JP2000106890A - 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 適当な遺伝子植物の修飾により、有用で生物
学的に活性なポリペプチドを生成する方法を提供する。 【解決手段】 ２Ｓアルブミンの前駆体をコードするAr
abidopsis thaliana遺伝子の種子特異的プロモーター領
域を含む単離されたＤＮＡフラグメントであって、該２
Ｓアルブミンが、図４のAT2S1、AT2S2、AT2S3、及びAT2
S4の群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＤＮＡフラ
グメント。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、適当な植物遺伝子の修飾によ
り、有用で生物学的に活性な、ポリペプチドを生成する
方法に関する。

【０００２】容易に純化できる形でかつ有用な量で一定
の生物学的に活性なポリペプチドを生成することには今
なおほとんどの場合において多大な問題点がある。

【０００３】代替的な手法として挙げられるのは、化学
的合成又は遺伝的に処理された微生物による製造であ
る。第１の手法は、きわめて費用のかかる手法であり、
しかも往々にして、適正なコンフォーメーション（立体
配座）をもつポリペプチドが得られない。後者の手法
は、ポリペプチドの不安定さ、細胞内沈降そして純粋な
形での生成物の純化といった問題点のため、むずかしい
ものである。その上、ホルモンペプチドを含むいくつか
のクラスのペプチドは、適正なジスルフィドブリッジ形
成、アセチル化、グリコシル化又はメチル化といった付
加的な処理の後に初めて充分な活性を有することにな
る。天然においては、ジスルフィドブリッジは、前駆体
の膜転移の間にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
（異性化酵素）による同時翻訳触媒作用を受けるため、
きわめて高効率で形成される。次に、タンパク質分解印
割により、前駆体から活性形が誘導される。

【０００４】化学的に合成された又は原核系内で過剰生
産されたペプチドは一般に還元された形で得られ、従っ
て、次に、システイン残基の穏やかな酸化によりジスル
フィドブリッジを形成させなくてはならない。往々して
ペプチドの充分に変性された「スクランブル」状態から
出発するため、このときジスルフィドブリッジの形成は
不規則過程であり、この間に分子間架橋（より高い分子
量の会合物を生成する）ならびに不適切なジスルフィド
結合（不活性ペプチドを生成する）が正しく折りたたま
れたペプチドの他に生成される可能性がある。

【０００５】一定のペプチドを製造するためのシステム
として植物細胞を用いることも同様に、ＰＣＴ／ＵＳ８
６／０１５９９などにおいて提案されてきた。この特許
の中では、既知の技法（ＥＰ８３１１２９８５．３）に
従って前記ペプチドを構造的に発現させることを原理と
する提案されている方法が、植物の生理を乱すことなく
高い発現レベルを得ることそして植物タンパク質から分
離することによりかかるペプチドを回収する上で高い収
量を得ることを可能にするものである、ということは実
証されていない。このことは特に、植物全体があるがま
まの形で用いられ土中で育てられる場合に言えることで
ある。

【０００６】本発明の目的は、これらの問題点を克服
し、経済的に価値ある方法及び大量に生産できる遺伝子
的に処理された生物体を提供することにある。この方法
において、一定のポリペプチドは、かかる生物体の生理
を乱すことなく大量に合成されうると同時に、同じ又は
ほぼ同じアミノ酸配列をもつ野生型ペプチドに共通の高
度の生理学的活性を提供する形で生成され、また、かか
る生物体から容易に回収されうる。

【０００７】さらに詳しく言うと、本発明の目的は、遺
伝的に修飾された植物ＤＮＡならびにかかる植物材料の
細胞で複製可能なこの遺伝的に修飾されたＤＮＡを含む
植物の生きた材料を提供することにある。ここで遺伝的
に修飾された植物のＤＮＡは、相応する植物の成長の少
なくとも１段階においてその発現を実施させる一定の与
えられた植物プロモータによって表現が制御されている
ような前記一定のポリペプチドについてコード付けする
配列を含んでいる。この成長段階は、大量に作られしか
も容易に回収可能な植物の器官又は組織内で発現が起き
るように選ばれる。

【０００８】本発明のもう１つの目的は、種子の貯蔵タ
ンパク質に備わっている、植物中に大量に生産される能
力及びかかる植物の一定の成長段階とくに種子形成段階
において発現される能力を利用することにある。さらに
詳しく言うと、本発明は、水溶性貯蔵タンパク質が相応
する植物の種子から容易に回収されうるという点を利用
することをその目的としている。

【０００９】植物内での外来性遺伝子の発現は充分に立
証されている（De Blaere他、１９８７年）。いくつか
の事例において、種子の貯蔵タンパク質遺伝子が他の植
物内に移入された。またいくつかの事例において、移入
された種子の貯蔵タンパク質遺伝子がその新しい環境の
中で、組織特異的でかつ発育調製された形で表現される
ということが示された。（Beachy他、１９８５年；Okam
uro他、１９８６年；Sengupta-Gopalan他、１９８５
年；Higgins他、１９８６年）、このことはすなわち、
移入された遺伝子が、種子の適当な部分内でしかも正規
の時点でのみ発現される、ということを意味している。
同様に、少なくとも１つの事例において、外来性種子貯
蔵タンパク質が宿主植物のタンパク粒の中に位置づけら
れていることも示された（Greenwood ＆ Chrispeels、
１９８５年）。さらに、イントロン（介在配列）を含む
完全な遺伝子ではなくむしろｃＤＮＡがキメラ遺伝子の
ためのベースとして用いられた場合に、安定した機能的
な伝令ＲＮＡを得ることができるということも立証され
た（Chee他、１９８６年）。

【００１０】種子貯蔵タンパク質は、多くの植物の種子
内で全種子タンパク質の最高９０％を占めている。これ
らは、発芽直後の若い苗のための栄養源として用いられ
る。これらをコード付けしている遺伝子は、厳しく制御
されており、きわめて組織特異的かつ段階特異的な形で
発現される（Walling他、１９８６年；Higgins他、１９
８４年）。従ってこれらは、ほぼ排他的に発育する種子
内でのみ発現され、異なるクラスの種子貯蔵タンパク質
は、その種子の異なる発育段階で発現されうる。これら
は一般にその細胞内位置に関して制限を受けており、タ
ンパク粒（プロテインボディ）又はタンパク質貯蔵液胞
と呼ばれる、膜で結合された細胞小器官（オルガネラ）
内に貯蔵されている。これらの細胞小器官は、プロテア
ーゼの無い環境を提供し、又往々にしてプロテアーゼ抑
制因子をも含んでいる。これらのタンパク質は、開花の
時点で分解され、発育中の種子のための栄養源として役
立つものと考えられている。これらのタンパク質のうち
のいくつかのクラスについて単純な精製技法が記述され
てきた。

【００１１】種子貯蔵タンパク質は、例えばSvedbergが
規定しているように（Stryer. L.,著「Biochemistry
（生化学）」、第２版内、W.H. Freeman, New York, ｐ
５９９）、一般に可溶性とサイズ（さらに限定的に言う
と沈降速度）に基づいて分類される。１つの特定のクラ
スの種子貯蔵タンパク質が研究された。すなわち、水溶
性アルブミン類であり従って他のタンパク質から容易に
分離される２Ｓ種子貯蔵タンパク質である。これらはサ
イズが小さいこともあって精製が単純になっている。い
くつかの２Ｓ貯蔵タンパク質が、タンパク質又はｃＤＮ
Ａのいずれかのレベルで特徴づけされてきた（Crouch
他、１９８３年；Sharief ＆ Li、１９８２年；Ampe
他、1９８６年；Altenbach他、１９８７年；Ericson
他、１９８６年；Scofield ＆ Crouch、１９８７年；Jo
sefsson他、１９８７年；そして本出願明細書に記述さ
れている研究）。２Ｓアルブミンは、ジスルフィドブリ
ッジにより連結された、それぞれ６〜９及び３〜４キロ
ダルトン（kd）の２つのサブユニットから細胞内で形成
される。

【００１２】上述の参考図書内の研究は、２Ｓアルブミ
ンが、数多くの異なる種の２Ｓアルブミン間で共有の構
成をもつ複合プリプロペプチドとして合成され、図３に
これらの種のうちの３つについて概略的に示されている
とおりである、ということを示していた。いくつかの完
全な配列が図３に示されている。

【００１３】２Ｓアルブミンのタンパク質配列に関する
図３については、以下のような観察が行なわれる。B. n
apus、B. excelsia及びA. thalianaについては、タンパ
ク質及びＤＮＡの両配列が共に決定された。R. communi
sについては、タンパク質配列のみが利用可能である。
（B. napusはCrouch他、１９８３年及びEricson他、１
９８６年より；B. excelsiaは、Ampe他、１９８６年、d
e Castro他、１９８７年及びAltenbach他、１９８７年
より；R. communisはSharief他、１９８２年より）。囲
みは、相同性を表わしており、高くなった点はシステイ
ンの位置を表わしている。

【００１４】前駆体の初めのタンパク質配列と、シグナ
ルペプチドの標準的コンセンサス配列を比較すると、こ
の前駆体が、成熟タンパク質では存在しない１つではな
く２つのセグメントをアミノ末端基において有してお
り、そのうちの最初のものがシグナル配列であり（Perl
man ＆ Halvorson、１９８３年）、第２のものはアミノ
末端基処理済フラグメントと呼称された（いわゆるＡＴ
ＰＥ）。シグナル配列は、小胞体の膜を横切っての未完
成ポリペプチドの同時翻訳輸送を確実に行なうのに役立
ち（Blobel、１９８０年）、これまでに研究されてきた
全ての種子貯蔵タンパク質を含む数多くのタイプのタン
パク質内に見い出される（Herman他、１９８６年）。こ
れは、タンパク質の適当な区画化にとってきわめて重要
である。タンパク質はさらに、正しいジスルフィドブリ
ッジが形成されるような形で折りたたまれる。このプロ
セスはおそらく、酵素ジスルフィドイソメラーゼが局在
化されている小胞体膜の管腔部位に局在化される（Rode
n他、１９８２年；Bergman＆ Kuehl、１９７９年）。小
胞体膜を横切っての転座の後、ほとんどの貯蔵タンパク
質は前記小胞体を経由してゴルジ体へと輸送され、次に
そこから小さな膜で結合された小胞（「密な小胞」）内
をタンパク粒へと輸送される（Chrispeels、１９８３
年；Craig ＆ Goodchild、１９８４年；Lord、１９８５
年）。シグナルペプチドが同時翻訳して除去されるとい
うことはすなわちタンパク粒への種子貯蔵タンパク質の
それ以上の輸送を検出するシグナルが、存在するタンパ
ク質配列の残りの部分にあるにちがいないということを
暗に意味している。

【００１５】２Ｓアルブミン類は、成熟ポリペプチド内
には存在しないシグナル配列以外の配列を前駆体のアミ
ノ末端に含んでいる。これは、全ての貯蔵タンパク質に
一般的なことではない。このアミノ末端基処理済フラグ
メントは、図１においてはＰｒｏと、そして図３ではＡ
ＴＰＦと標識づけされている。

【００１６】さらに、図１及び図２に示されているよう
に、前駆体内で小さなサブユニットと大きなサブユニッ
トの間に位置づけされているいくつかのアミノ酸は除去
される〔図１ではlink、図２ではＩＰＦと標識づけされ
ており、ＩＰＦは内部処理フラグメント（internal pro
cessed fragment）を意味する〕。さらに、前駆体のカ
ルボキシル末端基からいくつかの残基が除去される〔図
１はTail、図２ではＣＴＰＦと標識づけされており、Ｃ
ＴＰＦはカルボキシル末端基処理フラグメント（carbox
yl terminal processed fragment）を意味する〕。これ
ら後者の処理段階の細胞位置づけは不確かであるが、タ
ンパク粒である可能性が最も高い（Chrispeels、１９８
３年；Lord、１９８５年）。これらの処理段階の結果と
して、小さなサブユニット（Sml. Sub）及び大きいサブ
ユニットが残る。これらは、以下に述べるようにジスル
フィドにより連結される。

【００１７】種々の植物の２Ｓ−アルブミン類のタンパ
ク質配列を比較すると、強い構造的類似性がみられる。
このことは、さらに詳しくは、図３及び図４で例示され
ている。これらの図は以下のような異なる植物の代表的
な２Ｓ−貯蔵種子アルブミンタンパク質のそれぞれ小サ
ブユニット及び大サブユニットのアミノ酸配列を与えて
いる： R. comm. ; Ricinus communis A. thali ; Arabidopsis thaliana B. napus ; Brassica napus B. excel ; Bertholletia excelsa（ブラジル産ナッ
ツ）

【００１８】図３及び図４においては以下のことに留意
しなくてはならない。 − 前記サブユニットのアミノ酸配列は、複数のライン
上に広がっている。 − 例として示されている貯蔵タンパク質のアミノ酸配
列及び前記タンパク質のうちのいくつかの中の同様なア
ミノ酸のシステイン基は、垂直に整列させられている；
これらの配列のいくつかの中に現われるハイフン記号
は、アミノ酸欠損言い換えるとそれらととり囲む最も近
いアミノ酸の間の直接連結を表わしている。 − 異なるタンパク質においてはほぼ保存されているア
ミノ酸配列が、枠で囲まれている。

【００１９】全ての配列は、Arabidopsis thalianaの２
Ｓ−アルブミンの実験により立証された真の構造を表わ
すというよりはむしろ（本論述を目的とした）仮想モデ
ルを表わしている図５に概略的に示されているようなジ
スルフィドブリッジ内に参与しうる８つのシステイン残
基（小サブユニット内に第１と第２のもの、残りは大サ
ブユニット内）を含んでいる、ということがわかる。か
かる仮想モデルは、血清アルブミン（Brown、１９７６
年）、アルファ胎児タンパク（Jagodzinski他、１９８
７年；Morinaga他、１９８３年）及び、類似の一定のＣ
−Ｃダブレット及びＣ−Ｘ−Ｃトリプレットがみられた
ビタミンＤ結合タンパク質（Yang他、１９８５年）のよ
うな動物性アルブミンのジスルフィドブリッジが媒介と
なったループ形成よりヒントを得たものである。

【００２０】さらに、システイン残基の間の距離は、大
サブユニット内の第６と第７のシステイン残基の間の距
離を除いて、各サブユニット内でほぼ一定に保たれてい
る。このことは、これらの配置が構造的に重要であるも
のの、この第６と第７のシステインの間で大サブユニッ
ト内で或る程度の変化が許されるということを示唆して
いる。

【００２１】本発明は、遺伝子導入植物の植物種子内の
かかる修飾貯蔵タンパク質の特性及び適切な処理の変化
をひき起こさずに修飾されうるような貯蔵タンパク質の
領域の決定に基づいている。この領域（図５に拡幅され
た斜線入り部分で概略的に示されている）は、以下の例
において「超可変部」と呼ばれる。図５はまた、前駆体
の小サブユニットと大サブユニットを分離する「ＩＰ
Ｆ」セクションならびに、タンパク質サブユニットのシ
ステイン残基のほぼ保持された部分内のアミノ酸の数
（ａａ）を含めて、前駆体配列の他の部分のそれぞれの
位置も示している。処理開裂部位は、▼という記号で示
されている。

【００２２】数多くの植物の種子は、上述の貯蔵タンパ
ク質とほぼ同じサイズのアルブミンを含んでいる。しか
しながら文言を簡略にするため、ここでは、図１に示さ
れている全体的構造のペプチド前駆体をコード付けする
遺伝子をもち、ジスルフィドブリッジにより連結された
２つのサブユニットから成る最終的な形に処理される種
子タンパク質を指して、「２Ｓアルブミン」という語を
用いる。これは、以下に記述する方法がこのような２Ｓ
アルブミンのみに適用できることを意味するとみなされ
てはならない。

【００２３】問題の一定のポリペプチドを生成するため
の本発明に従った方法は、 − 一世代又は複数世代にわたり、再生された植物細胞
から又はこの再生植物細胞から得られた植物の種子から
得た植物を栽培する段階、（なおここにおいて、かかる
植物内で複製可能なこの植物細胞の遺伝的遺産又は情報
には、種子特異的なプロモータの制御下に置かれた核酸
配列が含まれている。これは、かかる植物のシグナルペ
プチドを含む貯蔵タンパク質の前駆体の少なくとも一部
分をコード付けするｍＲＮＡに転写され、前記核酸は以
下「前駆体コード付け核酸」と呼ばれる） ・なおここで、かかる核酸には１つのヌクレオチド配列
（以下「関連配列」と呼ぶ）が含まれ、かかる関連配列
は、その中で自らをとり囲む未修飾部分と共に読みとり
段階においてオープンリーディングフレームを形成する
非相同核酸インサートにより修飾された非必須領域を含
んでいる； ・かかるインサートは、前記問題のポリペプチドをコー
ド付けするヌクレオチドセグメントを含んでいる； ・前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサー
ト又は隣接する末端のいずれか又はその両方に属するヌ
クレオチドを有する単数又は複数のコドンにより、前記
関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結され
ている； ・前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列に
よりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タン
パク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲む選択
的に開裂可能な境界部位を構成する単数又は複数のアミ
ノ酸残基をコード付けする； − 栽培された植物の種子を回収し、その中に含まれて
いる雑種貯蔵タンパク質を抽出する段階； − 開裂部位レベルで前記雑種貯蔵タンパク質から問題
のペプチドを開裂させる段階；そして − 問題のペプチドを精製された形で回収する段階を含
んでいる。

【００２４】上述の条件の下で、栽培された植物の各々
全ての細胞が修飾された核酸を含んでいることがわかる
だろう。それでも上述の組換え型つまり雑種の配列は、
栽培された植物の種子形成段階のみにおいて又はほとん
どこの段階において発現され、従って雑種タンパク質は
大部分がこの種子内で生成されることになる。

