KR20100017491A - 식물 소포체 파생적 단백질체들 내의 축적에 의한 펩티드 및 단백질들의 생산 - Google Patents

식물 소포체 파생적 단백질체들 내의 축적에 의한 펩티드 및 단백질들의 생산 Download PDF

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에라 바이오테크, 에스.에이.
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Abstract

단백질 γ-zein을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 1 핵산 서열, 또는 식물 세포의 소포체를(ER) 향하여 단백질을 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 그 단편; 효소적 또는 화학적 수단에 의해 특이적으로 절단가능한 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 2 핵산 서열; 및 관심있는 산물을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 3 핵산 서열;을 포함하는 핵산 분자가 설명된다.
숙주 세포들을 형질전환하고 관심있는 펩티드 또는 단백질을 생산하는 데 상기 핵산분자를 이용하는 방법이 또한 설명된다.
소포체, 단백질, 단백질 γ-zein.

Description

식물 소포체 파생적 단백질체들 내의 축적에 의한 펩티드 및 단백질들의 생산{PRODUCTION OF PEPTIDES AND PROTEINS BY ACCUMULATION IN PLANT ENDOPLASMIC RETICULUM-DERIVED PROTEIN BODIES}
본 발명은 소포체 파생적 단백질체들 내의 축적에 의해 숙주 식물 시스템에서 관심있는 펩티드 및 단백질의 생산과, 그 생산물들을 인코딩하는 핵산 및 숙주 식물 시스템을 형질전환하기 위한 구성체 및 벡터의 제조에 있어서의 상기 핵산의 이용에 관한 것이다. 식물에서 칼시토닌(CT)과 같은 관심있는 이종의 산물들을 발현 및 분리하는 방법이 자세히 게시되어 있다.
게놈 지식 및 관련 생물의학적 연구에 있어서의 현저한 진보로 인해 생물약제의 요구가 상당하게 증가될 것으로 기대되어짐에 따라, 저비용 재조합 생산 시스템을 공들여 만드는 것에는 상당한 중요성이 있다.
박테리아, 균류 및 배양된 포유동물 세포들을 포함하여 다른 유전자 도입 시스템들이 대규모로 오랜 시간 동안 생물적 생산에 채용되어 왔던 이래로 생물약제들을 생산하기 위한 식물 유전공학은 비교적 최근이다. 그럼에도 불구하고, 식물 발현 시스템을 이용하는 몇몇 재조합 치료학적 단백질들이 이미 시장에 나와 있거 나 히루딘과 같이 트롬보시스를 치료하는 항응고성 단백질(Parmenter 기타, 1995), 충치에 대한 합성 IgG-IgA 백신(Ma기타,1998), 대장균의 엔테로톡시제닉(enterotoxigenic) 균주에 대한 세균성 백신(Haq 기타.,1995), 및 낭포성 섬유증를 치료하기 위한 재조합 개(dog) 위 리파아제(Benicourt 기타.,1993)의 다양한 단계의 인간의 임상적 시도들에 존재한다.
식물 발현 시스템들은 재조합 단백질의 발현 수준이 식물이 숙주 단백질들을 기관으로 표적화하는데 사용하는 선천적 분류 및 표적화 기작을 이용함으로써 향상될 수 있다는 점에서 매력적이다. 나아가 식물 파생적 생물약제들은 쉽게 대량생산으로 확대될 수 있으며 병원체 또는 독소에 의한 오염으로부터 발생하는 건강 위험들을 최소화할 수 있는 이점을 가진다.
식물은 저생산 비용으로 감소된 건강 위험들을 가진 무제한량의 생물학적 활성 물질을 제공하는 그들의 잠재성 때문에 더욱 매력적인 발현 시스템으로 생각된다. 고수준의 재조합 단백질들을 축적하고 대부분 번역후 수식을 수행하는 식물들의 능력이 그들을 재조합 치료학의 분자적 양식을 위한 생물학적반응자(bioreactor)로 고려되게 한다(Fischer 및 Emans, 2000). 그러나 작물 종 선별, 조직 선택, 발현 및 회복 전략, 및 번역 후 프로세싱에 관하여 중요한 결정들이 상품화로 향한 식물-기반의 생산 가능성의 결정인자이다(Cramer 기타., 1999).
재조합 단백질들의 준세포 표적화는 식물에서 그러한 단백질들의 고수준 축적과 정확한 조립 및 접힘에 대한 중요한 고려대상이다. 숙주 단백질들의 세포내 저장 기관들로의 구획화는 일반적으로 적절한 신호 펩티드 또는 전체 단백질 융합 을 이용함으로써 이루어진다. 다양한 재조합 치료적 단백질들은 다음의 식물의 구획인, 아포플라스틱 스페이스(McCormick 기타., 1999), 엽록체(Staub 기타., 2000), 소포체(ER)(Stoger기타., 2000)내로 전해져 왔다. 형질전환 식물에서 ER구획으로 지시된 면역글로불린은 아포플라즘 또는 사이토졸과 같은 다른 구획들로 전해졌을 때 보다도 10-100 접힘의 더 높은 수득량을 가져오는 것을 보여주었다(Conrad and Fiedler, 1998).
ER 구획에서 항체와 같은 복합 단백질들의 표적화는 기능적 산물을 얻기 위해 요구되는 대부분의 번역 후 수식이 ER 내부에서 일어나기 때문에 특이하게 흥미롭다(During 기타., 1990; Ma 및 Hein, 1995; Conrad 및 Fiedler, 1998). 실로, ER 내부에서, 상기 신호펩티드는 잘려지고 결합 IgG 단백질(BiP)과 같은 스트레스 단백질들 및 프로테인 디설파이드 아이소머레이즈(PDI)와 같은 효소들은 샤페론으로서 작용하고 조립되지 않은 단백질들에 결합하고 부수적 접힘과 조립을 명한다. 이러한 특별한 특징들에 추가하여, 이용가능한 증거는 식물 ER이 고도로 유연하여 그것을 이종의 약제 단백질들의 이상적인 저장소로 만든다는 사실을 지적한다. ER은 분비 경로로 가는 출구일 것으로 보일지라도, 역시 단기 또는 장기간 동안 단백질을 저장할 수 있다. 식물들은 아미노산을 특정 저장 단백질의 형태로 오랜기간동안 저장한다. 조절되지 못한 미성숙한 분해로부터 이러한 저장 단백질들을 보호하는 하나의 기작은 이들을 단백질체(protein bodies (PB))라고 하는 ER-파생적 저장 기관들 내에 두는 것이다(for review, Muntz, 1998). ER루멘 내부로의 재조합 단백질들의 단순한 축적으로서의 그러한 기관들의 조립은 첫번째 단계로서 숙주 단 백질의 보존을 필요로 한다. 분비성 단백질들은 정확하게 접혀지고 상기 ER 내부로 조립되었을 때에 대부분 골지체를 경유하는 진행에 의한 다양한 세포성 운명을 갖는다. 그러나 수용성 운반-적임의 단백질들 (가용성 수송-적임의 단백질들)의 ER 보존은 카복시 말단 보존/회복 신호 KDEL (or HDEL)에 의해 유도될 수 있다(Munro 기타., 1987; Wandelt 기타., 1992; Vitale 기타., 1993). 막통과 수용체들을 통하여 골지체내에서 식별된 이러한 보존된 C-말단 모티브는 이탈된 ER 소재 단백질들의 ER로의 재순환을 가능하게 한다(Vitale 및 Denecke, 1999; Yamamoto 기타., 2001). 많은 재조합 항체 단편들은 식물 ER 내에 안정되게 축적되기 위해 상기 KDEL 신호들과 함께 연장되어 왔다(Verch 기타., 1998; Torres et al., 1999). 재조합 단백질들의 ER 구획 내부로의 보존 및 축적을 이루는 다른 하나의 경로는 씨앗(seed) 저장 단백질과 같은 본래의 ER 소재와 적절한 융합을 생성하는 것이다.
WO 01/75312은 식물 숙주 시스템에서 사이토카인을 생산하는 방법 설명하고 있으며, 상기 식물 숙주 시스템은 상기 사이토카인을 인코딩하는 재조합 핵산(재조합 nucleic acid) 서열로 형질전환되었으며 상기 재조합 핵산 서열은 상기 식물 숙주 시스템에서 제 2 핵산 서열의 전사를 조절할 수 있는 제 1 핵산 서열을 포함하고, 상기 제 2 핵산 서열은 해독틀(reading frame)에서 사이토카인을 암호화하는 제 3 핵산 서열 및 해독틀(reading frame)에서 "KDEL" 아미노산 서열을 암호화하는 제 3 핵산 서열의 3'말단에 연결된 제 4 핵산 서열과 연결된 신호 서열을 암호화한다.
Zein들은 옥수수에서 배내유 발달 동안 합성된 단백질 그룹이며, 그들의 용해도에 따라 α, β, γ및 δ로 나눠질수 있다. Zein들은 ER 내에서 PB 내부로 집합될 수 있다. 전체 길이의 zein 단백질과 실시가능하게 연결된 단백질성 물질을 포함하는 융합 단백질들로서 발현된 루민(rumin) 안정성 단백질체들을 포함하는 식물들 또는 식물 조직들이 게시되어 있다 (WO 00/40738).
옥수수 저장 단백질인 γ-zein은 4개의 옥수수 프롤라민 중 하나이고 옥수수 배젖의 전체 단백질의 10-15% 에 상당한다. 다른 곡류의 프롤라민들인 α 및 γ-zein은 거친 ER(rough ER)의 세포질측에 있는 막에 부착된 폴리솜들 내에서 생합성되고 루멘 내에서 조립되고 나서 ER-파생적 PB 내부로 떼어놓아진다(Herman 및 Larkins, 1999, Ludevid 기타., 1984, Torrent 기타., 1986). γ-zein은 i) 19 아미노산의 펩티드 신호 ii) 헥사펩티드 PPPVHL (53 aa)의 8개 단위들을 포함하는 반복 영역 iii) 프롤린 잔기들이 다른 아미노산들과 번갈아 있는 프로X (proX) 영역(29 aa) 및 iv) 소수성 시스테인 다량의 C-말단 영역(111aa)인 4개의 특징적인 영역들로 이루어진다. ER-파생적 PB들에서 조립하는 γ-zein의 능력은 씨앗에 한정되어 있는 것은 아니다. 사실, γ-zein 유전자가 트랜스제닉 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물들에서 구성적으로 발현되었을 때, 상기 저장 단백질은 잎의 잎살 세포들의 ER-파생적 PB들 내에 축적되었다(Geli 기타, 1994). ER-파생적 PB 내부로 γ-zein 전달을 담당하는 신호(프롤라민들은 KDEL 신호를 가지고 있지 않다)를 조사해보면, 무작위 반복을 포함하는 프롤린 다량의 N말단 영역이 ER 유지에 필수적이라는 것과 C 말단 영역이 PB형성에 포함되어 있다는 것이 증명되었다. 그 러나 PB조립을 촉진하는 이들 영역들에 의한 기작은 여전히 알려져 있지 않다.
