JP2005531309A - 植物の小胞体由来のタンパク粒に蓄積することによるペプチドおよびタンパク質の産生 - Google Patents
植物の小胞体由来のタンパク粒に蓄積することによるペプチドおよびタンパク質の産生 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005531309A JP2005531309A JP2004516544A JP2004516544A JP2005531309A JP 2005531309 A JP2005531309 A JP 2005531309A JP 2004516544 A JP2004516544 A JP 2004516544A JP 2004516544 A JP2004516544 A JP 2004516544A JP 2005531309 A JP2005531309 A JP 2005531309A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid sequence
- nucleic acid
- protein
- zein
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 148
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 124
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 title claims abstract description 78
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 9
- 239000008187 granular material Substances 0.000 title description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 127
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 claims abstract description 102
- 239000005019 zein Substances 0.000 claims abstract description 102
- 229940093612 zein Drugs 0.000 claims abstract description 102
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 66
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 66
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 154
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical group N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims description 115
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 claims description 105
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 claims description 104
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 claims description 103
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 95
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 95
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 59
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 52
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 26
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 26
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 23
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 13
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 10
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 5
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 3
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 claims description 3
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 claims description 3
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 claims description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical group BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 102
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 40
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 17
- 108010068072 salmon calcitonin Proteins 0.000 description 16
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 15
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 14
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960003773 calcitonin (salmon synthetic) Drugs 0.000 description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 10
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 10
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 101000741445 Homo sapiens Calcitonin Proteins 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229940045644 human calcitonin Drugs 0.000 description 7
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 6
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 108010055615 Zein Proteins 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(CO)(CO)NCC(O)=O CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- VLJNHYLEOZPXFW-BYPYZUCNSA-N L-prolinamide Chemical group NC(=O)[C@@H]1CCCN1 VLJNHYLEOZPXFW-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 101150070926 ct gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000941274 Canis lupus familiaris Gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 2
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 2
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 101710138460 Leaf protein Proteins 0.000 description 2
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 2
- 241000191965 Staphylococcus carnosus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 2
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl n-dimethoxyphosphorylcarbamate Chemical compound COP(=O)(OC)NC(=O)OC(C)C XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 229960000160 recombinant therapeutic protein Drugs 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091005753 BiP proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100031416 Gastric triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710095807 Glutelin-2 Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000946384 Homo sapiens Alpha-lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010030685 KDEL receptor Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 101000723835 Zea mays 16 kDa gamma-zein Proteins 0.000 description 1
- 101000785627 Zea mays Zein-beta Proteins 0.000 description 1
- QPBNUBJVIBPFJM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC(O)=O.OC1=CC=NC(O)=N1 QPBNUBJVIBPFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002862 amidating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000002506 anticoagulant protein Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- -1 cosmids Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000021759 endosperm development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108010091264 gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000121 hypercalcemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000031852 maintenance of location in cell Effects 0.000 description 1
- 230000012066 maintenance of protein localization in endoplasmic reticulum Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001192 peptidylglycine Polymers 0.000 description 1
- 108010007262 peptidylglycine monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000005924 transacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/425—Zeins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8221—Transit peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
核酸分子が、γ-ゼインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸配列、またはタンパク質を植物細胞の小胞体(ER)に送り且つ保持することができるその断片、酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸配列、および目的のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸配列を含むものとして開示される。この核酸分子を用いて宿主植物細胞を形質転換し、目的のペプチドまたはタンパク質を産生する方法も開示される。
Description
発明の分野
本発明は、小胞体由来のタンパク粒(bodies)に蓄積することによる宿主系植物における目的のペプチドおよびタンパク質の産生、これらの生成物をコードする核酸、および構築体およびベクターの製造における上記核酸を用いる宿主植物系の形質転換に関する。植物におけるカルシトニン(CT)のような目的の異種生成物の発現および単離の方法を、明確に開示する。
本発明は、小胞体由来のタンパク粒(bodies)に蓄積することによる宿主系植物における目的のペプチドおよびタンパク質の産生、これらの生成物をコードする核酸、および構築体およびベクターの製造における上記核酸を用いる宿主植物系の形質転換に関する。植物におけるカルシトニン(CT)のような目的の異種生成物の発現および単離の方法を、明確に開示する。
発明の背景
ゲノムの知識および関連の生物医学研究におけるめざましい進歩により生物薬剤学の要求がかなり増加することが予想されるので、低価格の組換え産生系を詳細に記述することをかなり興味深いことである。
ゲノムの知識および関連の生物医学研究におけるめざましい進歩により生物薬剤学の要求がかなり増加することが予想されるので、低価格の組換え産生系を詳細に記述することをかなり興味深いことである。
細菌、真菌および培養哺乳類細胞などの他のトランスジェニック系が生物学的産生(bioproduction)に大規模に且つ長期間にわたって採用されてきているので、植物の遺伝子工学による生物薬剤の産生は、比較的最近のことである。しかしながら、ヒルジン、血栓症を治療するための抗凝固性タンパク質(Parmenter et al., 1995)、虫歯に対するキメラIgG-IgAワクチン(Ma et al., 1998)、E. coliのエンテロトキシン産生株に対する細菌性痘苗原(Haq et al., 1995)、 and a recombinant dog gastric lipase to treat嚢胞性繊維症の治療のための組換えイヌ胃リパーゼ(Benicourt et al., 1993)のような植物発現系を用いる幾つかの組換え治療タンパク質は、既に市場に出回っているかまたはヒトでの臨床試験の様々な段階に入っている。
植物発現系は魅力的なものであり、組換えタンパク質の発現レベルを植物が宿主タンパク質を細胞小器官にターゲットするのに用いる先天性のソーティングおよびターゲッティング機構を利用することによって高めることができるからである。更に、植物由来の生物薬剤は容易にスケールアップして大量生産を行うことができ、病原体または毒素の混入によって生じる健康上のリスクを最小限にする利点を有する。
植物は、生物活性材料を低生産コストでしかも少ない健康上の危険性で無制限の量を提供する可能性を有するので、ますます魅力的な発現系となっていると思われる。植物が高レベルの組換えタンパク質を蓄積し、翻訳後修飾のほとんどを行う能力を有するため、植物は組換え治療薬の分子ファーミングのためのバイオリアクターと考えられる(総説については、Fischer and Emans, 2000を参照されたい)。しかしながら、作物の種類の選択、組織選定、発現および回収法、および翻訳後加工に関する重要な決定は、植物に基づく産生の商業科の可能性にとって決定的なものである(Cramer et al., 1999)。
組換えタンパク質の亜細胞性ターゲッティングは、植物における上記タンパク質の高レベルでの蓄積、および正確な集合およびフォールディングについての重要な要件である。宿主タンパク質の細胞内貯蔵小器官への区画化は、一般に適当なシグナルペプチドまたは総タンパク質融合物を用いて行われる。様々な組換え治療タンパク質は、植物の下記の区画であるアポプラスティックスペース(apoplastic space)(McCormick et al., 1999)、葉緑体(Staub et al., 2000)、および小胞体(ER)(Stoger et al., 2000)に向けられたものである。トランスジェニック植物のER区画に向けられた免疫グロブリンは、アポプラズム(apoplasm)または細胞質ゾルのような他の区画に向けられたときの10-100倍高い収率を生じることが示されている(Conrad et al., 1998)。
ER区画の抗体のような複雑なタンパク質のターゲッティングは特に興味深いものであり、機能的生成物を得るのに要した翻訳後修飾のほとんどはER内部で起こるからである(During et al., 1990; Ma and Hein, 1995; Conrad et al., 1998)。実際に、ER中では、シグナルペプチドが開裂し、結合IgGタンパク質(BiP)のようなストレスタンパク質およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)のような酵素はシャペロンとして機能し、未集合タンパク質に結合し、次のフォールディングおよび集合を指示する。これらの特殊な特性に加えて、利用可能な証拠は、植物ERが柔軟性が高く、異種薬剤タンパク質の理想的貯蔵器としていることを示している。ERは分泌経路への出入口であるとは思われるが、これはタンパク質を短期間または長期間貯蔵することもできる。植物は、アミノ酸を特殊な貯蔵タンパク質の形態で長期間貯蔵する。これらの貯蔵タンパク質を制御されない未成熟分解から保護する一つの機構は、それらをタンパク粒(PB)と呼ばれるER由来の貯蔵細胞小器官に入れることである(総説については、Muntz, 1998)。組換えタンパク質のER内腔への単純な蓄積としてのこれらの細胞小器官の集合には、第一段階として宿主タンパク質の保持が必要である。分泌タンパク質が正確にERにフォールドされて集められたときには、ほとんどがゴルジ装置を介する工程による様々な細胞の目的地を有する。しかしながら、可溶性の輸送コンピテントタンパク質のER保持は、カルボキシ末端の残留/回収シグナルKDEL(またはHDEL)によって誘発することができる(Munro et al., 1987; Wandelt et al., 1992; Vitale et al., 1993)。膜貫通受容体を介してゴルジ装置で認識されるこの保存されたC末端モティーフにより、逃げ出したER残留タンパク質をERに再循環させることができる(Vitale et al., 1999; Yamamoto et al., 2001)。多くの組換え抗体断片をKDELシグナルによって伸長して、植物ERに安定に蓄積している(Verch et al., 1998; Torres et al., 1999)。組換えタンパク質をER区画に保持して