【００２５】上述の「非相同核酸インサート」は、少な
くとも一部分が当該種子又は植物の貯蔵タンパク質の前
駆体をコード付けする天然の核酸にとって外来性のもの
であるようなヌクレオチド配列を含むインサートから成
る。最も一般的には、問題のポリペプチドをコード付け
するセグメントはそれ自体、前記貯蔵タンパク質の前駆
体をコード付けする天然の核酸にとって外来性のもので
ある。それでも、「非相同核酸インサート」という語
は、上述の種子又は植物細胞の遺伝的財産又は情報の中
に通常存在する上述のようなセグメントを含むインサー
トをも含んでいる。このとき前記インサートの「非相
同」性は、その両側でそれをとり囲み前記セグメントを
前記前駆体をコード付けする核酸の未修飾部分に連結す
る単数又は複数のコドンに向けられているのである。上
述の最後に示した状況の下で、本発明はこのように、植
物の種子形成段階またはその発育のその他の段階のいず
れにおいても、また種子のタンパク質体内又は前記植物
細胞の他のいずれの場所においてであれ、通常植物自体
の中で作られる貴重なタンパク質を生成し容易に分離し
回収することを可能にするような方法を提供している。

【００２６】「問題のポリペプチド」は、通常、本発明
に基づく方法の最終段階において雑種貯蔵タンパク質か
ら開裂されたとき、生物学的特性のうち少なくともその
問題の単一のポリペプチド又はタンパク質によって処理
されるべきものを保持又は回復するような単一のポリペ
プチド又はタンパク質で構成される。問題のポリペプチ
ドが保持すべき特性の、制限的な意味をもたない一例と
して、酵素活性又は治療効果、一定の抗体により認識さ
れうる能力、免疫学的特性例えば、生きた宿主内でかか
る問題のペプチド又はこの「問題のポリペプチド」と同
じ又は類似したアミノ酸配列を含む抗原を含む病原性因
子を中和できる抗体を惹起（誘発）する能力などを挙げ
ることができる。

【００２７】ただし、「問題のポリペプチド」はまた、
とくに何らかの望ましい生物学的活性をもつ個々のペプ
チド又はポリペプチドのユニットの反復をも含みうる。
かかるユニットは、生物学的なユニット又は反復を互い
に分離することができるようにしている開裂可能な部位
の上又はその中を通して互いに合わさっている。決定的
なものではないものの、このような開裂可能な部位は、
「問題のポリペプチド」全体が雑種貯蔵タンパク質から
開裂されうるようにする上述のような「境界制限酵素」
などの同じ開裂手段と同一であるか又は、これに対して
感応性をもつという利点がある。実際、活性ユニットの
互いからの分離は、このとき上述の「開裂（切り出
し）」オペレーションと同時に達成されうる。それでも
異なるユニット又は反復は、異なる開裂部位を通して結
合される可能性があり、こうしてこのユニットの互いの
分離は、雑種貯蔵タンパク質からの前記「問題のポリペ
プチド」の「開裂」オペレーションの後に続いて行なわ
れうる。

【００２８】当然のことながら問題のポリペプチド内の
反復ユニットの数は、本書中に規定されている条件の下
で関連する貯蔵タンパク質内に取り込まれうる問題のポ
リペプチドの最大長さによって異なる。

【００２９】本発明に基づく方法についての上述の定義
づけにおいて、前駆体をコード付けする前記核酸の関連
配列のいわゆる「非必須領域」は、未修飾の天然の貯蔵
タンパク質のものに比べて結果として得られた上記雑種
貯蔵タンパク質の全体的構成が変わることなく、又、そ
れ相応に修飾された未完成雑種貯蔵タンパク質の上述の
タンパク質体内への輸送に変化を与えることなく、上述
のインサートをその中に挿入するか又はかかるインサー
トで前記非必須領域の少なくとも一部分を置換すること
によって修飾されうるようなヌクレオチド配列をもつ領
域から成る。

【００３０】本発明においては、上述の前駆体コード付
け核酸は当然のことながら、本発明にて栽培されている
ものと同じ植物種から出てきたものであってよい。しか
しこれは又、すでに登記されているBeachey他、１９８
５年及びOkamuro他、１９８７年の教示に沿って、その
他の植物種から出てきたものであってもよい。

【００３１】同様に、種子特異的プロモータは、同じ植
物種からのものでも異なる植物種からのものでもよい。
ただし、後者の場合、宿主植物のポリメラーゼにそれを
認識する能力があることを条件とする。

【００３２】貯蔵タンパク質内の非必須領域の位置づけ
については、どんな方法でも用いることができる。この
領域がひとたびタンパク質配列レベルで規定されると、
前駆体コード付け核酸の相応する領域を変えることがで
きる。例えば、分子モデリングによる二次的及び三次的
タンパク質構造の設定に基づく方法を用いて、非必須領
域を位置付けることができる。このようなモデルは、よ
り高次の集合におけるその構成又は相互作用にとってき
わめて重要なタンパク質の領域の識別を可能にする。こ
のような技術が無い場合、さまざまな植物種からの類似
のタンパク質のペプチド配列を比較することができる。
前記ペプチド配列が共通してもっている副配列（そして
この一応の証明のある事実は、有害な形でペプチドの構
造、処理、細胞内通過又はパッケージングに影響を及ぼ
すことなくこれらを修飾することはできないという仮定
を裏づけることになる）、これらが、そのとき一定の非
相同インサートによる修飾に適しているとみなされうる
「非必須領域」で構成されうるという仮定を裏づけるた
めには互いに異なりすぎているような副配列とは、区別
されうるものである。

【００３３】このようなアプローチは、異なる植物から
のいくつかの同じような貯蔵タンパク質の核酸配列又は
タンパク質配列が確認されている場合に可能である（２
Ｓアルブミンの場合のように）。このとき適切な方法に
は、アミノ酸配列又は長さ或いはその両方における可変
性を受けているペプチド領域をコード付けする前記核酸
領域を、逆に前記いくつかの植物種の間でアミノ酸配列
の大方の保存を示している領域との比較において識別す
る作業が含まれている。研究中の貯蔵タンパク質がシス
テイン残基を含み、さらにかかるシステインが、当該貯
蔵タンパク質の構造及びコンフォメーションの設定に重
要な役割を果たす可能性の高いジスルフィドブリッジに
参加するということが考えられている又は実験データを
通してすでにわかっている場合、この方法は、このこと
を考慮に入れるように拡張されなくてはならない。この
場合、システイン残基は貯蔵タンパク質の修飾により変
えられた残基のうちのいずれかであってはならず、類似
タンパク質のタンパク質配列の配列比較によってシステ
イン間の距離（アミノ酸残基内の）が保持されているこ
とがわかった場合、この距離はその後のいかなる修飾に
よっても変えられてはならない。このようにして選択さ
れたタンパク質配列内の前記非必須領域はこのとき、前
駆体コード付け核酸の相応する領域内に望ましいペプチ
ド生成物をコード付けする核酸セグメントを挿入するこ
とにより修飾することができ、かかる修飾が達成された
後、植物の発育の種子形成段階において回収可能な種子
内の修飾された貯蔵タンパク質の発現を検定することが
できる。

【００３４】１つの領域を修飾にもっていくことができ
るものであると考えるか否か決定するため当業者が利用
できるもう１つの方法は、かかる修飾を行なうこと、そ
しキメラタンパク質を経済的に有利な量だけ生成するに
は適切ではないもののキメラタンパク質が安定していれ
ば分析のため少量を生成するような複数の発現システム
のうちのいずれかでキメラ遺伝子を発現することから成
る。このような実験においては、未修飾のタンパク質も
対照として発現させられなくてはならない。このような
システムとしては（ただし制限的な意味無く）、Xenopu
s leaves 卵母細胞（Bassener他、１９８３年）、植物
のクロロプラスト（葉緑体）内の一過性発現（Fromm
他、１９８５年）、酵母菌（Hollenberg他、１９８５
年）、植物のカルス（仮骨）及びAcetabularia（カサノ
リ属）システムがある。後者のものは、ゼイン遺伝子の
機能的分析及びリジンをコード付けする配列によるその
修飾のためにBrown他（１９８６年）により用いられ
た。

【００３５】修飾すべき植物細胞中に移入されるべき修
飾された核酸を生成するために、２Ｓ−タンパク質特に
水溶性の２Ｓ−タンパク質の前駆体をコード付けする前
駆体コード付け核酸を選択することは、既に記録されて
いる理由により、きわめて魅力のあることである。

【００３６】図３及び図４を見ればわかるように、タン
パク質の小さなサブユニット内では第１及び第２のシス
テインの間、タンパク質の大きいサブユニット内ではま
ず第５と第６のシステイン間そして第７と第８のシステ
イン間に介在している領域は、かなりの保存度つまり類
似性を示している。従って、これらの領域は、なんらか
の形で、植物の種子内で合成されたときのタンパク質の
適切なひだ形成及び／又は安定性にとってきわめて重要
である。

【００３７】逆に、小サブユニットの終り、大サブユニ
ットの最初と終りにおけるようなその他の領域は、きわ
めて大きな差異を示しているため、これらはタンパク質
の最終的特性に対し多大な影響を全く及ぼすものではな
いものと仮定して保持することができる。重要であると
思われない領域は、大きなサブユニット内で、成熟タン
パク質の第６と第７のシステインの間にある領域の中央
位置から成る。図面（図３）をみるとわかるように、B.
napusは、前にあるＱアミノ酸と後にくるＶアミノ酸の
間にＣＫＱＱＭ配列を有し、一方同じレベルで、A. tha
liは同じ近隣のseighbouringアミノ酸の間で同様な配列
を全く有しておらず、B. excel及びR. comm.は、それぞ
れさらに短いＣＥＱ及びＣＱペプチドを含んでいる。従
って、アミノ酸残基のレベルにおける類似性の欠如に加
えて、この領域を最長の２Ｓアルブミンでの置換及び最
短の２Ｓアルブミンにおけるアミノ酸付加又はその両方
の延長のために好適なものとしている長さの相違がある
ように思われる。

【００３８】同じ観察は、前記第６と第７のシステイン
の間の同じ領域の最初の第３部分のほぼ終りのレベルに
もあてはまる：その他の例示された２Ｓ−タンパク質の
相応する領域に比べてその領域においてはるかに短いも
のである R. communisの配列を参照のこと。

【００３９】当業者の技能の範囲内にある実験による
と、成熟タンパク質の上述の第６及び第７のシステイン
に隣接するその他のアミノ酸のうちのどれほどが、雑種
タンパク質の安定性及び適正な処理を妨げることなくさ
らに置換されうるかがわかる。例えば、実験により、B.
napusの上述のＧＫＱＱＭ配列にその上流及び下流で隣
接しているその他のアミノ酸のうちのどれほどがさら
に、正常なB. napus２Ｓ−アルブミンの基本的特性を雑
種タンパク質が失うことなしに、形成される可能性のあ
る雑種タンパク質をさらに置換させること無く置換され
うるか、がわかる。考慮されている修飾は、好ましく
は、関連するシステイン例えば２５−成熟タンパク質の
第６及び第７のシステインに隣接する３つの好ましくは
６つのアミノ酸に影響を与えるべきではない。

【００４０】当然のことながら、他の場所では甚だしい
差異を示すタンパク質の類似した部分を一列にすること
が関わってくるような任意の選択に基づく仮定に対して
は用心しなくてはならないということがわかる。それで
も、かかる比較はその他の遺伝学の分野においては、当
業者に対して、異なるソースの類似したタンパク質にお
いて一方では局所的な構造的差異から他方では局所的類
似性から、（なお外来性の又は非相同性の配列により局
所的に修飾された同じタンパク質内に未修飾タンパク質
の基本的特性のいくつかを保持しなくてはならない場合
に）かかるタンパク質のどの部分が修飾できどの部分が
修飾できないかを合理的に推測するための適切な指針を
与えてくれるものである。

【００４１】従って、確認の要はあるものの、１つのタ
ンパク質又はそのサブユニットのいずれの部分でも、異
なるアミノ酸配列を有するペプチドによる置換に適して
いるとみなすことができる、ということが一応の証明あ
る事実と考えられている。

【００４２】本発明に基づく方法において用いられるべ
き適切な非必須領域の選択は、同様に、問題のペプチド
の長さによっても左右される。従って基本的には本発明
に基づく方法は、長さがアミノ酸３〜１００個の範囲に
ある生物学的に活性のポリペプチドの生成を可能にす
る。この生物学的に活性なポリペプチドは、植物性のも
のであってもよいし、又は、細菌、菌類、藻類又は無せ
きつい動物又は哺乳類のようなせきつい動物を源とする
植物種非特異的なポリペプチドであってもよい。

【００４３】関連貯蔵タンパク質例えば２Ｓ−タンパク
質又はそのサブユニットの適当な領域内に挿入されるべ
き配列（インサート）は、通常、この問題のポリペプチ
ドをコード付けするセグメントのみならず例えばプロテ
アーゼ又は化学的処理により開裂可能な上述のアミノ酸
接合部を形成するアミノ酸又はペプチドをコード付けす
るコドン（或いは又前駆体コード付け核酸の関連ヌクレ
オチド配列の非修飾部分の隣接するヌクレオチドが適当
にコドンを補足することになった場合にはこのコドンの
一部分）をも含んでおり、このため問題のペプチドは後
に、精製された２Ｓタンパク質から回収されうる。この
接合部−配列は、２本鎖オリゴマーとして、或いは又遺
伝子の一部分が使用可能である場合には、制限フラグメ
ントとして作ることができるが、後者の場合、開裂部位
例えばプロテアーゼ開裂部位が一般に付加されなくては
ならない。問題のペプチドを縁どる配列の選択は、プロ
セスの最終段階において、このペプチドを精製するため
に用いられるべき技法に左右されるいくつかの要因に応
じて異なる。問題のペプチドは、問題のペプチドの配列
が内部の類似開裂部位を含んでいないことを条件とし
て、いかなるタンパク質分解開裂部位でも側面に有する
ことができる。最後に、プロテアーゼ及び／又は化学的
開裂試薬は、特異的でかつ直ちに入手できなくてはなら
ない。これらは、アミノ末端及びカルボキシル末端の両
方において挿入された配列を適正に開裂しなくてはなら
ない。例えば、プロテアーゼトリプシンは、アルギニン
又はリジン残基の後にプロリンがついていないと仮定し
て、これらの前記の後で開裂する。従って、アルギニン
又はリジン残基のいずれも問題のペプチド内に存在しな
い場合（又はこれらの残基の後にプロリンがついている
場合）、この配列は、これら２つのアミノ酸の１つをコ
ード付けするコドンを側面に有することができる。この
ときペプチドを、トリプシンを用いて雑種タンパク質か
ら開裂させることができ、その後に、余分なカルボキシ
ル末端Ａｒｇ（アルギニン）又はＬｙｓ（リジン）を除
去するためエキソプロテアーゼカルボキシペプチダーゼ
Ｂで処理がほどこされる。同様にして、プロテアーゼｅ
ｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃ（Jekel他、１９８３年）は、リジ
ン残基の後で開裂し、そのため、このプロテアーゼを用
いて２Ｓアルブミンから開裂された形で２つのこのよう
な残基の間にペプチドを１つ挿入し、カルボキシペプチ
ダーゼＢを用いて再び余分のリジンを除去することがで
きる。このような戦略は、２Ｓアルブミンが用いられる
場合に特に有益である。というのもそのリジン含有量が
少ないために、わずかなフラグメントしか生成されず、
その結果精製が容易であるからである。臭化シアンを、
化学的開裂試薬の一例として用いることができる。この
試薬による処理は、メチオニンのカルボキシル側で開裂
する。従って各々のケースについて、別々の戦略を展開
しなくてはならないが、利用可能なさまざまなプロテア
ーゼ開裂技法において同一の基本原理に遵ずることが可
能となっている。できるかぎり頻繁に、戦略には経済的
な市販のプロテアーゼ又は試薬が用いられなくてはなら
ず、又、精製作業段階数も制限されていなくてはならな
い。さまざまな酵素による又は化学的な開裂技術を再検
討するためには、「酵素学諸法（Methods in Enzymolog
y）」の第１９巻（１９７０年）及び第４７巻（１９７
１年）を参照されたい。

【００４４】最後に、Ｃ−末端アルファ・アミド構造を
もついくつかのペプチドは、自然界に見い出される（ア
ルファ−メラノトロピン、カルシトニンその他；Hunt
＆ Dayhoff、１９７６年参照）。この翻訳後修飾は、ペ
プチドの生物学的活性にとってきわめて重要であるとい
うことがわかっている。かかるＣ末端でアミド化された
ペプチドは、Ｃ−末端グリシン残基のアミド基への形質
転換により得ることができる（Seiringer他、１９８５
年）。従ってこのようなペプチドは、Ｃ末端グリシン残
基を、精製後にアミド基に形質転換されるペプチドに付
加することによって２Ｓ雑種タンパク質から生成され得
る。

【００４５】貯蔵タンパク質内に挿入されるべき領域の
完全なタンパク質配列が、問題のポリペプチド及び上述
の開裂可能な接合部を形成するペプチドのアミノ酸の両
方を含めて決定された時点で、かかるタンパク質配列を
コード付けするためのヌクレオチド配列が決定されなく
てはならない。おそらくは絶対的に必要なことではない
かもしれないが、コード付け核酸のコドン使用は、でき
るかぎり修飾される遺伝子のものに類似しているべきで
ある。当業者は、かかるコドン使用を決定する適切なコ
ンピュータ解析手段を利用することができるだろう。

【００４６】選択された前駆体コード付け核酸の一部分
の代わりにインサートを置換するため、又はこれを前記
前駆体コード付け核酸の適当な領域内に挿入するために
は、適当ないかなる遺伝子工学技法でも用いることがで
きる。キメラ遺伝子を作るためには、細菌内クローニン
グを伴う一般的な試験管内組換え技術を用いることがで
きる。以下にさらに詳しく例示されるように、同じ目的
のために部位指向の突然変異誘発を用いることができ
る。現行の専門的文献において開示されている技術に従
って、植物細胞の形質転換に適したプラスミドといった
ＤＮＡ組換え体も生成することができる。これは又、最
終的に、選択された前駆体コード付け核酸の関連部分に
よりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質が表現されう
るような形質転換された植物細胞の生成にも適用でき
る。例として、この目的のための適当な技術を開示して
いる公開された欧州特許出願明細書第１１６７１８号又
は国際特許出願明細書ＷＯ８４／０２９１３号（本書に
参考文献として内含されている）を参照することができ
る。