32 아미노산 호르몬성 펩디드인 칼시토닌(CT)은 올바른 칼슘 대사에 필수적이며 골다공증, 칼슘과잉혈증 쇼크 및 파젯씨 병에 광범위하게 임상적으로 이용되는 것으로 발견되었다(Reginster 기타., 1993; Azria 기타., 1995; Silverman 기타., 1997). 인간 CT는 25 아미노산인 하나의 신호 펩티드와 N- 및 C-말단에 있는 2개의 프로펩티드들(각각 57 aa 및 21 aa)을 가지는 프리프로프로테인으로서 합성된다. 합성된 활성의 펩티드는 단일 디설파이드 브릿지(Cys1-Cys7)를 가진 32 아미노산 길이이고, 카복시 말단에 아미드화된다. 시험관 내에서, 인간 CT 집합은 치료법으로서의 그 유용성을 제한한다. 따라서, 덜 집합되는 경향이 있는 연어 CT가 대신에 일반적으로 이용된다(Cudd 기타., 1995). CT의 생산은 현재 화학적 합성에 의해 이뤄지고 있지만, 이러한 생산의 비용은 대체 접근법들을 개발하도록 몇몇 연구 그룹들을 고무시켰다. 인간 및 연어 CT는 대장균(Ray 기타., 1993; Hong et al., 2000), 쥐의 뇌하수체 세포들(Merli 기타., 1996), 비내분비성 세포주 Cos-7 및 CHO (Takahashi 기타., 1997) 및 더욱 최근에는 트랜스제닉 토끼의 젖(McKee 기타., 1998)에서 생산되어 왔다. 인간 및 연어 CT 적어도 두가지 처리 단계인 i) 글리신-연장된 칼시토닌의 생성(Bradbury 기타., 1988) 및 ii) 아미드화 효소인 펩티딜 글리신 α-아미드화 모노옥시게나아제(PAM) (Eipper et al., 1992)의 작용을 경유한 카복시 말단 프롤린아미드의 형성을 요하는 바이오기술적 방법들에 의한 생물적 활성칼시토닌(칼시토닌)의 생산에서 생산되었다. 현재는 카복실-아미드화가 식물 세포들에서 일어날지가 알려지지 않았으므로, 식물 PAM 효소와 함 께 글리신-연장된 칼시토닌의 시험관내 아미드화가 C-말단 아미드를 제공할 것이다(Ray 기타., 1993).
본 발명은, 관심있는 재조합 산물들을 식물 숙주 시스템들에 있는 ER-파생적 PB 들에 축적하기 위한 융합 단백질 기반의 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 의해 해결될 문제점은 식물 숙주 시스템에 관심있는 펩티드 및 단백질들을 생산하는 대체 시스템을 제공하는 것이다.
여기에 제시된 해결책은 숙주 식물 시스템의 ER에서 γ-zein의 프롤린 과다 영역이 자가 조립하고 융합 단백질들에 안정성을 부여하는 능력에 기반한다. 숙주 시스템 식물에서 관심있는 산물을 축적하기 위한 γ-zein 융합 단백질 기반 시스템의 이용은 식물의 ER-파생적 PB들 내부로 상기 관심있는 산물을 축적하기 위한 성공적인 접근을 구성한다.
상기 발명은 실시예에서 예증되고, 실시예는 담배 식물의 ER-파생적 PB들에 재조합 CT를 축적하는 융합 단백질 기반 시스템이 설명된다. 다양한 프롤린 과다 영역들이 절단가능한 프로테아제 부위를 통하여 융합 파트너들로서 작용하도록 γ-zein으로부터 계획되었다. 성숙한 칼시토닌 코딩 부분은 γ-zein 영역들의 C-말단에서 융합되었고, 트랜스제닉 담배 식물들에서 발현되었다. 상기 융합 단백질들은 담배 잎에서 ER 파생적 PB들에 축적되었다. 정제 이후, 상기 융합 단백질들은 칼시토닌의 분리를 허용하는 엔테로키나아제 절단에 제공되었다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 (ⅰ) 단백질 γ-zein을 암호화하는 누클레오티드 서열, 또는 소포체를(ER) 향하여 단백질을 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 그 단편과; (ⅱ) 효소적 또는 화학적 수단에 의해 특이적으로 절단가능한 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열; 및 (ⅲ) 관심있는 산물을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 누클레오티드 서열들은 그들 상호간에 작동적으로 연결된 핵산 서열에 관한 것이다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 상기 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 서열 또는 구성체을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산 서열, 구성체 벡터를 가지는 형질전환된 식물 숙주 시스템에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 그 게놈에 통합된 상기 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 숙주 시스템에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식물 숙주 시스템에서 관심있는 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식물 숙주 시스템에서 칼시토닌을 생산하는 방법에 관한 것이다
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 핵산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 식물 숙주 시스템에 관심있는 펩티드 및 단백질들을 생산하는 대체 시스템을 제공할 수 있다.
또한 숙주 식물 시스템의 ER에서 γ-zein의 프롤린 과다 영역이 자가 조립하고 융합 단백질들에 안정성을 부여하는 능력에 기반한다.
또한 숙주 시스템 식물에서 관심있는 산물을 축적하기 위한 γ-zein 융합 단백질 기반 시스템의 이용은 식물의 ER-파생적 PB들 내부로 상기 관심있는 산물을 축적하기 위한 성공적인 접근을 구성한다.
본 발명의 첫번째 측면은, 이하 본 발명의 핵산 서열로 불리는
단백질 γ-zein을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 1 핵산 서열, 또는 단백질을 소포체(ER) 쪽으로 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 그 단편;
효소적 또는 화학적 방법에 의해 특이적으로 잘려질 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 2 핵산 서열; 및
관심있는 산물을 인코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 3 핵산 서열;을 포함하는 하나의 핵산 서열을 제공하며,
여기서 상기 제 1 핵산 서열의 3' 말단은 상기 제 2 핵산 서열의 5' 말단에 연결되어 있고, 상기 제 2 핵산 서열의 3' 말단은 상기 제 3 핵산 서열의 5' 말단 에 연결된다.
제 1 핵산 서열은 단백질 γ-zein을 암호화하는 상기 누클레오티드 서열, 또는 단백질을 ER쪽으로 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 그 단편을 포함한다.
여기에서 사용되는 "γ-zein" 용어는 본 발명의 배경 기술에서 이미 언급된 4개의 특징적인 영역으로 구성되어 있는 옥수수 저장 단백질을 말한다. 상기 용어는 본래의 γ-zein 단백질 뿐만 아니라, 그 변이체 및 단백질을 ER을 향하게 지시하고 보존할 수 있는 재조합 γ-zein 단백질들을 포함한다.
사실상 γ-zein 단백질을 암호화하는 어떠한 누클레오티드 서열, 또는 단백질을 ER을 향하게 지시하고 보존할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 어떠한 그 단편도 이용될 수 있다.
따라서, 바람직한 실시예에서, 제 1 핵산 서열은 전체 길이 γ-zein 단백질을 암호화하는 상기 누클레오티드 서열을 포함한다.
구체적인 실시예에서, 전체 길이 γ-zein 단백질을 인코딩하는 상기 누클레오티드 서열이 도 1A 에 나타나있고 서열번호 1에서 식별된다.
또다른 바람직한 실시예에서, 상기 제 1 핵산 서열은 γ-zein 단백질의 단편을 인코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하고, 상기 단편은 단백질을 ER쪽으로 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 이 경우에, 상기 제 1 핵산 서열은,
단백질 γ-zein의 반복 영역 전체 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 누클 레오티드 서열들;
단백질 γ-zein의 ProX 영역 전체 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 누클레오티드 서열들; 또는
단백질 γ-zein의 반복 영역 전체 또는 일부를 인코딩하는 하나 이상의 누클레오티드 서열들 및 단백질 γ-zein의 ProX 영역 전체 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 누클레오티드 서열들;을 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 제 1 핵산 서열은 γ-zein 단백질의 단편을 인코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하고, 상기 단편은 ER쪽으로 단백질을 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하고
- 서열번호 2에 나타난 누클레오티드 서열[ RX3 로 식별된 누클레오티드 서열(도 1B)],
- 서열번호 3에 나타난 누클레오티드 서열[ R3 으로 식별된 누클레오티드 서열 (도 1B)],
- 서열번호 4에 나타난 누클레오티드 서열[ P4 로 식별된 누클레오티드 서열 (도 1C)], 및
-서열번호 5에 나타난 누클레오티드 서열[ X10 로 식별되는 누클레오티드 서열 (도 1C)] 로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
제 2 핵산 서열은 효소적 또는 화학적 수단에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 제 2 핵산 서열은 예를들면, 엔테로티나아제, Arg-C 엔도프로티아제, Glu-C 엔도프로티아제, Lys-C 엔도프로티아제, Xa 인자 등과 같은 프로티아제에 의한 아미노산 절단가능 부위인 프로티아제 절단 부위를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함한다.
대신에, 제 2핵산 서열은 예를들면 메티오닌 잔기들을 절단하는 시아노젠 브로마이드(cyanogen bromide)와 같은 화학약제 또는 그 밖의 적합한 화학 약제에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 아미노산을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함한다.
제 2핵산 서열은 상기 제 1 핵산 서열 및 상기 제 3핵산 서열 간의 결합의 결과로서 생성되어질 수 있다. 그러한 경우, 각 서열은 상기 제 1 및 제 3핵산 서열이 효소적으로 또는 화학적 방법에 의해 특이적으로 절단가능한 아미노산 서열을 암호화하는 기능적 누클레오티드 서열에 연결되었을 때, 즉 제 2 핵산 서열이 형성되는 방식으로 많은 누클레오티드들을 포함한다. 대체 실시예에서, 제 2핵산 서열은 상기 제 1 및 제 3핵산 서열 사이에 작동적으로 삽입된 외부 서열이다.
제 3 핵산 서열은 관심있는 산물을 암호화하는 상기 누클레오티드 서열을 포함한다. 원칙적으로, 어떠한 관심있는 산물은 본 발명에 의해 제공된 상기 시스템에 의해 발현될 수 있다. 바람직한 실시예에서는, 관심있는 산물은 단백질성 약(즉, 단백질 또는 펩티드)이고, 예를 들면, 칼시토닌, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 성장 호르몬 등과 같은 펩디드 호르몬, 인터페론, 즉 바이러스성 감염에 반응하여 및 면역 반응 동안 사이토카인으로서 생산된 단백질 등이다. 바람직하게는, 상기 관심있는 치료적 산물들은 인간 또는 동물 신체의 치료에 효과적이다.