蓄積する代替法は、 is to create an appropriate融合 with a natural ER resident such 種子貯蔵タンパク質のような天然ERに錠剤するものと適当な融合体を作製することである。
蓄積する代替法は、 is to create an appropriate融合 with a natural ER resident such 種子貯蔵タンパク質のような天然ERに錠剤するものと適当な融合体を作製することである。
WO 01/75312号明細書には、植物宿主系でサイトカインを産生する方法であって、上記植物宿主系が上記サイトカインをコードするキメラ核酸配列で形質転換されており、上記キメラ核酸配列が第二の核酸配列の上記植物宿主系における転写を調節することができる第一の核酸配列を含んでなり、上記の第二の核酸配列がリーディングフレームにおいてサイトカインをコードする第三の核酸配列、およびリーディングフレームにおいて「KDEL」アミノ酸配列をコードする上記第三の核酸配列の3'末端に連結した第四の核酸配列に連結しているシグナル配列をコードする、方法が開示されている。
ゼインはトウモロコシの are a group ofタンパク質s that are synthesized during内胚乳発生の際に合成される一群のタンパク質であり、それらの溶解度によってα、β、γおよびδの4群に分離することができる。ゼインは、ERにおいて凝集して直接PBとなることができる。完全長ゼインタンパク質および操作可能に連結したタンパク質材料を含んでなる融合タンパク質として発現されるルミン安定なタンパク粒を含んでなる植物または植物組織が開示されている(WO 00/40738号明細書)。
トウモロコシ貯蔵タンパク質であるγ-ゼインは、4種類のトウモロコシプロラミンの一つであり、トウモロコシ内胚乳における総タンパク質の10-15%である。他の穀類プロラミンとしてのαおよびγ-ゼインは未加工のERの細胞質側の膜結合ポリソームで生合成され、管腔内に集められた後、ER由来のPBに隔離される(Herman and Larkins, 1999, Ludevid et al., 1984, Torrent et al., 1986)。γ-ゼインは、i)19アミノ酸のペプチドシグナル、ii)PPPVHLの8個の単位を含む反復ドメイン(53aa)、iii)プロリン残基が他のアミノ酸と交互になっているproXドメイン(29 aa)、およびiv)疎水性システインリッチなC末端ドメイン(111aa)の4個の特徴的なドメインから構成されている。γ-ゼインがER由来のPBに集合する能力は、種子に限定されない。実際に、γ-ゼインがトランスジェニックArabidopsis植物で構成的に発現するときには、貯蔵タンパク質は葉の葉肉細胞のER由来のPB中に蓄積された(Geli et al, 1994)。ER由来のPBへのγ-ゼイン沈着に関与するシグナルを探すときには(プロラミンはKDELシグナルを持たない)、タンデム反復ドメインを含むプロリンリッチなN末端ドメインがER保持に必要であり、C末端ドメインがPB形成に関与することが示された。しかしながら、これらのドメインがPB集合を促進する機構は未だ知られていない。
32アミノ酸のホルモン性ペプチドであるカルシトニン(CT)は正確なカルシウム代謝に本質的であり、骨粗鬆症、高カルシウム血症性ショック、およびバジェット病の治療に臨床的に広く用いられてきた(Reginster et al., 1993; Azria et al., 1995; Silverman et al., 1997)。ヒトCTは、25アミノ酸のシグナルペプチドとN-およびC末端の2種類のプロペプチド(それぞれ、57aaおよび21aa)を有するプレプロタンパク質として合成される。生成する活性ペプチドは、1個のジスルフィド橋(Cysl-Cys7)を有する32アミノ酸の長さであり、カルボキシ末端がアミド化されている。イン・ビトロでは、ヒトCTは凝集し、その治療薬としての用途が限定される。従って、余り凝集しやすくないサケCTが、一般に代わりとして用いられる(Cudd et al., 1995)。CTの生産は現在は化学合成によって行われているが、この生産のコストにより幾つかの研究グループが代替法を求めることが促進された。ヒトおよびサケCTはE. coli (Ray et al., 1993; Hong et al., 2000)、マウス下垂体細胞 (Merli et al., 1996)、非内分泌細胞系Cos-7およびCHO (Takahashi et al., 1997)、および更に最近では、トランスジェニックウサギの乳中(McKee et al., 1998)で産生されている。生物工学的方法による生物活性カルシトニンの産生には、少なくとも2つの加工段階i)グリシンで伸長したカルシトニンの生成(Bradbury et al., 1988)、およびii)アミド化酵素ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ(PAM)の作用によるカルボキシ末端プロリンアミドの形成(Eipper et al., 1992)が必要である。カルボキシル-アミド化が植物細胞で起こるかどうかは現在は知られていないので、PAM酵素を用いる植物グリシンで伸長したカルシトニンのイン・ビトロアミド化によってC末端アミドを提供する(Ray et al., 1993)。
発明の概要
本発明によって解決しようとする問題は、植物宿主系で目的のペプチドおよびタンパク質を産生する代替系を提供することである。
本発明によって解決しようとする問題は、植物宿主系で目的のペプチドおよびタンパク質を産生する代替系を提供することである。
本明細書で示される解決法は、γ-ゼインのプロリンリッチなドメインが自己集合して宿主植物系のERにおける融合タンパク質に安定性を付与する能力に基づいている。γ-ゼイン融合タンパク質に基づいた系が宿主系植物に目的の生成物を蓄積するための使用は、植物のER由来のPB中に目的の上記生成物を蓄積するための良好な方法を構成する。
本発明は、タバコ植物におけるER由来のPBおいて組換えCTを蓄積するための融合タンパク質に基づいた系を記載する例において示される。様々なプロリンリッチなドメインをγ-ゼインから遺伝子工学処理を行って、開裂可能なプロテアーゼ部位を介する融合パートナーとして働いた。成熟カルシトニンコード領域をγ-ゼインドメインのC末端で融合し、トランスジェニックタバコ植物で発現した。融合タンパク質は、タバコ葉のER由来のPBに蓄積した。精製後、融合タンパク質にエンテロキナーゼ開裂を行い、カルシトニンを放出させた。
従って、本発明の一態様は、(i)タンパク質γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列、またはタンパク質を小胞体に送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片、(ii)酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および(iii)目的生成物をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、上記ヌクレオチド配列がそれらの間で操作可能に連結している、核酸配列に関する。
もう一つの態様では、本発明は、上記核酸配列を含んでなる核酸構築物に関する。
もう一つの態様では、本発明は、上記配列または構築物を含むベクター、および上記ベクターで形質転換した細胞に関する。
もう一つの態様では、本発明は、上記核酸配列、構築物またはベクターを有する形質転換植物宿主系に関する。
もう一つの態様では、本発明は、ゲノムに上記核酸配列を組込んで含んでなる、トランスジェニック植物宿主系に関する。
もう一つの態様では、本発明は、植物宿主系で目的の生成物を産生する方法に関する。
もう一つの態様では、本発明は、植物宿主系でカルシトニンを産生する方法に関する。
もう一つの態様では、本発明は、融合タンパク質であって、上記核酸配列に相当するアミノ酸配列を有する上記融合タンパク質に関する。
発明の詳細な説明
本発明の第一の態様は、核酸配列(以後、本発明の核酸配列と呼ぶ)であって、
タンパク質γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸配列、またはタンパク質を小胞体(ER)に送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片、
酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸配列、および
目的生成物をコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸配列
を含んでなり、
上記第一の核酸配列の3'末端が上記第二の核酸配列の5'末端に連結し、上記第二の核酸配列の3'末端が上記第三の核酸配列の5'末端に連結している
核酸配列を提供する。
本発明の第一の態様は、核酸配列(以後、本発明の核酸配列と呼ぶ)であって、
タンパク質γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸配列、またはタンパク質を小胞体(ER)に送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片、
酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸配列、および
目的生成物をコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸配列
を含んでなり、
上記第一の核酸配列の3'末端が上記第二の核酸配列の5'末端に連結し、上記第二の核酸配列の3'末端が上記第三の核酸配列の5'末端に連結している
核酸配列を提供する。
第一の核酸配列は、タンパク質γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列、またはタンパク質をERに送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片を含む。
本明細書で用いられる「γ-ゼイン」とは、発明の背景で上記した4種類の特徴的なドメインから構成されているトウモロコシ貯蔵タンパク質を表す。上記用語としては、天然のγ-ゼインタンパク質並びにその変異体、およびタンパク質をERに送り且つ保持することができる組換えγ-ゼインタンパク質が挙げられる。
γ-ゼインタンパク質をコードする事実上任意のヌクレオチド配列、またはタンパク質をERに送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片を用いることができる。
従って、好ましい態様では、第一の核酸配列は、完全長のγ-ゼインタンパク質コードするヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、完全長のγ-ゼインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を図1Aに示し、配列番号:1で同定する。
もう一つの好ましい態様では、第一の核酸配列は、γ-ゼインタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列を含み、上記断片は、タンパク質をERに送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。この場合には、第一の核酸配列は、
タンパク質γ-ゼインの反復ドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列、
タンパク質γ-ゼインのProXドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列、または
タンパク質γ-ゼインの反復ドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列と、タンパク質γ-ゼインのProXドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列
を含むことができる。
タンパク質γ-ゼインの反復ドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列、
タンパク質γ-ゼインのProXドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列、または
タンパク質γ-ゼインの反復ドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列と、タンパク質γ-ゼインのProXドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列
を含むことができる。
特別な態様では、上記の第一の核酸配列は、γ-ゼインタンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列を含み、上記断片はタンパク質をERに送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、
配列番号:2に示されるヌクレオチド[RX3として同定されるヌクレオチド配列(図1B)]、
配列番号:3に示されるヌクレオチド配列[R3として同定されるヌクレオチド配列(図1B)]、
配列番号:4に示されるヌクレオチド配列[P4として同定されるヌクレオチド配列(図1C)]、および
配列番号:5に示されるヌクレオチド配列[X10として同定されるヌクレオチド配列(図1C)]
からなる群から選択される。
配列番号:2に示されるヌクレオチド[RX3として同定されるヌクレオチド配列(図1B)]、
配列番号:3に示されるヌクレオチド配列[R3として同定されるヌクレオチド配列(図1B)]、
配列番号:4に示されるヌクレオチド配列[P4として同定されるヌクレオチド配列(図1C)]、および
配列番号:5に示されるヌクレオチド配列[X10として同定されるヌクレオチド配列(図1C)]
からなる群から選択される。
第二の核酸配列は、酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、上記の第二の核酸配列は、プロテアーゼ開裂部位、例えばエンテロキナーゼ、Arg-Cエンドプロテアーゼ、Glu-Cエンドプロテアーゼ、Lys-Cエンドプロテアーゼ、Xa因子などのようなプロテアーゼによるアミノ酸開裂可能な部位をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
あるいは、第二の核酸配列は、例えばメチオニン残基を開裂させる臭化シアンのような化学試薬または任意の他の適当な化学試薬によって特異的に開裂可能なアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
第二の核酸配列は、上記第一の核酸配列と上記第三の核酸配列の合体の結果として生成することができる。その場合には、それぞれの配列は、上記第一と第三の核酸配列が結合するときには、酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードする機能的ヌクレオチド配列、すなわち第二の核酸配列が形成されるような方法で多数のヌクレオチドを含む。代替態様では、第二の核酸配列は、上記第一および第三の核酸の間に適切に挿入される異種配列である。
第三の核酸配列は、目的の生成物をコードするヌクレオチド配列を含む。原則的には、任意の目的生成物は、本発明によって提供される系によって発現することができる。好ましい態様では、目的生成物はタンパク質性(すなわち、タンパク質またはペプチド)薬剤、例えば、カルシトニン、エリトロポエチン、トロンボポエチン、成長ホルモンなどのペプチドホルモン、インターフェロン、すなわち、ウイルス感染に応答し且つ免疫応答などの際にサイトカインとして産生されるタンパク質である。好ましくは、上記の目的治療生成物は、ヒトまたは動物体の治療に有効である。
特別な態様では、第三の核酸配列は、カルシトニン(CT)、例えばヒトカルシトニン(hCT)またはサケカルシトニン(sCT)をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。一般に、この場合には、上記の第三の核酸配列は、好ましくは、カルシトニンをコードする上記核酸配列の3'末端にグリシンのコドンを含み、従って、グリシンによって伸長したカルシトニンを付与する。
本発明によれば、上記第一の核酸配列の3'末端が上記第二の核酸配列の5'末端に連結し、上記第二の核酸配列の3'末端が上記第三の核酸配列の5'末端に連結し、すなわち、上記第一、第二および第三の核酸配列はリーディングフレームにある。
本発明の核酸配列は、当業者に知られている従来の手法を用いて得ることができる。一般に、上記の手法は、本発明の核酸配列の様々な断片を適当なベクター中で連結することを伴う。上記の従来の手法の総説は、例えば、「分子クローニング、実験室便覧(Molecular cloning, a Laboratory Manual)」、第2版、Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に見出すことができる。本発明の核酸を含む幾つかのベクターの構築は、例に開示され、図3および4に示されている。そこに示されているように、様々なプロリンリッチドメインをγ-ゼインから遺伝子工学処理を施して、開裂可能なプロテアーゼ部位を介する融合パートナーとして働くようにする。成熟カルシトニンコード領域(32aa)をγ-ゼインドメインのC末端で融合させ、トランスジェニックタバコ植物で発現させた。融合タンパク質は、タバコ葉のER由来のタンパク粒に蓄積した。精製後、融合タンパク質にエンテロキナーゼ開裂を行って、カルシトニンを放出させ、これを逆相クロマトグラフィーによって消化混合物から更に精製することができる。
もう一つの態様では、本発明は、(i)タンパク質γ-ゼインのアミノ酸配列、またはタンパク質を植物細胞のERに送り且つ保持することができるその断片、(ii)酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列、および(iii)目的生成物
を含んでなる融合タンパク質であって、宿主植物系における本発明の核酸配列の発現生成物である、上記融合タンパク質(以後、本発明の融合タンパク質と呼ぶ)を提供する。
を含んでなる融合タンパク質であって、宿主植物系における本発明の核酸配列の発現生成物である、上記融合タンパク質(以後、本発明の融合タンパク質と呼ぶ)を提供する。
本発明の融合タンパク質は、宿主植物系において安定なER由来のPBに蓄積される。γ-ゼインドメインのC末端に存在する酵素的または化学的に開裂可能な部位により、目的生成物を後で回収することができる。目的生成物を次に、従来の手段によって単離して、精製することができる。従って、本発明の融合タンパク質は、目的生成物を蓄積するための新規で良好な方法を構成する。
一態様では、本発明の融合タンパク質は完全長のγ-ゼインタンパク質を含んでなる。完全長のγ-ゼインの特異的アミノ酸配列は、図1Aに示されており、配列番号:6で同定されている。
もう一つの態様では、本発明の融合タンパク質は、γ-ゼインタンパク質の断片であって、タンパク質をERに送り且つ保持することができるアミノ酸配列を含む上記断片を含んでなる。特別な態様では、本発明の融合タンパク質は、
配列番号:7に示されるアミノ酸配列[RX3に相当するアミノ酸配列(図1 B)]、
配列番号:8に示されるアミノ酸配列[R3に相当するアミノ酸配列(図1B)]、
配列番号:9に示されるアミノ酸配列[P4に相当するアミノ酸配列(図1C)]、および
配列番号:10に示されるアミノ酸配列[X10に相当するアミノ酸配列(図1C)]
からなる群から選択されたγ-ゼインタンパク質の断片を含んでなる。
配列番号:7に示されるアミノ酸配列[RX3に相当するアミノ酸配列(図1 B)]、
配列番号:8に示されるアミノ酸配列[R3に相当するアミノ酸配列(図1B)]、
配列番号:9に示されるアミノ酸配列[P4に相当するアミノ酸配列(図1C)]、および
配列番号:10に示されるアミノ酸配列[X10に相当するアミノ酸配列(図1C)]