【００４７】以上の詳述は、さらに詳しくは、一例とし
て貯蔵２Ｓアルブミンの修飾を基礎として行なわれてき
た。しかし、それが分離されうる植物内でそれをコード
付けするＤＮＡ配列がすでに識別されている又は識別さ
れうること、そしてその中の非必須又は「超可変配列」
がすでに検出されている又は検出されうることを条件と
して、本発明に基づくプロセスは、他の沈降係数をもつ
その他のいかなるタイプの２Ｓ−貯蔵タンパク質又はそ
の他の貯蔵タンパク質（例えば７Ｓ−１１Ｓ及び−１２
Ｓ貯蔵タンパク質）或いは同じものを用いた上で、実施
することができるということもわかるだろう。

【００４８】このようなその他の貯蔵タンパク質の例
（例示を目的とするものにすぎない）としては以下のよ
うなものがある〔再検討のためにはHiggins（１９８４
年）も参照のこと〕： − エンドウ及びその他の豆類から分離できるレクチン
のような１２Ｓタンパク質或いはすでに記録済みの２Ｓ
アルブミン又はエンドウ、ハッカダイコン又はひまわり
から分離できるその他の２Ｓアルブミンといった２Ｓタ
ンパク質などが考えられる、水溶性貯蔵タンパク質であ
るその他のアルブミン； − Phaseolusから分離可能なフェゾリン、エンドウか
ら分離可能なヴィシリン、大豆から分離可能なコングリ
シニン、オート麦から分離可能なオート−ヴィシリンの
ような７−８Ｓグロブリンか、又はエンドウから分離可
能なレグミン、大豆から分離可能なグリシニン、ひまわ
りから分離可能なヘリアンチンのような１１−１４Ｓグ
ロブリン、又は、インゲン豆、Arabidopsis及びおそら
くは小麦から分離可能なその他の１１−１４Ｓ−グロブ
リンが考えられる、塩水中で可溶な貯蔵タンパク質であ
るグロブリン； − とうもろこしから分離可能なゼイン、大麦から分離
可能なhordien 、小麦から分離可能なグリアジン及びモ
ロコシ属から分離可能なカフィリンといったアルコール
可溶性貯蔵タンパク質であるプロラミン； − 低いpH条件下で可溶性をもち、小麦から分離可能な
貯蔵タンパク質であるグルテリン。

【００４９】一例としてのみ挙げられたこれらの貯蔵タ
ンパク質のうちのいくつかは、システイン含有量が少な
いものである。それでも、同じグループの異なるタンパ
ク質は、一方では可変的な領域を示し、他方ではよりう
まく保存された領域を示す。

【００５０】言うまでもないことではあるが、これらの
貯蔵タンパク質は、相応する溶剤内でのそのそれぞれの
特異的可溶性に応じて、上述の雑種タンパク質の生成及
び種子タンパク質からのそのそれぞれの精製のための適
当なベクターとして用いることができる。

【００５１】以上に一般的に開示されてきた手順は、問
題のペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含む非相同性
インサートによる上述のその他の貯蔵タンパク質のいず
れかの非必須領域の適切な修飾に、そして次に関連する
植物の種子内における問題のペプチドの配列を含む雑種
タンパク質の生成のために得られたキメラ遺伝子による
関連する植物の形質転換に適用され、これらは、かかる
植物からの問題のペプチドの回収に適用される。言うま
でもないことであるが、当業者はあらゆる場合におい
て、かかる問題のペプチドの最良の生産収量を達成する
ためには、既存の技術のうちのいずれが、かかる修飾済
植物の生産の各段階レベルでのその必要性を最もうまく
満たすことになるかを選定することができることだろ
う。

【００５２】これまでの記述は、さらに詳しく言って、
一例として、生物学的に活性なペプチドをコード付けす
るインサートによる一定の貯蔵タンパク質の超可変領域
の修飾を基礎としてきた。しかし、当業者はインサート
としてかかる生物学的に活性なペプチドの反復をコード
付けする配列を選ぶことができる。この場合、かかる生
物学的に活性なペプチドをコード付けする全ての配列
は、精製の間のその分離を可能にする選択的開裂部位を
コード付けする周縁配列により他から分離される。

【００５３】例えば、相応する前駆体−コード付け核酸
が配列決定されたとき、一定の問題のポリペプチド又は
その反復を種子内で生成するための適切なベクターとし
て用いられうる貯蔵タンパク質の能力を利用するため
に、以下の方法を用いることができる。このとき、かか
る方法には、以下の段階が含まれる：

【００５４】１）その一部を１つのインサートで置換す
ることによって或いはその中にこのインサートを挿入す
ることによって修飾されうるペプチド配列をコード付け
する非必須領域を含む（なおここでかかる修飾は、貯蔵
タンパク質の構成の保持と相容れるものである）前駆体
コード付け核酸の前記関連配列の１つを位置づけし、選
択する段階

【００５５】２）前記関連配列の未修飾部分を適当なリ
ーディングフレーム関係で前記前駆体核酸の選択された
領域内に核酸インサートを挿入する段階；なお、かかる
インサートには、問題のポリペプチド又はその反復をコ
ード付けする一定のセグメント、そしてこのセグメント
の下流及び上流に、前記前駆体コード付け核酸内への挿
入が達成された後問題のポリペプチド又はその個々の反
復を互いに又は貯蔵タンパク質又はそのサブユニットの
関連部分内に連結するアミノ酸接合部をコード付けする
コドンの形成に参加し（こうしてかかるアミノ酸接合部
は問題のペプチドをとり囲む周縁部位を構成する）、そ
れ自体特異的ペプチダーゼなどによって選択的に開裂さ
れうるような、適当なヌクレオチド、コドン又はヌクレ
オチドのトリプレットが含まれている。

【００５６】３）完全な種子形成植物に再生されうる植
物細胞の形質転換に適したプラスミド内に得られた修飾
された前駆体コード付け核酸を挿入する段階。ここにお
いて、かかる挿入は、調節要素特に、それと結びつけら
れたオープンリーディングフレームの前記植物の種子内
での発現を提供することのできる種子特異的プロモータ
の制御下に置かれる）；

【００５７】４）かかる修飾されたプラスミドで、かか
る植物細胞の培養物を形質転換する段階；

【００５８】５）その超可変領域内に挿入された形で、
問題のポリペプチド又はその反復をコード付けするセグ
メントの一定の配列を有するキメラ貯蔵タンパク質の発
現を検定する段階、そしてこれが達成されると、

【００５９】６）得られた形質転換済み植物細胞から前
記植物を再生し、かかる植物を種子形成段階まで育てる
段階；

【００６０】７）種子を回収し、その中に含まれている
貯蔵タンパク質を抽出する段階；

【００６１】８）例えば前述の特異的ペプチダーゼを用
いて前記貯蔵タンパク質を開裂させる段階、かなりの数
のシステイン残基を含む貯蔵２Ｓ−タンパク質の場合
（今のところこの貯蔵タンパク質が好ましい）、そして
さらに、異なる植物内で同じ機能を果たししかもそれぞ
れ前記異なる植物を源としている複数の類似したタンパ
ク質の前駆体コード付け核酸が利用可能であり、すでに
配列決定された（又は配列決定できる）場合、上述の一
般的方法のステップ１）は、以下のように実施すること
ができる（ただし、以下に記されている一連のステップ
は、任意的なものであり、同じ結果を目的とする他のい
かなる手順によってでも置き換えることができる）、こ
のとき前記「ステップ１）」は、次の作業を含む。 ａ）それぞれ複数の種子形成植物種において入手可能で
あり識別可能な前記植物貯蔵タンパク質のいくつかを選
択すること； ｂ）前記植物種の各々において前記植物貯蔵タンパク質
の前駆体をコード付けする前駆体コード付け核酸配列を
位置づけし、かかる前駆体コード付け核酸内において、
成熟貯蔵タンパク質をコード付けする配列又はかかる成
熟貯蔵タンパク質のサブユニットに対してコード付けす
る適当な副配列から成る関連ヌクレオチド配列を決定す
ること； ｃ）前記成熟タンパク質又はタンパク質サブユニット内
の連続したシステイン残基をコード付けするコドンの相
対的位置を決定すること、そして、前駆体コード付け核
酸の前記副配列内の前記コドンの上流、間及び下流に位
置づけされた相応する連続的核酸領域を識別し、さらに
かかる連続領域の中に、かかる複数の植物種内のアミノ
酸配列の大方の保存をまさに示しているようなその他の
領域と比較して、植物種同士でアミノ酸配列又はその長
さ又はその両方において可変性を受けているような部分
を識別すること（なお、かかるヌクレオチド領域の１つ
はこのとき、前記２）に開示されているように問題のペ
プチド又はその反復をコード付けするセグメントを含む
核酸インサートのその中への挿入のために選択され
る）。

【００６２】この最後に記した本発明の実施態様は、１
つの植物内で雑種タンパク質の一部として問題の非相同
ポリペプチド又はその反復を作らせるにあたり、膜の転
座の間に植物タンパク質にジスルフィドイソメラーゼが
通り、こうして、その正常な前駆体状況におけるように
雑種前駆体内に正しいジスルフィドブリッジが形成され
る一方で問題のポリペプチド又はその反復が、宿主微生
物内に外来性ペプチドを生成するための標準的遺伝子工
学技術に関して先に喚起したようなさまざまな欠点から
守られる確率が増加されることになる、ということを規
定している。

【００６３】本発明はさらに、本発明に基づく方法にお
いて用いられる組換え型核酸自体特に以下のものに関す
る： − 前記方法の枠内で定義づけされてきた組換え型前駆
体コード付け核酸； − 他の植物のＤＮＡからの前記前駆体コード付け核酸
のものと同じＤＮＡを源としているか否かには無関係の
１つの種子特異性プロモータの制御下にある前記修飾さ
れた前駆体コード付け核酸を含む組換え型核酸。 − ベクター、さらに詳しく言うと、例えば上述の植物
細胞の形質転換において用いるため前述の組換え型核酸
のいずれかにより修飾されたＴｉ誘導のプラスミドとい
った、植物プラスミド。

【００６４】キメラ遺伝子にシグナル配列が無い場合
（全ての貯蔵タンパク質がそうであるように）適切なこ
のシグナル配列を与えなくてはならない。

【００６５】本発明は又、完全な植物に再生されうるよ
うな種子形成植物細胞又はかかる種子形成植物の種子の
いずれかで形成されている、問題のポリペプチドの再生
可能な供給源にも関する。かかる供給源は、かかる植物
又は種子が、前記植物細胞の再生の結果として得られる
植物の一世代又は複数世代の結果として得られること、
さらに前記植物細胞又は種子の遺伝的情報を支持するＤ
ＮＡは、種子特異的プロモータの制御の下に置かれた、
前記植物の貯蔵タンパク質の前駆体に相当するｍＲＮＡ
内に転写されうる、シグナルペプチドをコード付けする
配列を含めた１つの核酸又はその一部部を含んでいるこ
と、そして ・ 前記核酸配列には、成熟した貯蔵タンパク質をコー
ド付けする関連修飾配列又はこの成熟した貯蔵タンパク
質の単数又は複数のサブユニットに対しコード付けする
複数の副配列のうちの１つが含まれていること； ・ 前記関連配列の変更は、その可欠領域の１つの中で
起こり、関連配列の中で自らをとり囲んでいる未修飾部
分と読取り段階において１つのオープンリーディングフ
レームを形成する非相同核酸インサートで構成されるこ
と、 ・ 前記インサートには、前記問題のポリペプチドをコ
ード付けするヌクレオチドセグメントが含まれているこ
と； ・ 前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサ
ート又は隣接する末端のいずれか又はその両方に属する
ヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンにより、前
記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結さ
れていること、 ・ 前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列
によりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タ
ンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲む選
択的に開裂可能な周縁部位を構成する単数又は複数のア
ミノ酸残基をコード付けすることを特徴としている。

【００６６】本発明がこれに限定されているものとみな
されてはならないが、問題のポリペプチド又はその反復
をコード付けする核酸インサートは、ほとんどの場合に
おいて、ウイルス又は細菌の遺伝子から又はウイルス又
は細菌のＲＮＡの誘導ｃＤＮＡさらには非植物性真核生
物遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド又は人工的
合成ヌクレオチドであり、これらは全て通常、その性質
の如何に関わらず生物学的プロセスを通して本発明に基
づく植物細胞又は種子の適切な場所に挿入される可能性
が全く無いものである。換言すると、これらのインサー
トは通常、とくに遺伝的に全く関係が無く従って天然交
雑プロセスを含む標準的な生物学的方法によっていかな
る遺伝的材料も交換することのできない異なる種類の植
物の中に挿入されうるという点で「植物種に非特異的」
なものなのである。

【００６７】従って、本発明はさらに、前記形質転換さ
れた細胞又は種子から得られた種子形成植物自体にも関
するものである。かかる植物は、それがその細胞内で種
子プロモータと結びつけられている前記雑種前駆体コー
ド付け核酸を有していること、ただしほとんどかかる植
物の種子の中でかかるインサートが発現され相応する雑
種タンパク質が生成されていることをその特徴とする。

【００６８】以下に、２Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子の
修飾、遺伝子導入植物中でのその発現、２Ｓ貯蔵タンパ
ク質の精製そして問題の生物学的に活性のペプチドの回
収のために用いることのできる好ましい方法の概略を記
す。ここに与えられている方法の概略の後には、特定的
な例が記されている。当業者は、この方法をその他の２
Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子の修飾のためにも適合させ
ることができるものと思われる。

【００６９】１．問題の配列による２Ｓ貯蔵タンパク質
遺伝子の超可変領域の置換又は補足２Ｓアルブミンのｃ
ＤＮＡ又はゲノムクローンのいずれでも用いることがで
きる。図３の遺伝子の超可変領域の配列の比較をみる
と、それらの長さが変わっていることがわかる。従って
問題の配列が短く、比較的短い超可変領域を伴う２Ｓア
ルブミンが用いられる場合、問題の配列を挿入すること
ができる。そうでなければ超可変領域の一部を除去し
て、その問題のセグメント又は配列、及び場合によって
周縁コドンを含むインサートによりこれを置き換える。
その結果得られる雑種貯蔵タンパク質は、修飾された未
修飾の天然タンパク質に比べ長いこともあれば短いこと
もある。いずれの場合でも、次の２つの標準的技法を適
用することができる。すなわち、適当な制限部位を利用
するか又は突然変異誘発ベクターを用いる（例えばStau
ssen他、１９８７年）かである。両方の場合において、
メッセージのリーディングフレーム（読取り枠）を維持
するよう注意しなくてはならない。

【００７０】２．変えられた２Ｓアルブミンコード付け
領域を種子特異的遺伝子プロモータの制御下に置く。 種子のみにおいて必ずその後の発現が行なわれるように
するため、種子特異的プロモータが用いられる。こうし
て望まれる生成物の回収が容易になり、植物のその他の
部分に対する抑制の可能性を無くすることができる。原
則的に、修飾２Ｓアルブミンのプロモータを用いること
ができる。しかしこれは必ずそうでなくてはならないも
のではない。同じ目的に役立つものであればその他のい
かなるプロモータでも用いることができる。プロモータ
は、形質転換されるべき植物種におけるその効率レベル
に応じて選択することができる。以下の例においては、
大豆からのレクチンプロモータ及びArabidopsisからの
２Ｓアルブミンプロモータが用いられている。キメラ遺
伝子の構造によっては、そのプロモータが使用中である
遺伝子から又は修飾された遺伝子から、単一ペプチドコ
ード付け領域も同様に含み入れられなくてはならない。
キメラ遺伝子の実際の構築は、標準的な分子生物学技法
を用いて行なわれる（例を参照のこと）。

【００７１】３．キメラ遺伝子構造を、適当な宿主内に
移入する。 キメラ又は修飾遺伝子構造が完成すると、これは、植物
形質転換ベクター内へと全て移入させられる。アグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefa
ciens）から誘導された無力化された（非発がん性）Ｔ
ｉ−プラスミドに基づく多種多様のものが、二元性形及
び同時組込み形の両方で利用可能である（De Blaere
他、１９８７年）。一般に抗生物質耐性があり、形質転
換用の選択可能な標識を含むベクターを選ばなくてはな
らない。同様に、植物形質転換の方法も数多くあり、個
々の植物に適合されている。その大部分は、原形質体形
質転換（Marton他、１９７９年）又は成体植物からの組
織小片の形質転換（Horsch他、１９８５年）に基づくも
のである。以下の例においては、ベクターは、二元性の
無防備のＴｉ−プラスミドベクターであり、標識は、カ
ナマイシン耐性のあるものでリーフディスク形質転換方
法が用いられている。

【００７２】形質転換手順からのカルスは、選択可能な
標識に基づいて選択され、適切なホルモン導入により成
体植物に再生される。これも又、使用されている植物の
種に応じて変化する。再生された植物は次に種子を収穫
できるような安定した系統を作り上げるのに用いられ
る。

【００７３】４．生物学的に活性なポリペプチドの回
収。 ２Ｓ植物アルブミンの精製は、充分に実証されている
（Youle及び Huang、１９８１年；Ampe他、１９８６
年）。これは成熟した種子内の主要なタンパク質であ
り、水性緩衝液中で高い可溶性を示す。２Ｓ貯蔵タンパ
ク質の典型的な精製には、以下のようなステップが関与
してくる：１）ドライアイス内での種子の均質化及びヘ
キサンでの抽出；２）高塩分緩衝液での抽出及び精製水
に対する透析（汚染グロブリンを析出させる）；３）ゲ
ルろ過クロマトグラフィによる水溶性分画の付加的な精
製（これによりより小さな２Ｓ貯蔵タンパク質がより大
きな汚染物質から分離される）；そして４）イオン交換
クロマトグラフィによる最終的精製。使用される正確な
方法は、ここで記される技法にとって決定的な重要性を
もつものではなく、ゲルろ過、イオン交換及び逆相クロ
マトグラフィ及びアフィニティ又はイムノアフィニティ
クロマトグラフィを含む、広範な古典的技法を、キメラ
２Ｓアルブミンを精製するためそしてそれがアルブミン
から開裂された後生物学的に活性なペプチドを精製する
ための両方に適用することができる。この開裂のために
用いられる正確な技術は、側面にある配列（上記参照）
の設計の時点で決定される戦略によって決められる。２
Ｓアルブミンは、プロテアーゼに対し幾分か抵抗性を有
するため、プロテアーゼ処理の前に往々にして変性ステ
ップを含み入れるべきである（例を参照のこと）。