특정 실시예에서, 제 3 핵산 서열은 칼시토닌 (CT), 예를들면, 인간 칼시토닌(hCT) 또는 연어 칼시토닌(sCT)을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로, 이 경우, 상기 제 3핵산 서열은, 바람직하게는, 칼시토닌을 인코딩하여 글리신-연장된 칼시토닌을 만드는 상기 핵산 서열의 3'말단 글리신에 대한 코돈을 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 제 1 핵산 서열의 3'말단은 상기 제 2 핵산 서열의 5'말단에 연결되고 제 2 핵산 서열의 3'말단은 상기 제 3 핵산 서열의 5'말단에 연결되며, 즉, 상기 제 1, 제 2 및 제 3핵산 서열들은 해톡틀(reading frame)에 있다.
본 발명의 상기 핵산 서열은 당해 기술분야의 당업자에게 알려져있는 통상의 기술들을 이용함으로써 얻어질 수 있다. 일반적으로, 상기 기술들은 적합한 벡터에 본 발명의 상기 핵산 서열의 다른 단편들의 연결을 포함한다. 상기 통상의 기술들의 내용은 예를들면, 샘브룩, 기타에 의한 분자 클로닝, 실험 매뉴얼 2판 콜드 스프링 하버 실험실 출판, 1989"에서 알 수 있다. 본 발명의 핵산을 포함하는 몇몇 벡터들의 상기 구성 실시예에 게시되어 있고 도 3 및 4에 도시되어 있다. 여기에 나타난 바와 같이, 다양한 프롤린 풍부 영역들이 절단가능한 프로테아제 부위를 통해 융합 파트너들로 작용하도록 γ-zein으로부터 계획되었다. 성숙한 칼시토닌 코딩 영역(32 aa)이 γ-zein 영역들의 상기 C-말단에 융합되었고 트랜스제닉 담배 식물들에서 발현되었다. 상기 융합 단백질들은 담배 잎들에서 ER-파생적 단백질체들 내에 축적되었다. 정제 후, 상기 융합 단백질들은 역상 크로마토그래피에 의해 서 분해 혼합물로부터 더욱 정제될 수 있는 칼시토닌의 해리를 허용하는 엔테로키나아제 절단에 전달되었다.
다른 측면에서, 본 발명은, 여기서 본 발명의 상기 융합 단백질이라 부르는, (i) 상기 단백질 γ-zein의 아미노산 서열, 또는 단백질을 ER쪽으로 향하게 하고 유지하게 할 수 있는 그 단편, (ⅱ) 효소적 또는 화학적 방법들에 의해 특이적으로 절단가능한 아미노산 서열 및 (iii) 관심있는 산물; 을 포함하는 융합 단백질을 제공하며 상기 융합 단백질은 숙주 식물 시스템에서 상기 발명의 핵산 서열의 발현 산물이다.
본 발명의 상기 융합 단백질은 숙주 식물 시스템에서 안정하게, ER-파생적 PBs 내에 축적된다. γ-zein 영역들의 C-말단에 존재하는 효소적으로 또는 화학적으로 절단 가능한 부위는 나중에 관심있는 산물을 회복하게 한다. 상기 관심있는 산물은 보통의 방법에 의해 분리되고 정제되어질 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 융합 단백질은 관심있는 산물을 축적하는 새롭고 성공적인 접근을 구성한다.
실시예에서, 본 발명의 상기 융합 단백질은 전체 길이 γ-zein 단백질을 포함한다. 전체 길이 γ-zein 의 특이적 아미노산 서열은 도 1A 에 보여지고 서열번호 6에서 식별된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 상기 융합 단백질은 γ-zein 단백질의 단편을 포함하고, 상기 단편은 단백질을 ER쪽으로 지시하고 유지하게 할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 상기 융합 단백질은
- 서열번호7 에 나타난 상기 아미노산 서열 [ RX3에 해당하는 아미노산 서열 (도 1B)],
- 서열번호 8 에 나타난 상기 아미노산 서열 [ R3 에 해당하는 아미노산 서열 (도 1B)],
- 서열번호 9 에 나타난 상기 아미노산 서열 [ P4 에 해당하는 아미노산 서열 (도 1C)], 및
- 서열번호 10 에 나타난 상기 아미노산 서열 [ X10 에 해당하는 아미노산 서열 (도 1C)] 로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 γ-zein 단백질 단편을 포함한다.
본 발명의 상기 융합 단백질은 효소적 또는 화학적 방법에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 절단가능 부위는 예를들면, 엔테로키나아제, Arg-C 엔도프로테아제, Glu-C 엔도프로테아제, Lys-C 엔도프로테아제, Xa 인자 등과 같은 프로테아제에 의한 아미노산 절단 부위, 또는 예를 들면, 메티오닌 잔기들을 절단하는 시아노젠 브로마이드, 또는 기타 적합한 화학 약제와 같은 화학 약제에 의한 아미노산 절단 부위인 프로티아제 절단 부위를 포함한다.
본 발명의 상기 융합 단백질은 또한 관심있는 산물, 예를 들면, 펩티드 호르몬, 인터페론, 등과 같은 단백질성(즉, 단백질 또는 펩티드) 약을 포함한다. 바람직하게는, 상기 관심있는 산물들은 인간 또는 동물 신체의 치료에 효과적이다. 특정 실시예에서, 본 발명의 상기 융합 단백은 칼시토닌(CT), 예를 들면, 선택적으로 글리신-연장된 인간 칼시토닌(hCT) 또는 연어 칼시토닌(sCT)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명의 상기 핵산 서열, 및 (ii) 본 발명의 핵산(i)의 전사를 조절하는 조절성 누클레오티드 서열(상기 조절성 서열(ii) 은 식물들에서 기능적이다)을 포함하는 핵산 구성체를 제공한다. 상기 핵산 서열들은 유효하게 연결된다.
실제로 어느 식물 기능적 조절성 서열이라도 이용될 수 있다. 실시예에서, 상기 조절성 서열 (ii)는 바람직하게는 조직 특이적이며 즉, 씨앗, 잎들, 소괴경 등과 같은 특정 조직에서 본 발명의 핵산의 전사를 조절할 수 있다.
상기 조절성 서열 (ii)는 식물에서 기능적인 프로모터를 포함할 수 있다. 실질적으로, 식물에서 기능적인 어느 프로모터라도 이용될 수 있다. 특정 실시예에서 상기 조절성 서열(ii)는 프로모터 35SCaMV 를 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 상기 조절성 서열 (ii)는 "패타티나(patatina)" 프로모터, 저장 단백질 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitine) 유전자 프로모터, γ-zein 유전자의 상기 조절성 서열들, 등을 포함한다.
상기 조절성 서열 (ii)은 또한 전사종결 서열을 포함할 수 있다. 실제로, 식물에서 기능적인 어느 전사종결 서열이라도 이용될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 전사종결 서열은 터미네이터 35SCaMV, 옥토파인 합성효소(ocs) 유전자의 터미네이터, 노팔린(nopaline) 합성효소(nos) 유전자의 터미네이터, γ-zein 유전자의 터미네이터, 등을 포함한다.
상기 조절성 서열(ii)는 식물에서 기능적인 번역 인핸서를 또한 포함할 수 있다. 실제로, 예를 들어, 토마토 etch 바이러스, 등의 전사를 위한 프로모팅 서 열와 같은 식물에서 기능적인 어느 번역 인핸서라도 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 핵산 서열, 또는 본 발명에서 제공된 상기 구성체는 적절한 벡터 내부로 삽입될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 당장의 발명에 의해 제공된 핵산 구성체를 포함하는 벡터를 제공한다. 적절한 벡터들은 플라스미드들, 코스미드들 및 바이러스성 벡터터들을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 벡터는 형질전환 식물들에 적합하다. 상기 벡터의 선택은 계속해서 도입될 숙주 세포에 의존한다. 실시예의 방식으로, 본 발명의 상기 핵산 서열이 도입된 벡터는, 숙주 세포에 도입되었을 때 상기 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고 통합된 곳에서 염색체(또는 염색체들)과 함께 복제되는 플라스미드, 코스미드, 또는 바이러스성 벡터일 수 있다. 상기 벡터들을 획득하기 위해서는, 통상의 방법들이 이용될 수 있다(샘브룩 기타., 1989).
또 다른 측면에서, 본 발명은 식물 숙주 시스템을 제공하고 상기 식물 숙주 시스템은 본 발명의 핵산 또는 본 발명에 의해 제공된 구성체 또는 벡터로 형질전환되고 있다.
여기서 사용되는 "식물 숙주 시스템" 용어는 식물들을 포함하며, 단자엽들, 쌍자엽들, 및 특이적으로 곡류들(예; 옥수수, 벼, 귀리 등), 콩류 (예;콩 등.), 평짓과 (예;아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 컬저(colza), 등.) 또는 가지과 (예: 감자, 토마토, 담배, 등.) 등을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 숙주 시스템은 식물 세포들을 또한 포함한다. 식물 세포들은 현탁액 배양, 배아, 메르스테매틱 영역들(merstematic regions), 캘러스 조직, 잎들, 뿌리들, 새 싹들, 배우체들, 포자체, 꽃가루, 씨앗들 및 소포자들을 포함한다. 식물 숙주 시스템은 다양한 성숙 단계들일 수 있고, 액체 또는 고체 배양 내, 화분에 있는 토양 또는 적절한 배지 내, 온실 또는 들판에서 성장될 수 있다. 식물 숙주 시스템들에서의 발현은 일시적 또는 영구적일 수 있다. 식물 숙주 시스템은 또한 식물, 씨앗, 자가수분된 또는 혼성된 자손, 유성적이거나 무성적으로 생성된 번식체(propagule), 절단 또는 씨앗과 같이 생성된 그들의 어느 후손들의 어느 클론을 일컫는다.
식물 숙주 시스템들의 형질전환은 통상의 방법을 이용함으로써 수행될 수 있다. 식물들로의 유전학적 전달의 개관은 Marta Izquierdo, Ed. Piramid (1999)에 의한 "Ingenieria genetica 및 transferencia genica"라는 제목의 교과서 특히, 제 9장 "식물로서 transferencia genica" 283-316쪽 에서 알 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신규하고 실험적으로 고안된 트랜즈진(transgene)을 포함하도록 계획된 트랜스제닉 식물 숙주 시스템을 제공하며 상기 트랜스제닉 식물 숙주 시스템은 그 게놈 내부에 통합된 본 발명의 핵산을 포함한다. 상기 트랜스제닉 식물 숙주 시스템은 예를들면, 통상의 안티센스 mRNA 기술들 및/또는 과다발현 (센스 사일런싱으로)의 이용을 통한 통상의 기술들에 의해서, 또는 예를 들면, 현재 이용되는 상이한 식물 형질전환 기술들에 이용가능한 이원성 벡터 또는 다른 벡터들을 이용함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 트랜스제닉 식물 숙주 시스템들의 실시예들은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물들 모두와 특히 곡류, 콩류, 평짓과, 가지과 등을 포함한다.
본 발명의 상기 핵산 서열은 식물 숙주 시스템에서 관심있는 산물을 생산하는데 유용하다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 식물 숙주 시스템에서 관심있는 산물을 생산하는 방법을 제공하고, 이는 융합 단백질 형태로 상기 관심있는 산물의 생산과 발현을 허용하는 조건하에서, 본 발명에 의해 제공된 형질전환되었거나 트랜스제닉한 식물 숙주 시스템의 발달을 포함한다. 상기 언급한 바와 같이, 상기 융합 단백질은 상기 숙주 식물 시스템에서 ER-파생적 PB들내에 안정되게 축적된다. γ-zein 영역들의 C-말단에 존재하는 효소적으로 또는 화학적으로 절단 가능한 부위는 나중에 관심있는 산물을 회복하게 한다. 상기 관심있는 산물은 보통의 방법에 의해 분리되고 정제되어질 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 방법은 희망에 따라, 융합 단백질의 분리 및 정제, 및 선택적으로, 상기 융합 단백질로부터 관심있는 산물의 해리를 더 포함한다. 상기 융합 단백질은 적합한 효소 또는 화학 약제에 의하여, 고유하게 절단부위에서 절단된다.
또 다른 측면에서 본 발명은
a) 단백질 γ-zein을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 1핵산 서열, 또는 식물세포의 소포체 (ER)쪽으로 단백질을 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 그 단편;
효소적 또는 화학적 수단에 의해 특이적으로 절단가능한 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 2핵산 서열;및
칼시토닌을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 3핵산 서열;로 이루어지고, 여기서 상기 제 1 핵산 서열의 3'말단은 상기 제 2핵산 서열의 5'말단에 연결되고 상기 제 2핵산 서열의 3'말단은 상기 제 3핵산 서열의 5'말단에 연결되는 핵산 서열(본 발명의 핵산 서열)의 전사를 위한 조절성 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 핵산 구성체로 식물 숙주 시스템을 형질전환시키는 단계;
b)상기 발현 벡터 또는 핵산 구성체로 형질전환된 상기 식물 숙주 시스템들로부터 완전한 식물들을 생성하는 단계;
c)융합 단백질 형태의 칼시토닌의 발현 및 생산을 허용하는 조건 하에서 그러한 형질전환된 식물들을 성장시키는 단계; 및, 희망에 따라
d)상기 융합 단백질을 분리, 정제하는 단계 및 칼시토닌을 해리하기 위해 상기 융합 단백질을 처리하는 단계를 포함하는, 식물 숙주 시스템에서 칼시토닌을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 따라서, 관심있는 재조합 산물들을 식물 숙주 시스템들에 있는 ER-파생적 PB 들에 축적하기 위한 융합 단백질 기반의 시스템을 제공한다. 본 발명은 다음의 제한적이지 않은 실시예에 의해 더욱 자세히 설명된다.
실시예1
담배 식물들에서의 칼시토닌 생산
담배 식물들에서 CT 생산의 성공 실시예는 아래에 설명된다. 다양한 프롤린 풍부 영역들이 절단가능한 프로테아제 부위를 통하여 융합 파트너로 작용하도록 γ-zein으로부터 계획되었다. 성숙한 CT 코딩 영역(32 aa)은 γ-zein 영역들의 C-말단에 융합되었고 트랜스제닉 담배 식물들에서 발현되었다. 절단가능한 프로테아 제 부위가 순수한 칼시토닌을 회복하기 위해 이후로 γ-zein 영역들의 C-말단에 도입되었다. 본 연구는 ER 내부에 융합 단백질들의 고축적과 담배 식물들에서 ER-파생적 PB들의 형성을 제공한다. 융합 단백질들은 담배 잎들에서 ER-파생적 PB들에 고도로 축적되었다. 상기 융합 단백질들의 발현 수준은 몇몇 경우에 전체 가용성 단백질들의 12.44% 까지 도달하였다. 불과 2번의 정제 단계 이후에, 상기 융합 단백질들은 칼시토닌의 해리를 허용하는 엔테로티나아제의 절단으로 전달되었다. 순수한 칼시토닌은 역상 크로마토그래피에 의해 분해 혼합물로부터 얻어졌다. 담배 식물들에 축적된 칼시토닌 산물은 질량분광기에 의해 확인되었다. 융합 단백질들의 정제, 프로테아제 분해 및 상기 해리된 식물 칼시토닌 (pCT)의 전체 특성이 또한 제공되었다.
I. 실험 절차
재조합 유전자들 및 벡터들의 구성
야생형 γ-zein 유전자 및 RX3, R3, P4 및 X10으로 명명하는 서로다른 γ-zein 영역들을 인코딩하는 4개의 γ-zein 파생적 서열들(도 1A, 1B 및 1C)이 엔테로키나아제 분해 부위(도 2)를 포함하는 합성 CT 유전자와 함께 융합되었고, 이하에서와 도 3에 설명된 바와 같이 식물 형질전환 벡터들에 도입되었다.
γ-zein, RX3 및 R3 cDNA 서열들은 주형으로 pKSG2 (Torrent 기타.,1994)을 이용하는 PCR에 의해 생성되었다. X10 Cdna는, 반복(repeat) 영역에 해당하는 서 열의 결실 이후에 pKSG2로부터 생산된 플라스미드인 pDR20로부터 증폭되었다. 서로 다른 PCR들에 대해 사용된 프라이머들은:
γ-zein cDNA 서열에 대해:
T1: 5'TCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTC3' 및
T4: 5'CCATGGCGTGGGGGACACCGCCGGC3'
RX3 및 X10 cDNA 서열들에 대해:
T1 및
T2: 5'CCATGGTCTGGCACGGGCTTGGATGCGG3', 및
R3 cDNA 서열에 대해:
T1 및
T3: 5'CCATGGTCCGGGGCGGTTGAGTAGGGTA3'
상기 PCR 산물들은 pUC 18 벡터 (슈어클론 연결 키트, 파마시아) 내부로 서브클론되었고 그 결과적 플라스미드들은 pUCZein, pUCRX3, pUCR3 및 pUCX10라고 명명되었다. 상기 γ-zein 파생적 서열 P4 (도 1C)를 포함하는 벡터 pUCP4가 pUCRX3 파생적 클론들의 스크리닝 동안에 얻어졌다. BspHI 및 NcoI의 점착말단들을 포함하는 γ-zein, RX3, R3, P4 및 X10 cDNA 단편들은 NcoI으로 이전에 분해된 벡터 pCKGFPS65C(레이첼 기타., 1996) 내부에 삽입되었다. 본 벡터는 식물들에서 발현을 위한 조절성 서열들 및 트랜스제닉 식물들에서 γ-zein 파생적 단백질들의 유사한 표적화 연구들을 위해 이용되었던 GFP 코딩 서열을 포함하기 때문에 선택되었다. 벡터들이 생성되었고, pCZeinGFP, pCRX3GFP, pCR3GFP, pCP4GFP 및 pCX10GFP는 식물 시스템들에서 발현을 위하여 다음의 조절성 서열들 i) 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMVp35S)로부터 파생된 인핸스된 35S 프로모터, ii)토마토 etch 바이러스 (TL)로부터의 전사적으로 인핸서 및 iii) CaMV35S (pA35S)로부터의 전사 종결 서열을 포함하였다. 상기 γ-zein 파생적/CT 재조합 구성체들은 이하에서 설명된 바와 같이(도 3 참조), GFP 코딩 서열을 CT 합성 유전자로 치환함으로써 생성되었다.
활성 연어 CT (도 2) 32 아미노산들을 암호화하는 합성 유전자는 두개의 122 염기들의 상보적 올리고누클레오티드들로부터 생성되었다. 상기 올리고누클레오티드들은 식물들에서 고발현을 달성하기 위해 우선적인 식물 코돈들을 사용하도록 설계되었다. 제공된 바이오시스템즈 394 DNA 합성기를 이용하여 합성된 5'인산화된 올리고누클레오티드들은 다음의 서열들을 가진다.
CalI:
5'CATGGACGACGACGACAAGTGCTCCAACCTCTCTACCTGCGTTCTTGGTAAGCTCTCTCAGGAGCTTCACAAGCTCCAGACTTACCCTAGAACCAACACTGGTTCCGGTACCCCTGGTTGAT3',
CalII:
5'CTAGATCAACCAGGGGTACCGGAACCAGTGTTGGTTCTAGGGTAAGTCTGGAGCTTGTGAAGCTCCTGAGAGAGCTTACCAAGAACGCAGGTAGAGAGGTTGGAGCACTTGTCGTCGTCGTC3'
12% 폴리아크릴아미드 젤 상에서의 정제 이후에, 60 pmole의 각 올리고누클레오티드이 이중 가닥 분자를 형성하는데 이용되었다. 95℃에서 5분간 열처리된 혼성화 혼합물은 70℃에서 1시간동안 유지되었고 실온에서 냉각되었다. 상기 합 성 cDNA 단편은 NcoI 및 XbaI 5' 및 3' 말단에 각각 점착말단을 포함하였다. 상기 합성 CT cDNA는 엔테로키나아제 특이적 절단 부위((Asp)4-Lys)에 해당하는 5' 링커 서열을 포함하였고, 상기 CT 펩티드의 추가적 아미데이션을 위한 단일 글리신을 생산하기 위해 3' 말단에 연장되었다. 상기 NcoI/XbaI CT cDNA는 pUC 18 벡터내로 서브클론 되고 그리고나서 상기 파생적 γ-zein 코딩 서열들을 포함하며 상기 GFP 코딩 서열로부터 결실된 pCZeinGFP, pCRX3GFP, pCR3GFP, pCP4GFP 및 pCX10GFP 벡터들의 NcoI 및 BamHI 제한 부위들 내로 삽입되었다. 결과적인 구성체들은 pCZeinCT, pCRX3CT, pCR3CT, pCP4CT 및 pCX10CT (도 3)로 명명되었고, 효과적인 식물 형질전환 벡터들 pBZeinCT, pBRX3CT, pBR3CT, pBP4CT 및 pBX10CT (도 4)은 최종적으로 서로 다른 HindIII/HindIII 발현 카세트들을 이원성 벡터 pBin19 (Bevan, 1984) 내부로 삽입함으로써 얻어졌다.
안정한 담배 식물들 형질전환
이원성 벡터들은 애그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 LBA 4404 균주들 내부로 전달되었다. 담배 (Nicotiana tobaccum, W38) 잎 디스크들은 드래퍼(Draper) 기타(1988)의 방법에 따라서 형질전환되었다. 재생된 식물들 200 mg/L 카나마이신을 포함하는 배지 상에서 선별되고 온실로 이전되었다. 최고의 트랜스진 산물 수준을 갖는 트랜스제닉 담배 식물들은 T1 세대의 획득을 위하여 배양되었다. 발육하고 있는 잎들(대략 12 cm 길이) 이 수확되었고, 추가 실험을 위해 즉시 액체 질소로 냉동되어 -80℃에서 저장되었다.
재조합 단백질들의 추출 및 웨스턴 블롯 분석
담배 잎들은 액체 질소에서 가루로 되었고, 신선한 잎 재료의 그램당 4 ml 의 추출 버퍼 (50 mM 트리스-HCl pH 8, 200 mM 디티오트레이톨 (DTT) 및 프로테아제 억제제 (10 mM 애프로티닌(aprotinin), 1 mM 펩스태틴(pepstatin), 100 mM 루펩틴(leupeptine), 100 mM 페닐메틸설포닐 플로오라이드(phenylmethylsulphonyl fluoride) 및 100 mM E64 [(N-(N-(L-3-트랜스-카복시옥시레인(carboxyoxirane)-2-카보닐)-L루실)-애그맨틴(agmantine)]을 사용하여 균질화되었다. 상기 균질화물들은 4℃에서 30 분동안 저어지고 나서 비가용성 물질을 제거하기 위해 두번 원심분리(15000 rpm 30 분, 4℃) 되었다. 전체 가용성 단백질들은 브래드포드 단백질 분석(바이오-래드)을 이용하여 정량되었다. 단백질들은 15% SDS 폴리아크릴아미드 젤 상에 분리되었고 반건조 장치(semidry apparatus)를 이용하여 니트로셀룰로오스 막(0.22 mM)에 이전되었다. 막들은 γ-zein 항혈청 (dilution 1/7000) (루더비드 기타., 1985) 또는 KLH-칼시토닌 (CT-항혈청)(희석도 1/1000)에 반응하여 생성된 항혈청과 함께 배양되었고, 그리고나서 항체들과(희석도 1/10000) 접합된 양고추냉이의 과산화효소와 함께 배양되었다. 면역반응이 있는 밴드들은 인핸스된 화학발광 (ECL 웨스턴 블로팅 시스템, 애머셤)으로 관찰되었다. 칼시토닌 항체들은 토끼들에서 KLH 와 쌍을 이룬 합성 연어 칼시토닌을 접종함으로써 생성되었다. 네 번의 항원 (각 200 ㎍) 접종 이후, 혈청들이 모아지고, 등분되었으며 -80℃에서 저장되었다. 혈청들의 적정은 합성 칼시토닌을 이용하는 이뮤노-닷 블롯과, 항원으로 서 BSA-칼시토닌을 사용하는 ELISA 분석을 이용하여 수행되었다.
노던 블롯 분석
전체 RNA는 로지맨 기타., 1987 에 따라서 야생형 및 트랜스제닉 담배 (T1) 잎들로부터 분리되었다. RNA는 변성 포름아미드-아가로오스 젤 전기영동 (레인 당 30 mg) 상에서 분류되었고 나일론 막(Hybond N, Amersham Pharmacia Biotech) 위로 캐필러리 블롯되었다. RNA 블롯들은, CT cDNA 로부터 얻어지고 무작위 프라임된 DNA 표지화 키트(로쉐)를 이용하여 (α-32P) dCTP로 표지된 129 염기 DNA 프로브와 함께 혼성화되었다. 혼성화는 42℃에서 오버나이트로 수행되었고, 필터들은 3X SSC 및 0.5% SDS (W/V)에서 65℃에서 15분 동안 3번 세척되었다. 블롯들은 포스포이미저 스캐너(phosphorImager scanner) (플루오르-STM 멀티이미저, 바이오-래드)로 검출되었다.
ELISA 분석들
ELISA 분석들이 식물 칼시토닌 (pCT) 정량화를 위해 가용성 잎 단백질 추출물 상에서 실시되었고 γ-zein-CT 융합 단백질들을 부분적으로 정제하였다. 마이크로타이터 플레이트들 (맥시솝, 날진 넌크 인터내셔널)은 포스페이트-버퍼된 살린 pH 7.5 (PBS)에서 희석된 가용성 단백질들(100 ml)이 올려졌고, 4℃에서 오버나이트로 배양되었다. 웰들을 세번 세척 후에, 비특이적인 결합 부위들은 실온에서 한시간 PBS-T (0.1% Tween 20을 포함하는 PBS)에서 3% 보바인 혈청 알부민(BSA)으로 차단되었다. 상기 플레이트들은 CT 항혈청 (희석도 1/1000)과 함께 두시간 동안 배양되었고, 및 PBS-T로 네번 세척 후 과산화효소-결합된 2차 항체들(희석도 1/8000)(시그마)과 함께 두시간동안 배양되었다. 초기 및 2차 항체들은 1% BSA를 포함하는 PBS-T에서 희석되었다. PBS-T로 넓게 세척한 후에, 상기 효소적 반응이 37℃에서 100 ml 의 기질 버퍼 (100 mM 소디움 아세테이트 pH 6, 0.01 mg/ml TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 및 0.01% 과산화수소)와 함께 수행되었다. 상기 반응은 10분 후에 2N 황산으로 정지되었고, 광학밀도는 450 nm 에서 멀티스캔 EX 분광광도계(랩시스템즈)를 사용하여 측정되었다. 식물 추출물에서의 항원 농도는 칼시토닌-BSA 및 CT 항혈청 (희석도 1/1000)를 이용하여 획득된 표준곡선으로부터 추정되었다.
전자 현미경 검사
야생형 및 트랜스제닉 식물들로부터의 잎들은 pH 7.4. 실온에서 한시간 동안 20 mM 포스페이트 버퍼내의 1% 글루타알데히드 및 2.5% 파라포름알데히드로 진공 침투에 의해 고정되었다. 20 mM 포스페이트 버퍼 및 200 mM 암모늄 클로라이드로 계속하여 세척 후에, 샘플들은 에탄올 시리즈를 통해 탈수되었고 로위크릴(Lowicryl) K4M 레진에 끼워 넣어졌다. 면역화학이 무어 기타., 1991에 의해 기술된 바와 같이 본질적으로 행하여졌다. 극박의 분획들이 KLH-칼시토닌(1/500), aBiP (1/500) 및 γ-zein (1/1500)에 대한 항혈청들과 함께 배양되었다. 단백질 A-폴로이달 골드 (15 nm의 금 입자) 항체 검출을 위해 사용되었다. 기준으로서, 유사한 배양들이 초기 항체들의 동일한 희석들을 이용하는 비-트랜스제닉 식물 샘플들 및 초기 항체가 없는 트랜스제닉 샘플들 상에서 행하여졌다. 분획들은 우라닐 아세테이트 및 리드 시트레이트로 염색되었고 모델 301 전자현미경(필립스, 아인트호벤, 네덜란드)로 검사되었다.
RX3-CT 및 P4-CT 융합 단백질들의 정제 및 엔테로키나아제 절단
RX3-CT 및 P4-CT의 가용성 추출물들이 트랜스제닉 담배 식물들 (T1)의 잎들로부터 위에서 설명한 바와 같이 추출 버퍼들에서 얻어졌다. 고체 (NH4)2SO4 가 0℃에서 RX3-CT 및 P4-CT 가용성 추출물들에 각각 45% 및 60% 포화도까지 점차적으로 더해졌다. 상기 샘플들은 0℃에서 30분동안 섞여졌고 그리고나서 4℃에서 45분간 15000 rpm으로 원심분리 되었다. 침전된 단백질들은 20 mM 트리스-HCl pH 8.6 에서 다시 중지되었고 PD 10 칼럼(세파덱스 G-25 M, 에머샴 파마시아)상에서 염분이 제거되었다. 염분이 제거된 단백질 추출물들은 20 mM 트리스-HCl pH 8.6, 100 mM DTT로 평형이 잡힌 음이온 교환 칼럼(하이트랩 Q 세퍼로오스, 에머샴 파마시아)을 이용하는 빠른 실행 액상 크로마토그래피 (FPLC)에 의해 분류되었다. 단백질 추출이 20 mM Tris-HCl pH 8.6, 100 mM DTT에서 0 에서 200 mM NaCl 까지의 선형의 염 구배와 함께 수행되었다. 추출 단편내의 RX3-CT 및 P4-CT 존재는 15% SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 CT 항혈청을 이용하는 이뮤노블롯 검출에 의해 평가되었다. 양성 단편은 염이 제거되고 5 K NMWL 원심분리기 필터들(BIOMAX, Millipore)과 함께 농축되었다. RX3-CT 및 P4-CT 융합 단백질들의 정량화가 ELISA에 의해 행해졌다.
EK 분해를 위해, 15 ㎍ 의 부분적으로 정제된 융합 단백질들이 0.2 U EK (EK Max, 인비트로젠)와 함께 30 ml의 분해 버퍼(50 mM 트리스-HCl pH8, 1 mM NaCl, 0.1% Tween-20)에서 20℃ 24시간 동안 배양되었다. EK 분해 버퍼는 100 mM DTT로 보충되었다. 상기 환원제(reducing agent)의 존재는 엔테로키나아제 절단을 효과적으로 활용하게 한다. 분해 산물들은 18% 트리스-트리신 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 상에서 분석되었고 해리된 pCT 가 이뮤노블롯에 의해 검출되었다. 합성 연어 CT가 양성 기준으로 이용되었다.
해리된 pCT의 정제 및 분석
융합 단백질들로터 EK 분해에 의해 해리된 식물 칼시토닌 (pCT) 은 RP-HPLC에 의해 정제되었다. 분해 혼합물은 분석적 RP-C18 칼럼 (250 x 4 mm, 10 μM particule 크기, 120Å구멍크기)에 적용되었고 상기 칼럼은 0.036% TFA를 가지는 25 내지 60% 범위의 아세토니트릴 구배를 이용하여 20분동안 1 ml/분의 유속으로 추출되었다. 수집된 단편들은 냉동건조에 의해 농축되었고 pCT 특성화를 위해 -20℃에서 저장되었다. 독립된 실험에서, 표준 연어 CT가 동일한 크로마토그래피의 조건하에서 추출되었다. TOF-MALDI 질량 분광계가 pCT 특성화를 위해 이용되었다. RP-HPLC 단편 앨리쿼트(aliquots)들은 동일 부피의 기질 용액(10 mg/㎖ α-시아노- 4-하이드록시시나믹 산(hydroxycinnamic acid) 및 0.1% TFA)으로 혼합되었고 1 ml의 상기 혼합물은 홀더 상에 넘겨졌고 보이저-DE-RP 질량 분광계 (어플라이드 바이오시스템즈)로 분석되었다. 표준 연어 CT는 TOF-MALDI 질량 분광계 실험들에서 항상 기준으로 이용되었다. 상기 pCT의 C-말단 분석은 상기 정제된 펩티드를(20 pmoles/㎕) 37℃에서 60분 동안 카복시펩티다아제 Y (0.1U/㎕)와 함께 배양하고 TOF-MALDI 질량 분광계로 상기 분해 산물들을 분석함으로써 실행되었다.
Ⅱ. 결과
몇가지의 파생적 γ-zein-CT 재조합 유전자들의 구성
식물 잎들에서 γ-zein 프롤린 풍부 영역들의 발현 및 ER-파생적 단백질체들내로의 계속적인 조립(Geli 기타., 1994)은 식물 조직들의 ER에 치료적 단백질들을 축적하는 귀중한 도구를 제공한다. γ-zein 유전자는 담배 식물들에서 CT를 생산하기 위한 융합 파트너로 이용된 다양한 프롤린-풍부 결절의 단백질들을 생성하기 위해 결실되었다. 상기 재조합 유전자들은 γ-zein 영역들과 프로테아제 절단가능 부위에 해당하는 링커에 의해 연결된 CT 합성 유전자를 포함하였다. 32 아미노산 활성 연어 칼시토닌을 암호화하는 상기 합성 유전자는 식물들에서 재조합 펩티드의 고발현을 달성하기 위하여 우선적 식물 코돈들을 이용하도록 고안된 두개의 상보적 올리고누클레오티드들 (122 bases)로부터 생성되었다. 상기 합성 CT cDNA (도 2) 는 5' 말단에 엔테로키나아제 절단 부위 ((Asp)4-Lys)에 해당하는 링커 서열과 3' 말단에 글리신을 생산하기 위한 부가적 코돈을 포함하였다. 상기 글리신은 CT 생물학적 활성에 본질적인 C-말단 프롤린아미드를 생산하기 위한 아미드화 효소(PAM)의 필수 기질이다. 상기 칼시토닌 cDNA는 C-말단 융합에서 γ-zein 영역들을 암호화하는 서열들에 융합되었다. 식물 시스템들에서 상기 파생적 γ-zein-CT 재조합 유전자들의 최적의 발현을 위하여, 상기 식물 형질전환 벡터들은 다음의 조절성 서열들 i) 컬리플라워 모자이크 바이러스로부터의 구성적 인핸스된 35S 프로모터 및 35S 터미네이터 및 ii) 토마토 etch 바이러스 (TL)로부터의 번역적 인핸서를 포함하였다. 생성된 다른 융합 단백질들이 도 5에 기술되었다. 상기 γ-zein-CT 융합 단백질은 CT에 융합된 전체 γ-zein을 포함한다. 상기 RX3-CT, R3-CT, P4-CT 및 X10-CT 융합 단백질들은 전체 γ-zein와 동일한 방식으로 상기 CT에 연결된 파생적 γ-zein 영역들을 포함한다. 이들 융합 단백질들은 상기 반복(repeat) 및 proX 영역들의 존재 또는 부존재에 있어서 본질적으로 다르다.
담배 식물들에서 융합 단백질들의 생산
모든 융합 유전자들은 애그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 경유하여 담배 식물 형질전환에 안정하게 이용되었다. 적어도 20개의 독립적 카나마이신-저항성 식물들(To)이 각 융합 유전자에 대해 생성되었다. 상기 트랜스제닉 식물들의 스크리닝이 γ-zein 폴리클로널 항혈청을 이용하는 가용성 단백질 추출물들의 웨스턴 블롯 분석에 의해 행해졌다. 각 융합 유전자의 트랜스제닉 라인들 이뮤노블롯 형태 대표는 도 6에서 보여진다. 관찰된대로, 재조합 융합 단백질들은 융합 단백질들의 흔적이 검출되지 않은 X10-CT 융합 유전자를 제외하고 모든 트랜스제닉 라인들에서 관찰되었다. 이러한 작은 융합 단백질(80 아미노산)은 담배 식물들에서 대개 불안정하다. 2개의 면역-표지된 밴드들이 R3-CT 트랜스제닉 라인들에서 검출되었고, 하나는 불규칙한 고선명 분자량을 가진다. 이러한 융합 단백질은 대개 글리코실레이션과 같은 번역후 수식을 받는다. 실제로, 상기 γ-zein 프롤린 풍부 반복(repeat) 영역은 아라비돕시스 식물들(알바레즈 기타., 1998)에서 발현되었을 때 글리코실화될수 있다는 것이 증명되었다.
단백질 발현 수준은, 모든 트랜스제닉 라인들에서 높은 재조합 단백질 발현 수준을 보인 RX3-CT 융합유전자를 제외한 동일한 융합 유전자의 다른 라인들 사이에서 매우 가변적이다.
추가적 이뮤노블롯 스크리닝이 상기 sCT 펩티드에 대해 반응하여 특이적으로 생성된 항혈청을 이용하여 수행되었다(도 7 A). 관찰된 바와 같이, 상기 RX3-CT 및 상기 P4-CT 단백질들은 이들 융합이 담배 식물들에 CT 펩티드의 더 나은 축적을 제공한다는 것을 지시하는 sCT 항혈청에 의해 강하게 인지되었다. RX3-CT 및 P4-CT 이뮤노블롯 형태들은 몇 개의 표지된 밴드들을 나타내었고, 주요 밴드는 관련된 재조합 단백질의 정확하고 분명한 분자량에 해당한다는 것을 알 수 있다. 하나의 가설은 고분자량의 표지된 밴드들이 식물들 조직에서 융합 단백질들의 축적 동안 형성된 γ-zein 영역들에서의 올리고화 과정의 결과라 할 수 있다. 단백질 수준에 관하여 융합 유전자들의 발현수준을 체크하기 위하여, 도 7 A에서 이뮤노블롯에 의해 분석된 트랜스제닉 라인들을 이용하는 비교적 노던 블롯 분석(도 7 B)이 행해졌다. 보여진대로, RX3-CT 및 P4-CT 전사체들은 더욱 풍부하고 이들 전사체의 안정 한 축적을 증명한다. 놀랍게도, R3-CT 전사체들은 이뮤노블롯에 의해 검출된 상기 낮은 R3-CT 융합 단백질 수준에 비하여 상대적으로 풍부하였다. 대개, 번역 후 수식은 상기 융합 단백질의 정확한 자가조립 및 부수적으로 ER에서의 그 안정성을 피한다.
T1 식물들로부터의 잎 단백질 추출물들 상의 ELISA에 의해 측정된 RX3-CT 및 P4-CT 단백질들의 최대 발현 수준은, 각각 전체 가용성 단백질의 12.44% 와 10.65% 이며 반면에 γ-zein-CT 및 R3-CT 발현 수준은 전체 가용성 단백질들의 0.01 % 정도로 낮게 유지되었다. 이러한 결과를 고려하면, RX3-CT 및 P4-CT 트랜스제닉 라인들이 식물 칼시토닌 (pCT)의 생산을 이끄는 추가 실험을 위해 선택되었다.
융합 단백질 RX3-CT 및 P4-CT의 준세포적 국부화
아라비돕시스 식물들에서 γ-zein의 발현과 두개의 γ-zein 결실 돌연변이체는 이러한 단백질들이 ER-파생적 PBs (겔리 기타., 1994)를 형성하는 잎살 세포들의 ER 내부에 위치하는 것을 증명하였다. 분명하진 않지만, γ-zein 유도체들에 융합된 칼시토닌은 유사한 기관들인 ER-PBs로 분류되었다. 칼시토닌을 포함하는 γ-zein 융합 단백질들의 담배 잎들에서의 준세포적 국부화를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 면역전자 현미경(도 8)을 사용하였다. RX3-CT 및 P4-CT 단백질들을 발현하는 트랜스제닉 담배 잎들의 극박 분획들은 CT 항체 및 단백질 A-골드와 함께 배양되었다. 강력하게 표지된 거대한 PB-유사 기관들이 RX3-CT 및 P4-CT를 발현하 는 담배의 잎살 세포들에서 관찰되었다(도 8 A 및 B, 각각). 극소수의 액포가 세포 마다 검출되었고 그들의 크기는 상당히 이종이다. 융합 단백질들은 칼시토닌 단백질 및 γ-zein 단편들을 포함하므로, 극박 분획들 역시 γ-zein 항체와 함께 배양되었다. 기대한대로, 상기 PBs 는 상기 융합 단백질들은 이들 기관 내부에 축적되었다는 것을 확증하는 γ-zein 항체와 함께 표지되었다 (도 8 C). PB들이 ER로부터 형성된 것을 증명하기 위해, 상기 분획들은 ER 내재 단백질에 대한 항체와 함께 배양되었다, BiP (도 8 D). 이들 기관에서의 상기 CT-융합 단백질들 및 BiP의 부수물 발생은 RX3-CT 및 P4-CT가 독립된 ER-파생적 액포들을 추가로 형성하기 위해 ER 루멘 내에 축적된다는 사실을 지시하였다. 본 발명자들은 비트랜스제닉 식물들의 극박 분획에 있는 PB-유사 기관들을 검출할 수 없었으므로 (도 8 E), 기준 실험들이 초기 항체 없이 트랜스제닉 식물들에서 행해졌다 (도 8 F). 예측한 대로 기준 실험들에서 특이적인 표지는 검출되지 않았다.
융합 단백질들의 정제 및 Pct의 해리
RX3-CT 및 P4-CT 융합 단백질들은 DTT (200 mM)와 같은 감량 약제를 포함하는 추출 버퍼를 이용하여 트랜스제닉 담배 잎들 (T1)로부터 효과적으로 추출되었다. 약 85 ㎍의 RX3-CT 및 73 ㎍ 의 P4-CT 들이 신선한 재료의 그램마다 회복되었다. RX3-CT 및 P4-CT 단백질들은 45% 및 60% 암모늄 설페이트 침전에 의해 각각 농축되었다. 상기 염이 제거된 단백질 추출물들은 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 FPLC에 의해 분류되었고, 상기 회복된 융합 단백질들은 ELISA에 의해 정량화되었다. RX3-CT 단백질은 전체 정제된 단백질의 약 80%를 나타내고 반면에 P4-CT는 겨우 전체 정제된 단백질의 약 50%를 나타냈다. 그러한 차이는 더 많은 단백질이 45%에서보다 60%의 암모늄 설페이트에서 침전했고 따라서 상기 침전된 P4-CT 단백질들은 더욱 많은 오염 단백질들을 포함하였다는 점에 의해 설명될 수 있다. 부분적으로 정제된 융합 단백질 RX3-CT 및 P4-CT는 EK에 의해 분해되었고 pCT 해리는 트리스-트리신 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 면역검출에 의해 조절되었다. 도 9에 보여진 대로, 칼시토닌에 해당하는 단일의 표지된 밴드는 RX3-CT 및 P4-CT 단백질 절단 모두로부터 생성되었다. 소량의 융합 단백질 RX3-CT 및 P4-CT는 대개는 몇몇 절단 부위들에 대한 효소의 비접근성에 의해 분해되지 않은 채로 남았다.
pCT의 정제와 특성화
식물 칼시토닌 (pCT)은 분석적 C18 RP-HPLC 칼럼 (도 10) 상의 EK 분해 혼합물의 분류와 합성 sCT(MW 3433.24, 도 11. A)를 표준으로 이용하는 TOF-MALDI 질량 분광계에 의한 상기 추출된 단편들의 분석에 의해 분리되었다. pCT 칼시토닌은 13 분 (합성 sCT Tr = 14 분)에서 추출되었고 상기 감소된 C-말단 글리신 연장된 칼시토닌의 (도 11 B) 이론상 분자 질량과 일치하며 TOF-MALDI 질량 분광계로 3491.93 Da의 질량을 가지는 단일 스펙트럼을 내었다. 카복시펩티다아제 Y 분해를 겪은 pCT의 질량 분광계 분석은 C-말단 프롤린아미드를 생산하는데 필수적인 상기 C-말단 글리신의 보전을 확증하였다.
Ⅲ. 고찰
담배 식물들에 연어 칼시토닌을 축적하는 계속적인 융합 단백질 기반의 시스템이 제공되었다. 두개의 융합 단백질 RX3-Cal 및 P4-Cal는 담배 잎들의 ER-파생적 PB들에서 강력하게 축적되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 융합 단백질들은 i) 8개 단위들의 헥사펩티드 PPPVHL (P4-Cal 융합 단백질에는 단지 하나의 단위만)로 이루어진 반복(repeat) 영역 및 ii) 프롤린 잔기들이 다른 아미노산들과 교대로 있는 proX 영역에 존재하는 CT 펩티드 및 γ-zein의 프롤린 풍부 영역들을 포함한다.
상기 γ-zein 프롤린 풍부 영역들은 아라비돕시스 식물들 ER (겔리 기타., 1994) 내부에서 γ-zein의 정확한 유지 및 조립에 필수적이다. ER에서 상기 γ-zein 폴리펩티드 사슬들의 접힘과 안정화는 자가 조립하고 올리고머들의 형성을 항상시키는 상기 반복(repeat) 및 proX 영역의 능력에 기인하였다. 이러한 고도의 소수성 영역들에 의해 채택된 특별한 형태는 양친매성(amphipathic) 2차 구조를 형성할 수 있는 프롤린 풍부 서열들에 의할 것이다. 그 적절한 형태의 결과로서, 상기 프롤린 풍부 영역들 단백질-단백질 상호작용들과 ER유지와 ER-파생적 PB들의 형성을 이끄는 2황화물 교차 결합들을 포함하는 집합 기작을 유도할 것이다. 이 실시예는 N-말단 융합 방식으로 발현되었을 때에, 상기 γ-zein 프롤린 풍부 영역들은 자가 조립하고 ER-파생적 PBs에 유지와 축적을 이끄는 상기 복합체 사건들을 진행시키는 전체적 능력을 유지한다는 것을 보여준다. 상기 융합 단백질에 포함된 연어 CT 역시 PBs에 매우 축적되는 것으로 발견되었다. 트랜스제닉 담배 식물들에서 상기 CT의 고발현 수준은 융합 단백질을 접히게 하고 안정화시키는 프롤린 풍부 영역들의 능력에 의한 것으로 생각될 수 있다.
PBs 내의 융합 단백질의 전달은 가수분해적 세포간 환경으로부터 그것을 제거함으로써 CT에서 식물 조직들의 농축에 확실히 기여한다.
작은 펩티드들은 생물학적 시스템들에서 불안정하기 때문에, 상기 융합 단백질 연구는 현재 이종의 시스템들, 예를들면 대장균(래이 기타., 1993; 야부타 기타., 1995; 홍 기타., 2000), 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus) (딜슨 기타., 2000) 및 트랜스제닉 토끼들의 젖 (맥키 기타., 1998)에서 칼시토닌을 생산하는데 이용되고 있다. 이 마지막 경우에 CT의 인간 알파 락트알부민과의 융합 또한 보통의 동물 발달과의 가능한 간섭을 피하기 위하여 칼시토닌 활성을 방해할 목적을 갖는다.
발명자들은 담배 식물들로부터 글리신 연장된 sCT의 빠른 생산에 성공하였다;
ⅰ) RX3-Cal 및 P4-Cal 융합 단백질들은 환원제의 존재에서 그들의 높은 용해도 때문에 담배 조직들로부터 효과적으로 회복되었다,
ⅱ)융합 단백질들로부터 칼시토닌의 엔테로키나아제 해리는 상기 융합 단백질의 하나의 정제 단계 이후 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 달성되었다,. 및
ⅲ) 역상 크로마토그래피는 CT를 EK분해 혼합물로부터 제거함으로써 정제된 CT가 되게 하였다.
해리된 CT의 질량 분광계 분석은 정확한 글리신 연장된 CT가 담배 식물들에 의해 생산되었음을 확증하였다.
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도 1은 누클레오티드 서열들과 γ-zein (도 1A) 및 γ-zein 유도체들 RX3(도 1B 상측), R3 (도 1B 하측), P4 (도 1C 상측) 및 X10 (도 1C 하측)의 번역을 나타낸다.
도 2는 상기 누클레오티드 서열(레인 2) 및 합성 칼시토닌(CT)의 번역(레인 1)을 나타낸다. 상기 합성 CT 유전자는 우선적 식물 코돈 사용법(codon usage)을 이용하여 구성된다. 코돈 수식들은 야생형 연어 CT유전자(레인 3)에 비교하여 강조된다. 상기 합성 유전자는 5' 말단에 엔테로키나아제 절단가능 부위(EK)에 해당하는 링커 서열을 포함하며, 단일 C-말단 글리신을 생산하기 위하여 3'에 연장된다.
도 3은 pCRX3CT 플라스미드의 구성에 대한 도식적인 윤곽을 나타낸다. 상기 제시된 과정은 다음의 플라스미드들 pCZeinCT, pCR3CT pCP4CT 및 pCX10CT의 획득과 동일하였고, 그들간의 차이는 상기 해당하는 γ-zein 또는 γ-zein 파생적 서열이 도입된 점이다. 상기 서로 다른 플라스미드들은 비율로 설명된 것은 아니다.
도 4는 pBZeinCT, pBRX3CT, pBR3CT, pBP4CT 및 pBX10CT 플라스미드들의 도식적인 설명을 나타낸다. 상기 서로 다른 플라스미드들은 비율로 설명된 것은 아니다.
도 5는 융합 단백질들의 도식적인 설명을 나타낸다. γ-zein 및 γ-zein파생적 영역(RX3, R3, P4 and X10)들은 엔테로키나아제 절단가능 부위(EK)를 통하여 칼시토닌(CT)에 융합되었다. SP, 신호펩티드; REPEAT, 반복 영역(PPPVHL) 여덟개 단위들; R1, 하나의 반복 단위; Pro-X, 프롤린-Xaa; PX, 프로-X 영역의 단편; C-term, 시스테인 풍부C-말단 영역; N, 성숙한 단백질의 N-말단 서열. 각 융합 단백질의 아미노산 수는 오른쪽에 보여진다.
도 6은 트랜스제닉 담배 식물들에서의 γ-zein 항혈청을 이용한 융합 단백질의 이뮤노블롯 분석 결과를 나타낸다. 가용성 단백질들은 야생형(WT) 및 트랜스제닉 담배(To)잎들로부터 추출되었고, 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤들(레인 당 20 mg) 상에서 분리되어 니트로셀룰로오스로 전달되었다. 번호들은 서로 다른 합성 유전자들인, γ-zein-CT, RX3-CT, R3-CT, P4-CT에 대해서 획득된 독립적인 트랜스제닉 라인들을 나타낸다.
도 7은 다음을 나타낸다.
A. CT 항혈청을 이용한 서로 다른 재조합 융합 단백질들의 비교 웨스턴 블롯 분석. 가용성 단백질 추출물들이 야생형 식물들(WT) 및 관련 합성 유전자의 최대 융합 단백질 발현을 가지는 트랜스제닉 담배 라인들(T1)로부터 준비되었다. 8 ㎍의 가용성 단백질들이 15% SDS-폴리아크릴아키드 젤 상에 올려지고 니트로셀룰로오스에 전달되었다. B. 서로 다른 합성 유전자 전사체들의 비교 노던 블롯 분석. 전체 RNA들이 이뮤노블롯에(도 7A) 의해 분석된 트랜스제닉 라인들로부터 분리되었고 변성하는 포름아미드 젤 전기영동(레인 당 30 ㎍) 상에 분별되었고, 나일론 막 위로 캐필러리 블롯되었다. 블롯들은 칼시토닌 cDNA로부터 얻어진 무작위로 프라임된 프로브(random primed probe)(129 염기)와 함께 혼성화되었다.
도 8은 트랜스제닉 담배 식물들내에서 RX3-CT 및 P4-CT 단백질들의 준세포적 위치를 나타낸다; (A) CT 항혈청 (희석도 1:100)을 이용하는 RX3-CT 트랜스제닉 라인들에서의 RX3-CT 단백질의 면역국소화(Immunolocalization). (B) CT 항혈청 (희석도 1:100)을 이용하는 P4-CT 트랜스제닉 라인들에서의 P4-CT 단백질의 면역국소화. (C) γ-zein 항혈청 (희석도 1:1.500)을 이용하는 RX3-CT 트랜스제닉 라인들에서의 RX3-CT 단백질의 면역국소화. (D) BiP 항혈청 (희석도 1:250)을 이용하는 RX3-CT 트랜스제닉 라인들에서의 BiP 단백질의 면역국소화. (E) γ-zein 항혈청 (희석도 1:1.500)을 이용하는 야생형 식물들에서의 면역국소화. (F) 초기 항체 없이 RX3-CT 트랜스제닉 식물들에서의 면역국소화(희석도 1:1.500). 지시된 초기 항체들 및 단백질 A-폴로이달 골드(15 nm)를 이용함으로써 담배 잎 구획들상의 면역세포화학이 수행되었다. cw: 세포벽; ch: 엽록소; pb: 단백질체; v: 액포.
도 9는 RX3-CT 및 P4-CT 융합단백질 EK 절단의 이뮤노블롯 분석 결과를 나타낸다. 12 ㎍의 각기 부분적으로 정제된 융합 단백질은 0.2 U EK 와 함께 20℃ 에서 24시간 동안 배양되었다. 분해된 융합 단백질들은 18% 트리스-트리신 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 상에 분류되고 니트로셀룰로오스로 전달되었다. 레인 1, 분해되지 않은 융합 단백질(1 mg); 레인 2, 분해 산물; 레인 3, 합성 연어 CT 기준.
도 10은 EK에 의해 분해된 RX3-CT 융합 단백질의 RP-HPLC 분류 결과들을 나타낸다. RX3-CT 융합 단백질로부터 해리된 pCT는 기준으로 합성 연어 CT를 이용하는 TOF-MALDI에 의해 단편 3 (Tr = 13 분)에서 발견되었다.
도 11은 (A) 합성 연어 CT (MW = 3433.24) 및 (B) Tr = 13분에서 RP-HPLC 분류로부터 추출된 식물 CT (MW = 3491.93)의 TOF-MALDI 질량분광계 특성의 결과를 나타낸다.
<110> ERA BIOTECH,S.A. <120> Production of products of interest by accumulation in endoplasmic reticulum-derived protein bodies <150> ES200201508 <151> 2002-06-28 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 672 <212> DNA <213> Zea mays <400> 1 atgagggtgt tgctcgttgc cctcgctctc ctggctctcg ctgcgagcgc cacctccacg 60 catacaagcg gcggctgcgg ctgccagcca ccgccgccgg ttcatctacc gccgccggtg 120 catctgccac ctccggttca cctgccacct ccggtgcatc tcccaccgcc ggtccacctg 180 ccgccgccgg tccacctgcc accgccggtc catgtgccgc cgccggttca tctgccgccg 240 ccaccatgcc actaccctac tcaaccgccc cggcctcagc ctcatcccca gccacaccca 300 tgcccgtgcc aacagccgca tccaagcccg tgccagctgc agggaacctg cggcgttggc 360 agcaccccga tcctgggcca gtgcgtcgag tttctgaggc atcagtgcag cccgacggcg 420 acgccctact gctcgcctca gtgccagtcg ttgcggcagc agtgttgcca gcagctcagg 480 caggtggagc cgcagcaccg gtaccaggcg atcttcggct tggtcctcca gtccatcctg 540 cagcagcagc cgcaaagcgg ccaggtcgcg gggctgttgg cggcgcagat agcgcagcaa 600 ctgacggcga tgtgcggcct gcagcagccg actccatgcc cctacgctgc 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10 Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser 1 5 10 15 Ala Thr Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Cys Gly Cys Gln Cys His Tyr 20 25 30 Pro Thr Gln Pro Pro Arg Pro Gln Pro His Pro Gln Pro His Pro Cys 35 40 45 Pro Cys Gln Gln Pro His Pro Ser Pro Cys Gln Tyr 50 55 60

Claims (38)

  1. 단백질 γ-zein을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 1 핵산 서열, 또는 식물 세포의 소포체를(ER) 향하여 단백질을 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 그 단편과;
    효소적 또는 화학적 수단에 의해 특이적으로 절단가능한 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 2 핵산 서열; 및
    관심있는 산물을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 3 핵산 서열;을 포함하며,
    상기 제 1 핵산 서열의 3'말단은 상기 제 2 핵산 서열의 5'말단에 연결되고 상기 제 2 핵산 서열의 3'말단은 상기 제 3 핵산 서열의 5'말단에 연결된 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 핵산 서열은 전체 길이 γ-zein 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 핵산 서열은 단백질 γ-zein의 반복(repeat) 영역 전체 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 누클레오티드 서열들;
    단백질 γ-zein의 ProX 영역 전체 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 누클레오티드 서열들; 또는
    단백질 γ-zein의 반복(repeat) 영역 전체 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 누클레오티드 서열들 및 단백질 γ-zein의 ProX 영역 전체 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 누클레오티드 서열들; 을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 핵산 서열은 다음의 그룹
    서열번호 1에 나타난 누클레오티드 서열 [ γ-zein 을 암호화하는 누클레오티드 서열(도1A)],
    서열번호 2에 나타난 누클레오티드 서열[ RX3로 식별되는 누클레오티드 서열(도 1B)],
    서열번호 3에 나타난 누클레오티드 서열[ R3 로 식별되는 누클레오티드 서열 (도 1B)],
    서열번호 4에 나타난 누클레오티드 서열[ P4 로 식별되는 누클레오티드 서열 (도 1C)], 및
    서열번호 5에 나타난 누클레오티드 서열[ X10 로 식별되는 누클레오티드 서열 (도 1C)] 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  5. 제 1항 내지 4항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 제 2 핵산 서열은 프로테아제 절단 부위를 규정하는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 프로테아제는 엔터로키나아제, Arg-C 엔도프로티아제, Glu-C 엔도프로티아제, Lys-C 엔도프로티아제 또는 Xa 인자인 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  7. 제 1항 내지 4항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 제 2 핵산 서열은 화학 약제에 의해 특이적으로 절단 가능한 아미노산을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 화학 약제는 시아노젠 브로마이드(cyanogen bromide)인 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 관심있는 산물은 단백질성 약인 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 단백질성 약은 펩티드 호르몬 또는 인터페론이고, 상기 약은 인간 또는 동물체의 치료에 효과적인 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 펩티드 호르몬은 칼시토닌, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴 및 성장 호르몬으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 제 3핵산 서열은 칼시토닌을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 칼시토닌을 암호화하는 상기 핵산 서열의 3'말단에 글리신에 대한 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  13. 융합 단백질은,
    (ⅰ) 상기 단백질 γ-zein의 아미노산 서열, 또는 식물 세포의 ER쪽으로 단백질을 지시하고 유지할 수 있는 그 단편;
    (ⅱ) 효소적 또는 화학적 수단에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 아미노산 서열; 및
    (ⅲ) 관심있는 산물을 포함하며,
    상기 융합 단백질은 숙주 식물 시스템에서 제 1항 내지 제 12항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열의 발현 산물인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 전체 길이 γ-zein 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 도 1A 에서 보여지고 서열번호 6에서 식별된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 γ-zein 단백질의 단편을 포함하고, 상기 단편은 식물 세포의 ER쪽으로 단백질을 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 융합 단백질은
    서열번호 7에 나타난 아미노산 서열 [RX3에 해당하는 아미노산 서열(도 1B)],
    서열번호 8에 나타난 아미노산 서열 [R3 에 해당하는 아미노산 서열(도 1B)],
    서열번호 9에 나타난 아미노산 서열 [P4 에 해당하는 아미노산 서열(도 1C)], 및
    서열번호 10에 나타난 아미노산 서열 [ X10 에 해당하는 아미노산 서열 (도1C)];로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 γ-zein 단백질의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  18. 제 13항에 있어서,
    효소적 수단에 의해 특이적으로 절단가능한 상기 아미노산 서열은 포로테아제 절단 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  19. 제 13항에 있어서,
    화학적 수단에 의해 특이적으로 절단가능한 상기 아미노산 서열은 화학 약제에 의해 절단가능한 절단 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  20. 제 13항에 있어서,
    상기 관심있는 산물은 단백질성 약인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  21. (i) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 하나의 항에 있어서의 핵산 및
    (ii) 본 발명(i)의 핵산의 전사를 조절하는 조절성 누클레오티드 서열을 포함하며, 상기 조절성 서열(ii)은 식물들에서 기능적인 것을 특징으로 하는 핵산 구성체.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 조절성 서열(ii)은 조직특이적인 것을 특징으로 하는 구성체.
  23. 제 21항에 있어서,
    상기 조절성 서열(ii)은 식물체에서 기능적인 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 구성체.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 조절성 서열(ii)은 프로모터 35SCaMV, "패타티나"(patatina) 프로모터, 저장 단백질 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitine) 유전자 프로모터 또는 상기 γ-zein 유전자의 조절성 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 구성체.
  25. 제 21항에 있어서,
    상기 조절성 서열(ii)은 식물들에서 기능적인 전사종결 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구성체.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 조절성 서열(ii)은 터미네이터 35SCaMV, 옥토파인 합성효소(ocs) 유전자의 터미네이터, 노팔린 합성효소(nopaline synthase) (nos) 유전자의 터미네이터 또는 γ-zein 유전자의 터미네이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 구성체.
  27. 제 21항에 있어서,
    상기 조절성 서열(ii)은 식물체에서 기능적인 번역 인핸서(translation enhancer)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 구성체.
  28. 제 27항에 있어서,
    식물체에서 기능적인 상기 번역 인핸서는 토마토 etch 바이러스 등의 전사를 위한 프로모팅 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구성체.
  29. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 하나의 항에 있어서의 핵산 서열, 또는 제 21항 내지 제 28항 중 어느 하나의 항에 있어서의 핵산 구성체를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  30. 형질전환된 식물 숙주 시스템으로서, 상기 식물 숙주 시스템은 제 1항 내지 제 12항 중 어느 하나의 항에 있어서의 핵산 서열, 또는 제 21항 내지 제 28항 중 어느 하나의 항에 있어서의 핵산 구성체, 또는 제 29항에 있어서의 벡터로 형질전환되고 있는 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물 숙주 시스템.
  31. 트랜스제닉 식물 숙주 시스템으로서, 상기 트랜스제닉 식물 숙주 시스템은 그 게놈 내에 통합되어 있는 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 있어서의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물 숙주 시스템.
  32. 제 30항 또는 제 31항에 있어서,
    상기 식물 숙주 시스템은 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물 숙주 시스템.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 식물 숙주 시스템은 곡류, 콩류, 평짓과 또는 가지과인 것을 특징으로 하는 식물 숙주 시스템.
  34. 제 30항 또는 제 31항에 있어서,
    상기 식물 숙주 시스템은 씨앗을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 숙주 시스템.
  35. 제 30항 내지 제 34항 중 어느 하나의 항에 있어서의 융합 단백질 형태의 상기 관심있는 산물의 발현 및 생산을 허용하는 조건들 하에서 형질전환된 또는 트랜스제닉한 식물 숙주 시스템을 성장시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 숙주 시스템 내의 관심있는 산물의 생산방법.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 융합 단백질을 분리 및 정제시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 숙주 시스템내의 관심있는 산물의 생산방법.
  37. 제 35항 또는 제 36항에 있어서,
    상기 융합 단백질로부터 상기 관심있는 산물을 해리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 숙주 시스템내의 관심있는 산물의 생산방법.
  38. a) 단백질 γ-zein을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 1핵산 서열, 또는 식물세포의 소포체 (ER)쪽으로 단백질을 지시하고 유지할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 그 단편;
    효소적 또는 화학적 수단에 의해 특이적으로 절단가능한 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 2핵산 서열;및
    칼시토닌을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 3핵산 서열;로 이루어지고, 여기서 상기 제 1 핵산 서열의 3'말단은 상기 제 2핵산 서열의 5'말단에 연결되고 상기 제 2핵산 서열의 3'말단은 상기 제 3핵산 서열의 5'말단에 연결되는 핵산 서열(본 발명의 핵산 서열)의 전사를 위한 조절성 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 핵산 구성체로 식물 숙주 시스템을 형질전환시키는 단계;
    b) 상기 발현 벡터 또는 핵산 구성체로 형질전환된 상기 식물 숙주 시스템으로부터 완전한 식물들을 생성하는 단계;
    c) 융합 단백질 형태의 상기 칼시토닌의 발현 및 생산을 허용하는 조건들 하에서 그러한 형질전환된 식물들을 성장시키는 단계; 및, 바람직하게는
    d) 상기 융합 단백질을 분리 및 정제하고 칼시토닌을 해리하기 위해 상기 융합 단백질을 처리하는 단계;
    를 포함하는 식물 숙주 시스템에서의 칼시토닌 생산방법.
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