からなる群から選択されたγ-ゼインタンパク質の断片を含んでなる。
本発明の融合タンパク質は、酵素的または化学的手段によって特異的に開裂可能なアミノ酸配列を含む。特別な態様では、上記の開裂可能な部位は、プロテアーゼ開裂部位、例えばエンテロキナーゼ、Arg-Cエンドプロテアーゼ、Glu-Cエンドプロテアーゼ、Lys-Cエンドプロテアーゼ、Xa因子などのプロテアーゼによるアミノ酸開裂部位、または化学試薬、例えばメチオニン残基を開裂する臭化シアンまたは任意の他の適当な化学試薬によるアミノ酸開裂部位を含んでなる。
本発明の融合タンパク質は、目的生成物、例えばペプチドホルモン、インターフェロンなどのタンパク質性(すなわち、タンパク質またはペプチド)薬剤も含む。好ましくは、上記の目的治療生成物は、ヒトまたは動物体の治療に有効である。特別な態様では、本発明の融合タンパク質は、カルシトニン(CT)、例えば場合によってはグリシンによって伸長したヒトカルシトニン(hCT)またはサケカルシトニン(sCT)を含んでなる。
もう一つの態様では、本発明は、(i)本発明の核酸配列、および(ii)本発明の核酸(i)の転写を調節する調節ヌクレオチド配列であって、植物で機能する上記調節配列(ii)を含んでなる核酸構築物を提供する。上記核酸配列は、有効に結合している。
事実上任意の植物で機能する調節配列を用いることができる。一態様では、上記調節配列(ii)は、好ましくは組織特異的であり、すなわち、これは、種子、葉、小塊茎などの特異的組織で本発明の核酸の転写を調節することができる。
調節配列(ii)は、植物で機能するプロモーターを含んでなることができる。実質的には、植物で機能する任意のプロモーターを用いることができる。特別な態様では、上記調節配列(ii)はプロモーター35SCaMVを含んでなる。他の特別な態様では、上記調節配列(ii)は、「パタチナ(patatina)」プロモーター、貯蔵タンパク質プロモーター、ユビキチン遺伝子プロモーター、γ-ゼイン遺伝子のターミネーターなどを含んでなる。
調節配列(ii)は、転写終結配列を含むこともできる。実質的には、植物で機能する任意の転写終結配列を用いることができる。特別な態様では、上記転写終結配列は、ターミネーター35SCaMV、オクトピンシンターゼ(ocs)遺伝子のターミネーター、ノパリンシンターゼ(nos)遺伝子のターミネーター、γ-ゼイン遺伝子のターミネーターなどを含んでなる。
調節配列(ii)は、植物で機能する翻訳エンハンサーを含むこともある。実質的には、植物で機能する任意の翻訳エンハンサー、例えばトマトエッチウイルスの転写の促進配列などを用いることができる。
本発明の核酸配列、または本発明によって提供される構築物を、適当なベクターに挿入することができる。従って、もう一つの態様では、本発明は、本発明の核酸配列または本発明によって提供される核酸構築物を含んでなるベクターを提供する。適当なベクターとしては、プラスミド、コスミド、およびウイルスベクターが挙げられる。一態様では、上記ベクターは植物の形質転換に適する。ベクターの選択は、続いてこれを導入する宿主細胞によって変化することがある。例えば、本発明の核酸配列を導入するベクターは、宿主細胞に導入するときにこの宿主細胞のゲノムに組込まれて、組込まれている染色体(または複数の染色体)と共に複製するプラスミドコスミドまたはウイルスベクターであることができる。上記ベクターを得るため、従来の方法を用いることができる(Sambrook et al., 1989)。
もう一つの態様では、本発明は、植物宿主系であって、本発明の核酸、または本発明によって提供される構築物またはベクターで形質転換された上記植物宿主系を提供する。
本明細書で用いられる「植物宿主系」という用語は、単子葉植物、双子葉植物、具体的には穀類(例えば、トウモロコシ、米、オート麦など)、豆果(例えば、大豆など)、アブラナ(例えば、Arabidopsis thaliana、ナタネなど)、またはナス(例えば、ジャガイモ、トマト、タバコなど)などの植物が挙げられるが、これらに限定されない。植物宿主系は、植物細胞も包含する。植物細胞としては、懸濁培養物、胚、分裂領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、種子および小胞子が挙げられる。植物宿主系は成熟の様々な段階にあることがあり、液体または固体培養で、または土壌またはポット、温室または屋外で適当な培地で生育することができる。植物宿主系の発現は、一過性または恒久的であることがある。植物宿主系は、これらの植物、種子、自家受粉または雑種子孫、有性生殖または無性生殖によって生成した胎芽、および挿木または種子のようなこれらのいずれかの子孫も表す。
植物宿主系の形質転換は、従来の方法を用いて行うことができる。植物への遺伝子導入の総説は、「遺伝子工学と遺伝子導入(Ingenieria genetica and transferencia genica)」, Marta Izquierdo, Ed. Pyramide (1999)という標題の教科書、特に第9章「植物への遺伝子導入(Transferencia genica a plantas) ", 283-316頁に見ることができる。
もう一つの態様では、本発明は、新規な実験室でデザインしたトランスジーンを含むように遺伝子工学処理したトランスジェニック植物宿主系であって、本発明の核酸をそのゲノムに組込んで含んでなる上記トランスジェニック植物宿主系を提供する。上記トランスジェニック植物宿主系は、従来の手法によって、例えば通常のアンチセンスmRNA手法および/または(センスサイレンシングにおける)過剰発現などを用いることによって、例えば二成分ベクターまたは現在用いられている様々な植物形質転換の手法に利用可能な他のベクターを用いることによって得ることができる。本発明によって提供されるトランスジェニック植物宿主系の例としては、単子葉および双子葉植物、具体的には、穀類、豆果、アブラナ、ナスなどが挙げられる。
本発明の核酸配列は、植物宿主系で目的生成物を産生するのに有用である。従って、もう一つの態様では、本発明は、植物宿主系で目的生成物を産生する方法であって、本発明によって提供される形質転換またはトランスジェニック植物宿主系を融合タンパク質の形態で目的生成物を産生し発現する条件下で生育することを含んでなる、方法を提供する。上記のように、上記の融合タンパク質は、上記の宿主植物系の安定なER由来のPBに蓄積される。γ-ゼインドメインのC末端にある酵素的または化学的に開裂可能な部位により、目的生成物を後で回収することができる。目的生成物を、次に従来の手段によって単離して精製することができる。従って、本発明によって提供される方法は、所望ならば、上記融合タンパク質の単離および精製、および場合によっては、上記融合タンパク質からの上記目的生成物の放出をも含んでなる。融合タンパク質は、適宜適当な酵素または化学試薬によって開裂部位で開裂される。
もう一つの態様では、本発明は、植物宿主系でカルシトニンを産生する方法であって、
a) タンパク質γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸配列、またはタンパク質を小胞体(ER)に送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片、
酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸配列、および
カルシトニンをコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸配列
からなる核酸配列(本発明の核酸配列)の転写のための調節配列を含んでなる発現ベクターまたは核酸構築物で植物宿主系を形質転換し、
上記第一の核酸配列の3'末端が上記第二の核酸配列の5'末端に連結し、上記第二の核酸配列の3'末端が上記第三の核酸配列の5'末端に連結しており、
b) 上記発現ベクターまたは核酸構築物で形質転換した上記植物宿主系から完全な植物を生成させ、
c) 上記形質転換植物を、カルシトニンを融合タンパク質の形態で産生し発現させる条件下で生長させ、所望ならば、
d) 上記融合タンパク質を単離し、精製して、上記融合タンパク質を処理してカルシトニンを放出させる、
ことを含んでなる、方法を提供する。
a) タンパク質γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸配列、またはタンパク質を小胞体(ER)に送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片、
酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸配列、および
カルシトニンをコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸配列
からなる核酸配列(本発明の核酸配列)の転写のための調節配列を含んでなる発現ベクターまたは核酸構築物で植物宿主系を形質転換し、
上記第一の核酸配列の3'末端が上記第二の核酸配列の5'末端に連結し、上記第二の核酸配列の3'末端が上記第三の核酸配列の5'末端に連結しており、
b) 上記発現ベクターまたは核酸構築物で形質転換した上記植物宿主系から完全な植物を生成させ、
c) 上記形質転換植物を、カルシトニンを融合タンパク質の形態で産生し発現させる条件下で生長させ、所望ならば、
d) 上記融合タンパク質を単離し、精製して、上記融合タンパク質を処理してカルシトニンを放出させる、
ことを含んでなる、方法を提供する。
従って、本発明は、植物宿主系におけるER由来のPBに目的の組換え生成物を蓄積するための融合タンパク質に基づく系を提供する。本発明を、更に下記の非制限例によって説明する。
タバコ植物におけるカルシトニンの産生
タバコ植物におけるCT産生の良好な例を、下記に説明する。様々なプロリンリッチドメインをγ-ゼインから遺伝子工学処理を行い、開裂可能なプロテアーゼ部位を介する融合パートナーとして働くようにした。成熟CTコード領域(32aa)をγ-ゼインドメインのC末端で融合させ、トランスジェニックタバコ植物で発現させた。開裂可能なプロテアーゼ部位をγ-ゼインドメインのC末端に導入して、後で純粋なカルシトニンを回収した。この方法によって、多量の融合タンパク質がER中に蓄積され、タバコ植物にER由来のPBが形成される。融合タンパク質は、タバコ葉のER由来のPBに多量に蓄積された。上記融合タンパク質の発現レベルは、幾つかの場合には、総可溶性タンパク質の12.44%にまで達した。たった2回の精製段階の後、融合タンパク質をエンテロキナーゼ開裂に付し、カルシトニンを放出させた。純粋なカルシトニンは、消化混合物から逆相クロマトグラフィーによって得た。タバコ植物に蓄積したカルシトニン生成物は、質量分析法によって確認した。融合タンパク質の精製、プロテアーゼ消化、および放出された植物カルシトニン(pCT)の完全な特性決定も示す。
タバコ植物におけるCT産生の良好な例を、下記に説明する。様々なプロリンリッチドメインをγ-ゼインから遺伝子工学処理を行い、開裂可能なプロテアーゼ部位を介する融合パートナーとして働くようにした。成熟CTコード領域(32aa)をγ-ゼインドメインのC末端で融合させ、トランスジェニックタバコ植物で発現させた。開裂可能なプロテアーゼ部位をγ-ゼインドメインのC末端に導入して、後で純粋なカルシトニンを回収した。この方法によって、多量の融合タンパク質がER中に蓄積され、タバコ植物にER由来のPBが形成される。融合タンパク質は、タバコ葉のER由来のPBに多量に蓄積された。上記融合タンパク質の発現レベルは、幾つかの場合には、総可溶性タンパク質の12.44%にまで達した。たった2回の精製段階の後、融合タンパク質をエンテロキナーゼ開裂に付し、カルシトニンを放出させた。純粋なカルシトニンは、消化混合物から逆相クロマトグラフィーによって得た。タバコ植物に蓄積したカルシトニン生成物は、質量分析法によって確認した。融合タンパク質の精製、プロテアーゼ消化、および放出された植物カルシトニン(pCT)の完全な特性決定も示す。
1. 実験手続き
キメラ遺伝子およびベクターの構築
野生型γ-ゼイン遺伝子、および異なるγ-ゼインドメインをコードするRX3、R3、P4およびX10と呼ばれる4種類のγ-ゼイン由来の配列(図1A、1Bおよび1C)をエンテロキナーゼ消化部位(図2)を含む合成CT遺伝子と融合させ、下記および図3の植物形質転換ベクターに導入した。
キメラ遺伝子およびベクターの構築
野生型γ-ゼイン遺伝子、および異なるγ-ゼインドメインをコードするRX3、R3、P4およびX10と呼ばれる4種類のγ-ゼイン由来の配列(図1A、1Bおよび1C)をエンテロキナーゼ消化部位(図2)を含む合成CT遺伝子と融合させ、下記および図3の植物形質転換ベクターに導入した。
γ-ゼイン、RX3およびR3 cDNA配列は、pKSG2 (Torrent et al., 1994)を鋳型として用いるPCRによって生成した。X10 cDNAは、反復ドメインに相当する配列の欠失後にpKSG2から産生したプラスミドであるpDR20から増幅した。異なるPCRに用いたプライマーは、
γ-ゼインcDNA配列については:
T1: 5'TCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTC3'、および
T4: 5'CCATGGCGTGGGGGACACCGCCGGC3'であり、
RX3およびX10 cDNA配列については:
T1および
T2: 5'CCATGGTCTGGCACGGGCTTGGATGCGG 3'であり、
R3 cDNA配列については:
T1および
T3: 5'CCATGGTCCGGGGCGGTTGAGTAGGGTA3'であった。
γ-ゼインcDNA配列については:
T1: 5'TCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTC3'、および
T4: 5'CCATGGCGTGGGGGACACCGCCGGC3'であり、
RX3およびX10 cDNA配列については:
T1および
T2: 5'CCATGGTCTGGCACGGGCTTGGATGCGG 3'であり、
R3 cDNA配列については:
T1および
T3: 5'CCATGGTCCGGGGCGGTTGAGTAGGGTA3'であった。
PCR生成物をpUC18ベクター(SureClone Ligation Kit, Pharmacia)にサブクローニングし、生成するプラスミドをpUCゼイン、pUCRX3、pUCR3およびpUCX10と命名した。γ-ゼイン由来の配列P4 (図1C)を含むベクターpUCP4は、pUCRX3由来のクローンのスクリーニングの際に得た。BspHIおよびNcoIの付着末端を有するγ-ゼイン、RX3、R3、P4およびX10c DNA断片を、予めNcoIで消化したベクターpCKGFPS65C (Reichel et al., 1996)に挿入した。このベクターを選択したが、これは植物での発現の調節配列、およびトランスジェニック植物におけるγ-ゼイン由来タンパク質の平行ターゲッティング研究に用いられるGFPコード配列を含むからである。生成したベクターpCZeinGFP、pCRX3GFP、pCR3GFP、pCP4GFPおよびpCXIOGFPは、植物系での発現の下記の調節配列i)カリフラワーモザイクウイルス(CaMVp35S)由来の増進35Sプロモーター、ii)トマトエッチウイルス(TL)由来の翻訳エンハンサー、およびiii)CaMV35S由来の転写終結配列(pA35S)を含んでいた。γ-ゼイン由来の/CTキメラ構築物は、GFPコード配列を下記のようにCT合成遺伝子で置換することによって生成した(図3参照)。
活性サケCTの32アミノ酸をコードする合成遺伝子(図2)は、2本の122塩基の相補性オリゴヌクレオチドから生成した。植物で高発現を達成するために、オリゴヌクレオチドを優先的植物コドンを用いるようにデザインした。Applied Biosystems 394 DNAシンセサイザーを用いて合成した5'-リン酸化オリゴヌクレオチドは、下記の配列:
CalI: 5'CATGGACGACGACGACAAGTGCTCCAACCTCTCTACCTGCGTTCTTGGTAAGCT CTCTCAGGAGCTTCACAAGCTCCAGACTTACCCTAGAACCAACACTGGTTCCGGTACCCCTGGTTGAT3'、
CalII: 5'CTAGATCAACCAGGGGTACCGGAACCAGTGTTGGTTCTAGGGTAAGTCTGGAG CTTGTGAAGCTCCTGAGAGAGCTTACCAAGAACGCAGGTAGAGAGGTTGGAGCA CTTGTCGTCGTCGTC3'
を有していた。
CalI: 5'CATGGACGACGACGACAAGTGCTCCAACCTCTCTACCTGCGTTCTTGGTAAGCT CTCTCAGGAGCTTCACAAGCTCCAGACTTACCCTAGAACCAACACTGGTTCCGGTACCCCTGGTTGAT3'、
CalII: 5'CTAGATCAACCAGGGGTACCGGAACCAGTGTTGGTTCTAGGGTAAGTCTGGAG CTTGTGAAGCTCCTGAGAGAGCTTACCAAGAACGCAGGTAGAGAGGTTGGAGCA CTTGTCGTCGTCGTC3'
を有していた。
12%ポリアクリルアミドゲル上で精製した後、それぞれのオリゴヌクレオチド60ピコモルを用いて二本鎖分子を形成した。95℃に5分間加熱したハイブリダイゼーション混合物を70℃で1時間保持した後、室温冷却した。合成cDNA断片は、5'および3'末端にそれぞれNcoIおよびXbaI付着末端含んでいた。合成CTcDNAはエンテロキナーゼ特異的開裂部位に相当する5'リンカー配列を含み((Asp)4-Lys)、3'末端で伸長し、CTペプチドの更なるアミド化のための単一グリシンを産生した。NcoI/XbaI CTcDNAをpUC18ベクターにサブクローニングした後、誘導されたγ-ゼインコード配列を含み且つGFPコード配列から欠失したベクターpCZeinGFP、pCRX3GFP、pCR3GFP、pCP4GFPおよびpCXIOGFPのNcoIおよびBamHI制限部位に挿入した。生成する構築物を、pCZeinCT、pCRX3CT、pCR3CT、pCP4CT、およびpCXIOCTと命名した(図3)。有効な植物形質転換ベクターpBZeinCT、pBRX3CT、pBR3CT、pBP4CTおよびpBXIOCT(図4)を、様々なHindIII/HindIII発現カセットを二成分ベクターpBin19に挿入することによって最終的に得た(Bevan, 1984)。
安定なタバコ植物形質転換
二成分ベクターを、Agrobacterium tumefaciensのLBA 4404株に導入した。タバコ(Nicotianatobaccum, W38)葉のディスクを、Draper et al. (1988)の方法に従って形質転換した。再生した植物を、200mg/Lのカナマイシンを含む培地で選別し、温室に移した。最高のトランスジーン生成物レベルを有するトランスジェニックタバコ植物を栽培して、T1世代を得た。発育している葉(長さ約12cm)を採取して、直ちに液体窒素で冷凍し、更に実験を行うために-80℃で保管した。
二成分ベクターを、Agrobacterium tumefaciensのLBA 4404株に導入した。タバコ(Nicotianatobaccum, W38)葉のディスクを、Draper et al. (1988)の方法に従って形質転換した。再生した植物を、200mg/Lのカナマイシンを含む培地で選別し、温室に移した。最高のトランスジーン生成物レベルを有するトランスジェニックタバコ植物を栽培して、T1世代を得た。発育している葉(長さ約12cm)を採取して、直ちに液体窒素で冷凍し、更に実験を行うために-80℃で保管した。
組換えタンパク質の抽出およびウェスタンブロット分析