【００７４】５．生物学的に活性なペプチドの検定。 回収された生成物についての検定は明らかに、生成物自
体によって異なる。植物の初期スクリーニングのために
は、問題のペプチドの存在を検出するのに免疫学的検定
を用いることができる。望まれる生成物に対する抗体、
往々にして、それがなお雑種２Ｓタンパク質の一部分で
ある間ででも機能する。そうでない場合には、これは雑
種から部分的又は完全に解放されなくてはならず、その
後でペプチド混合物を用いることができる。抗体を用い
たスクリーニングは、古典的なＥＬＩＳＡ技法（Engval
l ＆ Pesce、１９７８年）によって行なわれるか又は、
以前にポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離され
たタンパク質のニトロセルロースブロットに基づいて行
なわれる（ウエスタンブロット法、Towbin他、１９７９
年）。精製されたペプチドはさらに、アミノ酸の組成及
び配列分析により分析され、その同一性が確認される。

【００７５】生物学的活性についての生物学的検定は当
然のことながら、問題の最終的ペプチドの性質及び機能
によって左右される。

【００７６】本発明はまた、適当なベクターとして植物
の種子貯蔵タンパク質を用いた、生物学的に活性であり
うる標識づけされたタンパク質の生成にも適用できると
いうことも、理解しなくてはならない。この場合、上述
の項目３）に記されている、得られた形質転換体の植物
再生は、標識づけされた炭素源（^{1 3}Ｃ）及び／又は、窒
素源（^{1 5}Ｎ）及び／又は水素源(²Ｈ）及び／又は硫黄源
（^{3 5}Ｓ）及び／又はリン光体源（^{3 2}Ｐ）が形質転換され
た成長中の植物に対して与えられるべき条件の下で起こ
らなくてはならない。（Kollman他、１９７９年；Jung
＆ Jettner、１９７２年、De Wit他、１９７８年）。

【００７７】本発明の付加的な特徴は、とくに以下の添
付の図面に基づいた、制限的な意味の無い特定の例の開
示を通して明らかになるものと思われる：

【００７８】− 図１、図２、図３、図４及び図５は、
すでに上述のような２Ｓ−貯蔵タンパク質の全体的特長
を示している。

【００７９】− 図６は、以下に指示されているように
得られたｐＢＮ２Ｓ１プラスミドから得たブラジルナッ
ツの２Ｓ−アルブミンの配列の一部分とその関連要素を
表わしている。

【００８０】− 図７は、他の図面に示されている構成
内で用いられている制限部位を表わしている。

【００８１】− 図８及び図９は、１つの前駆体をコー
ド付けする核酸を含む制限フラグメントを含むキメラプ
ラスミドの構成の連続的段階を図式的に示している（な
お、かかる核酸は本書において「前駆体−コード付け核
酸」と呼ばれ、この全体は、特に部位指向性をもつ突然
変異誘発を通して問題のポリペプチドをコード付けする
ＤＮＡの挿入による変更に適している）。

【００８２】− 図１０は、上述の部位指向性の突然変
異誘発の実施に適したプラスミドの制限部位及び遺伝地
図を示している。

【００８３】− 図１１は、一般に適当な場所での核酸
の変更に適用できるようなStanssens他（１９８７年）
の部位指向性突然変異誘発手順のさまざまな段階を図式
的に示している。

【００８４】− 図１２、図１３及び図１４は、以下の
開示において例としてＬｅｕ−エンケファリンが用いら
れているような１つの問題のポリペプチドをコード付け
するインサートを、その前駆体核酸配列の可欠領域内に
含み込むため、この前駆体核酸を含む上述のキメラプラ
スミドを変更する諸段階を、図式的に示している。

【００８５】− 図１５は、Arabidopsis thaliana２Ｓ
アルブミン遺伝子を含む１kbフラグメントの配列を表わ
し、関連する要素を示している。

【００８６】− 図１６は、上述のArabidopsis ２Ｓタ
ンパク質の大きなサブユニットのタンパク質配列を、関
連するオリゴヌクレオチド配列と共に提供している。

【００８７】− 図１７は、ｐＧＳＣ１７０３の制限地
図を示している。

【００８８】− 図１８は、ｐＧＳＣ１７０３Ａの制限
地図を示している。

【００８９】− 図１９のＡ図は、Ｃ４カラム上での、
標識として用いられた合成ペプチドＹＧＧＦＬＫのアリ
コートのクロマトグラムを表わしている。勾配（破線）
は０％の溶剤で０〜５分で平担であり、溶剤Ｂは７０分
で１００％に達するべく増大する。溶剤Ａ：水中０．１
％ＴＦＡ；溶剤Ｂ：７０％ＣＨ₃ＣＮ中０．１％のＴＦ
Ａ。

【００９０】− 図１９のＢ図は、図１９のＡ図で行な
われたものと同じ条件下での酸化された２Ｓ上のトリプ
シン消化のクロマトグラムを表わす、斜線のついたピー
ク部を収集して、さらに精製を行なった。

【００９１】− 図２０のＡ図は、Ｃ１８カラム上で
の、標識として用いられた合成ペプチドＹＧＧＦＬＫの
アリコートのクロマトグラムを表わす。勾配（破線）は
０％溶剤Ｂにて０分〜５分の間平担であり、溶剤Ｂは７
０分で１００％に達するべく増大する。溶剤Ａ：水中
０．１％ＴＦＡ；溶剤Ｂ：７０％ＣＨ₃ＣＮ中０．１％
ＴＦＡ。

【００９２】− 図２０のＢ図は、Ｃ４カラム上でＨＰ
ＬＣから得られたピークを含むＹＧＧＦＬＫのＣ１８カ
ラム上での再クロマトグラフィを表わす（図１９のＢ図
を参照）。実施条件は、図２０のＡ図の場合と同じであ
る。

【００９３】− 図２１は、ＹＧＧＦＬＫ上のアミノ酸
配列の決定の結果を表わす。左の角の囲みは、ＰＴＨア
ミノ酸の標準を示す（各々２０ｐモル）。サイクル１〜
６についての信号は、基準より８倍減衰されている。

【００９４】− 図２２のＡ図は、マーカーとして用い
られるＹＧＧＦＬペプチドを示すクロマトグラムであ
る。このペプチドは合成ペプチドＹＧＧＦＬＫに対する
カルボキシペプチダーゼＢ消化の結果である。実施条件
は、図１９のＡ図の場合と同じである。

【００９５】− 図２２のＢ図は、植物材料から分離さ
れたＹＧＧＦＬＫペプチドに対するカルボキシペプチダ
ーゼＢ消化の後の、＊印で表わされたＩＧＧＦＬペプチ
ドの分離を示している。

【００９６】− 図２３は、超可変領域のほぼ全ての欠
失及びそのＡｃｃＩ部位での置換、以下の開示に例とし
て与えられている開裂部位及びＧＨＲＦをコード付けす
る配列の、特に部位指向性突然変異誘発を通してのＡｃ
ｃＩ部位内への挿入ならびに、植物の形質転換に適した
植物ベクター内の前記キメラ遺伝子のクローニングを含
む、キメラ２ＳアルブミンのArabidopsis thaliana遺伝
子の構成の連続的段階を、図式的に示している。

【００９７】− 図２４のＡ図は、ＧＨＲＦＳ及びＧＨ
ＲＦＬ遺伝子の構成に用いられる８つのオリゴヌクレオ
チドを示している。オリゴヌクレオチドの限界は垂直線
で表わされ、かかるオリゴヌクレオチドの上下の数字は
その番号を示す。オリゴヌクレオチド４及び８におい
て、囲み内に入っている塩基は除外され、結果としてＧ
ＨＲＦＳをコード付けする遺伝子が得られる。このＧＨ
ＲＦＳとＧＨＲＦＬのペプチド配列及び、ＣｎＢｒ開裂
部位を与えるメチオニン配列は、ＤＮＡ配列の上に示さ
れている。

【００９８】− 図２４のＢ図は、修飾されたＡＴ２Ｓ
１遺伝子のＡｃｃＩ部位及び、オープンリーディングフ
レームが維持されるようにするこのＡｃｃＩ部位内への
前記ＧＨＲＦの挿入を示している。

【００９９】例１ 記述されている方法の第１の例としてヒトの脳及びその
他の神経繊維内においてアヘン剤活性をもつペンタペプ
チドであるＬｅｕ−エンケファリンの生成のための手順
が示される。（H. Ughes他、１９７５ａ）。ペプチド及
び特異的プロテアーゼの開裂部位をコード付けする合成
オリゴマーが、Bertholletia excelsa（ブラジルナッ
ツ）の２Ｓアルブミンをコード付けするｃＤＮＡクロー
ン内で超可変領域の一部と置換される。このキメラ遺伝
子は、大豆のレクチン遺伝子のプロモータ及びシグナル
ペプチドコード付け領域を含むフラグメントに融合させ
られる（Goldberg他、１９８３年）。この構成全体を、
アグロバクテリウムを媒介にした形質転換システムを用
いてタバコに移入（転移）させる。この植物を再生さ
せ、開花の後種子を収集し、２Ｓアルブミンを精製す
る。

【０１００】オリゴヌクレオチド内に組み込まれた開裂
部位をもつ２つの特異的プロテアーゼを用いて、２Ｓア
ルブミンからエンケファリンペプチドを開裂させ、次に
ＨＰＬＣ技法を用いてこれを回収する。

【０１０１】１．ｃＤＮＡの合成及びスクリーニング Harris及びDureにより記述されている方法（１９８１
年）を用いてブラジルナッツのほぼ成熟した種子から全
ＲＮＡを分離する。次に、オリゴｄＴクロマトグラフィ
を用いてポリＡ＋ＲＮＡを分離する（Maniatis他、１９
８２年）。いくつかの公開されている方法のいずれか
（Maniatis他、１９８２年；Okayama ＆ Berg、１９８
２年；Land他、１９８１年；Gubler ＆ Hoffman、１９
８３年）を用いて、ｃＤＮＡの合成及びクローニングを
行なうことができる。この事例においては、ブラジルナ
ッツからの２Ｓアルブミンが配列決定され（Ampe他、１
９８６年）、アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチド
が構築された。これは、Maniatis他（１９８２年）の方
法を用いて作られたｃＤＮＡライブラリをスクリーニン
グするのに用いられた。結果として得られたクローンは
あまりにも短すぎることがわかり、Gubler及びHoffman
（１９８３年）の方法を用いて第２のライブラリを作
り、第１のより短いｃＤＮＡクローンを用いてスクリー
ニングさせた。ブラジルナットの２Ｓアルブミン配列を
含むＤＮＡ組換え体を分離した。後者をさらに、プラス
ミドｐＵＣ１８内でクローニングさせた〔Yanisch-Perr
on, C., Vieira, J.及びMassino, J.（１９８５年）、
「Gene（遺伝子）」３３、ｐ１０３〜１１９〕

【０１０２】回収されたプラスミドをｐＢＮ２Ｓ１と呼
称した。誘導されたタンパク質配列、ＤＮＡ配列、置換
されるべき領域及び関連する制限部位は、図６に示され
ている。

【０１０３】導き出されたタンパク質配列（プラスミド
ｐＢＮ２Ｓ１から得られたもの）は、ＤＮＡ配列の上に
示され、タンパク質分解処理部位が示されている（図
６）。シグナル配列の終りは、ａで表わされている。図
８、図９、図１２、図１３及び図１４中の構造にて用い
られている制限部位が表示されている。構造の後半部分
内で用いられるＰｓｔＩ部位を表示する目的で、クロー
ニングベクターのポリリンカーが示されている。挿入さ
れるべきペプチドのタンパク質及びＤＮＡ配列は、突然
変異誘発に用いられるべきオリゴヌクレオチドの残りと
共に、ｃＤＮＡ配列の下に示されている。突然変異誘発
手順の間、図示されているオリゴヌクレオチドは、ｃＤ
ＮＡの反対側のストランドに対し交雑される（図１２参
照）。

【０１０４】２．キメラ遺伝子の構成。 まず、大豆のレクチン遺伝子のシグナルペプチドとプロ
モータをコード付けするＤＮＡフラグメントに２Ｓアル
ブミン遺伝子を融合させる。レクチン及びブラジルナッ
ツの両方の中のシグナルペプチドの開裂点は、標準的コ
ンセンサスシーケンスから誘導される（Perlman ＆ Hal
vorson、１９８３年）。以下にそして図６内に、関連配
列が示されている：

【０１０５】プラスミドｐＬｅ１、ｐＳＯＹＬＥＡ１及
びｐＢＮ２Ｓ１内のシグナルペプチド／成熟タンパク質
配列の領域内のタンパク質配列及び２本鎖ＤＮＡ配列が
図７に示されている。図面に示されている構造において
用いられる制限部位の位置及び認識部位が示されてい
る。＊印は、シグナル配列の終りのタンパク質開裂部位
を表わす。

【０１０６】構成の出発点は、大豆のゲノムHindIIIフ
ラグメントを含むプラスミドｐＬｅ１（Okamuro他、１
９８７年）である。このフラグメントには、大豆レクチ
ン遺伝子全て、そのプロモータ、種子特異的発現にとっ
て重要でありうるプロモータの上流の配列が含まれてい
る。このフラグメントから、適当な大豆レクチンプロモ
ータ／シグナル配列のカセットが、図８に示されている
ように構成された。ＤｄｅＩ部位は、シグナル配列（Ｓ
Ｓ）をコード付けする配列の終りにあり、その開裂部位
（Ｃ／ＴＣＡＧ）はプロセシング部位に相当する。この
プロセシング部位において有効な制限部位を得るため
に、ＳＳ配列のＫｐｎＩ−ＤｄｅＩフラグメント（以下
「ＳＳ」と呼ぶ）をｐＬＥ１から分離し、それ自体Ｋｐ
ｎＩ及びＢｇ１IIで線形化されたｐＬＫ５７へクローニ
ングする（Botterman、１９８６年）。ＤｄｅＩ及びＢ
ｇ１IIの末端には、Klenow ＤＮＡポリメラーゼＩを満
たす。これはＢｇ１II部位（Ａ／ＧＡＴＣＴ）を再構成
し、その開裂部位はこのときシグナル配列処理部位に相
当する（図８、図９参照）。このようにして得られたプ
ラスミドｐＳＯＹＬＥＡ１は、従って、プラスミドｐＬ
Ｋ５７から成り、ここにおいて当初ｐＬＥ１内に含まれ
ていたＳＳ配列のＫｐｎＩ−ＤｄｅＩフラグメント（Ｓ
Ｓ）はｐＬＫ５７の初期ＫｐｎＩ−Ｂｇ１IIフラグメン
トで置換されている。HindIII部位は、図６に図式的に
示されているように、ｐＳｏｙＬｅａ１内の（１）で表
わされたＰｓｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントの代りにｐＬ
Ｋ６９からの前記HindIII部位を含むＫｐｎＩ−Ｐｓｔ
Ｉフラグメントを置換することにより、このフラグメン
トの前に置かれている。この中間構成はｐＳｏｙＬｅａ
２と呼ばれる。第２段階においては、ｐＳｏｙＬｅａ２
内にｐＬＥ１のHindIII−ＫｐｎＩフラグメント（２）
を挿入することによりレクチンプロモータを再構成す
る。このプロモータフラグメントの上流には別のＢｇ１
II部位があるため、レクチンプロモータ／シグナル配列
カセットは、このときＢｇ１II−Ｂｇ１IIフラグメント
としてプラスミドｐＳｏｙＬｅａ３中に存在する。

【０１０７】このカセットはこのとき、プラスミドｐＢ
Ｎ２Ｓ１の２０５ｂｐブラジルナッツｃＤＮＡフラグメ
ントとレジスタ内で融合する。なおこれは、ブラジルナ
ッツのプロ−２Ｓアルブミンに対するコード付け配列
（すなわちシグナル配列を除く前駆体分子全て）を含ん
でいる。このことは、図７に示されているとおりに行な
われる。Ｂｇ１ＩでのｃＤＮＡクローンｐＢＮ２Ｓ１の
消化（図６）、Ｂｇ１Ｉ突出末端を切除するためのKlen
owＤＮＡポリメラーゼＩでの処理及びＰｓｔＩでの消化
の後に得られた２０５ｂｐフラグメントは、ＳｍａＩ及
びＰｓｔＩでの消化により線形化されたｐＵＣ１８へク
ローニングされる（Yannish-Perron他、１９８５年）。
結果として得られたプラスミドｐＵＣ１８−ＢＮ１は、
両末端共に充てんされ再結紮されているＥｃｏＲＩ及び
ＡｖａＩの両方で消化される。その結果、最初にＥｃｏ
ＲＩ部位をもつ望ましいブラジルナッツコード付け配列
を含むｐＵＣ１８−ＢＮ２と呼ばれる新しいプラスミド
が再構成されることになる（図９）。

