑であった。クルシフェリンは配列同一性に基づいて3つのサブクラス(α1、2/3及び4)に分けられ、これらのクラスは各々相互に60−75%の配列同一性がある(Rodin、J.等(1992)Plant Mol.Biol.20:559−563)。α2/3アイソフォームをコードするアンチセンス遺伝子の発現はより低いレベルのα1及び2/3型を生じた。しかしながら、α4クラスの発現の減少はなかった。
【0011】
コメでは種子貯蔵タンパク質、グルテリンのレベルを減少するためにアンチセンス技術が用いられた。全長のアンチセンスグルテリンコーディング領域に機能的に連結された種子特異的グルテリンプロモータの発現はグルテリンタンパク質レベルの約25%の減少をもたらした(米国特許番号第5,516,668号)。
【0012】
【発明の要約】
本発明はダイズにおいてグリシニンまたはβ−コングリシニン(それぞれ、11Sまたは7Sグロブリン)種子貯蔵タンパク質の量を減少するための方法を提供する。一つの態様として、種子タンパク質遺伝子の7S−グロブリンクラスをコードする遺伝子の発現を抑制するために共抑制技術が用いられた。7Sグロブリンの2個(α及びα’)または3個全てのサブクラス(α、α’及びβ)をコードする遺伝子は、β−コングリシニンの単一のサブクラス(α)をコードする遺伝子の発現により抑制され、改変された種子貯蔵特性を有するダイズ系統を生じた。別の態様として、片方のみが種子タンパク質遺伝子である2個の全く異なる遺伝子を抑制するための方法が提示され、種子組成の複数の変化を与える。意外にも、発現がトランスジェニックダイズ種子の脂肪酸特性を変えるダイズ遺伝子のコーディング領域に機能的に連結されたダイズ種子貯蔵タンパク質のプロモーター領域を含んでなるキメラ遺伝子の発現により、2つの異なる表現型形質:種子貯蔵タンパク質特性及び種子油特性が同時に改変された。
【0013】
本明細書に教示されるダイズ種子貯蔵タンパク質の量を減少するための方法は以下の工程:
(a)(i)ダイズ種子の細胞において機能できるプロモーターをコードする核酸フラグメント、(ii)(i)のプロモーターに対してセンスまたはアンチセンスの向きに置かれたダイズ種子貯蔵タンパク質の全部または一部をコードする核酸フラグメント及び(iii)転写終結領域を含んでなるキメラ遺伝子を構築し、
(b)(a)のキメラ遺伝子をダイズ細胞中に導入することによりトランスジェニックダイズ細胞を作製し、そして
(c)工程(a)のキメラ遺伝子の発現を生じる条件下で工程(b)のトランスジェニックダイズ細胞を生育する
ことを含んでなり、ここで、工程(a)のキメラ遺伝子を含有しないダイズに比較した場合にダイズ種子貯蔵タンパク質サブユニットのあるクラスの1個またはそれ以上のメンバーの量が減少している。
【0014】
【発明の詳述】
配列表の説明:
以下の詳細な説明及び本出願の一部を形成する配列表から本発明をより完全に理解することができる。配列表は引用することにより本明細書に組み込まれる37C.F.R.1.822に定義されるようなアミノ酸の3文字コードを含む。
配列番号1はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のαサブユニットをコードする5'→3'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号2はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα’サブユニットをコードする5'→3'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号3はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のβサブユニットをコードする5'→3'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号4及び5はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする核酸フラグメントを単離するために用いられるPCRプライマーConS及びConl.4a(それぞれ)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号6及び7はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする核酸フラグメントを区別するために用いられるPCRプライマーCon.09及びCon.8(それぞれ)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号8及び9はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする全長cDNAを単離するために用いられるPCRプライマーConSa及びCon1.9a(それぞれ)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号10はβ−コングリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のα及びα’サブユニットをコードする全長cDNAを確認するために用いられるPCRプライマーCon.1.0のヌクレオチド配列を示す。
配列番号11、12及び13は群Iグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のGy1、Gy2及びGy3サブユニット(それぞれ)をコードする5'→3'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号14及び15は群IIグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のGy4及びGy5サブユニット(それぞれ)をコードする5'→3'ヌクレオチド配列を示す。
配列番号16、17及び18は群Iグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のサブユニットをコードするcDNAを単離するために用いられるPCRプライマーG1−1、G1−1039及びG1−1475(それぞれ)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号19、20及び21は群IIグリシニンダイズ種子貯蔵タンパク質のサブユニットをコードするcDNAを単離するために用いられるPCRプライマーG4−7、G4−1251及びG4−1670(それぞれ)のヌクレオチド配列を示す。
【0015】
添付図面において:
図1は本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドpML70の制限地図である。
図2は本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドpCW109の制限地図である。
図3は本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドpKS18HHの制限地図である。
図4はプラスミドpJo1の制限地図である。このプラスミドは植物転写単位KTiプロモーター/β−コングリシニンの欠失したαサブユニット/KTi3'末端をpKS18HHのBamHI部位にクローニングすることにより得られた。
図5はpJo1で形質転換された体細胞胚から抽出されたタンパク質のSDS−PAGEゲルである。
図6はプラスミドpBS43の制限地図である。このプラスミドはダイズβ−コングリシニンプロモーターの転写制御下にグリシンマックス(Glycine max)ミクロソームのデルタ−12デサチュラーゼをコードする核酸配列を含んでなる。
図7はpBS43で形質転換された植物より得られたダイズ種子から抽出されたタンパク質のSDS−PAGEゲルである。
図8はプラスミドpJo3の制限地図である。このプラスミドは植物転写単位KTiプロモーター/β−コングリシニンのαサブユニットの全長cDNA/KTi3'末端をpKS18HHのHindIII部位にクローニングすることにより得られた。
図9はプラスミドpRB20の制限地図である。このプラスミドは転写単位β−コングリシニンプロモーター/ファゼオリン3'末端をpKS18HHのHindIII部位にクローニングすることにより得られた。これは本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられる。
【0016】
生物学的寄託物
以下のプラスミドはAmerican Type Culture Collection(ATCC)、12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852にブダペスト条約の条件下で寄託されており、以下の登録番号を有する。
プラスミド 登録番号 寄託日
pJo1 ATCC97614 1996年6月15日
pBS43 ATCC97619 1996年6月19日
pJo3 ATCC97615 1996年6月15日
【0017】
定義
本開示の文脈上多数の用語が用いられる。「核酸」という用語は、糖、リン酸及びプリンまたはピリミジンのいずれかを含有するモノマー(ヌクレオチド)からなる、一本鎖または二本鎖であってもよい高分子をさす。「核酸フラグメント」は与えられた核酸分子の断片である。高等植物では、デオキシリボ核酸(DNA)が遺伝物質であり、一方、リボ核酸(RNA)はDNA中の情報のタンパク質への転移に関与する。「ゲノム」は生物の各細胞中に含まれる遺伝物質の全体である。「ヌクレオチド配列」という用語は、DNAまたはRNAポリマー中に取り込むことができる合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を場合により含有していてもよい、一本鎖または二本鎖であってもよいDNAまたはRNAポリマーの配列をさす。
【0018】
本明細書に用いられる場合、「相同な」という用語は2個の核酸分子のヌクレオチド配列間または2個のタンパク質分子のアミノ酸配列間の相関性をさす。そのような相同性の見積もりは当業者によく理解されているようなストリンジェンシーの条件下でのDNA−DNAもしくはDNA−RNAのいずれかのハイブリダイゼーション(Hames及びHiggins、編集(1985)Nucleic Acid Hybridisation、IRL Press、Oxford、U.K.)またはNeedleman等((1970)J.Mol.Biol.48:443−453)の方法のような2個の核酸またはタンパク質間の配列類似性の比較により与えられる。
【0019】
本明細書に用いられる場合、「本質的に類似した」はコードされるアミノ酸に変化を生じない塩基変化を含む可能性があるか、または1個もしくはそれ以上のアミノ酸を変える可能性があるがDNA配列によりコードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない塩基変化を含むDNA配列をさす。従って、本発明は特定の代表的な配列より多くを包含すると理解される。また、得られるタンパク質分子の機能特性を実質的に変えないサイレント変化を生じる配列中の欠失、挿入または置換のような配列の改変も意図される。例えば、遺伝暗号の縮重を反映するかまたは与えられた部位で化学的に同等なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の改変も意図され、従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンをグリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンのような別の疎水性アミノ酸残基をコードするコドンで置換することができる。同様に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のようなある負に荷電した残基の同種のものでの置換、またはアルギニンの代わりにリシンのようなある正に荷電した残基の同種のものでの置換を生じる変化も生物学的に同等な産物を生じると予想することができる。タンパク質分子のN末端及びC末端部分の変化を生じるヌクレオチド変化もタンパク質の活性を変えると予想されない。ある場合では、実際、タンパク質の生物学的活性に対する改変の影響を研究するために配列の突然変異体を作製することが望ましいことがある。コードされる産物の生物学的活性の保持の測定のように、提示される改変の各々は当該技術分野の慣例技術の十分範囲内である。さらに、本発明により包含される「本質的に類似した」配列を厳しい条件下(0.1×SSC、0.1%SDS、65℃)で本明細書に例示される配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても特定できることを当業者は認識する。
【0020】
「遺伝子」はコーディング領域の前(5'非コーディング)及び後ろ(3'非コーディング)の調節配列を包含する、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをさす。「天然の」遺伝子は天然に見いだされるそれ自体の調節配列を有する単離された遺伝子をさす。「キメラ遺伝子」は天然に見いだされない異種の調節及びコーディング配列を含んでなる遺伝子をさす。「内在性」遺伝子はゲノム中のその天然の位置に通常見いだされ、単離されていない天然の遺伝子をさす。「外来」遺伝子は宿主生物で通常見いだされないが、遺伝子導入により導入される遺伝子をさす。
【0021】
「コーディング配列」または「コーディング領域」は特定のタンパク質をコードするDNA配列をさし、非コーディング配列を除く。それは「遮断されないコーディング配列」を形成してもよく、すなわち、イントロンを欠いているか、または適切なスプライス連結部により境界を定められた1個もしくはそれ以上のイントロンを含んでもよい。「イントロン」は一次転写産物中に転写されるが、タンパク質に翻訳することができる成熟mRNAを生じるために細胞内でRNAの開裂及び再連結により除かれるヌクレオチド配列である。
【0022】
「開始コドン」及び「終止コドン」はタンパク質合成(mRNA翻訳)のそれぞれ開始及び鎖の終結を特定するコーディング配列中の3個の隣接するヌクレオチドの単位をさす。「読み枠」はアミノ酸配列をコードする開始及び終止コドン間のイントロンにより遮断されないコーディング配列をさす。
【0023】
「RNA転写産物」はRNAポリメラーゼが触媒するDNA配列の転写から生じる産物をさす。RNA転写産物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合にそれは一次転写産物と呼ばれ、またはそれは一次転写産物の転写後プロセシングから得られるRNA配列であってもよく、成熟RNAと呼ばれる。「メッセンジャーRNA(mRNA)」はイントロンを含まず、細胞によりタンパク質に翻訳することができるRNAをさす。「cDNA」はmRNAに相補的でそれから得られる二本鎖のDNAをさす。「センス」RNAはmRNAを含むRNA転写産物をさす。「アンチセンス」RNAは標的一次転写産物またはmRNAの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するRNA転写産物をさす。アンチセンスRNAの相補性は特定の遺伝子転写産物のあらゆる部分、すなわち、5'非コーディング配列、3'非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列とであってもよい。
【0024】
本明細書に用いられる場合、「好適な調節配列」は本発明の核酸フラグメントの発現を制御する、本発明の核酸フラグメントの上流(5')、内部または下流(3')に位置する天然またはキメラ遺伝子中のヌクレオチド配列をさす。「発現」という用語は、本発明に用いられる場合、細胞のタンパク質装置と連係して改変された表現型形質をもたらす本発明の核酸フラグメントから得られるセンス(mRNA)またはアンチセンスRNAの転写及び安定な蓄積をさす。遺伝子の発現は遺伝子の転写及び前駆体または成熟タンパク質へのmRNAの翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は標的タンパク質の発現を防ぐことができるアンチセンスRNA転写産物の生産をさす。「過剰発現」は通常または非形質転換生物における生産のレベルを上回るトラスジェニック生物における遺伝子産物の生産をさす。「共抑制」は外来及び内在性遺伝子の両方の発現の抑制をもたらす、内在性遺伝子に実質的に相同な外来遺伝子の発現をさす。「改変されたレベル」は通常または非形質転換生物のものと異なる量または割合のトラスジェニック生物における遺伝子産物の生産をさす。通常または非形質転換生物に比較してトラスジェニック生物において生産される遺伝子産物のレベルを改変することで本発明により意図される表現型の結果、すなわち、アンチセンス抑制または共抑制によりもたらされる遺伝子発現の減少を達成できることを当業者は認識する。
【0025】
「プロモーター」はRNAポリメラーゼ及び適切な転写のために必要な他の因子の認識を与えることによりコーディング配列の発現を制御する、通常そのコーディング配列の上流(5')の、遺伝子中のDNA配列をさす。人工DNA構築物において、アンチセンスRNAを転写するためにプロモーターを用いることもできる。また、プロモーターは生理的または発生条件に反応して転写開始の効力を制御するタンパク質因子の結合に関与するDNA配列を含んでもよい。また、エンハンサー成分を含んでもよい。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるDNA配列である。それはプロモーターの本来の成分かまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるために挿入された異種起源の成分であってもよい。「構成的プロモーター」は全ての組織でいつでも遺伝子発現を導くものをさす。本明細書に関係する「組織特異的」または「発生特異的」プロモーターは、それぞれ、葉もしくは種子のような特定の組織または初期もしくは後期胚発生のような組織の特定の発生段階でほとんど限定的に遺伝子発現を導くものである。
【0026】
「3'非コーディング配列」はポリアデニル化シグナル及びmRNAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができるあらゆる他の調節シグナルを含む遺伝子のDNA配列部分をさす。ポリアデニル化シグナルは通常、mRNA前駆体の3'末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【0027】
「機能的に連結された」という用語は、片方の機能がもう片方により影響を受けるように結合されている単一核酸分子上の核酸配列を指す。例えば、プロモーターが構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる(すなわち、構造遺伝子がプロモーターの転写制御下にある)場合、それはその構造遺伝子と機能的に連結されている。
【0028】
「形質転換」は宿主生物のゲノム中への核酸フラグメントの導入をさし、遺伝的に安定な継承をもたらす。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。
【0029】
本発明はトランスジェニック植物の種子貯蔵タンパク質特性の変化をもたらすように種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現が改変されているトランスジェニックダイズ系統の構築に関する。種子貯蔵タンパク質特性の改変により独特で有益な機能特性を有する新規なダイズタンパク質製品を製造することができる。
【0030】
植物における遺伝子発現はそのような植物において機能できる調節配列を用いる。植物における外来遺伝子の発現は確立されている(DeBlaere等(1987)Meth.Enzymol.153:277−291)。本発明のフラグメントの発現を導くために選択されるプロモーターの供給源は、標的種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現を減少することにより本発明を成し遂げるために十分な転写活性を有するならば重要ではない。好ましいプロモーターはカリフラワーモザイクウイルスにおいて19S及び35S転写産物を導くもの(Odell)J.T.等(1985)Nature 313:810−812;Hull等(1987)Virology 86:482−493)のような強力な構成的植物プロモーターを含む。特に好ましいプロモーターは種子特異的発現をさせるものである。種子特異的プロモーターの例は多くの植物において全種子タンパク質の90%までに相当することがある種子貯蔵タンパク質のプロモーターを含むがそれらに限定されない。種子貯蔵タンパク質は厳密に調節され、非常に組織特異的及び発生段階特異的にほとんど種子においてのみ発現される(Higgins等(1984)Ann.Rev.Plant Physiol.35:191−221;Goldberg等(1989)Cell 56:149−160)。さらに、異なる種子貯蔵タンパク質を種子発生の異なる段階で発現することができる。
【0031】
種子特異的遺伝子の発現は非常に詳細に研究されている(Goldberg等(1989)Cell 56:149−160及びHiggins等(1984)Ann.Rev.Plant Physiol.35:191−221)による概説を参照)。現在、トランスジェニック双子葉植物における種子貯蔵タンパク質遺伝子(天然またはキメラ)の種子特異的発現の多数の実施例があり、通例、時間的及び空間的発現パターンが維持されている。そのような実施例に用いられるプロモーターを本発明に影響を及ぼすために用いることができる可能性がある。これらはインゲンマメ β−ファゼオリン(Sengupta−Gopalan等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3320−3324;Hoffman等(1988)Plant Mol.Biol.11:717−729)、インゲンマメ レクチン(Voelker等(1987)EMBO J.6:3571−3577)、ダイズレクチン(Okamuro等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8240−8244)、ダイズクニッツ型トリプシンインヒビター(Perez−Grau等(1989)Plant Cell 1:095−1109)、ダイズβ−コングリシニン(Beachy等(1985)EMBO J.4:3047−3053)、エンドウマメ ビシリン(Higgins等(1988)Plant Mol.Biol.11:683−695)、エンドウマメ コンビシリン(Newbigin等(1990)Planta 180:461−470)、エンドウマメ レグミン(Shirsat等(1989)Mol.Gen.Genetics 215:326−331)、ナタネ ナピン(Radke等(1988)Theor.Appl.Genet.75:685−694)及びシロイヌナズナ 2Sアルブミン(Vandekerckhove等(1989)Bio/Technology 7:929−932)の双子葉植物からの遺伝子を含む。
【0032】
本発明の核酸フラグメントの発現に特に有用なものはクニッツ型トリプシンインヒビター(KTi;Jofuku等(1989)Plant Cell 1:1079−1093)、グリシニン(Nielson等(1989)Plant Cell 1:313−328)及びβ−コングリシニン(Harada等(1989)Plant Cell 1:415−425)のもののようないくつかのダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子からの異種起源のプロモーターである。異なる種子プロモーターが有する時間的調節の違いに注意を払わなければならないことを当業者は認識する。例えば、α−サブユニット遺伝子のプロモーターはβ−サブユニット遺伝子のものより数日前に発現され(Beachy等(1985)EMBO J.4:3047−3053)、従って、β−サブユニット遺伝子の使用はα−サブユニット発現を抑制するためには有用性が低いと思われる。
【0033】
同様に有用な可能性があるが、優先度が低いものは脂質または炭水化物生合成のような種子代謝の他の面に関与する遺伝子のプロモーターである。要約すると、十分な強さ及び適切な時間的発現パターンのあらゆるプロモーターを本発明を実施するために用いることができる可能性があることを当業者は容易に認識する。同様に、本発明の天然またはキメラの核酸フラグメントのプロモーター領域中にエンハンサーまたはエンハンサー様成分を導入することは、本発明を達成するために増加した発現をもたらす。これは35Sプロモーターに見いだされるもののようなウイルスのエンハンサー(Odell等(1988)Plant Mol.Biol.10:263−272)、オピン遺伝子からのエンハンサー(Fromm等(1989)Plant Cell 1:977−984)または本発明の核酸フラグメントに機能的に連結されたプロモーター中に置かれた場合に増加した転写をもたらすあらゆる他の供給源からのエンハンサーを含む。
【0034】
特に重要なものは構成的プロモーターに対して40倍の種子特異的増大を与えることができるβ−コングリシニンのα−サブユニットをコードする遺伝子から単離されたDNA配列成分である(Chen等(1989)Dev.Genet.10:112−122)。トランスジェニック植物においてプロモーターで種子特異的増大発現を達成するために当業者はこの成分を容易に単離し、それをあらゆる遺伝子のプロモーター領域内に挿入することができる。β−コングリシニン遺伝子と異なる時に通常発現されるあらゆる種子特異的遺伝子中にそのような成分を挿入することにより、種子発生中にトランスジェニック植物においてより長い期間その遺伝子の発現が生じる。
【0035】
本発明を成し遂げるためにポリアデニル化シグナル及び本発明の核酸フラグメントの適切な発現のために必要な可能性がある他の調節配列を与えることができるあらゆる3'非コーディング領域を用いることができる。これは天然の脂肪酸デサチュラーゼ、35Sまたは19Sカリフラワーモザイクウイルス転写産物からのようなウイルス遺伝子、オピン合成遺伝子、リブロース1,5−ビスホスフェートカルボキシラーゼまたはクロロフィルa/b結合タンパク質からの3'末端を含む。異なる3'非コーディング領域の有用性を教示する当該技術分野の多数の実施例がある。
【0036】
本発明の高等植物の細胞を形質転換する様々な方法を当業者は利用できる(欧州特許公開EP−A−第295,959号及びEP−A−第318,341号を参照)。そのような方法はアグロバクテリウム(Agrobacterium)種のTi及びRiプラスミドを利用する形質転換ベクターに基づくものを含む。これらのベクターのバイナリー型を用いることが特に好ましい。Ti由来のベクターは単子葉及び双子葉植物を初めとする多種多様な高等植物を形質転換する(Sukhapinda等(1987)Plant Mol.Biol.8:209−216;Potrykus、(1985)Mol.Gen.Genet.199:183)。外来DNA構築物の直接取り込み(欧州特許公開EP−A−第295,959号を参照)、エレクトロポレーションの技術(Fromm等(1986)Nature(London)319:791)または核酸構築物で被覆された金属粒子での高速弾動打ち込み(ballistic bombardment)(Klein等(1987)Nature(London)327:70)のような他の形質転換方法を当業者は利用できる。いったん形質転換されると、それらの細胞を当業者は再生することができる。特に関係するものはMcCabe等((1988)Bio/Technology 6:923−926)、Finer等((1991)In Vitro Cell.Dev.Biol.27:175−182)及びHinchee、M.A.W.((1988)Bio/Technology 6:915−922)を初めとする、ダイズを形質転換するために最近記述された方法である。いったんトランスジェニック植物が上記の方法のいずれかにより得られると、個々のトランスジェニック体を適切な表現型を最も効果的に示すものに関して選別することが必要である。同じ構築物を保有する個々のトランスジェニック植物が発現レベルにおいて異なる可能性があることは当業者によく知られており、この減少は一般的に「位置効果」と呼ばれる。従って、本発明において異なる個々の形質転換体が標的種子タンパク質の抑制の効果において異なる可能性がある。特定の遺伝子の発現を減少するためにアンチセンスまたは共抑制技術を用いることに特別な考慮が伴うことを当業者はよく理解している。米国特許番号第5,190,931号、第5,107,065号及び第5,283,323号はこれらの技術の実現可能性を示唆しているが、それらの有効性が予測できないことはよく知られている。当該技術分野は特定の遺伝子に対して最も有効である予測方法を教示していないので、従って、当業者は抑制される遺伝子の1種またはそれ以上の異なる部分を含有する多数の遺伝子構築物を作製する。さらに、最も有効な構築物でさえ、単離された個々のトランスジェニック系統の一部においてのみ効果的な抑制表現型を与える。例えば、国際特許公開WO第93/11245号及びWO第94/11516号は、カノラにおいて脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の発現を抑制しようと試みた場合に、実際の抑制が試験された系統の1%未満で得られたことを教示している。他の種ではパーセンテージは幾分高いが、いずれの場合でもパーセンテージは100に達しない。このことは本発明に対する制限としてではなく、代わりに当業者により理解され、前以て考慮される実際問題として考えられるべきである。従って、当業者は非常に多数の形質転換体をスクリーニングするための方法を開発する。通常、これらのスクリーニングの種類は実際の場で選択され、本発明の固有の部分ではない。サンプルの大部分が陰性であると予想されるので、好ましい方法は非常に多数のサンプルを迅速に処理することができるものである。
【0037】
共抑制の機構は不明のままであり(一つの概説及び考察として、Flavell、R.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3490−3496を参照)、それ故、必要な場合にそれを誘導するための厳密な条件もはっきりしない。文献で見いだされる大部分の実施例は適切な反応を引き起こすために共抑制される遺伝子の転写領域の全部または大部分の使用を含む。しかしながら、少なくとも一つの場合(Brusslan等(1993)Pl ant Cell 5:667−677:Brusslan及びTobin(1995)Plant Mol.Biol.27:809−813)、シロイヌナズナのcab140遺伝子の場合で、全く関係のない遺伝子に融合された(1.3kbフラグメントとしての)プロモーター及びわずか14bpの転写領域の使用が内在性cab140遺伝子及び導入されたキメラ遺伝子の共抑制を生じるために十分であった。多数の他のプロモーター−リーダー(5'非翻訳リーダーは転写の開始と翻訳開始コドンの間の領域として定義される)単位がキメラ遺伝子を導くためにうまく用いられているので、この結果は例外的で明らかに全く予測できない。Flavellは(種子タンパク質をコードするもののような多重遺伝子ファミリーのメンバーを初めとする)いくつかまたは多数の遺伝子は共抑制の機構を回避するように進化した可能性があり、一方、別のものはそうではなく、ゲノムが進化するにつれて可能性のあるさらなるレベルの調節を生じると予測する。従って、コングリシニン遺伝子のプロモーター及びリーダーを用いて内在性コングリシンの発現を抑制することができ、一方、(開始コドンを越える)導入遺伝子の他の部分を用いて全く関係のない遺伝子を抑制することができる本結果は独特である。
【0038】
【実施例】
本発明は以下の実施例によりさらに特定される。これらの実施例は例示のためだけに与えられ、本発明は実施例に記述される用途に限定されないと理解される。改変されたレベルの各種種子貯蔵タンパク質を有するトランスジェニックダイズ植物を生成するために本発明を用いることができる。上記の説明及び以下の実施例から当業者は確認することができ、そして本発明をその趣旨及び範囲からそれずに様々に変形及び改変し、それを各種用途及び条件に適用することができる。全てのそのような改変は意図される請求の範囲内に入ると考えられる。
【0039】
制限エンドヌクレアーゼ酵素、他の修飾酵素の使用、アガロースゲル電気泳動、核酸ハイブリダイゼーション及びプラスミドDNAでの大腸菌の形質転換のようなDNA操作の詳細な方法はSambrook等(1989)Molecular Cloning、A Laboratory manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(以下、「Maniatis」)に記述されている。全ての制限酵素及び他の修飾酵素をGibco BRL(Gaithersburg、MD)から購入した。
【0040】
実施例1
発生中のダイズ子葉におけるβ−コングリシニンの発現が共抑制の標的となり得るかどうかを決定するために、β−コングリシニンのα及びα’サブユニットの欠失cDNAフラグメントを逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応キット(GeneampTM(商標)RNAPCRキット:Perkin Elmer Cetus)を用いて調製した。上流プライマーConSはEMBL/GenBank/DDBJデータベースから得られたα及びα’サブユニットcDNA配列のヌクレオチド5−19に相同である。クローニングを容易にするために、NcoI制限部位をコードするようにさらなるヌクレオチドを5'末端に付加した。下流プライマーCon1.4aは、それぞれα及びα’cDNAの配列に相当する配列番号1のヌクレオチド1370−1354及び配列番号2の1472−1456に相補的である。クローニングを容易にするために、KpnI制限部位を導入するようにさらなるヌクレオチドを5'末端に付加した。PCRプライマーConS及びCon1.4aのヌクレォチド配列を以下に示す。
【0041】
発生中のダイズ種子から単離されたRNAをキットに供給されるランダムヘキサマーまたはCon1.4aのいずれかを用いて製造業者のプロトコルに従って逆転写した。得られたcDNAフラグメントをConS及びCon1.4aの混合物を用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)反応で増幅した。反応物濃度は製造業者のプロトコルに記述されたとおりであった。以下のプログラム:a)95℃で2分を1サイクル;b)50℃で1.5分(アニーリング)、70℃で5分(伸長)、95℃で1.5分(変性)を35サイクル;及びc)50℃で2分を1サイクル、続いて68℃で10分を用いた。PCR反応混合物の各々の15μLをアガロースゲル電気泳動で分析した。反応は予想される大きさ:α’には1.47kbそしてαには1.37kbのPCR産物を生じた。反応混合物の残りから欠失cDNAフラグメントをWizardTM(商標)PCRPreps DNA精製システムキット(Promega)を用いて精製した。
【0042】
用いたプライマーのために5'末端にNcoI制限部位及び3'末端にKpnI制限部位を含むα及びα’フラグメントを含有する精製された反応混合物をKpnI及びNcoI制限酵素で消化した。α cDNAフラグメントをゲル電気泳動後に回収し、フラグメントF8と称し、pCW109(図1)及びpML70(図2)中に両プラスミドに存在するNcoI−KpnI部位を用いて指向的(センス方向)にクローン化した。Cons及びCon1.4aの内側のネスティッドプライマー組(Con.09及びCon.8)を用いてPCRによりF8をαと確認し、pCW109/F8プラスミドをHindIII、NcoI、KpnI及びPstIで消化することによりα’と区別した(αはPstI部位を含まず、一方、α’は含む)。
【0043】
BamHIでの制限消化によりプラスミドPML70/F8から転写単位KTiプロモーター/欠失α/KTi3'末端を遊離し、ゲル単離し、F11と称した。次に、F11をBamHI部位でpKS18HH(図3)中にクローン化した。pKS18HHは以下の遺伝子成分:(i)T7プロモーター/ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(HPT)/T7ターミネーター配列;(ii)カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)からの35Sプロモーター/ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(HPT)/アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)T−DNAからのノパリンシンターゼ(NOS)3';及び(iii)β−ラクタマーゼコーディング領域が除かれたpSP72プラスミドベクター(Promega)を含有するプラスミド構築物である。分子生物学の分野の当業者はよく知られているプロトコル(Maniatis)を用いて単一のプラスミドベクター中に上記の3成分を連結することができる。
【0044】
ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子をクレブシエラ菌由来のプラスミドpJR225(Gritz L.及びDavies J.(1983)Gene 25:179−188)を含有する大腸菌株W677からPCR増幅により単離した。pKS18HHはダイズのような植物におけるHPT酵素の構成的発現のためにCaMV 35S/HPT/NOSカセットを含有する。また、pKS18HHプラスミドは(lacUV5制御下にT7RNAポリメラーゼ遺伝子を保有する)ラムダDE3に溶原性であるNovaBlueTM(DE3)(商標)(Novagen)のような大腸菌のある株におけるHPT酵素の発現のためにT7プロモーター/HPT/T7ターミネーターカセットも含有する。pKS18HHはこのベクター中に遺伝子をクローニングするために好適な3種の唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位も含有する。
【0045】
従って、pKS18HHプラスミドベクタ−は大腸菌及び植物の両方で選択のためにハイグロマイシンBを用いることができる。HindIIIでの消化によりF11フラグメントの挿入及び方向を確認した。F11フラグメントを右回りの向きに含むクローンを選択し、pJo1(図4)と称した。
【0046】
体細胞胚培養物の形質転換
ダイズ体細胞胚の形質転換及び増殖のために以下のストック溶液及び培地を用いた。
【0047】
【表1】
【0048】
ダイズ胚懸濁培養物を16/8時間の昼/夜スケジュールを与える蛍光及び白熱灯の混合を用いて28℃で回転式振盪機(150rpm)で35mLの液体培地(SB55)中で維持した。約35mgの組織を35mLの液体培地中に接種することにより培養物を2ないし3週毎に継代培養した。
【0049】
ダイズ胚懸濁培養物をパーティクルガン打込みの方法(Klein等(1987)Nature 327:70)によりpJo1で形質転換した。DuPont BiolisticTM(商標)PDS1000/He装置をこれらの形質転換のために用いた。
【0050】
5μLのpJo1プラスミドDNA(1μg/μL)、50pL CaCl2(2.5M)及び20μLスペルミジン(0.1M)を50μLの60mg/mL 1mm金粒子懸濁液に添加した。粒子調製物を3分間撹拌し、微量遠心機(microfuge)で10秒間回転させ、上清を除いた。次に、DNAで被覆された粒子を400μLの70%エタノールで1回洗浄し、40μLの無水エタノールに再懸濁した。DNA/粒子懸濁液を各1秒間3回超音波処理した。次に、5μLのDNA被覆金粒子を各マクロ担体ディスク上に添加した。
【0051】
約300ないし400mgの2週齢の懸濁培養物を空の60mm×15mmペトリ皿に置き、残っている液体をピペットで組織から取り除いた。組織を保持スクリーンから約3.5インチ離して置き、2回打込んだ。膜破壊圧力を1000psiに設定し、室を−28インチのHgまで排気した。実験当たり構築物当たり2枚のプレートに打込んだ。打込み後に組織を半分に分け、液体培地中に戻し、上記のように培養した。
【0052】
打込みの15日後に液体培地を50mg/mLハイグロマイシンを含有する新しいSB55に交換した。選択培地を毎週新しくした。打込みの6週後に緑色の形質転換された組織を単離し、フラスコに接種して新しい形質転換された胚懸濁培養物を生成させた。
【0053】
形質転換された胚培養物を液体培養培地から取り出し、0.5%の木炭を加えた固体寒天培地SB103上に置いて成熟を開始した。1週後に木炭を欠いたSB103培地に胚を移した。SB103培地上で3週後に成熟中の胚を分離し、SB148培地上に置いた。胚成熟中の条件は16/8時間の昼/夜スケジュールを与える蛍光及び白熱灯の混合を用いて26℃であった。SB148培地上で6週後に胚をβ−コングリシニンサブユニットタンパク質の発現に関して分析した。各胚集団は5ないし20個の体細胞胚を生じた。
【0054】
形質転換された体細胞胚の分析
SDS−PAGEゲル電気泳動により体細胞胚成熟中にいつβ−コングリシニンのα、α’及びβサブユニットを可視化することができるかを決定するために最初の実験を実施した。(打込みを受けなかったことを除いて上記のように生成された)非形質転換胚の子葉を成熟を開始した後6、8、10及び12週で胚から切断し、分析するまで−80℃で凍結保存した。子葉組織の重さを量り、組織1mg当たり10μLの抽出バッファーを添加し、ペレット乳棒使い捨てミキサー(Pellet Pestle Disposable Mixer)(Kimble/Kontes)で組織をすりつぶした。抽出バッファーは50mMTris−HCl(pH 7.5)、10mM β−メルカプトエタノール(βME)及び0.1%SDSからなった。次に、サンプルを12,000rpmで10分間微量遠心分離し、上清をピペットで新しい微量遠心管へ取り出した。使用するまで抽出物を−20℃で凍結保存した。
【0055】
SDS−PAGE分析のために8μLの(2×)ローディングバッファーを8μLのサンプル抽出物に添加した。(2×)ローディングバッファーは100mM Tris−HCl(pH7.5)、4%SDS、0.2%ブロモフェノールブルー、15%グリセロール及び200mM βMEからなった。混合物を95℃で4分間加熱した。次に、サンプル混合物を微量遠心分離し(12,000rpm、20秒間)、ミニ−プロテインII電気泳動セル(mini−Protein II Electrophoresis Cell)(Bio−Rad)中に取り付けられた10%プレキャストReady GelTM(商標)(Bio−Rad)上に添加した。Bio−Rad Tris/グリシン/SDSバッファーを泳動バッファーとして用い、電圧は一定の125Vであった。サンプル抽出物に加えて、各ゲルは分子量標準(Bio−Rad SDS−PAGE標準、低範囲)を含有する1レーン及び市販の脱脂ダイズ粉から抽出された全ダイズ種子タンパク質を含有する1レーンを含んだ。終了時にタンパク質を可視化するためにゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色した(Maniatis)。ゲルの写真をとり、水を含むシールバッグに入れ、冷蔵庫で保存した。結果は、成熟の開始後8ないし10週の間で体細胞胚の子葉においてβ−コングリシニンのα、α’及びβサブユニットを検出できることを示した。
【0056】
上記の方法を用いて成熟の開始後10週で形質転換された胚の分析を実施した。クローン当たり2個の胚をまず分析した。これら2個の胚でβ−コングリシニンサブユニットの抑制が観察された場合はさらなる胚を分析した。表1にこの分析の結果を示し、ここで、各β−コングリシニンサブユニットの存在または欠如はそれぞれ(+)または(−)で示される。
【0057】
【表2】
【0058】
7個のトランスジェニッククローンが、α及びα’発現が抑制された胚を生じた。さらに、1個のクローン(Jo1−4)は3種全てのβ−コングリシニンサブユニットが抑制された胚を生じた。欠失したα導入遺伝子配列は全部で1.32kbのβサブユニットcDNAの0.75kbの部分のみと重複するので、この結果は意外である。全体的に見て、欠失したα導入遺伝子とβサブユニットcDNAの間には52%の類似性があるだけである。知るかぎりでは、欠失したα導入遺伝子はβ−コングリシニン遺伝子のβサブユニットを「共抑制」するために十分な構造の類似性を有すると考えられない。
【0059】
SDS−PAGE分析の例を図5に示す。レーン1−3はクローンJo1−1より生じた胚から切断された3枚の子葉の抽出物である。レーン4及び5はそれぞれタンパク質分子量標準及び種子から得られたダイズタンパク質標準である。レーン6−8はクローンJo1−4より生じた胚から切断された子葉の抽出物である。レーン2のタンパク質パターンはα及びα’の両方が共抑制されている胚の例である。レーン6及び8のタンパク質パターンはβ−コングリシニンを構成する全てのサブユニットが抑制されている胚の例である。
【0060】
実施例2
β−コングリシニンプロモーター領域を用いる共抑制により発生中の子葉においてβ−コングリシニンの発現を抑制することができるかどうかを決定するために、ダイズβ−コングリシニンプロモーター(Beachy等、(1985)EMBO J.4:3047−3053)の制御下にグリシンマックスミクロソームのデルタ−12デサチュラーゼcDNA(GmFad2−1)配列(Heppard等、(1996)Plant Physiol.110:311−319;ジーンバンク登録番号L43920)を含有するpBS43と称するプラスミドを構築した。このベクターの構築は以下のプラスミド:pMH40、pCST2及びBS13を用いることにより促進された。以下に詳しく述べられるプラスミド構築物は米国特許出願番号USSN第08/262,401号及び国際特許公開番号WO第94/11516号に部分的に記述されており、それらの両方は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【0061】
pMH40ベクターは、大腸菌からのβ−グルクロニダーゼ遺伝子に連結されたCaMVからの1.4kb35Sプロモーター領域(Odell等(1985)Nature 303:810−812;Harpster等(1988)Mol.Gen.Genet.212:182−190)を挿入することにより市販されているクローニンベクター、プラスミドpGEM9z(Promega Biotech)から得られた。これは酵素β−グルクロニダーゼ(Jefferson等(1986)PNAS USA 83:8447−8451)をコードする1.85kbフラグメント及びアグロバクテリウムツメファシエンス(Fraley等(1983)PNAS USA 80:4803−4807)のTi−プラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子からの転写ターミネーターを含有する0.3kb DNAフラグメントであった。
【0062】
ベクターpCST2はベクターpML18及びpCW109Aから得られた。プラスミドpCW109Aはダイズβ−コングリシニンプロモーター配列及びファゼオリン3'非翻訳領域を含有し、市販されているプラスミドpUC18(Gibco−BRL)から得られたベクターpCW109の改変された型である。ベクターpCW109はクローニンベクターpUC18のHindIII部位にβ−コングリシニン遺伝子の(プロモーター領域を含む)555bpの5'非コーディング領域並びにそれに続くNcoI、SamI、KpnI及びXbaIの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するマルチクローニング配列を挿入し、次にそのHindIII部位に1174bpの共通のインゲンマメ ファゼオリン3'非翻訳領域を挿入することにより作製された。用いられるβ−コングリシニンプロモーター領域は27ヌクレオチドの位置での違いのために公表されたβ−コングリシニン遺伝子(Doyle等、(1986)J.Biol.Chem.261:9228−9238)の対立遺伝子である。この遺伝子のさらなる配列の記述を国際特許公開WO第91/13993号に見いだすことができる。
【0063】
アンチセンス構築物における使用を容易にするために、NcoIでの消化、マングビーンエキソヌクレアーゼ消化及び平滑部位の再連結によりプラスミドpCW109中のNcoI部位及び可能性のある翻訳開始部位を破壊して改変プラスミドpCW109Aを生ぜしめた。
【0064】
ベクターpML18は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Beck等(1982)Gene 19:327−336)の発現を導く非組織特異的で構成的なカリフラワーモザイクウイルス(35S)プロモーター(Odell等、(1985)Nature 313:810−812;Hull等(1987)Virology 86:482−493)及びそれに続くヌクレトチド848〜1550を含むノパリンシンターゼ遺伝子の3'末端(Depicker等(1982)J.Appl.Genet.1:561−574)からなる。この転写単位を市販のクローニンベクターpGEM9z(Gibco−BRL)中に挿入し、それは35Sプロモーターの5'末端で制限部位SalI、XbaI、BamHI及びSmaIにその順で隣接する。さらなるSalI部位がNOS 3'配列の3'末端に存在し、XbaI、BamHI及びSalI部位は唯一である。XbaI部位を除くために、プラスミドpML18をXbaIで消化し、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いて一本鎖の末端を埋め、生成物を連結した。得られたプラスミドをpBS16と称した。
【0065】
プラスミドpCW109AをHindIIIで消化し、β−コングリシニン/アンチセンスデルタ−12デサチュラーゼcDNA/ファゼオリン3'非翻訳領域を含有する得られた1.84kbフラグメントをゲル単離した。この1.84kbフラグメントをpBS16のHindIII部位中に連結した。適切な向きにインサートを含有するプラスミドはKpnIで消化した場合に3.53kb及び4.41kbフラグメントを生じ、このプラスミドをpCST2と称した。
【0066】
ダイズミクロソームのデルタ12−デサチュラーゼをコードし、ジーンバンク登録番号L43920に開示されるような配列を保有するGmFad2−1 cDNAの供給源としてベクターpBS13を用いた。ベクターpBS13はベクターpML70(図1)から得られ、それはKTi3プロモーター及びKTi33'非翻訳領域を含有し、市販されているベクターpTZ18R(Pharmacia)から中間プラスミドpML51、pML55、pML64及びpML65を経て得られた。5'非翻訳領域の2039ヌクレオチド全て及びJofuku(Jofuku及びGoldberg(1989)Plant Cell1:1079−1093)に記述された配列の塩基755〜761に相当するEcoRI部位で終わるKTi3遺伝子のコーディング配列の390塩基を含有する、完全なダイズKTi3遺伝子(Johuku及びGoldberg、上記)の2.4kb BstBI/EcoRIフラグメントをpTZ18RのAccI/EcoRI部位に連結してプラスミドpML51を作製した。KTi3インサートの5'非翻訳領域の真ん中のNcoI部位を破壊するためにプラスミドpML51をNcoIで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いて一本鎖の末端を埋め、生成物を再連結してプラスミドpML55を生ぜしめた。プラスミドpML55をXmnI/EcoRIで部分消化して上に引用した配列の塩基732〜755に相当する0.42kbフラグメントを遊離し、それを廃棄した。XmnI部位(5'−TCTTCC−3')及びNcoI部位(5'−CCATGGG−3')それに直接続くEcoRI部位の一部(5'−GAAGG−3')のコーディング配列からなる相補的な合成オリゴヌクレオチドのダイマーを作製することによりNcoI部位を含有する合成のXmnI/EcoRIリンカーを構築した。XmnI及びNcoI/EcoRI部位を短い介在配列(5'−ATAGCCCCCCAA−3')で連結した。この合成リンカーを4.94kbフラグメントのXmnI/EcoRI部位に連結してプラスミドpML64を作製した。プライマーML51及びML52を用いて標準的なPCRプロトコル(Perkin Elmer Cetus、GeneAmp PCRキット)によりJofuku(上記)に記述された配列からKTi3遺伝子の3'非翻訳領域を増幅した。プライマーML51は上に引用した配列の塩基1072〜1091に相当する20ヌクレオチドを含有し、プライマーの5'末端にはEcoRV(5'−GATATC−3')、NcoI(5'−CCATGG−3')、XbaI(5'−TCTAGA−3')、SmaI(5'−CCCGGG−3')及びKpnI(5'−GGTACC−3')部位に相当するヌクレオチドが付加されている。プライマーML52は上に引用した配列の塩基1242〜1259に相当するヌクレオチドの完全な相補物を含有し、プライマーの5'末端にはSmaI(5'−CCCGGG−3')、EcoRI(5'−GAATTC−3')、BamHI(5'−GGATCC−3')及びSalI(5'−GTCGAC−3')部位に相当するヌクレオチドが付加されている。PCR増幅されたKTi3遺伝子の3'末端をpML64のNcoI/EcoRI部位に連結してプラスミドpML65を作製した。PstI(5'−CTGCA−3')、SalI(5'−GTCGAC−3')、BamHI(5'−GGATCC−3')及びPstI(5'−CTGCA−3')部位からなる相補的な合成オリゴヌクレオチドのダイマーを作製することにより合成のマルチクローニング部位リンカーを構築した。そのリンカーをpML65のPstI部位(KTi3プロモーター領域の直接5')に連結してプラスミドpML70を作製した。
【0067】
ダイズデルタ−12デサチュラーゼcDNA、GmFad2−1(ジーンバンク登録番号L43920)からの1.46kb SmaI/KpnIフラグメントをpML70の対応する部位に連結してプラスミドpBS10を生ぜしめた。デサチュラーゼcDNAフラグメントはpBS10中のKTi3プロモーターに対して逆(アンチセンス)向きであった。プラスミドpBS10をBamHIで消化し、KTi3プロモーター/アンチセンスデサチュラーゼcDNA/KTi33'末端転写単位に相当する3.47kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。ベクターpML18は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Beck等(1982)Gene 19:327−336)の発現を導く非組織特異的で構成的なカリフラワーモザイクウイルス(35S)プロモーター(Odell等、(1985)Nature 313:810−812;Hull等、(1987)Virology 86:482−493)及びそれに続くヌクレオチド848〜1550を含むノパリンシンターゼ遺伝子の3'末端(Depicker等(1982)J.Appl.Genet.1:561−574)からなる。この転写単位を市販のベクターpGEM9z(Gibco−BRL)に挿入し、それは35Sプロモーターの5'末端で制限部位SalI、XbaI、BamHI及びSmaIにその順で隣接する。さらなるSalI部位がNOS 3'配列の3'末端に存在し、XbaI、BamHI及びSalI部位は唯一である。pBS10から遊離された3.47kb転写単位をベクターpML18のBamHI部位に連結した。得られたプラスミドをSmaI及びKpnIで消化した場合に適切な向きにインサートを含有するプラスミドは5.74、2.69及び1.46kbの3フラグメントを生じた。正しい向きに転写単位を含むプラスミドを選択し、pBS13と称した。
【0068】
pBS13(上記)からの1.46kb XbaI/EcoRVフラグメントをベクターpCST2(上記)のSmaI/XbaI部位に指向的にクローン化してpBS39と称するプラスミドを生ぜしめた。プラスミドpBS39の3.3kb HindIIIフラグメントをプラスミドpMH40(上記)のHindIII部位にクローン化して植物発現ベクターpBS43(図6)を生ぜしめた。
【0069】
ベクターpBS43でのダイズの形質転換及びトランスジェニック「トランスイッチ(Transwitch)」系統の同定
ダイズ分裂組織のパーティクル打込みの方法(Christou等(1990)Trends Biotechnol.8:145−151)を用いてベクターpBS43をダイズ分裂組織中に形質転換した。形質転換された植物(すなわち、GUS活性に関して陽性と同定された植物から)の種子を脂肪酸組成に関して選別した。脂肪酸メチルエステルを少量(約10mg)の種子片のヘキサン抽出物から調製した(Browse等(1986)Anal.Biochem.152:141−145)。10個の異なるトランスジェニック系統からの種子片を分析し、260−05と称するこれらの系統の1つからのR1種子のいくつかはコントロール種子の約20%に比較して80−85%の全オレイン酸含有量であった。この表現型は内在性Fad2−1遺伝子の共抑制により引き起こされ、「トランスイッチ遺伝子座」(Kinney、A.J.(1995)「Induced Mutations and Molecular Techniquesfor Crop Improvement」中、International Atomic Energy Agency、Vienna)と呼ばれるダイズゲノムの遺伝子座への2コピーのpBS43の挿入の結果である。トランスイッチ遺伝子座を含有する系統260−05からの高オレイン酸R1種子を自殖させ、トランスイッチ遺伝子座がホモであるR2種子を選択した。これらのR2ホモ種子の2つ(G94−1、G94−19)並びにG94−1及びG94−19のさらなる世代から得られた種子(R3、R4、R5)をさらなる分析のために選択した。
【0070】
アイオワ及びプエルトリコの両方で生育されたG94−1及びG94−19植物のR5種子をひいて粉末にし、約1gを5mLのヘキサンで抽出した。遠心分離後にヘキサンを注ぎ出し、フラスコを風乾させた。約10mgの脱脂粉末を上記のように抽出し、SDS−PAGEで分析した。両方の場所から得られた両方のトランスジェニック系統において、β−コングリシニンのα’及びαサブユニットの発現はコントロールダイズ系統及び標準的なダイズ粉に比較して抑制されていた(図7)。
【0071】
実施例3
アンチセンス技術を用いてβ−コングリシニン発現を抑制できるかどうかを試験するために、上記のように逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いてα及びα’の全長cDNAを作製した。上流プライマーConSaはα及びα’の両方のcDNA配列の領域4−19に相同であり、KpnI制限部位をコードするようにさらなるヌクレオチドが5'末端に付加されている。用いた下流プライマーCon1.9aはαアイソフォームに相当する配列番号1の領域1818−1801及びα’アイソフォームに相当する配列番号2の1920−1903にそれぞれ相同である。次のクローニング工程を容易にするために、NcoI制限部位をコードするようにさらなるヌクレオチドを5'末端に付加した。
【0072】
逆転写及び次のPCR反応を上記のように実施した。発生中のダイズ種子から単離されたRNAをランダムヘキサマーまたはCon1.9aのいずれかを用いて逆転写した(上に詳細に記述したような方法)。上に詳細に記述したプロトコルを用いてConSa及びCon1.9aを用いてPCR反応でcDNAを増幅した。15μLのPCR反応混合物をアガロースゲル電気泳動で分析した。αに対して予想される分子量の1.8kbバンドが観察された。残りの反応混合物をWizardTM(商標)PCR Preps DNA精製システムキット(Promega)を用いて精製した。用いたプライマーのために5'末端にKpnI部位及び3'末端にNcoI部位を含むα cDNAをNcoI及びKpnI制限酵素で消化した。得られたα cDNAをゲル単離し、F10と称し、pCW109中にプラスミドに存在するNcoI及びKpnI部位を用いて指向的(アンチセンス方向)にクローン化した。ネスティッドプライマー(上流:Con.09(配列番号6);下流:Con1.4a(配列番号5)及びCon1.0(配列番号10))を用いてPCRによりF10をαと確認した。
【0073】
HindIIIでの部分消化によりpCW109/F10から転写単位β−コングリシニンプロモーター/α cDNAアンチセンス/ファゼオリン3'末端を遊離した。部分消化の条件は6フラグメント(5.1kb、3.8kb、3.6kb、2.6kb、2.4kb及び1.2kb)を生じるようにであった。転写単位を含有する3.6kbフラグメントをゲル単離し、F14と称した。次に、F14をpKS18HHのHindIIIにクローン化した。形質転換された細胞から作製したプラスミドDNA調製物のHindIIIでの消化により挿入を確認した後、陽性培養物からのプラスミドDNAをKpnIで消化してそれらがpCW109/F10のHindIIIでの部分消化からの3.6kb F14フラグメントを含有するが3.8kbフラグメントを含有しないことを確かめた。F14はKpnI部位を含むが、一方、3.8kbフラグメントは含まない。確認時にpKS18HH/F14をpJo3(図8)と称した。ダイズ胚懸濁培養物を上に詳細に記述したようにpJo3で形質転換した。形質転換は5個の形質転換されたクローンを生じ、成熟時に各クローンは4ないし8個の体細胞胚を生じた。
【0074】
形質転換された体細胞胚のタンパク質抽出物を先に詳細に記述したようにSDS−PAGEにより分析した。結果を表2に示す。トランスジェニッククローンは全てα及びα’の両方の発現が抑制されている少なくとも1個の体細胞胚を生じた。
【0075】
【表3】
【0076】
実施例4
グリシニンサブユニットをコードする5個の非対立遺伝子がある。ゲノムクローン及びcDNAのシークエンシングからこれらのサブユニット遺伝子は配列類似性に基づいて2つの群に分けられる。群IはGy1(配列番号11)、Gy2(配列番号12)及びGy3(配列番号13)からなり、一方、群IIはGy4(配列番号14)及びGy5(配列番号15)からなる。群内の遺伝子間には85%より高い類似性があるが、異なる群の遺伝子間は42ないし46%の類似性があるのみである。共抑制技術を用いることにより発生中の子葉においてグリシニンの発現を抑制できるかどうかを決定するために、上記のように逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いて群I及び群IIのcDNAを調製した。
【0077】
群I反応のために用いる上流プライマー(G1−1)は全ての群IcDNAの領域1−19に相同である。2種の下流プライマー:Gy1の領域1038−1022、Gy2の1008−992及びGy3の996−980と相同であるG1−1039またはGy1の領域1475−1460、Gy2の1445−1430及びGy3の1433−1418と相同であるG1−1475を用いた。後のクローニングを容易にするために、全てのプライマーはそれらの5'末端にNotI制限部位をコードするさらなるヌクレオチドを含有した。
【0078】
発生中のダイズ種子から単離されたRNAを反応の下流プライマーとしてランダムヘキサマーまたはG1−1475またはG1−1039のいずれかを用いて逆転写した。G1−1039またはG1−1475のいずれかとG1−1の混合物を用いてcDNAフラグメントを増幅した。15μLのPCR反応混合物をアガロースゲル電気泳動で分析した。PCR反応はプライマー組G1−1/G1−1039及びG1−1/G1−1475に対してそれぞれ約1kb及び1.4−1.5kbの予想される分子量の産物を生じた。反応混合物の残りからcDNAフラグメントをWizardTM(商標)PCR Preps DNA精製システムキット(Promega)を用いて精製した。次に、精製されたcDNAをNotIで消化し、アガロースゲル精製により単離した。
【0079】
群IIのRT−PCRのために用いる上流プライマー(G4−7)は群IIの両方のcDNAの領域7−22に相同である。2種の下流プライマー:Gy4の領域1251−1234及びGy5の1153−1135と相同であるG4−1251またはGy4の領域1668−1653に相同であるG4−1670を用いた。Gy5に類似領域はない。後のクローニングを容易にするために、全てのプライマーはそれらの5'末端にNotI制限部位をコードするさらなるヌクレオチドを含有した。
【0080】
発生中のダイズ種子から単離されたRNAを反応の下流プライマーとしてランダムヘキサマーまたはG4−1251またはG4−1670のいずれかを用いて逆転写した。G4−1251またはG4−1670のいずれかとG4−7の混合物を用いてcDNAフラグメントを増幅した。15μLのPCR反応混合物をアガロースゲル電気泳動で分析した。PCR反応はプライマー組G4−7/G4−1251及びG4−7/G4−1670に対してそれぞれ約1.25kb及び1.7kbの予想される分子量の産物を生じた。反応混合物の残りからcDNAフラグメントをWizardTM(商標)PCR Preps DNA精製システムキット(Promega)を用いて精製した。次に、精製されたcDNAをNotIで消化し、ゲルから単離した。
【0081】
単離された群IcDNAをNotI部位でpRB20(図9)にクローン化した(センス方向)。NotIでの部分制限消化及び単一切断されたpRB20/群I直鎖状フラグメントの単離後に群IIcDNAを添加して最終的な転写単位β−コングリシニンプロモーター/群IcDNA(センス方向)/ファゼオリン3'末端及びβ−コングリシニンプロモーター/群IIcDNA(センス方向)/ファゼオリン3'末端を作製した。次に、得られたプラスミドを用いて体細胞胚懸濁培養物を上に詳細に記述した方法を用いて形質転換する。
【0082】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドpML70の制限地図である。
【図2】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドpCW109の制限地図である。
【図3】本発明のキメラ遺伝子の構築において中間クローニング媒体として用いられるプラスミドpKS18HHの制限地図である。
【図4】プラスミドpJo1の制限地図である。
【図5】pJo1で形質転換された体細胞胚から抽出されたタンパク質のSDS−PAGEゲルである。
【図6】プラスミドpBS43の制限地図である。
【図7】pBS43で形質転換された植物より得られたダイズ種子から抽出されたタンパク質のSDS−PAGEゲルである。
【図8】プラスミドpJo3の制限地図である。
【図9】プラスミドpRB20の制限地図である。
Claims (1)
- (a)(i)β−コングリシニンα'−サブユニットプロモーター領域;及び
(ii)(i)のプロモーターに対してセンスの向きに置かれる、ダイズのデルタ−12デサチュラーゼの全長をコードする核酸フラグメント;及び
(iii)フォゼオリン3'末端領域;
を含んでなるキメラ遺伝子を構築し、
(b)(a)のキメラ遺伝子をダイズ種子中に導入することによりトランスジェニックダイズ種子を作製し、そして
(c)工程(a)のキメラ遺伝子の発現をもたらす条件下で工程(b)のトランスジェニックダイズ種子を生育する
ことを含んでなり、ここで、工程(a)のキメラ遺伝子を含有しないダイズに比較した場合に、β−コングリシニンのα−及びα'−サブユニットの量、並びに、ダイズのデルタ−12デサチュラーゼの量が減少している、3種のダイズ遺伝子の発現を同時に減少するための方法。
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US7537914B1 (en) * | 2002-11-04 | 2009-05-26 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Nucleic acid and allergenic polypeptides encoded thereby in cashew nuts (Anacardium occidentale) |
US20040172682A1 (en) | 2003-02-12 | 2004-09-02 | Kinney Anthony J. | Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants |
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BRPI0707413A2 (pt) | 2006-02-09 | 2011-05-03 | Pioneer Hi Bred Int | genes para aprimoramento da eficiência de utilização do nitrogênio em culturas |
EP2147109B1 (en) | 2007-05-24 | 2014-03-19 | E. I. Du Pont de Nemours and Company | Dgat genes from yarrowia lipolytica for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in soybean |
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EP2620500A3 (en) | 2008-05-23 | 2014-01-08 | E. I. du Pont de Nemours and Company | DGAT genes from oleaginous organisms for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in oilseed plants |
WO2009158694A1 (en) * | 2008-06-28 | 2009-12-30 | The Donald Danforth Plant Science Center | Improved protein production and storage in plants |
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WO2011017492A2 (en) | 2009-08-05 | 2011-02-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel eto1 genes and use of same for reduced ethylene and improved stress tolerance in plants |
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AR078829A1 (es) | 2009-10-30 | 2011-12-07 | Du Pont | Plantas y semillas con niveles alterados de compuesto de almacenamiento, construcciones relacionadas y metodos relacionados con genes que codifican proteinas similares a las aldolasas bacterianas de la clase ii del acido 2,4- dihidroxi-hept-2-eno-1,7-dioico |
EP2865761A1 (en) * | 2010-03-03 | 2015-04-29 | E. I. Du Pont de Nemours and Company | Plant seeds with altered storage compound levels, related constructs and methods involving genes encoding oxidoreductase motif polypeptides |
BR112012033668A2 (pt) | 2010-07-01 | 2017-06-13 | Du Pont | planta e semente transgênica, método para a produção de um planta transgênica, produto e/ou subproduto obtido a partir da semente transgênica, polinucleotídeo isolado e planta ou semente compreendendo uma cosntrução de dna recombinante |
BR112014010537A2 (pt) | 2011-10-31 | 2017-05-02 | Pioneer Hi Bred Int | método para modular a sensibilidade ao etileno, planta transgênica, proteína isolada, sequência de polinucleotídeos isolada, polipeptídeo com atividade regulatória de etileno, método para aumentar o rendimento em uma planta, método para melhorar um parâmetro agronômico de uma planta, método de seleção assistida por marcador de uma planta |
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JP6034053B2 (ja) * | 2012-04-26 | 2016-11-30 | トヨタ自動車株式会社 | 植物の種子総量の増産方法 |
WO2013184768A1 (en) | 2012-06-05 | 2013-12-12 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods of gene silencing in plants |
CN103937750B (zh) * | 2014-03-26 | 2015-04-08 | 北京龙科方舟生物工程技术有限公司 | 抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用 |
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Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US4267118A (en) * | 1979-09-07 | 1981-05-12 | John R. Hersh | Process for producing food grade soybean oil |
US5190931A (en) | 1983-10-20 | 1993-03-02 | The Research Foundation Of State University Of New York | Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA |
US5283323A (en) | 1985-08-07 | 1994-02-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing immune response |
US5107065A (en) | 1986-03-28 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells |
NZ225044A (en) | 1987-06-19 | 1990-01-29 | Plant Cell Res Inst | Bertholletia excelsa dna molecule; sulphur rich storage protein |
EP0318341B1 (en) | 1987-10-20 | 1996-07-31 | Plant Genetic Systems, N.V. | A process for the production of transgenic plants with increased nutritional value via the expression of modified 2S storage albumins in said plants |
US5416011A (en) * | 1988-07-22 | 1995-05-16 | Monsanto Company | Method for soybean transformation and regeneration |
JPH02156889A (ja) * | 1988-12-08 | 1990-06-15 | Natl Food Res Inst | グリシニン生産細胞及びグリシニン生産植物の育種方法並びに育種増殖方法 |
WO1991013993A1 (en) | 1990-03-05 | 1991-09-19 | The Upjohn Company | Protein expression via seed specific regulatory sequences |
JPH07501701A (ja) | 1991-12-04 | 1995-02-23 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子 |
AU667301B2 (en) * | 1992-03-24 | 1996-03-21 | Japan Tobacco Inc. | Process for reducing seed storage proteins and process for transforming plants |
US6372965B1 (en) * | 1992-11-17 | 2002-04-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants |
JP3818540B2 (ja) * | 1992-11-17 | 2006-09-06 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 植物由来のミクロソームデルタ−12脂肪酸デサチュラーゼおよび関連酵素の遺伝子 |
EP0620281A3 (en) * | 1993-03-31 | 1995-05-03 | Mitsubishi Corp | Oilseed plants producing valuable seeds with modified amino acid and fatty acid compositions. |
DE69533616D1 (de) * | 1994-04-04 | 2004-11-11 | Pioneer Hi Bred Int | Des endogene samenproteins gehalts verminderung in pflanzen |
WO1996038561A1 (en) * | 1995-06-02 | 1996-12-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Improved methods of producing feed by reducing endogenous protein levels in soybean |
KR100316496B1 (ko) * | 1996-06-14 | 2002-08-13 | 이.아이,듀우판드네모아앤드캄파니 | 대두종자단백질유전자특정계열의억제방법 |
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