タバコ葉を液体窒素中で磨りつぶし、4mlの抽出緩衝液(50mM Tris-HCl pH 8, 200mMジチオトレイトール(DTT)、およびプロテアーゼインヒビター(10μMアプロチニン、1μMペプスタチン、100μMロイペプチン、100μMフッ化フェニルメチルスルホニルおよび100μM E64 [(N-(N-(L-3-トランス-カルボキシオキシラン-2-カルボニル)-L-ロイシル)-アグマンチン]/1gの新鮮な葉の材料を用いてホモジナイズした。ホモジェネートを4℃で30分間攪拌した後、2回遠心分離し(15000rpm、30分、4℃)、不溶性材料を除去した。総可溶性タンパク質を、Bradfordタンパク質分析法(Bio-Rad)を用いて定量した。タンパク質を15%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、半乾燥装置を用いてニトロセルロース膜(0.22μM)に移した。膜をγ-ゼイン抗血清(希釈倍率1/7000) (Ludevid et al., 1985)またはKLH-カルシトニンに対して生じた抗血清(CT-抗血清)(希釈倍率1/1000)と共にインキュベーションした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合抗体(希釈倍率1/10000)とインキュベーションした。免疫反応性バンドは、強化化学発光(ECLウェスタンブロッティング装置, Amersham)によって検出した。カルシトニン抗体は、KLHにカップリングした合成サケカルシトニンを接種することによってウサギで生成させた。抗原を4回接種した後(それぞれ200μg)、血清を集めて、等分し、-80℃で保管した。血清滴定は、合成カルシトニンを用いるイムノ-ドットブロットおよびBSA-カルシトニンを抗原として用いるELISA分析法によって行った。
タバコ葉を液体窒素中で磨りつぶし、4mlの抽出緩衝液(50mM Tris-HCl pH 8, 200mMジチオトレイトール(DTT)、およびプロテアーゼインヒビター(10μMアプロチニン、1μMペプスタチン、100μMロイペプチン、100μMフッ化フェニルメチルスルホニルおよび100μM E64 [(N-(N-(L-3-トランス-カルボキシオキシラン-2-カルボニル)-L-ロイシル)-アグマンチン]/1gの新鮮な葉の材料を用いてホモジナイズした。ホモジェネートを4℃で30分間攪拌した後、2回遠心分離し(15000rpm、30分、4℃)、不溶性材料を除去した。総可溶性タンパク質を、Bradfordタンパク質分析法(Bio-Rad)を用いて定量した。タンパク質を15%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、半乾燥装置を用いてニトロセルロース膜(0.22μM)に移した。膜をγ-ゼイン抗血清(希釈倍率1/7000) (Ludevid et al., 1985)またはKLH-カルシトニンに対して生じた抗血清(CT-抗血清)(希釈倍率1/1000)と共にインキュベーションした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合抗体(希釈倍率1/10000)とインキュベーションした。免疫反応性バンドは、強化化学発光(ECLウェスタンブロッティング装置, Amersham)によって検出した。カルシトニン抗体は、KLHにカップリングした合成サケカルシトニンを接種することによってウサギで生成させた。抗原を4回接種した後(それぞれ200μg)、血清を集めて、等分し、-80℃で保管した。血清滴定は、合成カルシトニンを用いるイムノ-ドットブロットおよびBSA-カルシトニンを抗原として用いるELISA分析法によって行った。
ノーザンブロット分析法
総RNAは、Logemann et al., 1987の方法に従って野生型およびトランスジェニックタバコ(T1)葉から単離した。RNAを変性ホルムアミド-アガロースゲル電気泳動(レーン当たり30μg)で分画し、ナイロン膜(Hybond N, Amersham Pharmacia Biotech)に毛細管ブロッティングした。RNAブロットを、CT cDNAから得てランダムプライムドDNA標識キット(Roche)を用いて(α-32P) dCTPで標識した129塩基のDNAプローブとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは42℃で一晩行い、フィルターは3 X SSCおよび0.5% SDS (W/V)中で65℃で15分間3回洗浄した。ブロットは、phosphorImagerスキャナー(Fluor-S(商品名)MultiImager, BIO-RAD)で検出した。
総RNAは、Logemann et al., 1987の方法に従って野生型およびトランスジェニックタバコ(T1)葉から単離した。RNAを変性ホルムアミド-アガロースゲル電気泳動(レーン当たり30μg)で分画し、ナイロン膜(Hybond N, Amersham Pharmacia Biotech)に毛細管ブロッティングした。RNAブロットを、CT cDNAから得てランダムプライムドDNA標識キット(Roche)を用いて(α-32P) dCTPで標識した129塩基のDNAプローブとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは42℃で一晩行い、フィルターは3 X SSCおよび0.5% SDS (W/V)中で65℃で15分間3回洗浄した。ブロットは、phosphorImagerスキャナー(Fluor-S(商品名)MultiImager, BIO-RAD)で検出した。
ELISA分析法
ELISA分析は、可溶性の葉タンパク質抽出物および部分精製したγ-ゼイン-CT融合タンパク質について植物カルシトニン(pCT)定量の目的で行った。マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nalgene Nunc International)に、リン酸緩衝食塩水pH7.5 (PBS)で希釈した可溶性タンパク質(100μl)を加え、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを3回洗浄した後、非特異的結合部位を3%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS-T (0.1% Tween 20を含むPBS)で室温にて1時間ブロックした。プレートをCT抗血清(希釈倍率 1/1000)と2時間インキュベーションし、PBS-Tで4回洗浄した後、ペルオキシダーゼ接合二次抗体(希釈倍率1/8000)(Sigma)と2時間インキュベーションした。一次および二次抗体は、1% BSAを含むPBS-Tで希釈した。PBS-Tで十分に洗浄した後、酵素反応を100μlの基質緩衝液(100mM酢酸ナトリウムpH 6、0.01mg/ml TMB (3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)および0.01%過酸化水素)を用いて37℃で行った。反応を10分後に2N硫酸を用いて停止し、光学密度をMultiskan EX分光光度計(Labsystems)を用いて450nmで測定した。植物抽出物の抗原濃度を、カルシトニン-BSAおよびCT抗血清(希釈倍率 1/1000)を用いて得た標準曲線から補外した。
ELISA分析は、可溶性の葉タンパク質抽出物および部分精製したγ-ゼイン-CT融合タンパク質について植物カルシトニン(pCT)定量の目的で行った。マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nalgene Nunc International)に、リン酸緩衝食塩水pH7.5 (PBS)で希釈した可溶性タンパク質(100μl)を加え、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを3回洗浄した後、非特異的結合部位を3%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS-T (0.1% Tween 20を含むPBS)で室温にて1時間ブロックした。プレートをCT抗血清(希釈倍率 1/1000)と2時間インキュベーションし、PBS-Tで4回洗浄した後、ペルオキシダーゼ接合二次抗体(希釈倍率1/8000)(Sigma)と2時間インキュベーションした。一次および二次抗体は、1% BSAを含むPBS-Tで希釈した。PBS-Tで十分に洗浄した後、酵素反応を100μlの基質緩衝液(100mM酢酸ナトリウムpH 6、0.01mg/ml TMB (3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)および0.01%過酸化水素)を用いて37℃で行った。反応を10分後に2N硫酸を用いて停止し、光学密度をMultiskan EX分光光度計(Labsystems)を用いて450nmで測定した。植物抽出物の抗原濃度を、カルシトニン-BSAおよびCT抗血清(希釈倍率 1/1000)を用いて得た標準曲線から補外した。
電子顕微鏡法
Leaves from野生型およびトランスジェニック植物からの葉を、1%グルタルアルデヒドおよび2.5%パラホルムアルデヒド/20mMリン酸緩衝液, pH7.4を用いる真空浸透(vacuum infiltration)によって1時間室温にて固定した。20mMリン酸緩衝液と200mM塩化アンモニウムで連続的に洗浄した後、試料をエタノールシリーズで脱水し、Lowicryl K4M樹脂に埋設した。免疫化学は、本質的にMoore et al., 1991によって報告された方法で行った。超薄切片を、KLH-カルシトニン(1/500)、αBiP(1/500)およびγ-ゼイン(1/1500)に対する抗血清と共にインキュベーションした。プロテインA-コロイド状金(15nmの金粒子)を、抗体検出に用いた。コントロールとして、平行インキュベーションを、同一希釈倍率の一次抗体を用いて非トランスジェニック植物試料および一次抗体のないトランスジェニック試料で行った。切片を酢酸ウラシルおよびクエン酸鉛で染色し、301型電子顕微鏡(Phillips, Eindhoven, オランダ)で検査した。
Leaves from野生型およびトランスジェニック植物からの葉を、1%グルタルアルデヒドおよび2.5%パラホルムアルデヒド/20mMリン酸緩衝液, pH7.4を用いる真空浸透(vacuum infiltration)によって1時間室温にて固定した。20mMリン酸緩衝液と200mM塩化アンモニウムで連続的に洗浄した後、試料をエタノールシリーズで脱水し、Lowicryl K4M樹脂に埋設した。免疫化学は、本質的にMoore et al., 1991によって報告された方法で行った。超薄切片を、KLH-カルシトニン(1/500)、αBiP(1/500)およびγ-ゼイン(1/1500)に対する抗血清と共にインキュベーションした。プロテインA-コロイド状金(15nmの金粒子)を、抗体検出に用いた。コントロールとして、平行インキュベーションを、同一希釈倍率の一次抗体を用いて非トランスジェニック植物試料および一次抗体のないトランスジェニック試料で行った。切片を酢酸ウラシルおよびクエン酸鉛で染色し、301型電子顕微鏡(Phillips, Eindhoven, オランダ)で検査した。
RX3-CTおよびP4-CT融合タンパク質の精製およびエンテロキナーゼ開裂
RX3-CTおよびP4-CTの可溶性抽出物は、上記のように抽出緩衝液中でトランスジェニックタバコ植物(T1)の葉から得た。固形(NH4)2SO4を0℃でRX3-CTおよびP4-CT可溶性抽出物にそれぞれ45%および60%飽和度になるまで累進的に加えた。試料を0℃で30分間攪拌した後、15000rpmで4℃にて45分間遠心分離した。沈澱したタンパク質を20mM Tris-HCl pH 8.6に再懸濁し、PD 10カラム(Sephadex G-25 M, Amersham Pharmacia)上で脱塩した。脱塩したタンパク質抽出物を、20mM Tris-HCl pH 8.6, 100mM DTTで平衡にしたアニオン交換カラム(HiTrap Qセファロース, Amersham Pharmacia)を用いる高速液体クロマトグラフィー(FPLC)によって分画した。タンパク質は、0-200mM NaCl/20mM Tris-HCl pH 8.6, 100mM DTTの線形塩グラディエントによって溶出した。溶出画分におけるRX3-CTおよびP4-CTの存在を、15% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびCT抗血清を用いるイムノブロット検出によって評価した。ポジティブ画分を脱塩し、5 K NMWL遠心分離フィルター(BIOMAX, Millipore)で濃縮した。RX3-CTおよびP4-CT融合タンパク質の定量は、ELISAによって行った。
RX3-CTおよびP4-CTの可溶性抽出物は、上記のように抽出緩衝液中でトランスジェニックタバコ植物(T1)の葉から得た。固形(NH4)2SO4を0℃でRX3-CTおよびP4-CT可溶性抽出物にそれぞれ45%および60%飽和度になるまで累進的に加えた。試料を0℃で30分間攪拌した後、15000rpmで4℃にて45分間遠心分離した。沈澱したタンパク質を20mM Tris-HCl pH 8.6に再懸濁し、PD 10カラム(Sephadex G-25 M, Amersham Pharmacia)上で脱塩した。脱塩したタンパク質抽出物を、20mM Tris-HCl pH 8.6, 100mM DTTで平衡にしたアニオン交換カラム(HiTrap Qセファロース, Amersham Pharmacia)を用いる高速液体クロマトグラフィー(FPLC)によって分画した。タンパク質は、0-200mM NaCl/20mM Tris-HCl pH 8.6, 100mM DTTの線形塩グラディエントによって溶出した。溶出画分におけるRX3-CTおよびP4-CTの存在を、15% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびCT抗血清を用いるイムノブロット検出によって評価した。ポジティブ画分を脱塩し、5 K NMWL遠心分離フィルター(BIOMAX, Millipore)で濃縮した。RX3-CTおよびP4-CT融合タンパク質の定量は、ELISAによって行った。
EK消化のため、部分精製した融合タンパク質15μgを、0.2U EK (EK Max, Invitrogen)と消化緩衝液(50mM Tris-HCl pH8, 1mM NaCl, 0.1% Tween-20) 30μl中で20℃で24時間インキュベーションした。EK消化緩衝液に、100mM DTTを補足した。還元剤の存在により、エンテロキナーゼ開裂を最適にすることができる。消化生成物を18% Tris-Tricineポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、放出したpCTをイムノブロットによって検出した。合成サケCTを、ポジティブコントロールとして用いた。
放出したpCTの精製および分析
EK消化によって融合タンパク質から放出された植物カルシトニン(pCT)は、RP-HPLCによって精製した。消化混合物を分析用RP-C18カラム(250 x 4 mm, 粒度10μM, 細孔度120Å)に加え、カラムを0.036% TFAを加えた25-60%アセトニトリルの範囲のグラディエントを用いて1ml/分の流速で20分で溶出した。集めた画分を凍結乾燥によって濃縮し、pCT特性決定のために-20℃で保管した。別の実験では、標準のサケCTを同じクロマトグラフィー条件で溶出した。TOF-MALDI質量分析法を用いて、pCTを特性決定した。RP-HPLC画分の分量を等容のマトリックス溶液(10 mg/mlα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸および0.1% TFA)と混合し、混合物1μlをホルダーに沈着させ、Voyager-DE-RP質量分析計(Applied Biosystems)で分析した。標準のサケCTを、常にTOF-MALDI質量分析法実験でコントロールとして用いた。pCTのC末端分析は、精製ペプチド(20ピコモル/μl)をカルボキシペプチダーゼY(0.1U/μl)と37℃で60分間インキュベーションすることによって行い、消化生成物の分析はTOF-MALDI質量分析法によって行った。
EK消化によって融合タンパク質から放出された植物カルシトニン(pCT)は、RP-HPLCによって精製した。消化混合物を分析用RP-C18カラム(250 x 4 mm, 粒度10μM, 細孔度120Å)に加え、カラムを0.036% TFAを加えた25-60%アセトニトリルの範囲のグラディエントを用いて1ml/分の流速で20分で溶出した。集めた画分を凍結乾燥によって濃縮し、pCT特性決定のために-20℃で保管した。別の実験では、標準のサケCTを同じクロマトグラフィー条件で溶出した。TOF-MALDI質量分析法を用いて、pCTを特性決定した。RP-HPLC画分の分量を等容のマトリックス溶液(10 mg/mlα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸および0.1% TFA)と混合し、混合物1μlをホルダーに沈着させ、Voyager-DE-RP質量分析計(Applied Biosystems)で分析した。標準のサケCTを、常にTOF-MALDI質量分析法実験でコントロールとして用いた。pCTのC末端分析は、精製ペプチド(20ピコモル/μl)をカルボキシペプチダーゼY(0.1U/μl)と37℃で60分間インキュベーションすることによって行い、消化生成物の分析はTOF-MALDI質量分析法によって行った。
II. 結果
数種類の誘導されたγ-ゼイン-CTキメラ遺伝子の構築
植物の葉におけるER由来のタンパク粒中へのγ-ゼインのプロリンリッチドメイン発現および良好な集合(Geli et al., 1994)は、植物組織のERに治療タンパク質を蓄積するための重要な手段を提供する。γ-ゼイン遺伝子を欠失し、タバコ植物でCTを産生するための融合パートナーとして用いられる様々なプロリンリッチな切頭タンパク質を作製した。キメラ遺伝子は、γ-ゼインドメインと、プロテアーゼ開裂部位に相当するリンカーが連結したCT合成遺伝子を含んでなっていた。32アミノ酸の活性サケカルシトニンをコードする合成遺伝子を優先的な植物コドンを用いるようにデザインした2種類の相補的オリゴヌクレオチド(122塩基)から生成し、植物における組換えペプチドの高発現を達成した。合成CT cDNA (図2)は、5'末端においてエンテロキナーゼ開裂部位に相当するリンカー配列((Asp)4-Lys)と、3'末端においてグリシンを産生するための追加コドンを含んでいた。このグリシンは、CT生物活性に本質的なC末端プロリンアミドを生成するためのアミド化酵素(PAM)にとって必要な基質である。カルシトニンcDNAを、C末端融合におけるγ-ゼインドメインをコードする配列に融合させた。植物組織における誘導されたγ-ゼイン-CTキメラ遺伝子の発現を最適にするために、植物形質転換ベクターは下記の調節配列i)カリフラワーモザイクウイルス由来の増進35Sプロモーターおよび35Sターミネーター、およびii)トマトエッチウイルス(TL)由来の翻訳エンハンサーを含んでいた。生成した様々な融合タンパク質を図5に示す。γ-ゼイン-CT融合タンパク質は、CTに融合した全γ-ゼインを含んでいる。RX3-CT、R3-CT、P4-CTおよびX10-CT融合タンパク質は、全γ-ゼインと同じ方法でCTに連結した誘導されたγ-ゼインドメインを含む。これらの融合タンパク質は、本質的に反復およびproXドメインの存在または非存在の点が異なる。
数種類の誘導されたγ-ゼイン-CTキメラ遺伝子の構築
植物の葉におけるER由来のタンパク粒中へのγ-ゼインのプロリンリッチドメイン発現および良好な集合(Geli et al., 1994)は、植物組織のERに治療タンパク質を蓄積するための重要な手段を提供する。γ-ゼイン遺伝子を欠失し、タバコ植物でCTを産生するための融合パートナーとして用いられる様々なプロリンリッチな切頭タンパク質を作製した。キメラ遺伝子は、γ-ゼインドメインと、プロテアーゼ開裂部位に相当するリンカーが連結したCT合成遺伝子を含んでなっていた。32アミノ酸の活性サケカルシトニンをコードする合成遺伝子を優先的な植物コドンを用いるようにデザインした2種類の相補的オリゴヌクレオチド(122塩基)から生成し、植物における組換えペプチドの高発現を達成した。合成CT cDNA (図2)は、5'末端においてエンテロキナーゼ開裂部位に相当するリンカー配列((Asp)4-Lys)と、3'末端においてグリシンを産生するための追加コドンを含んでいた。このグリシンは、CT生物活性に本質的なC末端プロリンアミドを生成するためのアミド化酵素(PAM)にとって必要な基質である。カルシトニンcDNAを、C末端融合におけるγ-ゼインドメインをコードする配列に融合させた。植物組織における誘導されたγ-ゼイン-CTキメラ遺伝子の発現を最適にするために、植物形質転換ベクターは下記の調節配列i)カリフラワーモザイクウイルス由来の増進35Sプロモーターおよび35Sターミネーター、およびii)トマトエッチウイルス(TL)由来の翻訳エンハンサーを含んでいた。生成した様々な融合タンパク質を図5に示す。γ-ゼイン-CT融合タンパク質は、CTに融合した全γ-ゼインを含んでいる。RX3-CT、R3-CT、P4-CTおよびX10-CT融合タンパク質は、全γ-ゼインと同じ方法でCTに連結した誘導されたγ-ゼインドメインを含む。これらの融合タンパク質は、本質的に反復およびproXドメインの存在または非存在の点が異なる。