【０１０８】レジスタ内のブラジルナッツコード付け配
列をレクチンプロモータ／シグナル配列カセットに融合
するために、ｐＵＣ１８−ＢＮ２はＥｃｏＲＩで消化さ
れ、末端は、ｄＡＴＰのみが存在する中でKlenow酵素を
用いて部分的に充てんされる。残りの張出しヌクレオチ
ドはＳ１ヌクレアーゼで除去され、その後ＰｓｔＩ消化
が行なわれる。こうして１つの平滑末端と１つのＰｓｔ
Ｉ消化末端をもつフラグメントが生み出される。レクチ
ンプロモータ／シグナル配列フラグメントは、充てんさ
れたＢｇ１II末端をもつＥｃｏＲＩ−Ｂｇ１IIフラグメ
ントとして、ｐＳｏｙＬｅａ１（図９）からとられる。
これら２つのセグメントはＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化さ
れたｐＵＣ１８で合わせて結紮される。この結果、シグ
ナルペプチドコード付け配列とブラジルナッツ配列の接
合部に再構成されたＢｇ１II部位をもつｐＵＣ１８ＳＬ
ＢＮ１が得られる（図９）。従ってｐＵＣ１８ＳＬＢＮ
１は、ｐＳｏｙＬｅａ１のＢｇ１II−ＥｃｏＲＩフラグ
メント（図８に（３）として示されている）そしてその
転写方向上流にはｐＵＣ１８ＢＮ２により供給されブラ
ジルナッツプロ−２Ｓアルブミンに対する２０５ｂｐｃ
ＤＮＡコード付け配列を含むＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＥｃｏ
ＲＩフラグメントが中に挿入されてしまっているｐＵＣ
１８プラスミドで構成される。

【０１０９】しかしながら、読みとり枠は適切に維持さ
れていない。これを補正するために、このプラスミドを
Ｂａ１IIで線形化し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、再結
紮する。この中間体をｐＵＣ１８ＳＬＢＮ２と呼ぶ。こ
の構成は最後に、ｐＳｏｙＬｅａ３からのプロモータの
５′部分を担うＫｐｎＩフラグメントを挿入し、ｐＵＣ
１８ＳＬＢＮ３を生み出し、ｐＢＮ２Ｓ１からのブラジ
ルナッツｃＤＮＡの３′部分を含むＰｓｔＩフラグメン
トを後者に挿入することにより、２段階の作業にて完成
される。その結果得られた最終的構成ｐＵＣＳＬＢＮ４
は、ＢａｍＨＩフラグメント内に含まれているレクチン
プロモータ／シグナル配列−ブラジルナッツｃＤＮＡ配
列の融合物を含んでいる。

【０１１０】３．エンケファリン及びプロテアーゼ開裂
部位をコード付けする配列での超可変領域の一部分の置
換。 Ｌｅｕ−エンケファリンペプチドはＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕの配列を有する（Hughes他、１９
７５ｂ）。精製後の雑種２Ｓアルブミンから無傷のポリ
ペプチドを回復することができるように、リジンをコー
ド付けするコドンを、エンケファリンコード付け配列の
いずれかの側に置く。こうすることによって、下流の処
理段階においてひきつづき、エンドペプチダーゼエンド
リジン・Ｃ及びカルボキシペプチダーゼＢ、２Ｓアルブ
ミンからエンケファリンポリペプチドを開裂することが
できる。最後に、突然変異誘発の間に、オリゴヌクレオ
チドが間隙ある二本鎖分子に交雑できるようにするため
（以下参照）、保持すべきブラジルナッツ配列に対し相
補的な追加配列を含み入れる。複数の植物貯蔵タンパク
質遺伝子におけるコドン使用を研究した後決定されたオ
リゴヌクレオチドの正確な配列は以下のとおりである：
５′−ＧＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＡ
ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＣＧ−３′

【０１１１】ブラジルナッツ２Ｓアルブミンの超可変領
域をコード付けする配列の一部分の置換は、プライマと
してオリゴヌクレオチドを用い部位指向の突然変異誘発
を使って行なわれる（図６及び図１２）。Stanssens他
（１９８７年）のシステムが用いられる。

【０１１２】Stanssens他の方法は図１１に図示されて
おり、以下に再現する。これは、その制限及び遺伝子地
図が図１０に示されその主な特長も又以下に再現されて
いるようなプラスミドｐＭａｃ５−８を用いる。

【０１１３】ｐＭａｃ５−８の関連する遺伝子座は、図
１０に示されている。矢印は、その機能的方向性を示
す。ｆｄＴ：ファージｆｄの中央転写終結信号（ターミ
ネータ）；Ｆ１−ＯＲＩ：繊維状ファージ（ｆ１）の複
数起点；ＯＲＩ；Ｃｏ／Ｅ１タイプの複数起点；ＢＬＡ
／Ａｐ^R：β−ラクタマーゼに対しコード付けする領
域；ＣＡＴ／Ｃｍ^R：クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼに対しコード付けする領域。ｐＭｃ５
−８（ｂｌａ−ａｍ遺伝子はＳｃａＩ部位をもたない）
及びｐＭｃ５−８（ｃａｔ−ａｍ：突然変異は単一のＰ
ｖｕIII部位を除去する）内に存在するアンバー突然変
異の位置が示されている。ｓｕｐＥ及びｓｕｐＦ宿主の
両方におけるｃａｔアンバー突然変異の抑制の結果、少
なくとも２５μg/mlのＣｍに対する耐性が得られる。ｐ
Ｍｃ５−８は、それぞれｓｕｐＥ及びｓｕｐＦ菌株での
アンバー抑制の時点で±２０μg/ml及び１００μg/mlの
Ａｐに対する耐性を与える。野生型ｃａｔ遺伝子内に存
在するＥｃｏＲＩ、ＢａｌＩ及びＮｃｏＩ部位（星印で
示されている）は、突然変異技術を用いて除去された。

【０１１４】以下に記されているように、ここで例示さ
れている２Ｓ−アルブミン領域の選択された超可変領域
に対するＬｅｕ−エンケファリンペプチドの置換に対し
ても適用されるようなこのStanssens方法の原理も同様
にまず、以下に再現される：

【０１１５】基本的に、上述の置換のために用いられる
突然変異誘発の１ラウンドは、以下のように進行する。
閉じた円でＡｐ及びＣｍ選択可能標識内のアンバー突然
変異が示されている図１１を参照する。記号は、突然変
異誘発オリゴヌクレオチドを表わす。突然変異自体は矢
印の頭で示されている。

【０１１６】このプロセスの個々の段階は、以下のとお
りである： − 標的ＤＮＡフラグメントのｐＭａ５−８へのクロー
ニング（Ｉ）。このベクターは、Ｃｍ^R遺伝子内のアン
バー突然変異を続行し、アンピシリンに対する耐性を規
定する； − 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖ＤＮＡ
の調製（II）； − 相補的ｐＭｃ型プラスミドからの制限フラグメント
の調製（III）。ｐＭｃ型ベクターは、Ａｐ耐性標識内
にアンバー突然変異がとり込まれている一方で、野生型
Ｃｍ^R遺伝子を含んでいる； − 試験管内ＤＮＡ／ＤＮＡ交雑による間隙二本鎖ＤＮ
Ａ（以下ｇｄＤＮＡと呼ぶ）の構成（IV）。ｇｄＤＮＡ
内において、標的配列は一本鎖ＤＮＡとして露出され
る。交雑のその他のコンポーネントからのｇｄＤＮＡの
予備的精製は必要でない； − ｇｄＤＮＡへの合成オリゴヌクレオチドのアニーリ
ング（Ｖ）； − 同時試験管内ＤＮＡポリメラーゼ／ＤＮＡリガーゼ
反応による残りの間隙の充てんならびにニックのシーリ
ング（VI）； − Ｃｍ耐性について選択する、ｍｕｔＳ宿主、すなわ
ちミスマッチ修復において欠失している菌株の形質転
換。この結果、混合プラスミド後代が生成される（VI
I）； − アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の
再形質転換による鋳型ストランド（ｐＭａ型）から誘導
される後代の除去（VIII）。Ｃｍ耐性に関する選択の結
果、間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘発
オリゴヌクレオチドが取り込まれているストランドから
誘導された後代が豊富になる； − 望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結
果として得られたクローンのスクリーニング。

【０１１７】図１１に描かれている突然変異誘発実験に
おいて、Ｃｍ耐性は、合成標識のための間接的な選択と
して用いられる。明らかに、Ａｐ選択可能な標識が開発
利用されるように、実験をセットアップすることもでき
る。後者の場合、一本鎖鋳型（II）及びフラグメント
（III）はそれぞれｐＭｃ及びｐＭａ−型である。単一
の突然変異誘発プロセスは、望ましい突然変異の導入の
みならずプラスミドのｐＭａ型からｐＭｃ型への又はそ
の逆の変換という結果をもたらす。従って、これら２つ
の形態の間の循環（アンピシリン又はクロラムフェニコ
ールに対する抵抗性についての交互選択も含む）を用い
て、連続する突然変異誘発ラウンド中に標的配列内で多
くの突然変異を構成することができる。

【０１１８】ここで、ブラジルナッツ２Ｓアルブミンの
超可変領域をコード付けする配列の一部分の置換に関す
る本例に戻ると、Stanssens他のシステムは以下のよう
に適用される：

【０１１９】問題の領域を含むキメラ遺伝子のＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩフラグメント（図１２、図１３及び図６参
照）を、アンバー突然変異を伴うクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子と無傷のベータラク
タマーゼ遺伝子を運ぶｐＭａベクター内に挿入し（図１
２）、出発プラスミドがアンピシリン耐性のみを付与
し、クロラムフェニコール耐性を付与しないようにす
る。一本鎖ＤＮＡ（図６に示されているものと反対のス
トランドを表わす）を調製し、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ線
形化形状のｐＭｃ型プラスミドでアニーリングし、間隙
ある二本鎖分子を生成する。オリゴヌクレオチドをこの
間隙二本鎖にアニーリングする。一本鎖間隙を、Klenow
ＤＮＡポリメラーゼＩで充てんし、結紮し、混合物を適
切な宿主に形質転換させる。望ましい突然変異を有する
クローンは、アンピシリンに対し敏感であるが、クロラ
ムフェニコールに対する耐性をもつ。クロラムフェニコ
ール耐性をもつ形質転換体を選び、ＤＮＡ配列づけによ
り分析する。最後に、ｐＵＣ１８ＳＬＢＮ４内のＰｓｔ
１−ＮｃｏＩフラグメントをｐＭＣ５８ＢＮからの突然
変異誘発されたものと置換することにより、雑種遺伝子
フラグメントをレクチン／ブラジルナッツキメラに挿入
し直す（図１３）。結果として得られたプラスミドｐＵ
Ｃ１８ＳＬＢＮ５は、全てＢａｍＨＩフラグメントとし
て、雑種ブラジルナッツ−エンケファリン遺伝子に融合
されたレクチンプロモータ及びシグナルシーケンスを含
む。

【０１２０】４．タバコの形質転換 キメラ遺伝子を含むＢａｍＨＩフラグメントを、二元性
ベクターｐＧＳＣ１７０２のＢａｍＨＩ部位内に挿入す
る（図１４）。このベクターは、大腸菌（E.coli）及び
A. tumefaciensの両方における安定性及び選択のための
官能基ならびにＴ−ＤＮＡフラグメントとして外来性Ｄ
ＮＡの植物ゲノムへの転移のための官能基を含んでいる
（Deblaere他、１９８７年）。後者は、オクトピンＴ−
領域の末端反復配列から成る。フラグメントがクローニ
ングされるＢａｍＨＩ部位は、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子７のポ
リアデニル化シグナルの前にある。ノパリン合成（ｎｏ
ｓ）プロモータ、ネオマイシンフォスフォトランスフェ
ラーゼタンパク質コード付け領域（ｎｅｏ）及びＯＣＳ
遺伝子の３′末端基から成るキメラ遺伝子が存在するた
め、形質転換された植物はカナマイシン耐性をもつこと
になる。標準的な手順（Deblaere他、１９８７年）を用
いて、プラスミドを、プラスミドｐＧＶ２２６０をもつ
アグロバクテリウム菌株Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆに転移させ
る。後者は植物のゲノムへＴ−ＤＮＡ領域をうまく転移
させるのに必要とされるin trans及びｖｉｒ遺伝子官能
基を与える。次にこのアグロバクテリウムを用いて、標
準の手順により菌株ＳＲ１のタバコを形質転換する（De
blaere他、１９８７年）。１００μg/mlのカナマイシン
上でカルスを選択し、耐性あるカルスは、植物を再生す
るのに用いる。これらの植物から調製されたＤＮＡを、
ブラジルナッツの２Ｓアルブミンクローン又はオリゴヌ
クレオチドとの交雑により雑種遺伝子の存在についてチ
ェックする。陽性の植物を生育させ、以下に記されてい
るように処理する。

【０１２１】５．種子からの２Ｓアルブミンの精製 陽性の植物を生育させ種子を生じさせる。これには約１
５週間が必要である。個々の植物の種子を収穫しドライ
アイス中で均質化（ホモジナイス）し、ヘキサンで抽出
する。残留物をLaemmli標本緩衝液に溶かし、沸とうさ
せ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に置く（Laemli、
１９７０年）。分離させたタンパク質をニトロセルロー
スシート上にて電気ブロットし（Towbin他、1９７９
年）、Ｌｅｕ−エンケファリン抗原の市販の多クローン
性抗体で検定する（ＵＣＢｃａｔ、ｆｉ７２／００１、
ｉｂ７２／００２）。

【０１２２】上述の免疫学的検定を用いて、強度に陽性
の植物を選択する。次にこれらをさらに大量に育て、種
子を収穫する。ヘキサン粉末を調製し、高塩度緩衝液
（０．５M ＮａＣｌ、０．０５Mのリン酸ナトリウムpH
７．２）で抽出する。次にこの抽出物を水に対し透析
し、遠心分離で清澄にさせ（３０分間５０，０００×
ｇ）、同じ高塩分緩衝液内で行なわれたSephadexＧ−７
５カラム上でのゲルろ過により上澄みをさらに精製す
る。ＤＥＡＥ−セルロースカラム上の非イオン、非タン
パク質材料のイオン交換クロマトグラフィから、さらに
タンパク質を精製する。次に、２Ｓタンパク質混合物を
含む分画と組合せ、０．５％のＮＨ₄ＨＣＯ₃に対し透析
し、凍結乾燥させる。

【０１２３】６．Ｌｅｕ−エンケファリンの回収 精製された内生の２Ｓ貯蔵タンパク質と雑種２Ｓタンパ
ク質の混合物を、Ｅｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃで消化する。効
果的にタンパク質分解を行なうため、まず過ギ酸で２Ｓ
タンパク質を酸化させる（Hirs、１９５６年）。この酸
化段階は、ジスルフィドブリッジを開き、タンパク質を
変性させる。Ｌｅｕ−エンケファリンは過ギ酸と反応し
うるアミノ酸残基を含んでいないので、この処理によっ
てアヘン誘導体が変わることはない。Ｅｎｄｏ−Ｌｙｓ
−Ｃ消化は、３７℃で１２時間、０．５％のＮＨ₄ＨＣ
Ｏ₃溶液中で実施され、凍結乾燥で終結する。この消化
によりＬｅｕ−エンケファリンは遊離させられるが、な
おＣ末端リジン残基に付着したままである。雑種タンパ
ク質にはその他のリジン残基がきわめてわずかしか含ま
れていないため、ｅｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃペプチドの数は
きわめて少なく、このペプチドの付加的な精製を単純な
ものにしている。エンケファリン−Ｌｙｓペプチドは、
Ｃ１８カラムを用いて（例えばＶＹＤＡＣの商標で市販
されているもの）ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィで精製
する。勾配は、初期溶剤としての０．１％のトリフルオ
ロ酢酸（Ａ）そしてダイリュータ溶剤としての０．１％
のトリフルオロ酢酸中の７０％のアセトニトリル（Ｂ）
で構成されている。一分あたり１．５％のＡ中Ｂ溶剤の
勾配を、Ampe他（１９８７年）により開示されている条
件の下で用いる。精製されたエンケファリン−Ｌｙｓペ
プチドは、アミノ酸分析及び／又は免疫学的方法により
識別する。さらに、カルボキシル末端リジン残基を除去
するためAmbler（１９７２年）が開示したようにカルボ
キシペプチダーゼＢでこれを処理する。最後に、Lewis
他（１９７９年）が開示している方法に従って逆相ＨＰ
ＬＣクロマトグラフィによりオピオイドペプチドの分離
及び精製を達成する。

【０１２４】例IIに示されているとおり、その他の方法
も利用可能である。

【０１２５】７．Ｌｅｕ−エンケファリンの生物学的活
性の検定 エンケファリンは、テンジクネズミの脳のナトリウムの
無いホモジエネ−ト内で〔³Ｈ〕−ナロクソンの結合を
抑制する。前述のように（Simantov他、１９７６年）、
ラットの脳膜に対する特異的〔³Ｈ〕−ナロクソン結合
を抑制する能力として、オピオイド活性を検定すること
が可能である（Pasternak他、１９７５年）。「エンケ
ファリン」のオピオイド活性の１ユニットは、２００μ
lの検定において５０％の占有度を生むような量として
定義づけされた（Colquhaun他、１９７３年）。

【０１２６】例II：当該技法の柔軟性を立証するものと
して、異なる１つの２Ｓアルブミンを用いたＬｅｕ−エ
ンケファリンの生成手順が与えられる。この場合、構成
の基礎としてBertholletia excelsaからのｃＤＮＡクロ
ーンを用いる代りに、Arabisopsisthalianaから分離し
たゲノムクローンを用いる。１つのゲノムクローンが用
いられるため、その遺伝子自身のプロモータが用いら
れ、構成は著しく簡略なものとなる。当該技術の一般性
をさらに立証するため、タバコ、 Arabidopsis及びその
近縁植物であり同様に２Ｓアルブミンを有するBrassica
napis（導入部参照）といった異なる３つの植物におい
て、変化した２Ｓアルブミン遺伝子を発現させる。この
例の細部の多くは前述の例と同様であるため、ここでは
さらに簡単に説明する。