タバコ植物における融合タンパク質の産生
総ての融合遺伝子を、Agrobacterium tumefaciensによる安定なタバコ植物形質転換に用いた。少なくとも20種類の独立したカナマイシン耐性植物(To)を、それぞれの融合遺伝子について再生した。トランスジェニック植物のスクリーニングは、γ-ゼインポリクローナル抗血清を用いる可溶性タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析によって行った。それぞれの融合遺伝子を表すトランスジェニック系のイムノブロットパターンを、図6に示す。観察されたように、微量の融合タンパク質も検出されなかったX10-CT融合遺伝子を除き、組換え融合タンパク質が総てのトランスジェニック系で得られた。この小さな融合タンパク質(80アミノ酸)は、タバコ植物で不安定であると思われる。2つの免疫標識したバンドがR3-CTトランスジェニック系で検出され、1つは異常に高い見かけの分子質量を有していた。この融合タンパク質は、グリコシル化のような翻訳後修飾を施したものと思われた。実際に、γ-ゼインプロリンリッチ反復ドメインは、Arabidopsis植物で発現するときには、グリコシル化することができることが示されている(Alvarez etal., 1998)。タンパク質発現レベルは、総てのトランスジェニック系で高い組換えタンパク質発現レベルを示したRX3-CT融合遺伝子を除き、同じ融合遺伝子の異なる系で極めて変化しやすいものであった。追加のイムノブロットスクリーニングは、sCTペプチドに対して特異的に生じた抗血清を用いて行った(図7 A)。観察されるように、RX3-CTおよびP4-CTタンパク質はsCT抗血清によって強く認識され、これらの融合がタバコ植物においてCTペプチドを良好に蓄積することを示していた。RX3-CTおよびP4-CTイムノブロットパターンは幾つかの標識したバンドを示し、主要バンドは関連した組換えタンパク質の正確な見かけの分子質量に相当することが示された。高分子量標識バンドは、植物組織における融合タンパク質の蓄積中に形成されたγ-ゼインドメイン上でのオリゴマー化工程の結果であると仮定することができた。タンパク質レベルに関する融合遺伝子の発現レベルをチェックするため、比較用のノーザンブロット分析(図7 B)を図7Aでのイムノブロットによって分析したトランスジェニック系を用いて行った。示されるように、RX3-CTおよびP4-CT転写体は一層豊富であり、これらの転写体の安定な蓄積を示していた。意外なことには、R3-CT転写体は、イムノブロットによって検出された低R3-CT融合タンパク質レベルと比較して比較的豊富であった。恐らくは、翻訳後修飾により融合タンパク質の正確な自己集合とそれに続くERでのその安定性が回避されるものと思われる。
総ての融合遺伝子を、Agrobacterium tumefaciensによる安定なタバコ植物形質転換に用いた。少なくとも20種類の独立したカナマイシン耐性植物(To)を、それぞれの融合遺伝子について再生した。トランスジェニック植物のスクリーニングは、γ-ゼインポリクローナル抗血清を用いる可溶性タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析によって行った。それぞれの融合遺伝子を表すトランスジェニック系のイムノブロットパターンを、図6に示す。観察されたように、微量の融合タンパク質も検出されなかったX10-CT融合遺伝子を除き、組換え融合タンパク質が総てのトランスジェニック系で得られた。この小さな融合タンパク質(80アミノ酸)は、タバコ植物で不安定であると思われる。2つの免疫標識したバンドがR3-CTトランスジェニック系で検出され、1つは異常に高い見かけの分子質量を有していた。この融合タンパク質は、グリコシル化のような翻訳後修飾を施したものと思われた。実際に、γ-ゼインプロリンリッチ反復ドメインは、Arabidopsis植物で発現するときには、グリコシル化することができることが示されている(Alvarez etal., 1998)。タンパク質発現レベルは、総てのトランスジェニック系で高い組換えタンパク質発現レベルを示したRX3-CT融合遺伝子を除き、同じ融合遺伝子の異なる系で極めて変化しやすいものであった。追加のイムノブロットスクリーニングは、sCTペプチドに対して特異的に生じた抗血清を用いて行った(図7 A)。観察されるように、RX3-CTおよびP4-CTタンパク質はsCT抗血清によって強く認識され、これらの融合がタバコ植物においてCTペプチドを良好に蓄積することを示していた。RX3-CTおよびP4-CTイムノブロットパターンは幾つかの標識したバンドを示し、主要バンドは関連した組換えタンパク質の正確な見かけの分子質量に相当することが示された。高分子量標識バンドは、植物組織における融合タンパク質の蓄積中に形成されたγ-ゼインドメイン上でのオリゴマー化工程の結果であると仮定することができた。タンパク質レベルに関する融合遺伝子の発現レベルをチェックするため、比較用のノーザンブロット分析(図7 B)を図7Aでのイムノブロットによって分析したトランスジェニック系を用いて行った。示されるように、RX3-CTおよびP4-CT転写体は一層豊富であり、これらの転写体の安定な蓄積を示していた。意外なことには、R3-CT転写体は、イムノブロットによって検出された低R3-CT融合タンパク質レベルと比較して比較的豊富であった。恐らくは、翻訳後修飾により融合タンパク質の正確な自己集合とそれに続くERでのその安定性が回避されるものと思われる。
T1植物由来の葉のタンパク質抽出物についてELISAによって測定したRX3-CTおよびP4-CTタンパク質の最大発現レベルはそれぞれ総可溶性タンパク質の12.44%および10.65%であったが、γ-ゼイン-CTおよびR3-CT発現レベルは総可溶性タンパク質の0.01%程度と低いままであった。これらの結果に関して、RX3-CTおよびP4-CTトランスジェニック系は、植物カルシトニン(pCT)の産生に寄与する更なる実験のために選択した。
融合タンパク質RX3-CTおよびP4-CTの亜細胞性局在化
Arabidopsis植物におけるγ-ゼインおよび2種類のγ-ゼイン欠失突然変異体の発現は、これらのタンパク質がER由来のPBを形成する葉肉細胞のER中に位置することを示していた(Geli etal., 1994)。しかしながら、γ-ゼイン誘導体に融合したカルシトニンは同様な細胞小器官であるER-PBに分類されることは明らかではなかった。カルシトニンを含むγ-ゼイン融合タンパク質のタバコ葉における亜細胞性局在化を検討するため、本発明者らは免疫電子顕微鏡法を用いた(図8)。RX3-CTおよびP4-CTタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の超薄切片を、CT抗体およびプロテインA-金とインキュベーションした。強く標識された大きなPB様細胞小器官が、RX3-CTおよびP4-CTを発現するタバコの葉肉細胞に観察された(それぞれ、図8AおよびB)。小胞は細胞当たり少数しか検出されず、それらの大きさは全くバラバラであった。融合タンパク質はカルシトニンタンパク質とγ-ゼイン断片を含んでいたので、超薄切片をγ-ゼイン抗体ともインキュベーションした。予想されたように、PBにはγ-ゼイン抗体が標識され、融合タンパク質はこれらの細胞小器官の内側に蓄積することが確認された(図8C)。PBがERから形成されることを示すために、切片をER常在性タンパク質BiPに対する抗体とインキュベーションした(図8D)。これらの細胞小器官におけるCT-融合タンパク質とBiPの同時発生は、RX3-CTとP4-CTがER内腔中に蓄積して更に独立したER由来の小胞を形成することを示していた。非トランスジェニック植物の超薄切片にはPB様細胞小器官を検出することができなかったので(図8E)、トランスジェニック植物において一次抗体を持たないコントロール実験を行った(図8 F)。予想されたように、コントロール実験では特異標識は検出されなかった。
Arabidopsis植物におけるγ-ゼインおよび2種類のγ-ゼイン欠失突然変異体の発現は、これらのタンパク質がER由来のPBを形成する葉肉細胞のER中に位置することを示していた(Geli etal., 1994)。しかしながら、γ-ゼイン誘導体に融合したカルシトニンは同様な細胞小器官であるER-PBに分類されることは明らかではなかった。カルシトニンを含むγ-ゼイン融合タンパク質のタバコ葉における亜細胞性局在化を検討するため、本発明者らは免疫電子顕微鏡法を用いた(図8)。RX3-CTおよびP4-CTタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の超薄切片を、CT抗体およびプロテインA-金とインキュベーションした。強く標識された大きなPB様細胞小器官が、RX3-CTおよびP4-CTを発現するタバコの葉肉細胞に観察された(それぞれ、図8AおよびB)。小胞は細胞当たり少数しか検出されず、それらの大きさは全くバラバラであった。融合タンパク質はカルシトニンタンパク質とγ-ゼイン断片を含んでいたので、超薄切片をγ-ゼイン抗体ともインキュベーションした。予想されたように、PBにはγ-ゼイン抗体が標識され、融合タンパク質はこれらの細胞小器官の内側に蓄積することが確認された(図8C)。PBがERから形成されることを示すために、切片をER常在性タンパク質BiPに対する抗体とインキュベーションした(図8D)。これらの細胞小器官におけるCT-融合タンパク質とBiPの同時発生は、RX3-CTとP4-CTがER内腔中に蓄積して更に独立したER由来の小胞を形成することを示していた。非トランスジェニック植物の超薄切片にはPB様細胞小器官を検出することができなかったので(図8E)、トランスジェニック植物において一次抗体を持たないコントロール実験を行った(図8 F)。予想されたように、コントロール実験では特異標識は検出されなかった。
融合タンパク質の精製およびpCTの放出
RX3-CTおよびP4-CT融合タンパク質は、DTT (200mM)のような還元剤を包含する抽出物緩衝液を用いてトランスジェニックタバコ葉(T1)から効果的に抽出された。新鮮な材料1g当たり約85μgのRX3-CTおよび73μgのP4-CTを回収した。RX3-CTおよびP4-CTタンパク質を、それぞれ45%および60%硫酸アンモニウム沈澱によって濃縮した。脱塩したタンパク質抽出物をアニオン交換クロマトグラフィーを用いるFPLCによって分画し、回収された融合タンパク質をELISAによって定量した。RX3-CTタンパク質は全精製タンパク質の約80%であったが、P4-CTは全精製タンパク質の約50%に過ぎなかった。このような相違は，45%硫酸アンモニウムよりも60%でより多くのタンパク質が沈澱し、従って沈澱したP4-CTタンパク質はずっと多くの混入タンパク質を含むという事実によって部分精製した融合タンパク質RX3-CTおよびP4-CTをEKによって消化し、pCT放出をTris-Tricineポリアクリルアミドゲル電気泳動および免疫検出によって制御した。図9に示されるように、カルシトニンに相当する単一標識バンドがRX3-CTおよびP4-CTタンパク質開裂のいずれからも生成した。少量の融合タンパク質RX3-CTおよびP4-CTは、恐らくは酵素が幾つかの開裂部位に接近することができないため消化されないままに残った。
RX3-CTおよびP4-CT融合タンパク質は、DTT (200mM)のような還元剤を包含する抽出物緩衝液を用いてトランスジェニックタバコ葉(T1)から効果的に抽出された。新鮮な材料1g当たり約85μgのRX3-CTおよび73μgのP4-CTを回収した。RX3-CTおよびP4-CTタンパク質を、それぞれ45%および60%硫酸アンモニウム沈澱によって濃縮した。脱塩したタンパク質抽出物をアニオン交換クロマトグラフィーを用いるFPLCによって分画し、回収された融合タンパク質をELISAによって定量した。RX3-CTタンパク質は全精製タンパク質の約80%であったが、P4-CTは全精製タンパク質の約50%に過ぎなかった。このような相違は，45%硫酸アンモニウムよりも60%でより多くのタンパク質が沈澱し、従って沈澱したP4-CTタンパク質はずっと多くの混入タンパク質を含むという事実によって部分精製した融合タンパク質RX3-CTおよびP4-CTをEKによって消化し、pCT放出をTris-Tricineポリアクリルアミドゲル電気泳動および免疫検出によって制御した。図9に示されるように、カルシトニンに相当する単一標識バンドがRX3-CTおよびP4-CTタンパク質開裂のいずれからも生成した。少量の融合タンパク質RX3-CTおよびP4-CTは、恐らくは酵素が幾つかの開裂部位に接近することができないため消化されないままに残った。
pCTの精製および特性決定
植物カルシトニン(pCT)を、分析用C18 RP-HPLCカラム上でのEK消化混合物の分画化(図10)および合成CTを標準品(MW 3433.24, 図11.A)として用いるTOF-MALDI質量分析法による溶出画分の分析によって単離した。pCTカルシトニンは13分に溶出し(合成sCT Tr = 14分)、TOF-MALDI質量分析法により質量が3491.93Daの単一スペクトルを生じ、これは還元C末端グリシン伸長カルシトニンの理論分子質量と一致した(図11B)。カルボキシペプチダーゼY消化を施したpCTの質量分析法により、C末端プロリンアミドの産生に本質的であるC末端グリシンの完全性が確かめられた。
植物カルシトニン(pCT)を、分析用C18 RP-HPLCカラム上でのEK消化混合物の分画化(図10)および合成CTを標準品(MW 3433.24, 図11.A)として用いるTOF-MALDI質量分析法による溶出画分の分析によって単離した。pCTカルシトニンは13分に溶出し(合成sCT Tr = 14分)、TOF-MALDI質量分析法により質量が3491.93Daの単一スペクトルを生じ、これは還元C末端グリシン伸長カルシトニンの理論分子質量と一致した(図11B)。カルボキシペプチダーゼY消化を施したpCTの質量分析法により、C末端プロリンアミドの産生に本質的であるC末端グリシンの完全性が確かめられた。
III. 討論
タバコ植物にサケカルシトニンを蓄積するための良好な融合タンパク質を基剤とする系が提供される。2種類の融合タンパク質RX3-CalおよびP4-Calは、タバコ葉ER由来のPBに強く蓄積することが分かった。これらの融合タンパク質は、CTペプチドと、i)ヘキサペプチドPPPVHLの8単位(P4-Cal融合タンパク質では1単位のみ)から構成される反復ドメインとii)プロリン残基が他のアミノ酸と交互になっているproXドメインからなるγ-ゼインのプロリンリッチドメインを含む。γ-ゼインプロリンリッチドメインは、Arabidopsis植物のER中のγ-ゼインの正確な保持および集合に必要である(Geli et al., 1994)。ERでのγ-ゼインポリペプチド鎖のフォールディングおよび安定化は、反復およびproXドメインが自己集合し且つオリゴマーの形成を促進する能力によるものであった。これらの高度に疎水性のドメインによって採用される特定のコンホメーションは、両親媒性の二次構造を形成することができるプロリンリッチ配列によるものである。その適正なコンホメーションの結果、プロリンリッチドメインは、ER保持およびER由来のPBの形成に寄与するタンパク質-タンパク質相互作用およびジスルフィド架橋を伴う凝集機構を誘導する。この例は、N末端融合的に発現するときには、γ-ゼインプロリンリッチドメインは自己集合し且つER由来のPBで保持されて蓄積される複雑な事象を促進する全能力を保存することを示している。融合タンパク質に関与するサケCTは、PBに多量に蓄積することも分かった。トランスジェニックタバコ植物におけるCTの高発現レベルは、プロリンリッチドメインが融合タンパク質をフォールドして安定化することができることによると考えられる。融合タンパク質のPBにおける沈着は、加水分解的細胞内環境から除去することによるCTにおける植物組織の強化に確実に寄与する。小さなペプチドは生物系で不安定であるので、融合タンパク質法が非相同系、例えばE. coli (Ray et al., 1993; Yabuta et al., 1995 ; Hong et al., 2000)、Staphylococcus carnosus (Dilsen et al., 2000)、およびトランスジェニックウサギの乳(Mckee et al., 1998)でカルシトニンを産生するのに用いられてきているこの最後の場合には、CTとヒトα-ラクトアルブミンの融合は、カルシトニン活性を遮蔽し、通常の動物の発生に伴う起こり得る干渉を回避する目的も有していた。
タバコ植物にサケカルシトニンを蓄積するための良好な融合タンパク質を基剤とする系が提供される。2種類の融合タンパク質RX3-CalおよびP4-Calは、タバコ葉ER由来のPBに強く蓄積することが分かった。これらの融合タンパク質は、CTペプチドと、i)ヘキサペプチドPPPVHLの8単位(P4-Cal融合タンパク質では1単位のみ)から構成される反復ドメインとii)プロリン残基が他のアミノ酸と交互になっているproXドメインからなるγ-ゼインのプロリンリッチドメインを含む。γ-ゼインプロリンリッチドメインは、Arabidopsis植物のER中のγ-ゼインの正確な保持および集合に必要である(Geli et al., 1994)。ERでのγ-ゼインポリペプチド鎖のフォールディングおよび安定化は、反復およびproXドメインが自己集合し且つオリゴマーの形成を促進する能力によるものであった。これらの高度に疎水性のドメインによって採用される特定のコンホメーションは、両親媒性の二次構造を形成することができるプロリンリッチ配列によるものである。その適正なコンホメーションの結果、プロリンリッチドメインは、ER保持およびER由来のPBの形成に寄与するタンパク質-タンパク質相互作用およびジスルフィド架橋を伴う凝集機構を誘導する。この例は、N末端融合的に発現するときには、γ-ゼインプロリンリッチドメインは自己集合し且つER由来のPBで保持されて蓄積される複雑な事象を促進する全能力を保存することを示している。融合タンパク質に関与するサケCTは、PBに多量に蓄積することも分かった。トランスジェニックタバコ植物におけるCTの高発現レベルは、プロリンリッチドメインが融合タンパク質をフォールドして安定化することができることによると考えられる。融合タンパク質のPBにおける沈着は、加水分解的細胞内環境から除去することによるCTにおける植物組織の強化に確実に寄与する。小さなペプチドは生物系で不安定であるので、融合タンパク質法が非相同系、例えばE. coli (Ray et al., 1993; Yabuta et al., 1995 ; Hong et al., 2000)、Staphylococcus carnosus (Dilsen et al., 2000)、およびトランスジェニックウサギの乳(Mckee et al., 1998)でカルシトニンを産生するのに用いられてきているこの最後の場合には、CTとヒトα-ラクトアルブミンの融合は、カルシトニン活性を遮蔽し、通常の動物の発生に伴う起こり得る干渉を回避する目的も有していた。
本発明者らは、
i) RX3-CalおよびP4-Cal融合タンパク質を、還元剤の存在下での溶解度が高いため、タバコ組織から効率的に回収し、
ii) 融合タンパク質からのカルシトニンのエンテロキナーゼ放出を、アニオン交換クロマトグラフィーによる融合タンパク質の1精製段階の後に行い、
iii) 逆相クロマトグラフィーによって、EK消化混合物から除去することにより精製CTを得る
タバコ植物からグリシン伸長sCTの迅速産生に成功した。
i) RX3-CalおよびP4-Cal融合タンパク質を、還元剤の存在下での溶解度が高いため、タバコ組織から効率的に回収し、
ii) 融合タンパク質からのカルシトニンのエンテロキナーゼ放出を、アニオン交換クロマトグラフィーによる融合タンパク質の1精製段階の後に行い、
iii) 逆相クロマトグラフィーによって、EK消化混合物から除去することにより精製CTを得る
タバコ植物からグリシン伸長sCTの迅速産生に成功した。
放出CTの質量分析法により、正確なグリシン伸長CTがタバコ植物によって産生したことが確かめられた。
参考文献
Alvarez, I., Gelim M. I., Pimente, E. , Ludevid, D. , Torrent, M. 1998. 「リシンリッチなγ-ゼインはトランスジェニックArabidopsis植物に分泌される」Planta 205: 420-427.
Azria, M., Copp, D.H., Zanelli, J.M. 1995.「サケカルシトニンの25年: 合成から治療使用へ」Calcif. Tissue Int. 57 (6): 405-408.
Benicourt, C., Blanchard, C., Carriere, F., Verger, R. and Junien, J.L. 1993. 「嚢胞性繊維症における膵臓抽出物への酵素補足物としての組換えイヌ胃リパーゼの潜在的使用」, pp. 291-295 「嚢胞性繊維症の臨床生態学(Clinical Ecology of Cystic Fibrosis)」Escobar H, Baquero CF, Suarez L (監修). Elsevier Sciences Publishers BV, Amsterdam.
Bevan, M. 1984. 「植物形質転換のための二成分Agrobacteriumベクター」Nucleic Acids Research 12: 8711-8721.
Bradbury, A.F. and Smyth, D.G. 1988. 「ペプチド神経伝達物質の生合成: ペプチドアミドの形成の研究」Physio. Bohemoslov. 37: 267-274.
Conrad, U. and Fiedler, U. 1998. 「植物細胞における組換え免疫グロブリンの区画特異的蓄積: 生理学的機能および病原体活性の抗体産生および免疫調節のための本質的手段」Plant Mol. Biol. 38: 101-109.
Cramer, C.L. , Boothe, J.G. and Oishi, K.K. 1999. 「上流および下流法を連結する治療タンパク質のためのトランスジェニック植物」Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 95-118.
Cudd, A., Arvinte, T., Das, R.E., Chinni, C. and MacIntyre, I. 1995. 「繊維形成が回避されるときのヒトカルシトニンの能力増加」J. Pharm. Sci. 84: 717-719.
Dilsen, S., Paul, W., Sandgathe, D., Tippe, R., Freudl, J., Kula, M.R., Takors, C., Wandrey, D. and Weuster-Botz, D. 2000. 「Staphylococcus carnosusを発現-分泌系として用いる組換えヒトカルシトニン前駆体融合タンパク質の流加培養生産」Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 361-369.
Draper, J. , Scott, R. and Hamil, J. 1988. 「植物遺伝子形質転換および遺伝子発現。実験室便覧(Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual)」(Draper, J., Scott, R., Armitage, P. and Walden, R.監修), Blackwell Scientific Publications
Duering, K., Hippe, S., Kreuzaler, F. and Schell, J. 1990. 「トランスジェニックNicotiana tabacumにおける機能的モノクローナル抗体の合成および自己集合」Plant Mol. Biol. 15: 281- 293.
Eipper, B.A., Stoffers D.A. and Mains R.E. 1992. 「神経ペプチドの生合成: ペプチドα-アミド化」Annu. Rev. Neurosci. 15: 57-85.
Fischer, R. and Emans, N. 2000. 「医薬タンパク質の分子ファーミング」 Transgenic Research 9: 279-299.
Geli, M.I., Torrent, M. and Ludevid, M.D. 1994. 「2種類の構造ドメインがγ-ゼインターゲッティングにおける2個の連続事象を伝達する: タンパク質小胞体保持およびタンパク粒形成」Plant Cell 6: 1911-1922.
Haq, T.A., Mason, H.S., Clements, J.D. and Arntzen, C.J. 1995. 「トランスジェニック植物で産生した組換え細菌性抗原を用いる経口免疫」Science 268: 714-715.
Herman, E.M. and Larkins, B.A. 1999. 「タンパク質貯蔵体」Plant Cell 11: 601-613.
Hong, D., Mingqiang, Z., Min, L, Changqing, C. and Jifang, M. 2000. 「イン・ビトロでの酵素的トランスアシル化または光分解を用いる前駆体ペプチドのアミド化による組換えサケカルシトニンの産生」Biochem. Biophys. Res. Com. 267: 362-367.
Kogan, M.J., Dalcol, I., Gorostiza, P., Lopez-Igtesias, C., Pons, M., Sanz, F., Ludevid, M.D., and Giralt, E. 2001. 「両親媒性へリックス(VHLPPP)8の自己集合。ゼインタンパク粒形成の機構」J. Mol. Biol. 00: 1-7.
Logemann, J., Schell, J., Willmitzer, L. 1987. 「植物組織からのRNAの単離の改良法」Anal. Biochem. 163: 16-20.
Ludevid, M.D., Martinez-Izquierdo, J.A., Armengol, M., Torrent, M., Puigdomenech, P. and Palau, P., J. 1985. 「トウモロコシ(Zea mays)内胚乳からのグルテリン-2と低分子量ゼイン-2タンパク質との免疫学的関係」Plant sci. 41: 41-48.
Ludevid, M.D., Torrent, M., Martinez-Izquierdo, J.A., Puigdomenech, P. and Palau, P.1984.「トウモロコシにおけるグルテリン-2の亜細胞局在化」Plant Mol. Biol. 3: 277-234.
Ma, J.K. , Hikmat, B.Y., Wycoff, K., Vine, N.D., Chargelegue. D., Yum L. , Hein, M.B.and Lehner, T. 1998. 「組換え植物モノクローナル分泌抗体の特性決定およびヒトでの予防的免疫療法」Nat. Med. 4: 601-606.
Ma, J.K. and Hein, M.B. 1995. 「免疫療法のための植物抗体」Plant Physio. 109:341-346.
McCormick, A.A., Kumagai, M.H., Hanley, K., Turpen, T.H., Hakim, I., Grill, L.K., Tuse, D., Levy, S. and levy, R. 1999. 「タバコ植物での腫瘍由来の一本鎖Fvエピトープの発現によるリンパ腫の特異的ワクチンの迅速産生」Proc. Natl. Aca. Sci. USA 96 (2) 703-708.
McKee, C., Gibson, A., Dalrymple, M., Emslie, L., Garner, 1. and Cottingham, I. 1998.「Production of biologically activeサケカルシトニン in the milk ofトランスジェニックウサギの乳における生物活性なサケカルシトニンの産生」Nature Biotechnology 16: 647-651.
Merli, S., De Falco, S., Verdoliva, A., Tortora, M., Villain, M., Silvi, P., Cassani, G. and Fassina, G. 1996.「組換えヒトアミド化カルシトニンの一段階産生のための発現系」Protein Express. Purif. 7: 347-354.
Moore, P.J., Swords, K.M.M., Lynch, M.A. and Staehelin, L.A. 1991.「植物のゴルジ装置における糖タンパク質と複雑な多糖類の集合経路の空間的構成」J. Cell Biol. 112: 589-602.
Munro, S. and and Pelham, H.R.B. 1987. 「C末端シグナルは内腔のERタンパク質」Cell 48: 899-907.
Muentz, K. 1998. 「貯蔵タンパク質の沈着」Plant Mol. Biol. 38: 77-99.
Parmenter, D.L., Boothe, J.G., Van Rooijen, G.J., Yeung, E.C. and Moloney, M.M. 1995.「オレオシン分割を用いる植物種子の生物活性ヒルジンの産生」Plant Mol. Biol. 29: 1167-1180.
Ray, M.V., Van Duyne, P., Bertelsen, A.H., Jackson, Matthews, D.E., Sturmer, A.M., Merker, D.J., Consalvo, A.P., Young, S.D., Gilligan, J.P. and Shields, P.P. 1993.「Escherichia coliによって産生した前駆体ペプチドのイン・ビトロアミド化による組換えサケカルシトニンの産生」Bio/Technology 11 : 64-70.
Reginster, J.Y. 1993. 「骨粗鬆症の予防および治療のためのカルシトニン」Am. J. Med. 95(5A) :44S-47S.
Reichel, C., Mathur, J., Eckes, P., Langenkemper, K., Koncz, C., Schell, J., Reiss, B., and Maas, C. 1996.「単子葉および双子葉植物細胞におけるAequorea victoriaの緑色蛍光タンパク質の発現による緑色蛍光の増加」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5888-5893.
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T., 1989.「分子クローニング: 実験室便覧」Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Silverman, S. L. 1997.「カルシトニン」Am. J. Med. Sci. 313 (1) : 13-16.
Staub, J.M., Garcia, B., Graves, J., Hajdukiewicz, P.T., Hunter, P., Nehra, N., Paradkar, V., Schlittler, M., Caroll, J.A., Spatola, L., Ward, D., Ye, G. and Russell, D.A. 2000.「タバコ葉緑体におけるヒト治療タンパク質の高収率産生」Nature Biotechnology 18: 333-338.
Stoeger, E., Vaquero, C., Torres, E., Sack, M., Nicholson, L., Drossard, J., Williams, S., Keen, D., Perrin, Y., Christou, P. and Fischer, R. 2000.「医薬用scfv抗体の生育可能な産生および貯蔵系としての穀物」Plant Mol. Biol. 42: 583-590.
Takahashi, K.I., Liu, Y.C., Hayashi, N., Goto, F., Kato, M., Kawashima, H. and Takeuchi, T. 1997.「非内分泌細胞系COS-7およびCHOからの生物活性サケカルシトニンの産生」Peptides 18: 439-444.
Torrent, M., Poca, E., Campos, N., Ludevid, M.D. and Palau, J. 1986.「トウモロコシにおいて、 グルテリン-2および低分子量ゼインは膜結合したポリリボソームによって合成され、ミクロソーム膜に転流される」Plant Mol. Biol. 7: 393-403.
Torrent, M., Geli, M.I., Ruir-Avila, L., Canals, JM., Puigdomenech, P. and Ludevid, D.1994.「ツメガエル卵母細胞におけるトウモロコシγ-ゼイン保持のための構造ドメインの役割」Planta 192: 512-518.
Torres, E., Vaquero, C., Nicholson, L. , Sack, M., Stoger, E., Drossard, J., Christou, P., Fischer, R. and Perrin, Y. 1999.「機能的診断および治療抗体の代替産生系としてのコメ細胞培養物」Transgenic Research 8: 441-449.
Verch, T., Yusibov, V. and Koprowski, H. 1998「植物ウイルスベクターを用いる植物における完全長モノクローナル抗体の発現および集合」J. Immunol. Methods 220: 69-75.
Vitale, A., Ceriotti, A. and Denecke, J. 1993.「タンパク質合成、修飾および細胞内輸送における小胞体の役割」J. Exp. Bot. 44: 1417-1444.
Vitale, A. and Denecke, J. 1999.「分泌経路の小胞体の出入口」Plant Cell 11: 615-628.
Wandelt, C.I., Khan, M.R.I., Craig, S., Schroeder, H.E., Spencer, D. and Higgins, T.J.V. 1992.「カルボキシ末端KDELを有するビシリンは小胞体に保持され、トランスジェニック植物の葉に高レベルに蓄積する」Plant J. 2: 181-192.
Yabuta, M., Suzuki, Y. and Ohsuye, K. 1995.「Escherichia coliにおける組換えヒトカルシトニン前駆体ペプチドの高発現」Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 (5): 703- 708.
Yamamoto, K., Fujii, R., Toyofuku, Y., Saito, T., Koseki, H., Hsu V.W. and Aoe, T. 2001.「KDEL受容体は小胞体における品質制御に寄与する回復機構を伝達する」EMBO J. 20 (12): 3082-3091.
Alvarez, I., Gelim M. I., Pimente, E. , Ludevid, D. , Torrent, M. 1998. 「リシンリッチなγ-ゼインはトランスジェニックArabidopsis植物に分泌される」Planta 205: 420-427.
Azria, M., Copp, D.H., Zanelli, J.M. 1995.「サケカルシトニンの25年: 合成から治療使用へ」Calcif. Tissue Int. 57 (6): 405-408.
Benicourt, C., Blanchard, C., Carriere, F., Verger, R. and Junien, J.L. 1993. 「嚢胞性繊維症における膵臓抽出物への酵素補足物としての組換えイヌ胃リパーゼの潜在的使用」, pp. 291-295 「嚢胞性繊維症の臨床生態学(Clinical Ecology of Cystic Fibrosis)」Escobar H, Baquero CF, Suarez L (監修). Elsevier Sciences Publishers BV, Amsterdam.
Bevan, M. 1984. 「植物形質転換のための二成分Agrobacteriumベクター」Nucleic Acids Research 12: 8711-8721.
Bradbury, A.F. and Smyth, D.G. 1988. 「ペプチド神経伝達物質の生合成: ペプチドアミドの形成の研究」Physio. Bohemoslov. 37: 267-274.
Conrad, U. and Fiedler, U. 1998. 「植物細胞における組換え免疫グロブリンの区画特異的蓄積: 生理学的機能および病原体活性の抗体産生および免疫調節のための本質的手段」Plant Mol. Biol. 38: 101-109.
Cramer, C.L. , Boothe, J.G. and Oishi, K.K. 1999. 「上流および下流法を連結する治療タンパク質のためのトランスジェニック植物」Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 95-118.
Cudd, A., Arvinte, T., Das, R.E., Chinni, C. and MacIntyre, I. 1995. 「繊維形成が回避されるときのヒトカルシトニンの能力増加」J. Pharm. Sci. 84: 717-719.
Dilsen, S., Paul, W., Sandgathe, D., Tippe, R., Freudl, J., Kula, M.R., Takors, C., Wandrey, D. and Weuster-Botz, D. 2000. 「Staphylococcus carnosusを発現-分泌系として用いる組換えヒトカルシトニン前駆体融合タンパク質の流加培養生産」Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 361-369.
Draper, J. , Scott, R. and Hamil, J. 1988. 「植物遺伝子形質転換および遺伝子発現。実験室便覧(Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual)」(Draper, J., Scott, R., Armitage, P. and Walden, R.監修), Blackwell Scientific Publications
Duering, K., Hippe, S., Kreuzaler, F. and Schell, J. 1990. 「トランスジェニックNicotiana tabacumにおける機能的モノクローナル抗体の合成および自己集合」Plant Mol. Biol. 15: 281- 293.
Eipper, B.A., Stoffers D.A. and Mains R.E. 1992. 「神経ペプチドの生合成: ペプチドα-アミド化」Annu. Rev. Neurosci. 15: 57-85.
Fischer, R. and Emans, N. 2000. 「医薬タンパク質の分子ファーミング」 Transgenic Research 9: 279-299.
Geli, M.I., Torrent, M. and Ludevid, M.D. 1994. 「2種類の構造ドメインがγ-ゼインターゲッティングにおける2個の連続事象を伝達する: タンパク質小胞体保持およびタンパク粒形成」Plant Cell 6: 1911-1922.