【０１２７】１．Arabidopsis thalianaの２Ｓアルブミ
ン遺伝子のクローニング ２Ｓアルブミンの精製が容易であるとすると（導入部、
例（１）参照）、Arabidopsisの２Ｓアルブミン遺伝子
をクローニングする最も直接的な方法は、タンパク質配
列に基づきオリゴヌクレオチドプローブを作り上げるこ
とである。タンパク質配列は、標準的な技法すなわち基
本的にブラジルナッツの２Ｓアルブミンのものと同じ方
法で決定された（Ampe他、１９８６年）。図１５は、Ar
abidopsis thalianaの２Ｓアルブミン遺伝子を含む１kb
HindIIIフラグメントの配列を示している。導き出され
たタンパク質配列はＤＮＡ配列の上に示され、タンパク
質分解処理部位が表示されている。シグナル配列の終り
はａで示されており、ｓｓｕは小さなサブユニットを表
わす。挿入されるべきペプチドのタンパク質配列及びＤ
ＮＡ配列は、突然変異誘発に用いるべきオリゴヌクレオ
チドの残りのものと同じく、ｃＤＮＡ配列の下に示され
ている。突然変異手順の間、示されているオリゴヌクレ
オチドは、示されているＤＮＡ配列の反対側のストラン
ドに交雑される。構成中にHindIIIフラグメントの方向
性をチェックするために用いられるＮｄｅＩ部位には下
線が引かれている（ｂｐ−１１７）。番号づけシステム
は、開始コドンのＡが塩基対１としてとられるようなも
のである。

【０１２８】オリゴヌクレオチドプローブを用いる上で
の問題点は、１つ以上のコドンが１つのアミノ酸をコー
ド付けする可能性があるため、タンパク質配列からＤＮ
Ａ配列をあいまいでなく決定することが不可能である、
ということにある。従って、あいまいな位置では、塩基
イノシンが用いられた。イノシンの構造は、交雑の強度
を増大させはしないものの減少させもしないというよう
なものである（大塚他、１９８５年；高橋他、１９８５
年）。これに基づき、図１６「Arabidopsis thalianaの
２Ｓアルブミンの大きいサブユニットのタンパク質配
列」に示されているように、３つのオリゴヌクレオチド
プローブが設計された。タンパク質配列の下には、遺伝
子をクローニングするための交雑プローブとして用いら
れるオリゴヌクレオチドの配列がある。Ｉはイノシンを
表わす。

【０１２９】標準的な方法（Maniatis他、１９８２年；
Benton ＆ Davis、１９７７年）を用いて、ファージCha
ron３５内で作られたArabiodopsisＤＮＡのゲノムライ
ブラリをスクリーニングするのに、この３つのオリゴヌ
クレオチドを用いた（Loenen＆ Blattner、１９８３
年）。オリゴヌクレオチドをキナーゼ化し（Miller ＆B
arnes、１９８６年）、５×ＳＳＰＥ（Maniatis他、１
９８２年）、０．１％のＳＤＳ、０．０２％のフィコー
ル、０．０２％のポリビニルピロリドンそして５０μg/
mlの音波処理されたニシンの精液ＤＮＡの中で４５℃で
交雑を行なった。フィルターは、４〜８分４５度で５×
ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄した。これらの条件
を用いて、これら３つのオリゴヌクレオチドプローブ全
てと交雑した１つのクローンを分離した。適当な領域
を、標準的な技法（Maniatis他、１９８２年）を用いて
ｐＵＣ１８にサブクローニングし（Yanisch-Perron他、
１９８５年）、Maxam ＆ Gilbert（１９８０年）の方法
を用いて配列づけした。この遺伝子を含む領域の配列
は、図１５に示されている。

【０１３０】２．エンケファリン及びプロテアーゼ開裂
部位をコード付けする配列での可変領域の一部分の置換 上述の分離された遺を、Ｌｅｕ−エンケファリン／２Ｓ
アルブミンキメラの構成のために直接使用した。第１の
例の場合と同様に、下流の処理段階においてエンケファ
リンポリペプチドを回収することができるようにＬｅｕ
−エンケファリン配列とその両側にリジンコード付けコ
ドンを、そして突然変異誘発の間オリゴヌクレオチドが
間隙ある二本鎖分子に交雑できるように側面にあるArab
idopsis配列に対し相補性のある追加配列を取込む１つ
のオリゴを設計した。その結果として得られたオリゴヌ
クレオチドの配列は、以下のようなものである：５′−
ＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴ
ＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣ−３′

【０１３１】配列中のその位置は図１０に示されてい
る。

【０１３２】遺伝子及び必要な全ての調節信号を含むの
に充分なフランキング領域を含む領域は、クローニング
ベクターｐＪＢ６５内に挿入された３．５kbのＢｇ１II
フラグメント上で含まれている（Botterman他、１９８
７年）。このクローンはｐＡＴ２Ｓ１Ｂｇと呼ばれる。
突然変異誘発されるべき領域は、３．６kbのＢｇ１IIフ
ラグメント内で１kbのHindIIIフラグメント上で含まれ
ており、この比較的小さいフラグメントは、Stanssens
他（１９８７年）のｐＭａ５−８ベクターのHindIII部
位内に挿入される（図７）。非対称のＮｄｅＩを用いて
方向性をチェックする（図１０）。突然変異誘発は、例
１のステップ３に記されている戦略そのものを用いて行
なわれる。その後、標準的な技法（Maniatis他、１９８
２年）を用いて、雑種遺伝子を、突然変異誘発されたも
のを伴うより大きいフラグメント内に再度挿入する。再
びＮｄｅＩ部位を用いて方向性をチェックする。

【０１３３】３．植物の形質転換 雑種遺伝子ならびに、遺伝子調節のための適当な信号が
確かに存在するようにするためのコード付け領域に対す
る充分なフランキング配列（５′と３′の両方）を含ん
でいるＢａ１IIフラグメントを、例１において用いられ
ているのと同じ二元性ベクターｐＧＳＣ１７０２のＢａ
ｍＨＩ部位内に挿入する（図１４）。このベクターにつ
いては、例１の第４節に記されている。タバコの形質転
換はまさにそこに記述されているとおりに行なわれる。
Arabidopsis thaliana及びBrassica hapusの形質転換
は、同じベクター内で全く同じ構成が用いられうるよう
なものである。例１の第４節に記されているようにアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンスに対する授動の後、
それぞれArabidopsis及びBrassicaの形質転換のため
に、Llyod他（１９８６年）及びklimaszewska他（１９
８５年）の手順を用いる。各々の場合において、タバコ
についてと同様、カルスを１００μg/mlのカナマイシン
上で選択し、耐性あるカルスを植物の再生に用いること
ができる。このような植物から調製されたＤＮＡを、突
然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドとの交雑に
より、雑種遺伝子の存在についてチェックする（タバコ
及びBrassicaの場合、雑種構成の比較的大きい部分を用
いることができるが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの場合、
これらは内生の遺伝子と交雑する）。

【０１３４】本発明の実施態様において、雑種遺伝子な
らびに、遺伝子調節のための適切な信号が必ず存在する
ようにするのに充分なコード付け領域に対するフランキ
ング配列（５′及び３′の両方）を含むＢａ１ＩＩフラ
グメントは、二元性ベクターｐＧＳＣ１７０３（図１
７）又はｐＧＳＣ１７０３Ａ（図１８）のＢｇ１II部位
内に挿入される。ｐＧＳＣ１７０３は、大腸菌及びアグ
ロバクテリウムの両方における選択のための官能基、な
らびに外来性ＤＮＡの植物ゲノム内への転移を可能にす
るＴ−ＤＮＡフラグメントを含んでいる（Deblaere他、
１９８７年）。これにはさらに、ネオマイシンフォスフ
ォトランスフェラーゼタンパク質コード付け領域（ＮＰ
ＴII）及びｏｃｓ遺伝子の３′末端基を伴う両方向性プ
ロモータＴＲ（Velten他、１９８４年）が含まれてい
る。これには、ｐＧＳＣ１７０２のようにアンピシリン
耐性をコード付けする遺伝子は含まれておらず、そのた
め、感染段階の後アグロバクテリウムを殺すのにカルベ
ニシリンならびにクラフォランを用いることができる。
ベクターｐＧＳＣ１７０３Ａは、ハイグロマイシントラ
ンスフェラーゼをコード付けする付加的な遺伝子と共
に、ベクターｐＧＳＣ１７０３と同じ官能基を含んでい
る。このためカナマイシン及びハイグロマイシンの両方
について形質転換体を選択することが可能である。タバ
コの形質転換は、例１の第４節に記されているとおりに
行なわれ、こうして雑種遺伝子は、植物形質転換ベクタ
ーｐＧＳ１７０３内に挿入される。Arabidopsis thalia
na及びBrassicanapusの形質転換は、その中に雑種ＡＴ
２Ｓ１遺伝子が挿入されたｐＧＳＣ１７０３Ａを用いて
行なわれた。プラスミドｐＭＰ９０をもつアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスＣ５８Ｃ１Ｒｉｆへの授動の
後（Koncz ＆ Schell、１９８６年）、（なおこのプラ
スミドは、in trans及びｖｉｒ遺伝子官能基を与えるが
アンピシリン耐性をコード付けする遺伝子は有していな
い）、それぞれArabidopsis及びBrassicaを形質転換す
るためにLyoyd他（１９８６年）及びKlimaszewska他
（１９８５年）の手順が用いられる。同時培養が起こっ
た後アグロバクテリウムを殺すためにカルベニシリンを
用いる。各々の場合において、タバコの場合と同様に、
カルスを１００μg/mlのカナマイシン上で選択し、耐性
あるカルスを植物の再生のために用いることができる。
このような植物から調製されたＤＮＡを、突然変異誘発
において用いられたオリゴヌクレオチドとの交雑によ
り、雑種遺伝子の存在についてチェックする。（タバコ
の場合、雑種構成の比較的大きい部分を用いることがで
きるが、Brassica及びArabiodopsisの場合、これらは、
内生の遺伝子と交雑する）

【０１３５】４．種子からの２Ｓアルブミンの精製及び
付加的な処理 各種属からの陽性の植物を育てて種子をつけさせる。タ
バコの場合、これには約１５週間が必要であるが、Arab
idopsis及びBrassicaについてはそれぞれ６週間及び３
カ月が必要である。異なる品種を使用すると、これらの
期間も異なりうる。種子からの２Ｓアルブミンの精製、
Ｌｅｕ−エンケファリン及び生物学的活性についての後
者の検定は、以下のように行なわれる。

【０１３６】Arabidopsis種子からのエンケファリンの
分離に用いられる方法 Arabidopsis 種子からエンケファリンを分離するのに２
つの方法を用いた。まず第１に、複数の個々の形質転換
体から分離された少量の種子を、キメラ２Ｓアルブミン
の存在についてスクリーニングした。これは、Jones他
（１９８５年）が記述しているように導入された遺伝子
の発現が個々の形質転換体の間で大幅に変わりうるとい
う理由から行なわれるものである。この予備的スクリー
ニングにより見られた個々の植物からの種子を用いて次
に、より多い量を分離し、収量をより正確に測定する。
両方の手順が以下に記されている。

【０１３７】Ａ）エンケファリン含有２Ｓタンパク質の
ための高速スクリーニング手順 個々の植物の種子（約５０mg）を収集し、Eppendorf管
の中でこの管に合う形の小さなプラスチック製グライン
ダを用いて磨砕した。この手順では、ドライアイスは全
く用いない。結果として得られたペーストを１mlのヘプ
タンで３回抽出し、残留物を乾燥させた。粉末を１Mの
ＮａＣｌ ０．２ml中で懸濁させ、Eppendorf遠心分離機
内で５分間遠心分離した。この抽出を三回くり返し、上
澄みを組合せ、合計約０．５mlの量が得られた。この溶
液を水で２０倍に希釈し、最終的に０．０５MのＮａＣ
ｌ濃度を得た。これを一晩４℃で保存し、次にSorvall
ＳＳ−３４ローターで４０分間５０００ rpmの速さで回
転させた。結果として得られた上澄みを、使い捨てのＣ
１８カートリッジ上に通過させた（ＳＥＰ−ＰＡＣ、Mi
llipore, Milford, 米国マサチューセッツ州）。このカ
ートリッジには、５ml／分の速さでカラムを通し注射器
で１０mlの上澄みを注入して装荷した。次にこのカート
リッジを、０．１％のＴＦＡ ２mlで洗い、７％、１４
％、２１％等々で最高７０％までのアセトニトリルを含
む０．１％のＴＦＡ溶液の２ml部分で段階的に溶出する
ことによって脱着させた。２８％から４９％の範囲のア
セトニトリル中に溶出している分画を、異なる分画から
とったアリコートについて行なったＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル分析によって判断されるように、２Ｓアル
ブミンについて富化する。２Ｓアルブミン含有分画を組
合わせ、Speed Vac濃縮器（Savant Instruments）内で
乾燥させた。

【０１３８】組合わされた分画を水中１％ＴＦＡ ０．
９５ml内で再構成させ、ＨＶ−４Millexフィルター（Mi
llipore)を通してろ過し、長さ２５cm直径０．４６cmの
逆相Ｃ₄カラムを適用した（Vydac２１４ TP５４、気孔
径３００オングストローム、粒径５μm）。ＨＰＬＣ機
器は、２台のポンプ（５１０型）、１台の勾配制御装置
（６８０型）そして１台のＬＣ分光検知器（Lamda-Max
４８１型、全て米国マサチューセッツ州、MilfordのWat
ers社からのもの）で構成されていた。勾配は、以下の
ように実行した：すなわち、溶液Ａは、Ｈ₂Ｏ中０．１
％のＴＦＡであり、溶液Ｂは７０％のＣＨ₃ＣＮ中０．
１％のＴＦＡであった。５分間、Ｂ０％Ａ１００％の溶
液をカラム上に流し、その後Ｂの濃度を７０分にわたり
線形的に１００％にまで上昇させていった。２１４nmの
吸収度によりカラムの溶出物を検出した。２Ｓアルブミ
ンを含む分画を収集し、Speed Vac濃縮器内で乾燥させ
た。

【０１３９】プロテアーゼでのより完全な消化を得るた
めには、過ギ酸でジスルフィドブリッジを酸化させるこ
とによりタンパク質を変性することが勧められる。この
ことは、９mlのギ酸と１mlの３０％Ｈ₂Ｏ₂を室温で混合
して作った溶液を０．５ml加えて行なわれる。この溶液
は、使用より２時間前に作られた。０℃で３０分反応を
進ませ、Speed Vac濃縮器内での乾燥で終らせた。微量
の残留ギ酸は、水５００μlを２度加え、標本を凍結乾
燥させることによって除去した。

【０１４０】残渣をpH８．５の０．１MのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ０．７５ml中に再度溶解させ、その後４μgのＴＰ
ＣＫ処理されたトリプシン（Worthington）を加えた。
反応を３時間３７℃で放置し、その後ＴＦＡ １０μlを
加えて終結させ、分析に先立ち−２０℃で保存した。結
果として得られたペプチド混合物を、前述の勾配混合物
及びカラムを用いてＨＰＬＣで分離させる。標準とし
て、期待されるものと同じ配列（ＹＧＧＦＬＫ）のペプ
チドを、標準的な技術を用いてBiolynx４１７５ペプチ
ド合成装置（ＬＫＢ）で合成した。このペプチドをカラ
ム上に流し、保持時間を測定した。次に同じカラム上
で、トリプシン消化物から得られたペプチドの混合物を
装荷し、標準と同じ保持時間のペプチドを収集し、乾燥
し、Ｃ１８−逆相カラム上に再度装荷した。標識ペプチ
ドの溶出時間はここでも、エンケファリン含有ペプチド
の正しい位置についての基準として役立った。アミノ酸
配列づけによってこのペプチドの同一性を確認し、又こ
れによって大方の定量を行なうこともできた。分析され
た６つの形質転換体のうち４つの植物が有効量のＬｅｕ
−エンケファリンを含んでいることがわかった。例とし
て、これらの４つの植物のうちの１つについての詳しい
分析及び処理段階が以下に示されている。

【０１４１】Ｂ）Arabidopsis種子からのエンケファリ
ンのさらに大規模な分離及び処理 磨砕及び初期抽出 前記植物からの２．１１ｇの種子をドライアイス内でモ
ルタルの中でグラインディングした。５mlのヘプタンで
三回抽出することによって結果として得られた粉末から
脂質を除去した。結果として得られた残渣を乾燥した。

【０１４２】タンパク質の抽出 粉末を約４mlの１．０M ＮａＣｌ内に溶かした。結果と
して得られたペーストをＳＳ−３４ローター内で１７５
００rpmの速さで４０分間回転させた。各回転の後に、
上澄みを新しい試験管内に移し、ペレットを再び４mlの
１．０M ＮａＣｌ中に懸濁させた。この手順を三度くり
返した。０．４５μmのフィルター（HA,Millipore）に
３回の上澄み（計１２ml）を通した。

【０１４３】ゲルろ過による２Ｓアルブミンの分離 前段階からの溶液１２mlを６mlのバッチ２つに分けてSe
phadexＧ−５０媒質（Pharmacia)上を通過させた。カラ
ムは、直径２．５cm、長さ１００cmで０．５MのＮａＣ
ｌ中毎時約２７mlの流量で作動した。約７mlの分画を収
集した。この分画を次の２つの方法でタンパク質につい
て監視した。すなわち、まず第一に、鉛筆で分画番号を
表わしたWhatman ３ＭＭペーパー片に各分画を１０μl
適用することにより、合計タンパク質を検出した。暖気
の中で斑点を乾燥させ、１０％のＴＣＡ溶液中にペーパ
ーをすばやく浸して（３０秒）タンパク質を定着させ
た。次に紙片を、ポリアクリルアミドゲル染色に用いら
れるものと類似したCommassie Blue溶液へと移す。１分
後、ペーパーをとり出し水道水で洗う。タンパク質を含
む分画は、白の地に青の斑点を示す。この技術の最小検
出限界は、約０．０５mg/mlである。これらのタンパク
質含有分画を、７ml分画２μlを１０μlの標本緩衝液に
加え次に１７．５％のポリアクリルアミドのミニゲル上
にこの混合物６μlを装荷することによって、２Ｓアル
ブミンの存在について検定した。２Ｓアルブミンを含む
ことがわかった分画をプールしておいた。プールした分
画の合計量は１７５mlであった。

【０１４４】分離された２Ｓアルブミンの脱塩 これは、長さ２５cm、直径０．４６cmのＣ₄カラム上で
ＨＰＬＣによって行なった（Vydac２１４ TP５４、気孔
径３００オングストローム、粒径５μm）。ＨＰＬＣ装
置は、２台のポンプ（５１０型）、勾配制御装置（６８
０型）及びＬＣ分光検出器（Lamda-Max４８１型、全て
米国マサチューセッツ州、MilfordのWaters社のもの）
で構成されていた。各々３．５mlずつ６回にわけてこの
システムに１７５mlのうち２１mlを装荷した。勾配は以
下のように実行した：すなわち、溶液ＡはＨ₂Ｏ中の
０．１％ＴＦＡであり、溶液Ｂは７０％ＣＨ₃ＣＮ中の
０．１％ＴＦＡであった。５分間０％のＢと１００％の
Ａをカラム上に流し、その後Ｂの濃度を７０分にわたっ
て線形に１００％まで上昇させた。各回共その間に２Ｓ
アルブミンの分画を収集し、６回全てが終了した時点で
これらの分画をプールして３本の試験管に分けてとり、
従ってこれらの試験管の各々には２．１１ｇの種子から
の２Ｓアルブミンが７／１７５入っていた。さらに別々
にアリコートの各々を処理し、収量の量的評価のために
使用した。

【０１４５】トリプシン消化物 トリプシンでの消化に先立ち、３つのアリコートを上述
の要領で酸化させた。トリプシン消化は、基本的に上述
のように行なった。各アリコートに０．９５mlの０．１
M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．５を付加し、これに５０μ
gのトリプシン（Worthington）を補足して、３７℃で４
時間反応させた。

【０１４６】ＹＧＧＦＬＫペプチドの分離 カルボキシル末端残基を含むエンケファリンペプチドを
２つの連続したＨＰＬＣ段階を用いて分離した。上記小
規模分離手順内に説明されているように、期待されてい
るものと同じ配列のペプチドを合成し、上述の脱塩段階
で記されているのと同じカラム及び勾配条件を用いてＨ
ＰＬＣシステム上に流した。合成ペプチドの保持時間を
測定した（図１９のＡ図）。次に３つのトリプシン消化
物を（別々に）同じカラム上に装荷し、合成ペプチドを
同じ保持時間の材料を収集し（図１９のＢ図斜線の部
分）、乾燥させた。次に、Ｃ１８カラム（２５×０．４
６cm、Vydac２１８ TP１０４材料、気孔径３００オング
ストローム、粒径１０μm）を用いたことを除いて同じ
装置及び勾配を用い同じ手順に従った。ここでも、合成
ペプチドと同じ保持時間の材料を収集した（図２０のＡ
図及び図２０のＢ図）。この結果、各々合計２Ｓアルブ
ミンの７／１７５から誘導された３つの調製物が得られ
た。

【０１４７】これらの３つのアリコートの１つにある材
料の１／２０を用いて、分離されたペプチドの配列をチ
ェックした。これは、Applied Biosystems Inc.(U.S.
A.) の４７０Ａ気相シークエネーター（sequena-tor)を
用いた自動気相配列決定によって確認された。段階的に
遊離されたフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ
酸誘導体をオンラインＰＴＨアミノ酸分析器（Applied
Biosystems Inc. １２０Ａ）で分析した。シークエネー
ター（sequenator）及びＰＴＨ分析器は、製造業者の指
示に従って作動させた。サイクル１から６までの遊離さ
れたＰＴＨアミノ酸のＨＰＬＣクロマトグラムが、図２
１に示されている。配列は、予想どおりＹＧＧＦＬＫで
あった。この中間ペプチドの収量を計算するのには、第
１のサイクルのＰＴＨアミノ酸の収量を用いた（種子１
グラムあたり２５１〜２７７nmol）。

【０１４８】エンケファリンからの余分なリジンの除去 前段階の結果得られた３つのアリコートをpH８．５の
０．２MのＮ−エチルモルフォリン１００μl中に再度懸
濁させ（ベルギー、Janssen Chimica）、各々の３分の
１を３７℃で０．２μgのカルボキシペプチダーゼＢ（B
oehringer Manheim、配列決定グレード）で処理した。
３つのアリコートをそれぞれ５分、１２分及び１７分間
処理したが、３つの消化物は全て同等に有効であること
がわかった。消化の後、上記脱塩の項で記されているも
のと同じ装置、カラム及び勾配を用いてＨＰＬＣによっ
てエンケファリンを精製した。

【０１４９】アミノ酸分析を行なうことにより、エンケ
ファリンの最終的収量を決定した。上述の３つのアリコ
ートの合計量の１／１５０にあたるアリコートを６N Ｈ
Ｃｌ、０．０５％フェノール４００μlの中で１１０℃
で２４時間加水分解した。加水分解産物を乾燥させ、ア
ミノ酸をフェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）残基に誘
導体合成した（Bildingmeyer他、１９８４年）。ＰＩＣ
Ｏ−ＴＡＧアミノ酸分析システム（米国マサチューセッ
ツ州 Milford Millipore, Waters社）を用いて数量化し
た。内標準としてアルファアミノブチル酸を用いて３つ
の標本の各々についてエンケファリンペプチドの収量を
計算した。３つの測定値の平均に基づき、種子１ｇあた
り２０６nmolのエンケファリンという最終収量を計算し
た。

【０１５０】最終的に得られたペプチドの同一性は三つ
の方法で確認された。まず第一に、そのアミノ酸組成で
あり、これは、Ｇｌｙ、１．７６；Ｔｙｒ、１．００；
Ｌｅｕ、１．１５及びＰｈｅ、１．０２の分子比を示し
ていた。第２に、その逆相ＨＰＬＣカラム上での保持時
間は、基準エンケファリンペプチドのものと一致してお
り（図２２）、最後に、そのアミノ酸配列が決定され
た。これらの基準は、明確に、キメラ２Ｓアルブミンか
ら分離されたペプチドをＬｅｕ−エンケファリンである
ものとして識別している。

【０１５１】例III 上述の方法の第３の例として、２つの成長ホルモン放出
因子（ＧＨＲＦ）の類似体の生成のための手順が与えら
れる。位置２７におけるメチオニンがロイシンにより置
換され、カルボキシル末端基がさまざまな方法で変更さ
れているか又は４つのアミノ酸が短縮されてさえいるよ
うな当初分離された４４のアミノ酸ペプチド（Guillemi
n他、１９８２年）の合成及び天然の類似体は、活性で
あることが示された（Kempe他、１９８６年；Rivier
他、１９８２年）。この場合、以下ＧＨＲＦＬ及びＧＨ
ＲＦＳと呼称される２つの類似体が生成される。両方の
場合共、位置２７にメチオニンの代りにロイシンの置換
を取り込んでいる。ＧＨＲＦＬは、ペプチドの天然形態
においてみられるようにカルボキシル末端基がＬｅｕ−
ＮＨ₂であるような形で生成される（Guillemin他、１９
８２年）。ＧＨＲＦＳはＡｒｇ−Ｈｓｅ−ＮＨ₂で終
る。ここでＨｓｅはホモセリンを意味する。この類似体
は、生物学的に活性であることがKempe他（１９８６
年）により示されている。両方の類似体は共に、２Ｓア
ルブミン内でメチオニンコドンを側面に有しており、そ
のためＣｎＢｒでの処理によって開裂されうる。このこ
とはいずれの類似体も内部メチオニンを含んでいないこ
とから可能なのである。ＨＰＬＣ技術を用いた２つのペ
プチドの分離の後、これらは化学的に修飾されて、その
結果Ｌｅｕ−ＮＨ₂及びＡｒｇ−Ｈｓｅ−ＮＨ₂ カルボ
キシル末端が得られる。

【０１５２】２つのＧＨＲＦ類似体及びＣｎＢｒ開裂部
位をコード付けする１組の合成オリゴヌクレオチドは、
Arabidopsis thalianaの２Ｓアルブミンをコード付けす
るゲノミッククローン内の超可変領域全体について置換
される。６番目及び７番目のシステイン残基に隣接する
いくつかのアミノ酸のみが残った。このキメラ遺伝子
は、その天然のプロモータ及びシグナルペプチドの制御
下にある。そのプロセス及び構造は、図２３及び図２４
に図式的に示されている。構成全体を、アグロバクテリ
ウムを媒介とする形質転換システムを用いてタバコ、Ar
abidopsis thaliana及びBrassica napusへと移入（転
移）させる。植物を再生させ、開花後に種子を収集し
て、２Ｓアルブミンを精製する。ＧＨＲＦペプチドを、
ＣｎＢｒを用いて２Ｓアルブミンから開裂させ、（なお
この開裂部位はオリゴヌクレオチド内に組込まれてい
る）、次にＨＰＬＣ技術を用いて回収する。

【０１５３】Arabidopsis thaliana２Ｓアルブミン遺伝
子のクローニング Arabidopsis thaliana 遺伝子は、例IIに示されている事
項に従ってクローニングされた（Krebbers他、１９８８
年も参照のこと）。すでに公式の記録に載っているよう
に、この遺伝子を含むプラスミドはｐＡＴ２Ｓ１と呼ば
れる。ＡＴ２Ｓ１と呼ばれる、この遺伝子を含む領域の
配列は、図１５に示されている。

【０１５４】２．ＡＴ２Ｓ１遺伝子の超可変領域の欠失
及びＡｃｃＩ部位による置換 ＡＴ２Ｓ１の超可変領域の一部分は、以下のオリゴヌク
レオチドと置換される： ５′−ＣＣＡ ＡＣＣ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＧＴ Ｐ Ｔ Ｌ Ｋ ＧＡＴＡ Ｃ ＡＣ ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＡＣ−３′３０−ｍｅｒ Ｉ Ｈ Ｌ Ｐ Ｎ

【０１５５】なおここで下線の配列は、ＡｃｃＩ部位を
表わし、周囲の配列は、保持されるべきArabidopsis２
Ｓアルブミン遺伝子の超可変領域のコード付け配列に対
し相補的な配列である。この結果、最終的に、オリゴヌ
クレオチドの下に記されているアミノ酸配列が得られ
る。

【０１５６】ＡＴ２Ｓ１の超可変領域をコード付けする
配列の一部分の欠失及び置換は、プライマーとしてオリ
ゴヌレクオチドを用い、部位指向性突然変異誘発を使っ
て行なわれる。例Ｉに示されているように、Stanssens
他（１９８７年）のシステムが用いられる。

【０１５７】このプロセスの個々の段階は、以下のとお
りである。 − ＡＴ２Ｓ１遺伝子のコード付け領域を含むｐＡＴ２
Ｓ１のHindIIIフラグメントのｐＭａ５−８へのクロー
ニング（Ｉ）。このベクターはＣｍ^R遺伝子内でアンバ
ー突然変異を続行し、アンピシリン耐性を規定する。こ
の結果得られるプラスミドは、ｐＭａｃＡＴ２Ｓ１と呼
称される（図２３、ステップ１を参照）； − 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖ＤＮＡ
の調製（II）； − 相補性ｐＭｃ型プラスミドからのHindIII制限フラ
グメントの調製（III）。ｐＭｃ型のベクターは、Ａｐ
耐性標識内にアンバー突然変異が取り込まれている一方
で、野生型Ｃｍ^R遺伝子を含んでいる； − 試験管内ＤＮＡ／ＤＮＡ交雑による間隙二本鎖ＤＮ
Ａ（以下ｇｄＤＮＡと呼ぶ）の構成（IV）。ｇｄＤＮＡ
において、標的配列は一本鎖ＤＮＡとして露出されてい
る。交雑混合物のその他の構成成分からのｇｄＤＮＡの
予備的な精製は不要である； − ｇｄＤＮＡへの３０−ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチ
ドのアニーリング（Ｖ）。 − 同時試験管内klenowＤＮＡポリメラーゼＩ／ＤＮＡ
リガーゼ反応による、残りの一本鎖間隙の充てんとニッ
クのシーリング（VI）； − Ｃｍ耐性について選択する、ｍｕｔＳ宿主すなわち
ミスマッチ修復における欠失菌株の形質転換；この結
果、混合プラスミド後代が生成される（VII）。 − アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の
再形質転換による鋳型ストランド（ｐＭａ−型）から誘
導される後代の除去（VIII）。Ｃｍ耐性に関する選択の
結果、間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘
発オリゴヌクレオチドが取り込まれているストランドか
ら誘導された後代が豊富になる； − 望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結
果として得られたクローンのスクリーニング。結果とし
て得られるＡＴ２Ｓ１の欠失した超可変領域を含むプラ
スミドはｐＭａｃＡＴ２Ｓ１Ｃ４０と呼ばれる（図２３
ステップ２を参照）。

【０１５８】３．超可変領域をコード付けする配列が欠
失したＡＴ２Ｓ１遺伝子内へのＧＨＲＦをコード付けす
る配列の挿入 上述のように、超可変ループのほとんどをコード付けす
る配列が除去されたとき、ＡｃｃＩ部位がその代りに挿
入された。問題の配列はこのＡｃｃＩ部位内に挿入され
るが、第２のＡｃｃＩ部位も又、変更された遺伝子を含
むHindIIIフラグメント内に存在する。従って、変更さ
れた遺伝子を含むＮｄｅＩ−HindIIIフラグメントは、
同様にＮｄｅＩ及びHindIIIで切断されたクローニング
ベクターｐＢＲ（３２２）（Boliver、１９７７年）に
サブクローニングされる。２Ｓアルブミン遺伝子内のＮ
ｄｅＩ部位の位置は、図６に示されている。結果として
得られるサブクローンはｐＢＲＡＴ２Ｓ１と呼ばれる
（図２３、ステップ３）。成長ホルモンの２つのバージ
ョンをコード付けする配列は、アニーリングされたとき
ＧＨＲＦの完全な配列を形成するような一連の相補的合
成オリゴヌクレオチドを構成することによりｐＢＲＡＴ
２Ｓ１のＡｃｃＩ部位内に挿入される。ＡＴ２Ｓ１のも
のとほぼ一致するようにコドン使用が選択され、診断目
的で用いられるべき制限部位（ＳｔｙＩ）が含み入れら
れ、ＧＨＲＦコード付け配列の末端にはＢａｍＨＩ及び
ＰｓｔＩ部位に対し相補的な付着末端が、上述のステッ
プの後２Ｓアルブミン遺伝子の読取り枠が維持されるよ
うにするための追加の塩基と合わせて含み入れられた。
２つの構成において用いられた８つのオリゴヌクレオチ
ドが図２４に示されている。図２４のＡ図において、オ
リゴヌクレオチドの限界は垂直線により示されており、
配列の上下の数字はその番号を表している。オリゴヌク
レオチド（４及び８）において、囲み内に入っている塩
基は除外され、その結果、この構成のＧＨＲＦＳバージ
ョンが得られる。図２４のＡ図中＊印が付いている塩基
は、ＧＨＲＦＬをさらに構成するために用いられるクロ
ーン（ｐＥＫ７）内でＴに突然変異させられたというこ
とがわかったが、これらの変化はアミノ酸配列に影響を
及ぼさなかったため、補正されなかった。ＧＨＲＦペプ
チドのペプチド配列及びＣｎＢｒ部位を与えるために含
まれているメチオニンは、ＤＮＡ配列の上に示されてい
る。各末端の張出し塩基は、フラグメントをＢａｍＨＩ
及びＰｓｔＩ部位に結紮するのに役立つ。これらはＳ１
消化により除去される。次に、図２４のＢ図に示されて
いるように、平滑末端フラグメントがｐＢＲＡＴ２Ｓ１
のKlenow処理されたＡｃｃＩ部位へと結紮される。Ａｃ
ｃＩ部位の読取り枠コンテクストは、図の上部に示され
ており、開裂部位は▼で表わされている。処理の結果は
下にあり、ＡｃｃＩ部位及びその充てんの結果得られた
塩基は、太字で示されている。

【０１５９】各々の構成において用いられている６つの
オリゴヌクレオチドは全て、キナーゼ化された。アニー
リング反応のためには、各々のオリゴヌクレオチド２ｐ
モルを合計１２μlの体積になるよう組合わせた。混合
物を１０分間９０℃で保温し、１０分間約６５〜７０℃
の温度へと移行させ、それから３５〜４５分にわたって
３０〜３５℃まで漸進的に冷却させた。この時間の終了
時点で、リガーゼバッファ（Maniatis他、１９８２年）
及び１．５ユニットのＴ４−リガーゼを付加し、体積を
１５μlに調整し、混合物を１６℃で一晩保温した。次
に混合物を５分間６５℃に保温し、その後、１００mM
ＮａＣｌ制限エンドヌクレアーゼバッファ２．５μl（M
aniatis他、１９８２年）、ＢａｍＨＩ及びＰａｔＩの
各々を５〜１０ユニット付加し、体積を２５μlに調整
した。この消化物は、結紮段階中に形成したコンカテマ
ーを開裂するためのものである。４５分間の消化の後、
反応物をフェノール／クロロホルムで抽出し、沈降さ
せ、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化され細菌アルカリフ
ォスファターゼで処理されたｐＵＣ１８（Yanisch-Perr
on他、１９８５年）と結紮されたもの５μlを含む１０
μl中に再度懸濁させた。標準的な技術による細菌細胞
の形質転換の後（Maniatis他、１９８２年）、^{3 2}Ｐとい
う標識のついたオリゴヌクレオチドNo.１末端を用いてG
runstein（１９７５年）の方法により組換え体コロニー
をスクリーニングした。ＧＨＲＦ遺伝子の各バージョン
からのクローンを配列決定し、ｐＥＫ７（ＧＨＲＦＬを
含む）及びｐＥＫ８（ＧＨＲＦＳを含む）と呼ばれる各
バージョンについて１つずつのクローンを、その後のス
テップで用いた（図２３のステップ４参照）。

【０１６０】ｐＥＫ７及びｐＥＫ８のＢａｍＨＩ−Ｐｓ
ｔＩフラグメントをｐＢＲＡＴ２Ｓ１のＡｃｃＩ部位内
に挿入した（図２３、ステップ５）。オープンリーディ
ングフレームを維持するために行なわれた処理の詳細
は、図２４に示されている。ｐＥＫ７及びｐＥＫ８を各
々ＢａＨＩ及びＰｓｔＩの両方で切断し、Ｓ１ヌクレア
ーゼで処理し、ＧＨＲＦコード付け配列を含むフラグメ
ントを、ゲル電気泳動の後分離させた。次にこれらのフ
ラグメントを、ＡｃｃＩで切断されＤＮＡポリメラーゼ
ＩのKlenowフラグネントで処理されたｐＢＲＡＴ２Ｓ１
と個別に結紮した。結果として得られたクローンを、こ
の目的のための合成配列が含み入れられた部位であるＳ
ｔｙＩ及びHindIIIとの消化によりＧＨＲＦコード付け
配列の適切な方向性についてチェックした。正しい方向
性でインサートを含んでいることがわかったいくつかの
クローンを配列決定した。これは、Ｓ１ヌクレアーゼ消
化がつねに厳密に制御できないことから、必要となるこ
とである。２つのＧＨＲＦ構成の各々について正しい配
列をもつことの確認された１つのクローンを、その後の
ステップで用いた。これらは、それぞれＧＨＲＦＬ及び
ＧＨＲＦＳについてｐＥＫ１００及びｐＥＫ２００と呼
称された。

【０１６１】４．修飾された完全なＡＴ２Ｓ１遺伝子の
その天然プロモータによる再構成 完全なキメラ遺伝子は、以下のように再構成される（図
２３参照）：クローンｐＡＴ２Ｓ１Ｂｇは、遺伝子ＡＴ
２Ｓ１のコード付け領域を含む１．０kbのHindIIIフラ
グメントのみならず、遺伝子の適切な表現にとって充分
な配列をこのフラグメントの上流及び下流にて包含して
いるクローニングベクターｐＪＢ６５（Botterman他、
１９８７年）内に挿入された３．６kbのＢｇｌIIフラグ
メントを含んでいる。このプラスミドはHindIIIで切断
され、５．２kbのフラグメント（すなわちＡＴ２Ｓ１の
コード付け領域を含んでいないプラスミドの一部分）が
分離される。クローンｐＡＴ２Ｓ１はHindIII及びＮｄ
ｅＩで切断され、結果として得られる３２０ｂｐHindII
I−ＮｄｅＩフラグメントが分離される。このフラグメ
ントは、追加のＡｃｃＩ部位の複雑さ無く図２３のステ
ップ５のオリゴヌクレオチドの挿入が進められうるよう
に、ｐＢＲＡＴ２Ｓ１の構成中に変更された２Ｓアルブ
ミンから除去されたもの（図２３のステップ３）を表わ
す。次にこれら２つの分離されたフラグメントを、３方
向結紮にて、修飾されたコード付け配列を含むそれぞれ
ｐＥＫ１００及びｐＥＫ（２００）からのＮｄｅＩ−Hi
ndIIIフラグメントと結紮させる。数多くの部位のうち
のいずれかを用いて、ＢａｌIIフラグメント内の再構成
されたHindIIIフラグメントの適当な方向性についてチ
ェックするため、個々の形質転換体をスクリーニングす
ることができる。結果として得られるプラスミドｐＥＫ
５０２及びｐＥＫ６０１１は、全体的にＢａｌIIフラグ
メント上に含まれている、未修飾遺伝子と同じフランキ
ング配列ひいては同じプロモータによりとり囲まれた、
超可変領域内のみにおいて修飾された２Ｓアルブミン遺
伝子で構成されている。

【０１６２】５．植物の形質転換 キメラ遺伝子を含むＢａｌIIフラグメントを、例２の第
３節で用いられ説明されている二元性ベクターｐＧＳＣ
１７０３ＡのＢｇｌII内に挿入する（図２３、ステップ
６も参照のこと）。結果として得られたプラスミドはｐ
ＴＡＤ１２と呼ばれる。標準的な手順を用いて（Deblae
re他、１９８７年）、ｐＴＡＤ１２を、同様に例IIの第
３節で用いられているプラスミドｐＭＰ９０を有するア
グロバクテリウム菌株Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆに移入する。こ
のアグロバクテリウムを次に植物の形質転換のために用
いる。ＳＲ１株のタバコを、標準的な手順を用いて形質
転換する（Deblaere他、１９８７年）。１００μg/mlの
カナマイシン上でカルスを選択し、耐性あるカルスを植
物の再生に用いる。

【０１６３】Arabidopsis thaliana及びBrassica napus
の形質転換のための技法は、同じベクター内で全く同じ
構成を用いることができるようなものである。上述のよ
うなアグロバクテリウム・ツメファシエンスに対する授
動の後、それぞれArabidopsis及びBrassicaの形質転換
のために、Lloyd他（１９８６年）及びklimaszewska他
（１９８５年）の手順を使用する。各々のケースについ
て、タバコの場合と同様に、カルスを１００μg/mlのカ
ナマイシン上で選択し、耐性あるカルスを植物の再生に
用いることができる。

【０１６４】全三種の場合、再生の初期段階において、
カナマイシンを補足した媒質上で葉からカルスを導き出
すことにより、形質転換について再生体をチェックす
る。（第６項も参照のこと）。

【０１６５】６．形質転換された植物のスクリーニング
及び分析 全三種の場合において、再生された植物を種子をつける
よう育てる。形質転換されたさまざまな植物は、異なる
発現レベルをもつと予想されうるため（「位置効果」Jo
nes他、１９８５年）、当初複数の形質転換体を分析し
なくてはならない。これは原則として、ＲＮＡ又はタン
パク質のいずれかのレベルで行なうことができる。この
場合、Beachy他（１９８５年）に記されているように種
子ＲＮＡを調製し、標準的な技法を用いて（Thomas他、
１９８０年）、ノーザン・ブロット法を行なった。Bras
sica及びArabidopsisの両方の場合においては、キメラ
遺伝子全体は内因性遺伝子との交差交雑という結果をも
たらすため、２Ｓアルブミン内の挿入に対し相補性のオ
リゴヌクレオチドプローブを用いた。すなわち構成を作
るのに用いたようなオリゴヌクレオチドの１つを用いる
ことができる、各々の種について、１つ又は２つの個々
の植物を選択し、以下に開示するようなさらに詳しい分
析に用いた。

【０１６６】まず、キメラ遺伝子のコピー番号を、形質
転換された植物の葉の組織からＤＮＡを調製し（Dellap
orta他、１９８３年）、上で用いられているオリゴヌク
レオチドでプローピングすることによって決定する。

【０１６７】７．ＧＨＲＦ類似体の分離 Ａ）キメラ２Ｓアルブミンの精製 例IIに説明されているように、高塩分抽出、ゲルろ過及
び逆相ＨＰＬＣによって、２Ｓアルブミンを精製する。

【０１６８】天然ＧＨＲＦに対する市販の抗体（ＵＣＢ
−Bioproducts, Drogenbos、ベルギー）を用いた免疫学
的技法により、キメラ２Ｓアルブミンの正しい溶離回数
（時間）を測定する。

【０１６９】Ｂ）キメラ２Ｓアルブミンの開裂及びＧＨ
ＲＦ類似体の分離 ２Ｓアルブミンを含む脱塩、ＨＰＬＣ精製されたＧＨＲ
Ｆを次にＣＮＢｒ（Gross ＆ Witkop、１９６１年）で
処理する。ＣｎＢｒは、なおＣＯＯＨ末端基に付いてい
る余分なホモセリン／ホモセリン−ラクトンでＧＨＲＦ
類似体を遊離させる。ＧＨＲＦ類似体を、例IIに示され
ているように、古典的な逆相ＨＰＬＣ技法を用いて精製
し、例IIに示されている方法を用いて、そのアミノ酸配
列を決定する。Kempe他（１９８６年）が記しているよ
うにアンモニア、ｎ−ブチルアミン及びｎ−ドデシルア
ミンを用いて、分離されたＧＨＲＦＳ類似体をアミド化
する。この結果が、説明されるＡｒｇ−Ｈｓｅ−ＮＨ₂
末端である。

【０１７０】カルボキシル末端になお余分なメチオニン
を有する第２の類似体ＧＨＲＦＬをまずカルボキシペプ
チダーゼＢで処理し、カルボキシル末端ホモセリン残基
を除去する（Ambler、１９７２年）。その結果、Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ末端が得られる。Kreil（１９８４
年）に記されているように、カタラーゼ及びアスコルビ
ン酸塩の存在する中でＤ−アミノ酸オキシダーゼで処理
することにより、グリシン−ＣＯＯＨ末端は、アミド−
ＣＯＮＨ₂及びグリオキシル酸末端に変換される。この
一組の酵素段階の結果、最終的なアミド化されたＧＨＲ
ＦＬ類似体が得られる。

【０１７１】従って、前記諸例は、Ｌｅｕ−エンケファ
リン又は成長ホルモン放出因子をコード付けするインサ
ートを中にとり込むよう２Ｓアルブミン貯蔵タンパク質
をいかに変更するか、そしてそれに続く相応する変更さ
れた前駆体核酸を含む適切なプラスミドを用いたタバ
コ、Arabidopsis及びBrassica細胞の形質転換、形質転
換された植物細胞の相応する植物への再生、種子形成段
階に至るまでのその栽培、種子の回収、そこからの雑種
２Ｓアルブミンの分離そして最終的に純粋な形でのかか
る雑種タンパク質からのＬｅｕ−エンケファリン又はＧ
ＨＲＦの回収についての完全な例示を与えている。

【０１７２】従って本発明が、タンパク質又はポリペプ
チドの遺伝的処理技術及びその天然の形態に近い形態で
それらを生み出す条件の下で大量にこれらを生産する技
術を提供するものであるということは直ちに明白であ
る。

【０１７３】又当然のことながら、本発明は上述の例に
限られているわけではない。当業者は、各々のケースに
おいて、問題となっているいずれかの一定のポリペプチ
ド又はペプチドの生産に用いるべき貯蔵タンパク質、そ
の性質（例えば、相応するＤＮＡインサートを最もうま
く収納するためそれが含んでいる適切な制限部位に応じ
て）を選択し、問題のペプチドが究極的に開裂、回収及
び精製されうるもとである相応する雑種タンパク質を生
成するための、形質転換されるべき種子形成植物の性質
に基づく最適な種子特異的プロモータの選択を適切に行
なうことになる。

【０１７４】以下に、本書に記されているプロセスの段
階のいくつかを達成するための既知の方法又は本発明の
実施に先立って立証された一般的知識に対し参照指示が
なされた範囲内で本開示全体を通して基準とされてきた
参考文献を、記す。

【０１７５】なお、以下のことをさらに確認しておく： − プラスミドｐＧＶ２２６０は、１９８３年１２月に
ＤＳＭに２７９９にて寄託されたこと、 − プラスミドｐＳＯＹＬＥＡは、１９８７年８月３日
付で、ＤＳＭに４２０５にて寄託されたこと、 − プラスミドｐＢＮ２Ｓ１は、１９８７年８月３日付
でＤＳＭに４２０５にて寄託されたこと、 − プラスミドｐＭａ５−８は、１９８８年５月３日付
で４５６７にて、又ｐＭｃは同日４５６６にてＤＳＭに
寄託されたこと、 − プラスミドｐＡＴ２Ｓ１は、１９８８年１０月７日
付で、ＤＳＭに４８７９にて寄託されたこと、 − プラスミドｐＡＴ２Ｓ１Ｂｇは、１９８８年１０月
７日付でＤＳＭに４８７８にて寄託されたこと、 − プラスミドｐＧＳＣ１７０３Ａは、１９８８年１０
月７日付でＤＳＭに４８８０にて寄託されたこと、 − プラスミドｐＥＫ７は、１９８８年１０月７日付で
ＤＳＭに４８７６にて寄託されたこと、 − プラスミドｐＥＫ８は、１９８８年１０月７日付で
ＤＳＭに４８７７にて寄託されたこと。

【０１７６】ただし、これらは全て、当業者がいかなる
発明性の作業を実施しなくても入手可能な遺伝材料から
再生することのできるような構成である。

【０１７７】参考文献 − Altenback, S.B., Pearson, K.W., Leung, F.W., S
un, S.S.M共著（１９８７年）Plant. Mol. Biol（植物
分子生物学）、８、２３９−２５０。 − Ambler, R.P.著（１９７２年）。「Method in Enzy
m.（酵素学諸法）」２５、１４３−１５４。 − Ampe C., Van Damme, J., de Castro, L.A.B., Sam
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物学ジャーナル）」１５９、５９７−６０４。 − Bassβuβner, R., Huth, A., Manteuffel, R., Ra
paport, T.A.共著（１９８３年）、「Eur. J. Bioche
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４４−４８。

【０１７８】合計種子タンパク質の百分率で表わした２Ｓアルブミン 表１ 科種 ％ （一般名） CompositaeHelianthus annuus （ヒマワリ） ６２％ CruciferaeBrassica spp. （アブラナ） ６２％ LinaceaeLinum usitatissimum （アマニ） ４２％ LeguminosaeLupinus polyphyllus （ハウチワマメ） ３８％Arachis hypogaea （ピーナッツ） ２０％ LecythidaceaeBertholletia excelsa （ブラジルナッツ）３０％ LiliaceaeYucca spp.（ユッカ） ２７％ EuphorbiacaeRicinus communis （トウゴマの実） ４４％ （出典 Youle ＆ Huang, １９８１年）

【図面の簡単な説明】

【図１】２Ｓ−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。

【図２】２Ｓ−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。

【図３】２Ｓ−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。

【図４】２Ｓ−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。

【図５】２Ｓ−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。

【図６】ｐＢＮ２Ｓ１プラスミドから得たブラジルナッ
ツの２Ｓ−アルブミンの配列の一部分とその関連要素を
示す。

【図７】制限部位を示す。

【図８】１つの前駆体をコードする核酸を含む制限フラ
グメントを含むキメラプラスミドの構成の連続的段階を
示す。

【図９】１つの前駆体をコードする核酸を含む制限フラ
グメントを含むキメラプラスミドの構成の連続的段階を
示す。

【図１０】部位指向性の突然変異誘発の実施に適したプ
ラスミドの制限部位及び遺伝地図を示す。

【図１１】部位指向性突然変異誘発手順のさまざまな段
階を示す。

【図１２】キメラプラスミドを変更する諸段階を示す。

【図１３】キメラプラスミドを変更する諸段階を示す。

【図１４】キメラプラスミドを変更する諸段階を示す。

【図１５】Arabidopsis thaliana ２Ｓアルブミン遺伝
子を含む１kbフラグメントの配列を示す。

【図１６】Arabidopsis２Ｓタンパク質の大きなサブユ
ニットのタンパク質配列を、関連するオリゴヌクレオチ
ド配列と共に示す。

【図１７】ｐＧＳＣ１７０３の制限地図を示す。

【図１８】ｐＧＳＣ１７０３Ａの制限地図を示す。

【図１９】Ｃ４カラム上での、標識として用いられた合
成ペプチドＹＧＧＦＬＫのアリコートのクロマトグラム
（図１９のＡ図）、及び酸化された２Ｓ上のトリプシン
消化のクロマトグラム（図１９のＢ図）を示す。

【図２０】Ｃ１８カラム上での、標識として用いられた
合成ペプチドＹＧＧＦＬＫのアリコートのクロマトグラ
ム（図２０のＡ図）、及びＣ４カラム上でＨＰＬＣから
得られたピークを含むＹＧＧＦＬＫのＣ１８カラム上で
の再クロマトグラフィ（図２０のＢ図）を示す。

【図２１】ＹＧＧＦＬＫ上のアミノ酸配列の決定の結果
を表す。

【図２２】マーカーとして用いられるＹＧＧＦＬペプチ
ドを示すクロマトグラム（図２２のＡ図）、及び植物材
料から分離されたＹＧＧＦＬＫペプチドに対するカルボ
キシペプチダーゼＢ消化の後のＩＧＧＦＬぺプチドの分
離（図２２のＢ図）を示す。

【図２３】キメラ２ＳアルブミンのArabidopsis thalia
na 遺伝子の構成の連続的段階を示す。

【図２４】ＧＨＲＦＳ及びＧＨＲＦＬ遺伝子の構成に用
いられる８つのオリゴヌクレオチド（図２４のＡ図）、
並びに修飾されたＡＴ２Ｓ１遺伝子のＡｃｃＩ部位、及
びオープンリーディングフレームが維持されるようにす
るこのＡｃｃＩ部位内へのＧＨＲＦの挿入（図２４のＢ
図）を示す。

フロントページの続き (72)発明者 クレッバース，エンノ アメリカ合衆国、カリフォルニア 91803、 アルハンブラ、グレンビュー 1724 (72)発明者 ボッテルマン，ヨハン ベルギー国、9721 シェバーゲン−デ・ピ ンテ、ヘット・ヴィンガールデッケ ５ (72)発明者 レーマンズ，ジャン ベルギー国、9831 デュアレ、ピー・デ・ デンテルゲムラーン ２

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２Ｓアルブミンの前駆体をコードするAr
   abidopsis thaliana遺伝子の種子特異的プロモーター領
   域を含む単離されたＤＮＡフラグメントであって、該２
   Ｓアルブミンが、図４のAT2S1、AT2S2、AT2S3、およびA
   T2S4の群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＤＮＡフ
   ラグメント。
2. 【請求項２】 前記プロモーター領域が、図１５の−４
   ３１のヌクレオチド位〜−１のヌクレオチド位の配列を
   含む、請求項１に記載の単離されたＤＮＡフラグメン
   ト。
3. 【請求項３】 図１５の−４３１のヌクレオチド位〜−
   １のヌクレオチド位の配列を含む、DSM No.4878として
   寄託されている、プラスミドpAT2S1Bg由来の単離された
   ＤＮＡフラグメント。