Haq, T.A., Mason, H.S., Clements, J.D. and Arntzen, C.J. 1995. 「トランスジェニック植物で産生した組換え細菌性抗原を用いる経口免疫」Science 268: 714-715.
Herman, E.M. and Larkins, B.A. 1999. 「タンパク質貯蔵体」Plant Cell 11: 601-613.
Hong, D., Mingqiang, Z., Min, L, Changqing, C. and Jifang, M. 2000. 「イン・ビトロでの酵素的トランスアシル化または光分解を用いる前駆体ペプチドのアミド化による組換えサケカルシトニンの産生」Biochem. Biophys. Res. Com. 267: 362-367.
Kogan, M.J., Dalcol, I., Gorostiza, P., Lopez-Igtesias, C., Pons, M., Sanz, F., Ludevid, M.D., and Giralt, E. 2001. 「両親媒性へリックス(VHLPPP)8の自己集合。ゼインタンパク粒形成の機構」J. Mol. Biol. 00: 1-7.
Logemann, J., Schell, J., Willmitzer, L. 1987. 「植物組織からのRNAの単離の改良法」Anal. Biochem. 163: 16-20.
Ludevid, M.D., Martinez-Izquierdo, J.A., Armengol, M., Torrent, M., Puigdomenech, P. and Palau, P., J. 1985. 「トウモロコシ(Zea mays)内胚乳からのグルテリン-2と低分子量ゼイン-2タンパク質との免疫学的関係」Plant sci. 41: 41-48.
Ludevid, M.D., Torrent, M., Martinez-Izquierdo, J.A., Puigdomenech, P. and Palau, P.1984.「トウモロコシにおけるグルテリン-2の亜細胞局在化」Plant Mol. Biol. 3: 277-234.
Ma, J.K. , Hikmat, B.Y., Wycoff, K., Vine, N.D., Chargelegue. D., Yum L. , Hein, M.B.and Lehner, T. 1998. 「組換え植物モノクローナル分泌抗体の特性決定およびヒトでの予防的免疫療法」Nat. Med. 4: 601-606.
Ma, J.K. and Hein, M.B. 1995. 「免疫療法のための植物抗体」Plant Physio. 109:341-346.
McCormick, A.A., Kumagai, M.H., Hanley, K., Turpen, T.H., Hakim, I., Grill, L.K., Tuse, D., Levy, S. and levy, R. 1999. 「タバコ植物での腫瘍由来の一本鎖Fvエピトープの発現によるリンパ腫の特異的ワクチンの迅速産生」Proc. Natl. Aca. Sci. USA 96 (2) 703-708.
McKee, C., Gibson, A., Dalrymple, M., Emslie, L., Garner, 1. and Cottingham, I. 1998.「Production of biologically activeサケカルシトニン in the milk ofトランスジェニックウサギの乳における生物活性なサケカルシトニンの産生」Nature Biotechnology 16: 647-651.
Merli, S., De Falco, S., Verdoliva, A., Tortora, M., Villain, M., Silvi, P., Cassani, G. and Fassina, G. 1996.「組換えヒトアミド化カルシトニンの一段階産生のための発現系」Protein Express. Purif. 7: 347-354.
Moore, P.J., Swords, K.M.M., Lynch, M.A. and Staehelin, L.A. 1991.「植物のゴルジ装置における糖タンパク質と複雑な多糖類の集合経路の空間的構成」J. Cell Biol. 112: 589-602.
Munro, S. and and Pelham, H.R.B. 1987. 「C末端シグナルは内腔のERタンパク質」Cell 48: 899-907.
Muentz, K. 1998. 「貯蔵タンパク質の沈着」Plant Mol. Biol. 38: 77-99.
Parmenter, D.L., Boothe, J.G., Van Rooijen, G.J., Yeung, E.C. and Moloney, M.M. 1995.「オレオシン分割を用いる植物種子の生物活性ヒルジンの産生」Plant Mol. Biol. 29: 1167-1180.
Ray, M.V., Van Duyne, P., Bertelsen, A.H., Jackson, Matthews, D.E., Sturmer, A.M., Merker, D.J., Consalvo, A.P., Young, S.D., Gilligan, J.P. and Shields, P.P. 1993.「Escherichia coliによって産生した前駆体ペプチドのイン・ビトロアミド化による組換えサケカルシトニンの産生」Bio/Technology 11 : 64-70.
Reginster, J.Y. 1993. 「骨粗鬆症の予防および治療のためのカルシトニン」Am. J. Med. 95(5A) :44S-47S.
Reichel, C., Mathur, J., Eckes, P., Langenkemper, K., Koncz, C., Schell, J., Reiss, B., and Maas, C. 1996.「単子葉および双子葉植物細胞におけるAequorea victoriaの緑色蛍光タンパク質の発現による緑色蛍光の増加」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5888-5893.
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T., 1989.「分子クローニング: 実験室便覧」Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Silverman, S. L. 1997.「カルシトニン」Am. J. Med. Sci. 313 (1) : 13-16.
Staub, J.M., Garcia, B., Graves, J., Hajdukiewicz, P.T., Hunter, P., Nehra, N., Paradkar, V., Schlittler, M., Caroll, J.A., Spatola, L., Ward, D., Ye, G. and Russell, D.A. 2000.「タバコ葉緑体におけるヒト治療タンパク質の高収率産生」Nature Biotechnology 18: 333-338.
Stoeger, E., Vaquero, C., Torres, E., Sack, M., Nicholson, L., Drossard, J., Williams, S., Keen, D., Perrin, Y., Christou, P. and Fischer, R. 2000.「医薬用scfv抗体の生育可能な産生および貯蔵系としての穀物」Plant Mol. Biol. 42: 583-590.
Takahashi, K.I., Liu, Y.C., Hayashi, N., Goto, F., Kato, M., Kawashima, H. and Takeuchi, T. 1997.「非内分泌細胞系COS-7およびCHOからの生物活性サケカルシトニンの産生」Peptides 18: 439-444.
Torrent, M., Poca, E., Campos, N., Ludevid, M.D. and Palau, J. 1986.「トウモロコシにおいて、 グルテリン-2および低分子量ゼインは膜結合したポリリボソームによって合成され、ミクロソーム膜に転流される」Plant Mol. Biol. 7: 393-403.
Torrent, M., Geli, M.I., Ruir-Avila, L., Canals, JM., Puigdomenech, P. and Ludevid, D.1994.「ツメガエル卵母細胞におけるトウモロコシγ-ゼイン保持のための構造ドメインの役割」Planta 192: 512-518.
Torres, E., Vaquero, C., Nicholson, L. , Sack, M., Stoger, E., Drossard, J., Christou, P., Fischer, R. and Perrin, Y. 1999.「機能的診断および治療抗体の代替産生系としてのコメ細胞培養物」Transgenic Research 8: 441-449.
Verch, T., Yusibov, V. and Koprowski, H. 1998「植物ウイルスベクターを用いる植物における完全長モノクローナル抗体の発現および集合」J. Immunol. Methods 220: 69-75.
Vitale, A., Ceriotti, A. and Denecke, J. 1993.「タンパク質合成、修飾および細胞内輸送における小胞体の役割」J. Exp. Bot. 44: 1417-1444.
Vitale, A. and Denecke, J. 1999.「分泌経路の小胞体の出入口」Plant Cell 11: 615-628.
Wandelt, C.I., Khan, M.R.I., Craig, S., Schroeder, H.E., Spencer, D. and Higgins, T.J.V. 1992.「カルボキシ末端KDELを有するビシリンは小胞体に保持され、トランスジェニック植物の葉に高レベルに蓄積する」Plant J. 2: 181-192.
Yabuta, M., Suzuki, Y. and Ohsuye, K. 1995.「Escherichia coliにおける組換えヒトカルシトニン前駆体ペプチドの高発現」Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 (5): 703- 708.
Yamamoto, K., Fujii, R., Toyofuku, Y., Saito, T., Koseki, H., Hsu V.W. and Aoe, T. 2001.「KDEL受容体は小胞体における品質制御に寄与する回復機構を伝達する」EMBO J. 20 (12): 3082-3091.
Claims (38)
- タンパク質γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸配列、またはタンパク質を植物細胞の小胞体(ER)に送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片、
酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸配列、および
目的生成物をコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸配列
を含んでなり、
上記第一の核酸配列の3'末端が上記第二の核酸配列の5'末端に連結し、上記第二の核酸配列の3'末端が上記第三の核酸配列の5'末端に連結している
核酸配列。 - 上記の第一の核酸配列が完全長γ-ゼインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1に記載の核酸配列。
- 上記第一の核酸配列が、
タンパク質γ-ゼインの反復ドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列、
タンパク質γ-ゼインのProXドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列、または
タンパク質γ-ゼインの反復ドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列と、タンパク質γ-ゼインのProXドメインの全部または一部をコードする1種類以上のヌクレオチド配列
を含んでなる、請求項1に記載の核酸配列。 - 上記第一の核酸配列が、
配列番号:1に示されるヌクレオチド配列[γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列(図1A)]、
配列番号:2に示されるヌクレオチド[RX3として同定されるヌクレオチド配列(図1B)]、
配列番号:3に示されるヌクレオチド配列[R3として同定されるヌクレオチド配列(図1B)]、
配列番号:4に示されるヌクレオチド配列[P4として同定されるヌクレオチド配列(図1C)]、および
配列番号:5に示されるヌクレオチド配列[X10として同定されるヌクレオチド配列(図1C)]
からなる群から選択される、請求項1に記載の核酸配列。 - 上記第二の核酸配列がプロテアーゼ開裂部位を画定するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1-4のいずれか一項に記載の核酸配列。
- 上記プロテアーゼがエンテロキナーゼ、Arg-Cエンドプロテアーゼ、Glu-Cエンドプロテアーゼ、Lys-Cエンドプロテアーゼ、またはXa因子である、請求項5に記載の核酸配列。
- 上記第二の核酸配列が化学的試薬によって特異的に開裂可能なアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1-4のいずれか一項に記載の核酸配列。
- 上記化学的試薬が臭化シアンである、請求項7に記載の核酸配列。
- 上記目的生成物がタンパク質性薬剤である、請求項1-8のいずれか一項に記載の核酸配列。
- 上記タンパク質性薬剤がペプチドホルモンまたはインターフェロンであり、上記薬剤がヒトまたは動物体の治療に有効である、請求項9に記載の核酸配列。
- 上記ペプチドホルモンがカルシトニン、エリトロポエチン、トロンボポエチンおよび成長ホルモンである、請求項9に記載の核酸配列。
- 上記第三の核酸配列が、カルシトニンをコードするヌクレオチド配列と、カルシトニンをコードする上記核酸配列の3'末端におけるグリシンのこととを含んでなる、請求項1に記載の核酸配列。
- (i) タンパク質γ-ゼインのアミノ酸配列、またはタンパク質を植物細胞のERに送り且つ保持することができるその断片、
(ii) 酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列、および
(iii) 目的生成物
を含んでなる融合タンパク質であって、宿主植物系における請求項1-12のいずれか一項に記載の核酸配列の発現生成物である、上記融合タンパク質。 - 完全長γ-ゼインタンパク質を含んでなる、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 図1Aに示され且つ配列番号:6で同定されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項14に記載の融合タンパク質。
- γ-ゼインタンパク質の断片を含んでなり、上記断片がタンパク質を植物細胞のERに送り且つ保持することができるアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 配列番号:7に示されるアミノ酸配列[RX3に相当するアミノ酸配列(図1 B)]、
配列番号:8に示されるアミノ酸配列[R3に相当するアミノ酸配列(図1B)]、
配列番号:9に示されるアミノ酸配列[P4に相当するアミノ酸配列(図1C)]、および
配列番号:10に示されるアミノ酸配列[X10に相当するアミノ酸配列(図1C)]
からなる群から選択されたγ-ゼインタンパク質の断片を含んでなる、請求項16に記載の融合タンパク質。 - 酵素的手段によって特異的に開裂可能な上記アミノ酸配列がプロテアーゼ開裂部位を含んでなる、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 化学的手段によって特異的に開裂可能な上記アミノ酸配列が化学的試薬によって開裂可能な開裂部位を含んでなる、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 上記目的生成物がタンパク質性薬剤である、請求項13に記載の融合タンパク質。
- (i)請求項1-12のいずれか一項に記載の核酸配列と、(ii)本発明の核酸(i)の転写を調節する調節ヌクレオチド配列を含んでなり、上記調節配列(ii)が植物で機能する、核酸構築物。
- 上記調節配列(ii)が組織特異的である、請求項21に記載の構築物。
- 上記調節配列(ii)が植物で機能するプロモーターを含んでなる、請求項21に記載の構築物。
- 上記調節配列(ii)が、プロモーター35SCaMV、「パタチナ(patatina)」プロモーター、貯蔵タンパク質プロモーター、ユビキチン遺伝子プロモーター、またはγ-ゼイン遺伝子の調節配列を含んでなる、請求項22に記載の構築物。
- 上記調節配列(ii)が植物で機能する転写終結配列を含んでなる、請求項21に記載の構築物。
- 上記調節配列(ii)が、ターミネーター35SCaMV、オクトピンシンターゼ(ocs)遺伝子のターミネーター、ノパリンシンターゼ(nos)遺伝子のターミネーター、またはγ-ゼイン遺伝子のターミネーターを含んでなる、請求項25に記載の構築物。
- 上記調節配列(ii)が、植物で機能する翻訳エンハンサーをも含んでなる、請求項21に記載の構築物。
- 植物で機能する上記翻訳エンハンサーがトマトエッチウイルスの転写の促進配列などを含んでなる、請求項27に記載の構築物。
- 請求項1-12のいずれか一項に記載の核酸配列または請求項21-28のいずれか一項に記載の核酸構築物を含んでなる、ベクター。
- 形質転換植物宿主系であって、請求項1-12のいずれか一項に記載の核酸配列または請求項21-28のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項29に記載のベクターで形質転換した、上記植物宿主系。
- トランスジェニック植物宿主系であって、請求項1-13のいずれか一項に記載の核酸配列をそのゲノムに組込んで含んでなる、上記トランスジェニック植物宿主系。
- 植物宿主系が単子葉または双子葉植物である、請求項30または31に記載の植物宿主系。
- 植物宿主系が穀類、豆果、アブラナ、またはナスである、請求項32に記載の植物宿主系。
- 種子を含んでなる、請求項30または31に記載の植物宿主系。
- 融合タンパク質の形態で目的生成物を産生および発現させる条件下で請求項30-34のいずれか一項に記載の形質転換またはトランスジェニック植物宿主系を生長させることを含んでなる、植物宿主系で上記目的生成物を産生する方法。
- 上記融合タンパク質の単離および精製をも含んでなる、請求項35に記載の方法。
- 上記融合タンパク質から目的生成物の放出をも含んでなる、請求項35または36に記載の方法。
- 植物宿主系でカルシトニンを産生する方法であって、
a) タンパク質γ-ゼインをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸配列、またはタンパク質を植物細胞の小胞体(ER)に送り且つ保持することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその断片、
酵素的または化学的手段により特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸配列、および
カルシトニンをコードするヌクレオチド配列を含む第三の核酸配列
からなる核酸配列(本発明の核酸配列)の転写のための調節配列を含んでなる発現ベクターまたは核酸構築物で植物宿主系を形質転換し、
上記第一の核酸配列の3'末端が上記第二の核酸配列の5'末端に連結し、上記第二の核酸配列の3'末端が上記第三の核酸配列の5'末端に連結しており、
b) 上記発現ベクターまたは核酸構築物で形質転換した上記植物宿主系から完全な植物を生成させ、
c) 上記形質転換植物を、カルシトニンを融合タンパク質の形態で産生および発現させる条件下で生長させ、所望ならば、
d) 上記融合タンパク質を単離し、精製して、上記融合タンパク質を処理してカルシトニンを放出させる、
ことを含んでなる、方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200201508A ES2224792B1 (es) | 2002-06-28 | 2002-06-28 | Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas. |
| PCT/EP2002/008716 WO2004003207A1 (en) | 2002-06-28 | 2002-08-05 | Production of peptides and proteins by accumulation in plant endoplasmic reticulum-derived protein bodies |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010110481A Division JP2010213713A (ja) | 2002-06-28 | 2010-05-12 | 植物の小胞体由来のタンパク粒に蓄積することによるペプチドおよびタンパク質の産生 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005531309A true JP2005531309A (ja) | 2005-10-20 |
| JP4610334B2 JP4610334B2 (ja) | 2011-01-12 |
Family
ID=29797406
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004516544A Expired - Fee Related JP4610334B2 (ja) | 2002-06-28 | 2002-08-05 | 植物の小胞体由来のタンパク粒に蓄積することによるペプチドおよびタンパク質の産生 |
| JP2010110481A Withdrawn JP2010213713A (ja) | 2002-06-28 | 2010-05-12 | 植物の小胞体由来のタンパク粒に蓄積することによるペプチドおよびタンパク質の産生 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010110481A Withdrawn JP2010213713A (ja) | 2002-06-28 | 2010-05-12 | 植物の小胞体由来のタンパク粒に蓄積することによるペプチドおよびタンパク質の産生 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7575898B2 (ja) |
| EP (1) | EP1523558B1 (ja) |
| JP (2) | JP4610334B2 (ja) |
| KR (2) | KR20100017491A (ja) |
| CN (1) | CN100460510C (ja) |
| AR (1) | AR040293A1 (ja) |
| AT (1) | ATE366317T1 (ja) |
| AU (1) | AU2002333330B2 (ja) |
| CA (1) | CA2490348A1 (ja) |
| DE (1) | DE60221051T2 (ja) |
| DK (1) | DK1523558T3 (ja) |
| ES (2) | ES2224792B1 (ja) |
| MX (1) | MXPA05000290A (ja) |
| RU (1) | RU2381275C2 (ja) |
| UY (1) | UY27864A1 (ja) |
| WO (1) | WO2004003207A1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009527237A (ja) * | 2006-02-23 | 2009-07-30 | エラ バイオテック ソシエダッド アノニマ | 生物学的に活性のあるタンパク質の産生 |
| JP2011527181A (ja) * | 2008-07-08 | 2011-10-27 | メディカゴ インコーポレイテッド | 可溶性組換えインフルエンザ抗原 |
| JP2013532960A (ja) * | 2010-05-28 | 2013-08-22 | エラ、ビオテック、ソシエダッド、アノニマ | タンパク顆粒誘導ポリペプチド配列 |
| JP2014502497A (ja) * | 2010-12-23 | 2014-02-03 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物においてデオキシリボヌクレアーゼを発現させる方法 |
| JP2014502499A (ja) * | 2010-12-23 | 2014-02-03 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物においてミュラー管抑制因子を産生する方法 |
| JP2014502498A (ja) * | 2010-12-23 | 2014-02-03 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物においてアポリポプロテインを製造する方法 |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL155588A0 (en) * | 2003-04-27 | 2003-11-23 | Metabogal Ltd | Methods for expression of enzymatically active recombinant lysosomal enzymes in transgenic plant root cells and vectors used thereby |
| US20050032211A1 (en) * | 1996-09-26 | 2005-02-10 | Metabogal Ltd. | Cell/tissue culturing device, system and method |
| ES2224792B1 (es) * | 2002-06-28 | 2007-02-16 | Era Plantech, S.L. | Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas. |
| US7951557B2 (en) | 2003-04-27 | 2011-05-31 | Protalix Ltd. | Human lysosomal proteins from plant cell culture |
| GB0426160D0 (en) * | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Era Plantech S L | Production of proteins |
| GB0426161D0 (en) * | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Era Plantech S L | Protein isolation and purification |
| DE112006000559T5 (de) * | 2005-03-07 | 2008-04-30 | National University Corporation Nagoya University, Nagoya | Verfahren zur Expression und Anreicherung eines Peptids in einer Pflanze |
| WO2010040847A2 (en) | 2008-10-10 | 2010-04-15 | Era Biotech, S.A. | Recombinant protein bodies as immunogen-specific adjuvants |
| US7732569B2 (en) * | 2006-10-19 | 2010-06-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Zein-based peptide tags for the expression and purification of bioactive peptides |
| SI2150608T1 (en) | 2007-05-07 | 2018-04-30 | Protalix Ltd. | An extensive disposable bioreactor |
| CA2615372A1 (en) | 2007-07-13 | 2009-01-13 | Marc-Andre D'aoust | Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin |
| EP2610345B1 (en) | 2007-11-27 | 2015-08-19 | Medicago Inc. | Recombinant influenza virus-like particles (VLPS) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin |
| SI2445928T1 (en) | 2009-06-24 | 2018-05-31 | Medicago Inc. | HYPER PARTICULARS, SIMILAR VIRUSES OF GRIPE, WHICH HAVE EXPOSED HEMAGLUTININE |
| KR20140034139A (ko) | 2011-01-17 | 2014-03-19 | 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. | 식물에서의 단백질 발현 |
| FI20115704L (fi) | 2011-07-01 | 2013-01-02 | Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy | Vierasproteiinien tuoton parantaminen |
| US9603906B2 (en) | 2012-02-01 | 2017-03-28 | Protalix Ltd. | Inhalable liquid formulations of DNase I |
| EP3227318A4 (en) * | 2014-12-05 | 2018-12-12 | Planet Biotechnology, Inc. | Dpp4 immunoadhesin compositions and methods |
| DE102015107846A1 (de) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt | Synthetische Organellen in Hefe |
| KR101848082B1 (ko) * | 2017-05-11 | 2018-04-12 | 주식회사 바이오앱 | 셀룰로오즈 결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법 |
| AU2018278202B2 (en) | 2017-05-30 | 2024-05-09 | Agrivida, Inc. | Immunomodulating transgenic plants and related methods |
| CA3191387A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Nobell Foods, Inc. | Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same |
| US10947552B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-03-16 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants |
| US10894812B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-01-19 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant milk proteins |
| CN113683669B (zh) * | 2021-03-25 | 2023-05-16 | 中国农业大学 | 基于与醇溶蛋白的互作在植物中积累目标蛋白的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10507916A (ja) * | 1994-10-24 | 1998-08-04 | ザ テキサス エーアンドエム ユニバーシティ システム | トランスジェニック植物による経口免疫 |
| JPH10509317A (ja) * | 1994-11-02 | 1998-09-14 | エイジェニックス・インコーポレイテッド | アスペルギルス中の融合体から得られるプロセッシングされた組換えラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片 |
| JP2000106890A (ja) * | 1987-10-20 | 2000-04-18 | Plant Genetic Syst Nv | 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法 |
| WO2000040738A1 (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-13 | New Mexico State University Technology Transfer Corporation | Co-expression of proteins |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4215040A (en) * | 1978-12-22 | 1980-07-29 | The Procter & Gamble Company | Density separation process |
| WO1989003887A1 (en) | 1987-10-20 | 1989-05-05 | Plant Genetic Systems N.V. | A process for the production of biologically active peptide via the expression of modified storage seed protein genes in transgenic plants |
| US5589615A (en) | 1988-10-14 | 1996-12-31 | Plant Genetic Systems N.V. | Process for the production of transgenic plants with increased nutritional value via the expression of modified 2S storage albumins |
| US5948682A (en) * | 1991-02-22 | 1999-09-07 | Sembiosys Genetics Inc. | Preparation of heterologous proteins on oil bodies |
| US5650554A (en) | 1991-02-22 | 1997-07-22 | Sembiosys Genetics Inc. | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants |
| US5935822A (en) | 1995-03-21 | 1999-08-10 | The Regents Of The University Of Colorado | Product and process for membrane and soluble polypeptide segregation |
| FR2744134B1 (fr) | 1996-01-29 | 1998-04-03 | Biocem | Proteines de reserve de plantes enrichies en acides amines, notamment alpha-zeine de mais enrichie en lysine plantes exprimant ces proteines |
| US5990384A (en) | 1996-05-31 | 1999-11-23 | New Mexico State University | Co-expression of proteins |
| WO1999016890A2 (en) * | 1997-09-30 | 1999-04-08 | The Regents Of The University Of California | Production of proteins in plant seeds |
| AR020090A1 (es) | 1998-06-15 | 2002-04-10 | John Innes Ct | Celula vegetal monocotiledonea o semilla de ella,planta o parte de una planta, metodo para hacer una celula vegetal monocotiledonea, metodo para hacer unaplanta, uso de una construccion de expresion para producir una celula de planta o semilla monocotiledonea, y uso de una construccion de expresion |
| US20020061309A1 (en) * | 2000-03-08 | 2002-05-23 | Garger Stephen J. | Production of peptides in plants as N-terminal viral coat protein fusions |
| US7417178B2 (en) | 2000-05-02 | 2008-08-26 | Ventria Bioscience | Expression of human milk proteins in transgenic plants |
| WO2002086077A2 (en) | 2001-04-18 | 2002-10-31 | New Mexico State University Technology Transfer Corporation | Co-expression of zein proteins |
| JP3940793B2 (ja) | 2002-05-15 | 2007-07-04 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 任意のペプチドを植物のタンパク顆粒で蓄積させる方法 |
| DE60330564D1 (de) * | 2002-05-24 | 2010-01-28 | Restoragen Inc | Verfahren und konstrukte zur expression von clostripain mit hoher ausbeute |
| ES2224792B1 (es) | 2002-06-28 | 2007-02-16 | Era Plantech, S.L. | Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas. |
| CA2548749A1 (en) | 2003-12-09 | 2005-06-23 | Ventria Bioscience | High-level expression of fusion polypeptides in plant seeds utilizing seed-storage proteins as fusion carriers |
| BRPI0508518A (pt) | 2004-03-08 | 2007-08-14 | Syngenta Participations Ag | proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina |
| US20080034455A1 (en) | 2004-05-21 | 2008-02-07 | Simon Fraser University | Production Of A Protein Localized To The Endoplasmic Reticulum Protein Bodies In A Transgenic Plant And Seed |
| GB0426160D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Era Plantech S L | Production of proteins |
| GB0426161D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Era Plantech S L | Protein isolation and purification |
| EP2116264B1 (en) * | 2006-12-26 | 2017-09-27 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Preparation for transnasal application |
-
2002
- 2002-06-28 ES ES200201508A patent/ES2224792B1/es not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-05 KR KR1020097024928A patent/KR20100017491A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-08-05 CA CA002490348A patent/CA2490348A1/en not_active Abandoned
- 2002-08-05 RU RU2005101738/13A patent/RU2381275C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-08-05 JP JP2004516544A patent/JP4610334B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-05 MX MXPA05000290A patent/MXPA05000290A/es active IP Right Grant
- 2002-08-05 DK DK02807566T patent/DK1523558T3/da active
- 2002-08-05 CN CNB028293754A patent/CN100460510C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-05 AU AU2002333330A patent/AU2002333330B2/en not_active Ceased
- 2002-08-05 DE DE60221051T patent/DE60221051T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-05 AT AT02807566T patent/ATE366317T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-08-05 ES ES02807566T patent/ES2289185T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-05 EP EP02807566A patent/EP1523558B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-05 KR KR1020047021412A patent/KR100987946B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-08-05 WO PCT/EP2002/008716 patent/WO2004003207A1/en active IP Right Grant
- 2002-08-06 US US10/213,462 patent/US7575898B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-06-25 UY UY27864A patent/UY27864A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-06-27 AR ARP030102330A patent/AR040293A1/es active IP Right Grant
-
2009
- 2009-08-17 US US12/542,514 patent/US8802825B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-05-12 JP JP2010110481A patent/JP2010213713A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000106890A (ja) * | 1987-10-20 | 2000-04-18 | Plant Genetic Syst Nv | 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法 |
| JPH10507916A (ja) * | 1994-10-24 | 1998-08-04 | ザ テキサス エーアンドエム ユニバーシティ システム | トランスジェニック植物による経口免疫 |
| JPH10509317A (ja) * | 1994-11-02 | 1998-09-14 | エイジェニックス・インコーポレイテッド | アスペルギルス中の融合体から得られるプロセッシングされた組換えラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片 |
| WO2000040738A1 (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-13 | New Mexico State University Technology Transfer Corporation | Co-expression of proteins |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6009024825, Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９４，Ｖｏｌ．６，ｐ．１９１１−１９２２ * |
| JPN6009024829, Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９９，Ｖｏｌ．１１，Ｐ．６０１−６１３ * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009527237A (ja) * | 2006-02-23 | 2009-07-30 | エラ バイオテック ソシエダッド アノニマ | 生物学的に活性のあるタンパク質の産生 |
| JP2011527181A (ja) * | 2008-07-08 | 2011-10-27 | メディカゴ インコーポレイテッド | 可溶性組換えインフルエンザ抗原 |
| JP2013532960A (ja) * | 2010-05-28 | 2013-08-22 | エラ、ビオテック、ソシエダッド、アノニマ | タンパク顆粒誘導ポリペプチド配列 |
| JP2014502497A (ja) * | 2010-12-23 | 2014-02-03 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物においてデオキシリボヌクレアーゼを発現させる方法 |
| JP2014502499A (ja) * | 2010-12-23 | 2014-02-03 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物においてミュラー管抑制因子を産生する方法 |
| JP2014502498A (ja) * | 2010-12-23 | 2014-02-03 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物においてアポリポプロテインを製造する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2224792B1 (es) | 2007-02-16 |
| EP1523558B1 (en) | 2007-07-04 |
| AU2002333330A1 (en) | 2004-01-19 |
| ATE366317T1 (de) | 2007-07-15 |
| AU2002333330B2 (en) | 2007-07-12 |
| AR040293A1 (es) | 2005-03-23 |
| CA2490348A1 (en) | 2004-01-08 |
| CN100460510C (zh) | 2009-02-11 |
| KR100987946B1 (ko) | 2010-10-18 |
| WO2004003207A9 (en) | 2005-02-10 |
| WO2004003207A1 (en) | 2004-01-08 |
| DE60221051T2 (de) | 2008-03-13 |
| US20100083403A1 (en) | 2010-04-01 |
| DK1523558T3 (da) | 2007-11-05 |
| JP4610334B2 (ja) | 2011-01-12 |
| JP2010213713A (ja) | 2010-09-30 |
| ES2289185T3 (es) | 2008-02-01 |
| US7575898B2 (en) | 2009-08-18 |
| US20040005660A1 (en) | 2004-01-08 |
| CN1639342A (zh) | 2005-07-13 |
| EP1523558A1 (en) | 2005-04-20 |
| UY27864A1 (es) | 2003-09-30 |
| ES2224792A1 (es) | 2005-03-01 |
| US8802825B2 (en) | 2014-08-12 |
| RU2005101738A (ru) | 2006-07-20 |
| RU2381275C2 (ru) | 2010-02-10 |
| KR20100017491A (ko) | 2010-02-16 |
| MXPA05000290A (es) | 2005-03-31 |
| KR20050024419A (ko) | 2005-03-10 |
| DE60221051D1 (de) | 2007-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4610334B2 (ja) | 植物の小胞体由来のタンパク粒に蓄積することによるペプチドおよびタンパク質の産生 | |
| KR101216762B1 (ko) | 식물에서 인슐린의 생산 방법 | |
| CN101065491B (zh) | 生产胶原的植物及其生成和使用方法 | |
| KR102022662B1 (ko) | 식물 세포에서의 목적 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 | |
| AU2005308922B2 (en) | Protein isolation and purification | |
| JP2000504567A (ja) | 植物での貯蔵安定性蛋白質の発現のためのカセット | |
| US7554006B2 (en) | Commercial production of insulin and insulin-like protein in plants | |
| US20040117874A1 (en) | Methods for accumulating translocated proteins | |
| Hajibehzad et al. | High-level transient expression of the N-terminal domain of IpaD from Shigella dysenteriae in four plant species transformed with different construct configurations | |
| KR20050027838A (ko) | 식물체에서 발현된 재조합 인간 성장호르몬 | |
| KR20050092591A (ko) | 재조합 단백질의 제조 및 분리 방법 | |
| MX2007006333A (en) | Protein isolation and purification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050720 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050720 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080530 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080829 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080905 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081030 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081107 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081201 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090526 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090826 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090902 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090928 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091005 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091026 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091102 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091126 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100112 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100512 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100628 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100720 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100910 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101012 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131022 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |