CN100460510C - 通过在植物内质网衍生蛋白质体中的累积而生产肽和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

公开了一种核酸分子，它包含：第一核酸序列，它包含编码γ-玉米醇溶蛋白、或其能够将蛋白质指导和滞留进植物细胞内质网(ER)的片段的核苷酸序列；第二核酸序列，它包含编码能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列的核苷酸序列；第三核酸序列，它包含编码目的肽或蛋白质的核苷酸序列。还公开了将该核酸分子用于转化宿主植物细胞并生产目的肽或蛋白质的方法。

Description

通过在植物内质网衍生蛋白质体中的累积而生产肽和蛋白质
发明领域
本发明涉及：目的肽和蛋白质通过其在内质网衍生蛋白质体中的累积而实现的在宿主系统植物中的生产，编码这样的产物的核酸、以及所述核酸在制备用于转化宿主植物系统的构建体和载体中的用途。特异公开了在植物中表达和分离异源目的产物，例如降钙素(CT)，的方法。
发明背景
由于基因组知识和相关生物医学研究中的显著进步，预计对于生物制药学的需求将会大大提高，因此人们对努力制造低成本的重组生产系统相当有兴趣。
生产生物药物的植物遗传工程相对来说是比较新的，因为其它的转基因系统包括细菌、真菌和培养的哺乳动物细胞已经被广泛并长期的用于生物生产。不过，一些利用植物表达系统的重组治疗性蛋白质已进入市场或者处在人类临床试验的不同阶段，例如治疗血栓形成的抗凝血剂水蛭素(Parmenter等人，1995)、针对龋齿的嵌合IgG-IgA疫苗(Ma等人，1998)、针对大肠杆菌肠产毒性菌株的一种细菌vaccinogen(Haq等人，1995)、以及用于治疗囊性纤维化的重组犬胃脂肪酶(Bénicourt等人，1993)。
由于重组蛋白的表达水平可以通过利用植物用来将宿主蛋白质靶向细胞器的天生分类和靶向机制而得到提高，使得植物表达系统颇具吸引力。此外，植物衍生的生物制药易于被放大到大量生产，并且具有降低由病原体或毒素引起的健康风险的优势。
植物由于其以低生产成本和降低的健康风险来提供无限量的生物活性物质的潜力，越来越成为一种引人注目的表达系统。植物积累高水平重组蛋白质的能力以及完成大部分转录后加工的能力使它们被看作重组治疗剂分子农业的生物反应器(综述参见Fischer和Emans，2000)。然而，对于以商业化为目的的以植物为基础的生产的可行性来说，有关作物物种选择、组织选择、表达和恢复策略以及转录后加工的重要决策是起决定性作用的(Cramer等人，1999)。
重组蛋白质的亚细胞靶向对于这样的蛋白质在植物中的高水平积累和正确组装折叠是一个需要考虑的重要事项。宿主蛋白质向细胞内储存细胞器的区室化通常是通过利用适宜的信号肽或完整蛋白质融合体来实现的。多种重组治疗性蛋白质已经被靶向以下植物区室：质外体空间(McCormick等人，1999)、叶绿体(Staub等人，2000)、内质网(ER)(Stoger等人，2000)。指向转基因植物中ER区室的免疫球蛋白已经显示出比其指向其它区室例如质外体或胞质溶胶时高10～100倍的产量(Conrad和Fiedler，1998)。
ER区室中的复杂蛋白质例如抗体的靶向尤其令人感兴趣，因为大部分为获得有功能产物所必需的转录后加工都在ER中发生(Düring等人，1990；Ma和Hein，1995；Conrad和Fiedler，1998)。事实上，在ER内，信号肽被切割，应激蛋白例如结合型IgG蛋白(BiP)和酶例如二硫键异构酶(PDI)，作为侣伴蛋白与未装配蛋白质结合并指导随后的折叠和装配。除了这些特殊的特征之外，现有的证据指示，植物ER是高度可变的，这使得它成为异源药物蛋白质的理想贮器。即使ER似乎是分泌途径的入口，它也能短期或长期地储存蛋白质。植物以特定的贮藏蛋白质形式长期储存氨基酸。一种保护这些贮藏蛋白免于不受控制的过早降解的机制是将它们保藏进称作蛋白质体(PB)的ER衍生贮藏细胞器(综述见，Müntz，1998)。这样的作为重组蛋白质在ER腔中的简单积累的细胞器的装配需要宿主蛋白质的滞留作用作为第一步。分泌蛋白质被正确折叠并装配进ER后，主要经高尔基器的加工会有各种细胞目的地。然而，可溶性有运输能力的蛋白质的ER滞留可由羧基末端滞留/挽回信号KDEL(或HDEL)(Munro等人，1987；Wandelt等人，1992；Vitale等人，1993)诱导。这一在高尔基器中由跨膜受体识别的保守 C-末端基序，允许将逃逸的ER定居蛋白重新循环回到ER(Vitale和Denecke，1999；Yamamoto等人，2001)。为了在植物ER中被稳定累积，已经用KDEL信号延长了许多重组抗体片段(Verch等人，1998；Torres等人，1999)。在ER区室中产生重组蛋白滞留和累积的另一替代途径是创造适当的与天然ER常驻成员例如种子贮藏蛋白质的融合体。
WO 01/75312公开了在植物宿主系统中生产细胞因子的方法，其中所述的植物宿主系统已经用编码所述细胞因子的嵌合核酸序列转化，所述嵌合核酸序列含有能够在所述植物系统中调控第二核酸序列转录的第一核酸序列，其中所述第二核酸序列编码按阅读框与编码细胞因子的第三核酸序列相连的信号序列，以及按阅读框与所述第三核酸序列3′末端相连的、编码“KDEL”氨基酸序列的第四核酸序列。
玉米醇溶蛋白是一组在玉米胚乳发育过程中合成的蛋白质，并且根据它们的可溶性可被分成α、β、γ和δ四组。玉米醇溶蛋白可以直接在ER中凝集成PB。已经公开了植物或植物组织，其含有被表达为全长玉米醇溶蛋白蛋白质与可操作性连接的蛋白质物质的融合蛋白的瘤胃(rumin)稳定的蛋白质体(WO 00/40738)。
γ-玉米醇溶蛋白，一种玉米贮藏蛋白，是四种玉米醇溶蛋白之一，并占玉米胚乳总蛋白质的10-15％。如同其它的谷醇溶蛋白，α和γ玉米醇溶蛋白是在位于粗糙ER细胞质一侧的膜结合多核糖体中生物合成的，在腔内装配，之后被隔离进入ER-衍生PB(Herman和Larkins，1999，Ludevid等人，1984，Torrent等人，1986)。γ-玉米醇溶蛋白由四种特征结构域构成：i)19个氨基酸的肽信号，ii)包含八个六肽PPPVHL单位的重复结构域(53 aa)，iii)脯氨酸残基与其它氨基酸交替出现的proX结构域(29 aa)和iv)疏水的富半胱氨酸C-末端结构域(111aa)。γ-玉米醇溶蛋白在ER-衍生PB中装配的能力不限于种子。事实上，当γ-玉米醇溶蛋白基因在转基因拟南芥中被组成型表达时，贮藏蛋白在叶片叶肉细胞中的ER-衍生PB内累积(Geli等人，1994)。为寻找负责将γ-玉米醇溶蛋白沉积在ER-衍生PB中的信号(谷醇溶蛋白不带KDEL信号)，已经证实，包括串连重复结构域的富脯氨酸N-末端结构域是ER滞留所必需的，并且C-末端结构域参与PB形成。然而，这些结构域通过何种机制促进PB的装配仍然是未知的。
降钙素(CT)，一种32氨基酸的激素肽，是正确的钙代谢所必需的，并已广泛临床应用于骨质疏松、高血钙休克和Paget′s病的治疗(Reginster等人，1993；Azria等人，1995；Silverman等人，1997)。人CT以带有一个25氨基酸信号肽和位于N-和C-末端的两个前肽(分别为57aa和21aa)的前原蛋白质(preproprotein)合成。最终的活性肽长32个氨基酸带有二硫桥(Cys1-Cys7)，并在羧基末端被酰胺化。在体外，人CT发生凝集从而限制了其作为治疗剂的有效性。因此，通常替代使用较不易凝集的鲑鱼CT(Cudd等人，1995)。CT目前是通过化学合成生产的，但是这样生产的成本促使一些研究小组去开发替代的方法。已经在大肠杆菌(Ray等人，1993；Hong等人，2000)、小鼠垂体细胞(Merli等人，1996)、非内分泌细胞系Cos-7和CHO(Takahashi等人，1997)、以及最近在转基因兔的乳汁中(McKee等人，1998)生产了人和鲑鱼CT。通过生物技术方法生产具有生物活性的降钙素需要至少两个加工步骤：i)产生甘氨酸-延长的降钙素(Bradbury等人，1988)，和ii)通过酰胺化酶，肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)的作用形成羧基末端脯氨酰胺(prolinamide)(Eipper等人，1992)。由于目前仍然未知在植物细胞中是否发生羧基酰胺化，因此用PAM酶对植物甘氨酸-延长的降钙素的体外酰胺化提供C-末端酰胺(Ray等人，1993)。
发明概述
本发明要解决的问题是为在植物宿主系统中生产目的肽和蛋白质提供替代系统。
本文所提供的解决方案是以γ-玉米醇溶蛋白富脯氨酸结构域在宿主植物系统中自我装配并赋予融合蛋白稳定性的能力为基础的。利用基于γ-玉米醇溶蛋白融合蛋白的系统在宿主系统植物中累积目的产物创建了在植物ER-衍生PB中累积所述目的产物的成功途径。
本发明在实施例中得到举例说明，其中描述了一种以融合蛋白为基础在ER-衍生PB中累积重组CT的系统。通过可切割的蛋白酶位点从γ-玉米醇溶蛋白工程化了各种富脯氨酸结构域以用作融合配偶体。成熟降钙素编码区域在γ-玉米醇溶蛋白结构域C-末端融合，并在转基因烟草植物中表达。融合蛋白累积于烟草植物叶片的ER-衍生PB中。纯化后，将融合蛋白用肠激酶切割从而容许降钙素释放。
因此，本发明的一个方面涉及一个核酸序列，它含有(i)编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白的核苷酸序列或其片段，该片段包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在内质网的氨基酸序列的核苷酸序列；(ii)编码能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列的核苷酸序列；和(iii)编码目的产物的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列之间可操作性连接。
另一方面，本发明涉及含有所述核酸序列的核酸构建体。
在更进一步的方面，本发明涉及包含所述序列或构建体的载体以及用所述载体转化的细胞。
在更进一步的方面，本发明涉及带有所述核酸序列、构建体或载体的转化的植物宿主系统。
在更进一步的方面，本发明涉及在其基因组中整合了所述核酸序列的转基因植物宿主系统。
在更进一步的方面，本发明涉及在植物宿主系统中生产目的产物的方法。
在更进一步的方面，本发明涉及在植物宿主系统中生产降钙素的方法。
在更进一步的方面，本发明涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白具有对应于上述核酸序列的氨基酸序列。
附图简述
附图1显示，γ-玉米醇溶蛋白的核苷酸序列和翻译(附图1.A)以及γ-玉米醇溶蛋白衍生物RX3(附图1.B，上)，R3(附图1.B，下)、P4(附图1.C，上)和X10(附图1.C，下)。
附图2显示，合成降钙素(CT)的核苷酸序列(道2)和翻译(道1)。这一合成CT基因是用植物偏爱密码子构建的。相对于野生型鲑鱼CT基因的密码子修饰以下划线标示(道3)。该合成基因在5′末端包含了一个对应于肠激酶切割位点(EK)的接头序列，并在3′延伸以产生单个C-末端甘氨酸。
附图3显示，pCRX3CT质粒构建的示意图。所给出的过程与以下质粒的获得相似：pCZeinCT、pCR3CT、pCP4CT和pCX10CT，它们的区别在于所导入的相应的γ-玉米醇溶蛋白或γ-玉米醇溶蛋白衍生序列。不同的质粒不是按比例描绘的。
附图4显示，质粒pBZeinCT、pBRX3CT、pBR3CT、pBP4CT和pBX10CT的示意图。不同的质粒不是按比例描绘的。
附图5显示，不同融合蛋白的示意图。γ-玉米醇溶蛋白和γ-玉米醇溶蛋白衍生结构域(RX3、R3、P4和X10)通过肠激酶切割位点(EK)与降钙素(CT)融合。SP，信号肽；REPEAT，重复结构域(PPPVHL)八个单位；R1，一个重复单位；Pro-X，脯氨酸-Xaa；PX，Pro-X结构域的片段；C-term，富半胱氨酸C-末端结构域；N，成熟蛋白质的N-末端序列。各融合蛋白的氨基酸数目在右侧标出。
附图6显示，利用γ-玉米醇溶蛋白抗血清对转基因烟草植物中融合蛋白的免疫印迹分析结果。从野生型(WT)和转基因烟草(To)叶片中提取可溶性蛋白，在15％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶(每泳道20μg)中分离并转移至硝酸纤维素膜。数字表示获得不同嵌合基因γ-玉米醇溶蛋白-CT、RX3-CT、R3-CT、P4-CT的不同转基因系。
附图7显示：A.用CT抗血清做的不同重组融合蛋白质的比较性蛋白质印迹分析。从野生型(WT)植株和具有相关嵌合基因的最大融合蛋白表达的转基因烟草系(T1)制备可溶性蛋白提取物。将8μg可溶性蛋白质载样到15％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并转移至硝酸纤维素膜。B.不同嵌合基因转录物的比较性RNA印迹分析。总RNA分离自经免疫印迹分析的转基因系(附图7A)，在变性甲酰胺凝胶电泳上分离(每泳道30μg)，并毛细管印迹至尼龙膜上。印迹用获自降钙素cDNA的随机引物探针(129碱基)杂交。
附图8显示，RX3-CT和P4-CT蛋白质在转基因烟草植株中的亚细胞定位：(A)用CT抗血清(1∶100稀释)做的RX3-CT蛋白质在RX3-CT转基因系中的免疫定位。(B)用CT抗血清(1∶100稀释)做的P4-CT蛋白质在P4-CT转基因系中的免疫定位。(C)用γ-玉米醇溶蛋白抗血清(1∶1.500稀释)做的RX3-CT蛋白质在RX3-CT转基因系中的免疫定位。(D)用BiP抗血清(1∶250稀释)做的BiP蛋白质在RX3-CT转基因系中的免疫定位。(E)用γ-玉米醇溶蛋白抗血清(1∶1.500稀释)做的在野生型植株中的免疫定位。血清。(F)RX3-CT转基因植株中不带一级抗体(1∶1.500稀释)的免疫定位。用标明的一级抗体和蛋白质A胶体金(15nm)完成对烟草叶片切片的免疫细胞化学。cw：细胞壁；ch：叶绿体；pb：蛋白质体；v：液泡。
附图9显示，RX3-CT和P4-CT融合蛋白EK切割的免疫印迹分析结果。将12μg经部分纯化的各融合蛋白与0.2U EK在20℃孵育24小时。18％ Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳分离被消化的融合蛋白并将其转移至硝酸纤维素膜。泳道1，未经消化的融合蛋白(1μg)；泳道2，消化产物；泳道3，合成鲑鱼CT标准。
附图10显示，经EK消化的RX3-CT融合蛋白的RP-HPLC分级分离结果。以合成鲑鱼CT作为标准，用TOF-MALDI在级分3(Tr＝13分钟)中检测到从RX3-CT融合蛋白释放的pCT。
附图11显示，(A)合成鲑鱼CT(MW＝3433.24)和(B)在Tr＝13分钟处从RP-HPLC分级分离中洗脱的植物CT(MW＝3491.93)，的TOF-MALDI质谱分析特征结果。
发明详述
本发明第一方面提供核酸序列，下文称作本发明的核酸序列，含有：
第一核酸序列，它包含编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白的核苷酸序列或其片段，该片段包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在内质网(ER)的氨基酸序列的核苷酸序列；
第二核酸序列，它包含编码能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列的核苷酸序列；和
第三核酸序列，它包含编码目的产物的核苷酸序列；
其中所述第一核酸序列的3′末端与所述第二核酸序列的5′末端连接，所述第二核酸序列的3′末端与所述第三核酸序列的5′末端连接。
第一核酸序列包含编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白的核苷酸序列或其片段，该片段包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在内质网(ER)的氨基酸序列的核苷酸序列。
本文所用的术语“γ-玉米醇溶蛋白”指由在前述发明背景部分提及的四个特征结构域构成的玉米贮藏蛋白质。所述术语包括天然的γ-玉米醇溶蛋白蛋白质，以及能够将蛋白质指导入和滞留在内质网(ER)的它的变体和重组γ-玉米醇溶蛋白蛋白质。
在实践中，可以使用任何编码γ-玉米醇溶蛋白蛋白质的核苷酸序列、或其包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在ER的氨基酸序列的核苷酸序列。
因此，在优选实施方式中，第一核酸序列包含编码全长γ-玉米醇溶蛋白蛋白质的核苷酸序列。在特定实施方式中，编码全长γ-玉米醇溶蛋白蛋白质的核苷酸序列示于附图1A，并被鉴定为SEQ ID NO：1。
在另一优选实施方式中，第一核酸序列包含编码γ-玉米醇溶蛋白蛋白质片段的核苷酸序列，所述片段包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在ER的氨基酸序列的核苷酸序列。在这种情况中，第一核酸序列可以包含：
-  编码γ-玉米醇溶蛋白全部或部分重复结构域的一个或多个核苷酸序列；
-  编码γ-玉米醇溶蛋白全部或部分ProX结构域的一个或多个核苷酸序列；或
-  编码γ-玉米醇溶蛋白全部或部分重复结构域的一个或多个核苷酸序列，和编码γ-玉米醇溶蛋白全部或部分ProX结构域的一个或多个核苷酸序列。
在特定实施方式中，所述第一核酸序列包含编码γ-玉米醇溶蛋白蛋白质片段的核苷酸序列，所述片段包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在ER的氨基酸序列的核苷酸序列，选自下组：
-  示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列[鉴定为RX3的核苷酸序列(附图1B)]，
-  示于SEQ ID NO：3的核苷酸序列[鉴定为R3的核苷酸序列(附图1B)]，
-  示于SEQ ID NO：4的核苷酸序列[鉴定为P4的核苷酸序列(附图1C)]，和
-  示于SEQ ID NO：5的核苷酸序列[鉴定为X10的核苷酸序列(附图1C)]。
第二核酸序列包含编码能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列的核苷酸序列。在特定实施方式中，所述第二核酸序列含有编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列，例如，可被蛋白酶例如肠激酶、Arg-C内切蛋白酶、Glu-C内切蛋白酶、Lys-C内切蛋白酶、Xa因子等切割的氨基酸切割位点。
作为选择，第二核酸序列含有编码能被化学试剂特异性切割的氨基酸的核苷酸序列，例如，切割甲硫氨酸残基的溴化氰，或者任何其它适宜的化学试剂。
第二核酸序列可以作为所述第一核酸序列和所述第三核酸序列联合的结果来产生。在这种情况下，各序列以以下方式包含许多核苷酸：当所述第一与第三核酸序列连接时就形成了编码能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列的功能性核苷酸序列，即第二核酸序列。在另一种替代实施方式中，第二核酸序列是可操作性插入到所述第一和第三核酸序列之间的外源序列。
第三核酸序列包含编码目的产物的核苷酸序列。原则上，任何目的产物都可以被本发明所提供的系统表达。在一种优选实施方式中，目的产物是一种蛋白质(即，蛋白质或肽)药物，例如，肽激素，比如降钙素、促红细胞生成素、血小板生成素、生长激素及类似、干扰素，即应答病毒感染所产生的并在免疫应答中作为细胞因子的蛋白质，等。优选地，所述治疗性目的产物对人或动物体的治疗有效。
在特定实施方式中，第三核酸序列含有编码降钙素(CT)，例如人降钙素(hCT)或鲑鱼降钙素(sCT)，的核苷酸序列。通常，在这种情况下，优选所述第三核酸序列在所述编码降钙素的核酸序列的3′末端包括甘氨酸密码子从而形成甘氨酸-延长的降钙素。
根据本发明，所述第一核酸序列的3′末端与所述第二核酸序列的5′末端连接，所述第二核酸序列的3′末端与所述第三核酸序列的5′末端连接，即，所述第一、第二和第三核酸序列按阅读框连接。
本发明的核酸序列可以通过本领域技术人员已知的常规技术获得。一般，所述技术涉及将本发明核酸序列的不同片段连接进适宜的载体。在例如Sambrook等人所著的“Molecular cloning，aLaboratory Manual”，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989中可以找到所述常规技术的综述。实施例中公开了一些包含本发明核酸的载体的构建，并图示于附图3和4中。如本文所示，通过可切割的蛋白酶位点从γ-玉米醇溶蛋白工程化了各种富脯氨酸结构域用作融合配偶体。成熟降钙素编码区域在γ-玉米醇溶蛋白结构域C-末端融合，并在转基因烟草植株中表达。融合蛋白累积于烟草植物叶片的ER-衍生PB中。纯化后，将融合蛋白用肠激酶切割从而容许降钙素释放，可以通过反相层析从消化混合物中进一步纯化降钙素。
另一方面，本发明提供融合蛋白质，下文中称作本发明的融合蛋白，含有(i)γ-玉米醇溶蛋白的蛋白质氨基酸序列，或其能够将蛋白质指导入和滞留在ER的片段，(ii)能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列，和(iii)目的产物；所述融合蛋白是本发明核酸序列在宿主植物系统中的表达产物。
本发明的融合蛋白在宿主植物系统中累积在稳定的ER-衍生PB中。存在于γ-玉米醇溶蛋白结构域C-末端的酶或化学可切割位点允许随后回收目的产物。之后可以通过常规方法分离和纯化目的产物。因此，本发明的融合蛋白构成了累积目的产物的新的成功途径。
在一种实施方式中，本发明的融合蛋白含有全长γ-玉米醇溶蛋白蛋白质。全长γ-玉米醇溶蛋白的特定氨基酸序列示于附图1A并在SEQID NO：6中鉴定。
在另一种实施方式中，本发明的融合蛋白含有γ-玉米醇溶蛋白蛋白质的片段，所述片段包含能够将蛋白质指导入并滞留在ER中的氨基酸序列。在特定实施方式中，本发明的融合蛋白含有选自下组的γ-玉米醇溶蛋白蛋白质片段：
-  示于SEQ ID NO：7的氨基酸序列[对应于RX3的氨基酸序列(附图1B)]，
-  示于SEQ ID NO：8的氨基酸序列[对应于R3的氨基酸序列(附图1B)]，
-  示于SEQ ID NO：9的氨基酸序列[对应于P4的氨基酸序列(附图1C)]，和
-  示于SEQ ID NO：10的氨基酸序列[对应于X10的氨基酸序列(附图1C)]。
本发明的融合蛋白包含可被酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列。在特定实施方式中，所述的可切割位点包括蛋白酶切割位点，例如，可被蛋白酶例如肠激酶、Arg-C内切蛋白酶、Glu-C内切蛋白酶、Lys-C内切蛋白酶、Xa因子及类似切割的氨基酸切割位点，可被化学试剂切割的氨基酸位点，例如，切割甲硫氨酸残基的溴化氰，或者任何其它适宜的化学试剂。
本发明的融合蛋白还包含目的产物，例如，蛋白质(即，蛋白质或肽)药物，比如肽激素、干扰素、及类似。优选地，所述目的产物对治疗人或动物体有效。在特定实施方式中，本发明的融合蛋白包含降钙素(CT)，例如，可选择的甘氨酸-延长的人降钙素(hCT)或鲑鱼降钙素(sCT)。
在更进一步的方面，本发明提供核酸构建体，它含有(i)本发明的核酸序列，和(ii)调控本发明核酸序列(i)转录的调控核苷酸序列，所述调控序列(ii)是在植物中有功能的。所述核酸序列可操作性连接。
实践中，可以使用任何的植物功能性调控序列。在一种实施方式中，所述调控序列(ii)优选为组织特异性的，即，它能够调控本发明的核酸在特定组织中的转录，例如种子、叶片、小块茎，等。
调控序列(ii)可以包括在植物中有功能的启动子。事实上，可以使用任何在植物中有功能的启动子。在特定实施方式中，所述调控序列(ii)包括启动子35SCaMV。在其它的特定实施方式中，所述调控序列(ii)包括“patatina”启动子、贮藏蛋白启动子、泛素(ubiquitine)基因启动子、γ-玉米醇溶蛋白基因的调控序列，或类似。
调控序列(ii)还包括转录终止子序列。事实上，可以使用任何在植物中有功能的终止子序列。在特定实施方式中，所述转录终止子序列包括终止子35SCaMV、章鱼碱合酶(ocs)基因的终止子、胭脂碱合酶(nos)基因的终止子、γ-玉米醇溶蛋白基因的终止子，及类似。
调控序列(ii)还可以包括在植物中有功能的翻译增强子。事实上，可以使用任何在植物中有功能的翻译增强子，例如，番茄蚀刻病毒的转录促进序列，及类似。
可将本发明的核酸序列、或本发明提供的构建体插入适宜的载体。因此，在更进一步的方面，本发明提供含有本发明核酸序列或本发明提供的核酸构建体的载体。适宜的载体包括质粒、粘粒和病毒载体。在一种实施方式中，所述载体适合用于转化植物。载体的选择可依赖于随后将被导入载体的宿主细胞。作为例子，导入了本发明核酸序列的载体可以是质粒、粘粒或病毒载体，当这些载体被导入宿主细胞后，它们整合进入所述宿主细胞的基因组并随同它们所整合进的单个染色体(或多个染色体)一起复制。可以用常规方法获得所述载体(Sambrook等人，1989)。
在更进一步的方面，本发明提供植物宿主系统，所述植物宿主系统已经用本发明的核酸、或本发明提供的构建体或载体转化。
如本文所使用的，术语“植物宿主系统”包括，包括但不限于，单子叶植物、双子叶植物、以及特别是谷类作物(例如，玉米、水稻、燕麦，等)、豆类(例如，大豆等)、十字花科植物(例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、colza，等)或茄属植物(例如，土豆、番茄、烟草，等)。植物宿主系统也包括植物细胞。植物细胞包括悬浮培养物、胚、merstematic region、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。植物宿主系统可以处于成熟的各个阶段，可以在罐子、温室或田地的液体或固体、或土壤或适宜培养基中生长。植物宿主系统中的表达可以是瞬时的或永久的。植物宿主系统还指这样的植物的任一克隆、种子、自体或杂合后代、由有性或无性方式产生的繁殖体、以及这些之中任一的派生物，例如切割物或种子。
可以用常规方法实施植物宿主系统的转化。对植物的遗传转移综述可以参见Marta Izquierdo所著、标题为“Ingenieria genéticaand transferencia génica”的教科书，Ed.Pirámide(1999)，特别是，第九章，“Transferencia génica a plantas”，第283-316页。
在更进一步的方面，本发明提供经过工程化而包含新的、实验室设计的转基因的转基因植物宿主系统，所述转基因植物宿主系统包含整合进其基因组的本发明的核酸。所述转基因植物宿主系统可通过常规方法获得，例如，通过使用常规反义mRNA技术和/或过表达(在有义沉默的情况下)或其它，例如，通过利用双元载体或其它对于当前所使用的不同植物转化技术来说可以获得的载体。本发明提供的转基因植物宿主系统的例子包括单子叶植物和双子叶植物两者，以及具体地包括谷类作物、豆类、十字花科植物、茄属植物，等。
本发明的核酸序列对于在植物宿主系统中生产目的产物有用。因此，在更进一步的方面，本发明提供在植物宿主系统中生产目的产物的方法，它包括使本发明提供的转化或转基因植物宿主系统在允许所述目的产物以融合蛋白形式生产或表达的条件下生长。如上所提及的，所述融合蛋白在宿主植物系统中累积在稳定的ER-衍生PB中。存在于γ-玉米醇溶蛋白结构域C-末端的酶或化学可切割位点允许后来回收目的产物。之后可以通过常规方法分离和纯化目的产物。因此，由当前发明所提供的方法进一步包括，如果想要的话，所述融合蛋白的分离和纯化，以及，可选择地，所述目的产物从所述融合蛋白的释放。如果合适，融合蛋白在切割位点被适宜的酶或化学试剂切割。
在更进一步的方面，本发明提供在宿主植物系统中生产降钙素的方法，包括：
a)用含有核酸序列(本发明核酸序列)的转录调控序列的表达载体或核酸构建体转化植物宿主系统，所述核酸序列(本发明核酸序列)由以下组成：
第一核酸序列，它包含编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白的核苷酸序列或其片段，该片段包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在内质网(ER)的氨基酸序列的核苷酸序列；
第二核酸序列，它包含编码能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列的核苷酸序列；和
第三核酸序列，它包含编码降钙素的核苷酸序列；
其中所述第一核酸序列的3′末端与所述第二核酸序列的5′末端连接，所述第二核酸序列的3′末端与所述第三核酸序列的5′末端连接；
b)从用所述表达载体或核酸构建体转化的所述植物宿主系统产生完整植株；
c)使这样的转化植株在允许降钙素以融合蛋白形式生产或表达的条件下生长；以及，如果想要的话，
d)分离、纯化所述融合蛋白并处理所述融合蛋白以释放降钙素。
因此，本发明提供以融合蛋白为基础的系统以在植物宿主系统中的ER-衍生PB内累积重组目的产物。本发明将通过以下非限制性实施例得到进一步阐述。
实施例1
在烟草植株中生产降钙素
以下描述了在烟草中生产CT的一个成功例子。通过可切割的蛋白酶位点从γ-玉米醇溶蛋白工程化了各种富脯氨酸结构域。成熟降钙素编码区域在γ-玉米醇溶蛋白结构域C-末端融合，并在转基因烟草植株中表达。在γ-玉米醇溶蛋白结构域C-末端导入了可切割的蛋白酶位点以在之后回收纯化的降钙素。该方法在烟草植株中提供了融合蛋白在ER内的高度累积以及ER-衍生PB的形成。融合蛋白高度累积在烟草叶片的ER-衍生PB中。所述融合蛋白的表达水平，在一些情况下，达到了总可溶性蛋白质的12.44％。仅经两个纯化步骤后，将融合蛋白用肠激酶切割以释放降钙素。通过反相层析从消化混合物中得到了纯降钙素。累积在烟草植株中的降钙素产物经过了质谱法验证。还给出了融合蛋白的纯化、蛋白酶消化以及所释放的植物降钙素(pCT)的充分表征。
I.试验程序
嵌合基因和载体的构建
将野生型γ-玉米醇溶蛋白基因、以及四条命名为RX3、R3、P4和X10的编码不同γ-玉米醇溶蛋白结构域的γ-玉米醇溶蛋白衍生序列(附图1A，1B和1C)与包含肠激酶消化位点的合成CT基因融合(附图2)，并导入如下述以及附图3所示的植物转化载体。
以pKSG2(Torrent等人，1994)作模板，用PCR产生了γ-玉米醇溶蛋白、RX3和R3cDNA序列。X10 cDNA扩增自pDR20，pDR20是一个删除了对应于重复结构域的序列后从pKSG2形成的质粒。不同的PCR所用的引物是：
对于γ-玉米醇溶蛋白cDNA序列：
T1：5′TCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTC3′，和
T4：5′CCATGGCGTGGGGGACACCGCCGGC3′，
对于RX3和X10 cDNA序列：
T1和
T2：5′CCATGGTCTGGCACGGGCTTGGATGCGG 3′，和
对于R3 cDNA序列：
T1和
T3：5′CCATGGTCCGGGGCGGTTGAGTAGGGTA3′。
将PCR产物亚克隆进pUC18载体(SureClone Ligation Kit，Pharmacia)，并将所得的质粒命名为pUCZein、pUCRX3、pUCR3和pUCX10。在pUCRX3衍生克隆的筛选过程中得到了包含γ-玉米醇溶蛋白衍生序列P4的载体pUCP4(附图1C)。将包含BspHI和NcoI粘性末端的γ-玉米醇溶蛋白、RX3、R3、P4和X10 cDNA片段插入已经事先用NcoI消化的载体pCKGFPS65C(Reichel等人，1996)。之所以选择这一载体，是因为它含有植物表达调控序列和GFP编码序列，该GFP编码序列将用于转基因植物中γ-玉米醇溶蛋白衍生蛋白质的平行靶向研究。所产生的载体pCZeinGFP、pCRX3GFP、pCR3GFP、pCP4GFP和pCX10GFP包含了以下用于植物表达系统的调控序列：i)衍生自花椰菜花叶病毒的增强35S启动子(CaMVp35S)，ii)来自番茄蚀刻病毒(TL)的翻译增强子和iii)来自CaMV35S(pA35S)的转录终止子序列。如下述用CT合成基因替代GFP编码序列产生了γ-玉米醇溶蛋白衍生的/CT嵌合构建体(参见附图3)。
从两条122碱基的互补寡核苷酸产生了编码活性鲑鱼CT的32氨基酸(附图2)的合成基因。该寡核苷酸设计成使用植物偏爱密码子以达到在植物中的高表达。用Applied Biosystems 394 DNA合成仪合成的5′磷酸(phosphorilated)化寡核苷酸具有以下序列：
Ca1I：
5′CATGGACGACGACGACAAGTGCTCCAACCTCTCTACCTGCGTTCTTGGTAAGCTCTCT
CAGGAGCTTCACAAGCTCCAGACTTACCCTAGAACCAACACTGGTTCCGGTACCCCTGGT
TGAT3′，
Ca1II：
5′CTAGATCAACCAGGGGTACCGGAACCAGTGTTGGTTCTAGGGTAAGTCTGGAGCTTGT
GAAGCTCCTGAGAGAGCTTACCAAGAACGCAGGTAGAGAGGTTGGAGCACTTGTCGTCGT
CGTC3′。
在12％聚丙烯酰胺凝胶上纯化后，用60pmole各寡核苷酸形成双链分子。加热至95℃ 5分钟的杂交混合物在70℃下保持一小时，并冷却至室温。合成的cDNA片段分别在5′和3′末端包含NcoI和Xba I粘性末端。合成的CT cDNA包括对应于肠激酶特异切割位点((Asp)4-Lys)的5′接头序列，并在3′末端延长以产生用于CT肽进一步酰胺化的单个甘氨酸。将NcoI/XbaI CT cDNA亚克隆进pUC 18载体，之后插入到包含了衍生的γ-玉米醇溶蛋白编码序列的载体pCZeinGFP、pCRX3GFP、pCR3GFP、pCP4GFP和pCX10GFP的NcoI和BamHI限制性位点中，并删除了GFP编码序列。将所得到的构建体命名为pCZeinCT、pCRX3CT、pCR3CT、pCP4CT和pCX10CT(附图3)。将不同的HindIII/HindIII表达盒插入双元载体pBin19(Bevan，1984)最终得到了有效的植物转化载体pBZeinCT、pBRX3CT、pBR3CT、pBP4CT和pBX10CT(附图4)。
稳定的烟草植株转化
将双元载体转移进土壤根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA 4404菌株。根据Draper等人(1988)的方法转化烟草(Nicotiana tobaccum，W38)叶盘。在含有200mg/L卡那霉素的培养基上选择再生植物，并将其移入温室。种植具有最高转基因产物水平的转基因烟草植株以得到T1代。收获生长中的叶片(约12cm长)，立即用液氮冷冻，并保存于-80℃以用于进一步的试验。
重组蛋白质的提取和蛋白质印迹分析
在液氮中研磨烟草叶片，并且每克新鲜叶片材料用4ml提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8，200mM二硫苏糖醇(DTT)和蛋白酶抑制剂(10μM抑蛋白酶肽，1μM抑胃酶肽，100μM亮抑酶肽，100μM苯甲基磺酰氟和100μM E64[(N-(N-(L-3-反式-羧基环氧乙烷-2-羰基)-L亮氨酰)-精胺(agmantine))匀浆。匀浆物在4℃搅拌30分钟，之后离心(15000rpm 30分钟，4℃)两次以除去不溶物质。用Bradford蛋白质分析(Bio-Rad)对总可溶性蛋白质进行了定量。蛋白质在15％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离并用半干设备转移至硝酸纤维素膜(0.22μM)。将膜与γ-玉米醇溶蛋白抗血清(稀释1/7000)(Ludevid等人，1985)或针对KLH-降钙素产生的抗血清(CT-抗血清)(稀释1/1000)孵育，之后与辣根过氧化物酶耦联抗体(稀释1/10000)孵育。通过增强的化学发光检测免疫反应条带(ECL蛋白质印迹系统，Amersham)。对兔接种耦联了KLH的合成鲑鱼降钙素以在兔中产生降钙素抗体。抗原接种四次后(各200μg)，收集血清，等量分装并保存在-80℃。通过利用合成降钙素的免疫斑点印迹和用BSA-降钙素作抗原的ELISA检测完成了血清滴定。
RNA印迹分析
根据Logemann等人，1987，从野生型和转基因烟草(T1)叶片中分离总RNA。将RNA在变性甲酰胺琼脂糖凝胶电泳上分级分离(30μg每泳道)，并毛细管印迹到尼龙膜(Hybond N，AmershamPharmacia Biotech)上。将RNA印迹与129碱基DNA探针杂交，该探针获自CT cDNA并已经用随机引物DNA标记试剂盒(Roche)标记上了(α-32P)dCTP。42℃杂交过夜，65℃下将滤膜在3X SSC和0.5％SDS(W/V)中洗涤三次15分钟。用phosphorImager扫描仪(Fluor-STM MultiImager，BIO-RAD)对印迹进行检测。
ELISA检测
对可溶性叶片蛋白质提取物以及经过部分纯化的γ-玉米醇溶蛋白-CT融合蛋白做ELISA检测以定量植物降钙素(pCT)。将稀释于磷酸缓冲盐pH 7.5(PBS)中的可溶性蛋白质(100μl)加到微量滴定板(MaxiSorp，Nalgene Nunc International)中，4℃孵育过夜。将板孔洗涤三次后，于室温下用PBS-T(PBS含有0.1％ Tween 20)中的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点一小时。将板与CT抗血清(稀释1/1000)孵育两小时，用PBS-T洗涤四次后，与过氧化物酶耦联的二级抗体(稀释1/8000)(Sigma)孵育两小时。一级和二级抗体稀释于含1％ BSA的PBS-T中。用PBS-T充分洗涤后，于37℃用100μl底物缓冲液(100mM醋酸钠pH 6，0.01mg/ml TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)和0.01％过氧化氢)完成酶促反应。10分钟后用2N硫酸终止反应，用Multiskan EX分光光度计(Labsystems)测定450nm处的光密度。从用降钙素-BSA和CT抗血清(稀释1/1000)得到的标准曲线外推得到植物提取物中的抗原浓度。
电子显微术
室温下，用20mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中的1％戊二醛和2.5％多聚甲醛通过真空渗滤将野生型和转基因植株的叶片固定一小时。样品用20mM磷酸缓冲液和200mM氯化铵连续洗涤后，经乙醇梯度脱水，并包埋于Lowicryl K4M树脂中。基本上根据Moore等人，1991所描述的完成了免疫化学。将超薄切片与针对KLH-降钙素(1/500)、αBiP(1/500)和γ-玉米醇溶蛋白(1/1500)的抗血清孵育。将蛋白质A-胶体金(15nm的金颗粒)用于抗体检测。作为对照，对非转基因样品用相同稀释比例的一级抗体、以及对转基因植株不用一级抗体，进行平行孵育。切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并用型号301电子显微镜检查(Phillips，Eindhoven，TheNetherlans)。
RX3-CT和P4-CT融合蛋白的纯化和肠激酶切割
如上所述在提取缓液中从转基因烟草植株(T1)叶片获得RX3-CT和P4-CT的可溶性提取物。0℃下，向RX3-CT和P4-CT可溶性提取物中加入固体(NH4)2SO4分别至45％和60％的饱和度。样品在0℃下搅拌30分钟，之后于4℃在15000rpm离心45分钟。将沉淀的蛋白质重悬于20mM Tris-HCl pH 8.6，并在PD10柱(Sephadex G-25 M，Amersham Pharmacia)上除去盐分。脱盐蛋白质提取物用已用20mMTris-HCl pH 8.6、100mM DTT平衡的离子交换柱(HiTrap Qsepharose，Amersham Pharmacia)经快速液相层析(FPLC)分级分离。用20mM Tris-HCl pH 8.6、100mM DTT中的0至200mM NaCl线性盐梯度完成蛋白质洗脱。根据15％ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和利用CT抗血清的免疫印迹检测来评估洗脱级分中RX3-CT和P4-CT的存在。将阳性级分脱盐并用5K NMWL离心滤器(BIOMAX，Millipore)浓缩。用ELISA完成RX3-CT和P4-CT融合蛋白的定量。
为进行EK消化，将15μg部分纯化的融合蛋白与0.2U EK(EKMax，Invitrogen)在30μl消化缓冲液(50mM Tris-HCl pH8，1mM NaCl，0.1％ Tween-20)中20℃孵育24小时。EK消化缓冲液中补加了100mM DTT。还原剂的存在可以优化肠激酶切割。消化产物在18％ Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳上分析，并用免疫印迹检测释放的pCT。用合成的鲑鱼CT作为阳性对照。
所释放的pCT的纯化和分析
通过EK消化而从融合蛋白释放的植物降钙素(pCT)经RP-HPLC纯化。将消化产物应用于分析型RP-C18柱(250×4mm，10μM颗粒大小，
Figure C02829375D00311
孔大小)，并用含0.036％ TFA的25至60％乙腈梯度在20分钟内以1ml/min的流速对柱进行洗脱。用冻干法将所收集的级分浓缩，并保存在-20℃用于pCT表征。在另外的试验中，在相同层析条件下对标准鲑鱼CT进行洗脱。用TOF-MALDI质谱分析法表征pCT。将RP-HPLC级分等分量与等体积基质溶液混合(10mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸和0.1％ TFA)，将1μl该混合物置于容器中，并用Voyager-DE-RP质谱仪(Applied Biosystems)分析。始终用标准鲑鱼CT在TOF-MALDI质谱分析试验中作对照。通过将纯化的肽(20pmoles/μl)与羧肽酶Y(0.1U/μl)在37℃下孵育60分钟、并用TOF-MALDI质谱法分析消化产物，完成了对pCT的C-末端分析。
II.结果
几种衍生的γ-玉米醇溶蛋白-CT嵌合基因的构建
γ-玉米醇溶蛋白富脯氨酸结构域的表达和向植物叶片ER-衍生蛋白质体中的成功装配(Geli等人，1994)为在植物组织ER中累积治疗性蛋白质提供了一个有价值的工具。制造γ-玉米醇溶蛋白基因缺失，以创造为在烟草植株中产生CT而用作融合配偶体的各种富脯氨酸截短蛋白质。该嵌合基因含有通过对应于蛋白酶切割位点的接头连接的γ-玉米醇溶蛋白结构域和CT合成基因。从两条(122碱基)为在植物中达到重组肽蛋白质的高表达而被设计成使用植物偏爱密码子的互补寡核苷酸产生了编码活性鲑鱼CT 32氨基酸(附图2)的合成基因。合成的CT cDNA(附图2)在5′末端包括对应于肠激酶切割位点((Asp)4-Lys)的接头序列，在3′末端包括附加的密码子以产生甘氨酸。该甘氨酸是酰胺化酶(PAM)产生CT生物活性所必需的C-末端脯氨酰胺的必需底物。降钙素cDNA以C-末端融合与编码γ-玉米醇溶蛋白结构域的序列融合。为了优化衍生的γ-玉米醇溶蛋白-CT嵌合基因在植物系统中的表达，植物转化载体包含了以下调控序列：i)来自花椰菜花叶病毒的组成型增强35S启动子(CaMVp35S)和35S终止子，ii)来自番茄蚀刻病毒(TL)的翻译增强子。所产生的不同融合蛋白示于附图5。γ-玉米醇溶蛋白-CT融合蛋白包含与CT融合的完整γ-玉米醇溶蛋白。RX3-CT、R3-CT、P4-CT和X10-CT融合蛋白包含以与完整γ-玉米醇溶蛋白相同的方式与CT连接的衍生的γ-玉米醇溶蛋白结构域。这些融合蛋白的基本区别在于带或不带重复和proX结构域。
融合蛋白在烟草植株中生产
将所有的融合基因经土壤根瘤农杆菌用于烟草植株的稳定转化。对于各融合基因再生了至少二十株独立的卡那霉素抗性植株(To)。用γ-玉米醇溶蛋白多克隆抗血清对可溶性蛋白质提取物做蛋白质印迹分析来完成转基因植株的筛选。代表各融合基因的转基因系免疫印迹模式示于附图6。正如所观察到的，在所有转基因系中都得到了重组融合蛋白，但是X10-CT融合基因未检测到融合蛋白的痕迹。这个小融合蛋白(80氨基酸)可能在烟草植株中不稳定。在R3-CT转基因系中检测到了两个免疫标记条带，一条具有非典型的高表观分子质量。该融合蛋白可能接受了例如糖基化这样的翻译后修饰。事实上，已经证实γ-玉米醇溶蛋白富脯氨酸重复结构域在拟南芥植株中表达时能被糖基化(Alvarez等人，1998)。除RX3-CT融合基因外，相同融合基因不同系间的蛋白质表达水平非常不同，RX3-CT融合基因在所有转基因系中都表现出高重组蛋白质表达水平。用特异性针对sCT肽的抗血清作了一次附加的免疫印迹筛选(附图7A)。正如所观察到的，RX3-CT和P4-CT蛋白质被sCT抗血清强烈识别，这预示着这些融合体为CT肽在烟草植株中提供了更好的累积。可以注意到，RX3-CT和P4-CT免疫印迹模式显示了多种标记带，主带对应于相关重组蛋白质的正确表观分子质量。一种假说可能是，高分子量的标记条带是融合蛋白在植物组织内累积过程中形成的γ-玉米醇溶蛋白结构域寡聚化过程的结果。为了检查与蛋白质水平相关的融合基因表达水平，用经过附图7A中的免疫印迹分析的转基因系做了比较RNA印迹分析(附图7B)。如所显示的，RX3-CT和P4-CT转录物丰度更高，这证实了这些转录物的稳定累积。令人惊讶的是，R3-CT转录物与由免疫印迹检测到的低R3-CT融合蛋白水平相比是相对丰富的。有可能转录后修饰使融合蛋白避开了其正确的自我装配以及其随后在ER中的稳定性。
对T1植株叶片蛋白质提取物的ELISA所测定的RX3-CT和P4-CT蛋白质的最大表达水平，分别是总可溶性蛋白质的12.44％和10.65％，而γ-玉米醇溶蛋白-CT和R3-CT表达水平保持在低至总可溶性蛋白质的0.01％的水平。根据这些结果，选择了RX3-CT和P4-CT转基因系用于进一步的试验以有利于降钙素(pCT)生产。
融合蛋白RX3-CT和P4-CT的亚细胞定位
γ-玉米醇溶蛋白和两种γ-玉米醇溶蛋白缺失突变体在拟南芥植株中的表达证实了，这些蛋白质定位在叶肉细胞ER内，形成ER-衍生PB(Geli等人，1994)。然而，不明显的是，与γ-玉米醇溶蛋白衍生物融合的降钙素是否被分拣到类似的细胞器ER-PB中。为检查含有降钙素的γ-玉米醇溶蛋白融合蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位，本发明人使用了免疫电子显微术(附图8)。将表达RX3-CT和P4-CT蛋白质的转基因烟草叶片超薄切片，与CT抗体和蛋白质A-金孵育。在表达RX3-CT和P4-CT的烟草叶肉细胞中观察到了一个大的PB-类似细胞器被强烈标记(分别为附图8A和B)。每个细胞检测到了少数小泡，它们的大小非常不同。由于融合蛋白包含降钙素蛋白质和γ-玉米醇溶蛋白片段，还将超薄切片与γ-玉米醇溶蛋白抗体孵育。正如所预计的，PB被γ-玉米醇溶蛋白抗体标记，这证实了在这些细胞器中所累积的融合蛋白(附图8C)。为了证实PB是从ER形成的，将切片与针对ER常驻蛋白BiP的抗体孵育(附图8D)。CT-融合蛋白和BiP在这些细胞器中的相伴出现指示了，RX3-CT和P4-CT在ER腔中累积以形成进一步独立的ER-衍生的小泡。由于本发明人不能够在非转基因植株超薄切片中检测到PB-类似的细胞器(附图8E)，不用一级抗体而在转基因植株中完成了对照试验(附图8F)。正如所预计的，在对照试验中没有检测到特异性标记。
融合蛋白的纯化和pCT的释放
用包含还原试剂例如DTT(200mM)的提取缓冲液从转基因烟草叶片(T1)中有效提取了RX3-CT和P4-CT融合蛋白。每克新鲜材料大约回收了85μg RX3-CT和73μg P4-CT。RX3-CT和P4-CT蛋白质分别经45％和60％硫酸铵沉淀浓缩。用离子交换层析经FPLC分级分离脱盐蛋白质，回收的融合蛋白用ELISA定量。RX3-CT蛋白质占总纯化蛋白质约80％，而P4-CT仅占总纯化蛋白质约50％。这样的差异可以通过这样一个事实来解释：60％硫酸铵比45％能沉淀更多的蛋白质，由此所沉淀的P4-CT蛋白质中包含更多的污染蛋白质。经部分纯化的融合蛋白RX3-CT和P4-CT用EK消化，并用Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫检测控制pCT释放。如附图9所示，从RX3-CT和P4-CT蛋白质切割都产生了对应于降钙素的单个标记条带。少量融合蛋白RX3-CT和P4-CT保持未被切割，这可能是由于酶不能接近这些切割位点。
pCT的纯化和表征
通过EK消化混合物在分析型C18 RP-HPLC柱(附图10)上的分级分离、以及通过TOF-MALDI质谱法以合成sCT为标准(MW3433.24，附图11.A)对洗脱级分所作的分析分离了植物降钙素(pCT)。pCT降钙素在13分钟(合成sCT Tr＝14分钟)被洗脱，并由TOF-MALDI质谱法给出了质量为3491.93 Da的单一谱，这与还原的、C-末端甘氨酸-延长的降钙素的理论分子质量一致(附图11B)。对经过羧肽酶Y消化的pCT的质谱分析证实了产生C-末端脯氨酰胺所必需的C-末端甘氨酸的完整性。
III.讨论
给出了一个在烟草植株中累积鲑鱼降钙素的以融合蛋白为基础的成功系统。发现两种融合蛋白RX3-Ca1和P4-Ca1在烟草叶片的ER-衍生PB中高度累积。这些融合蛋白包含CT肽和γ-玉米醇溶蛋白的富脯氨酸结构域，这些结构域包括：i)由八个单位的六肽PPPVHL(在P4-Cal融合蛋白中仅有一个单位)组成的重复结构域，和ii)脯氨酸残基与其它氨基酸交替出现于其中的proX结构域。γ-玉米醇溶蛋白富脯氨酸结构域对于γ-玉米醇溶蛋白在拟南芥植物ER中的正确滞留和装配是必需的(Geli等人，1994)。γ-玉米醇溶蛋白多肽链在ER中的折叠和稳定性已经被归因于重复结构域和proX结构域自我装配并促进寡聚体形成的能力。这些高度疏水结构域所采用的特定构象可以归因于能够形成两性二级结构的富脯氨酸序列。作为其正确构象的结果，该富脯氨酸结构域将诱导涉及蛋白质-蛋白质相互作用和二硫键交联的凝集机制，这一凝集机制有利于ER滞留和ER-衍生PB的形成。该实施例显示，当以N-末端融合形式表达时，γ-玉米醇溶蛋白富脯氨酸结构域保留自我装配并促进导致ER-衍生PB中的滞留和累积的复杂事件的完整能力。发现参与融合蛋白的鲑鱼CT也大量累积于PB中。CT在转基因植株中的高表达水平可以归因于富脯氨酸结构域折叠并稳定融合蛋白的能力。融合蛋白在PB中的沉积，通过将CT从水解性的细胞内环境中移出，当然促成了CT在植物组织中的富集。由于小肽在生物系统中是不稳定的，因此该融合蛋白方法目前已经用于在异源系统中生产降钙素，例如在大肠杆菌中(Ray等人，1993；Yabuta等人，1995；Hong等人，2000)、在Staphylococcus carnosus中(Dilsen等人，2000)以及在转基因兔的乳汁中(Mckee等人，1998)。在最后一种情况中，CT与人α乳白蛋白的融合体还带有掩盖降钙素活性的目的以避免对正常动物发育的可能干扰。
发明人从烟草植株成功地快速生产了甘氨酸-延长的sCT：
i)由于RX3-Ca1和P4-Ca1融合蛋白在还原试剂存在下的高可溶性，因此从烟草组织有效回收了RX3-Ca1和P4-Ca1融合蛋白，
ii)经离子交换层析一步纯化融合蛋白后，实现了降钙素从融合蛋白的肠激酶释放，和
iii)用反向层析通过将CT从EK消化混合物中移出而产生了纯化的CT。
对所释放的CT所作的质谱分析证实，从烟草植株产生了正确的甘氨酸-延长的CT。
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                               序列表
<110>Advanced in vitro Cell Technologies，S.L.
<120>通过在植物内质网衍生蛋白质体中的累积而生产肽和蛋白质
<160>10
<210>1
<211>672
<212>DNA
<213>玉蜀黍
<400>1
Figure C02829375D00441
<210>2
<211>339
<212>DNA
<213>玉蜀黍
<400>2
Figure C02829375D00442
<210>3
<211>276
<212>DNA
<213>玉蜀黍
<400>3
Figure C02829375D00451
<210>4
<211>213
<212>DNA
<213>玉蜀黍
<400>4
Figure C02829375D00452
<210>5
<211>180
<212>DNA
<213>玉蜀黍
<400>5
Figure C02829375D00453
<210>6
<211>224
<212>PRT
<213>玉蜀黍
<400>6
Figure C02829375D00454
Figure C02829375D00461
<210>7
<211>113
<212>PRT
<213>玉蜀黍
<400>7
Figure C02829375D00471
<210>8
<211>92
<212>PRT
<213>玉蜀黍
<400>8
Figure C02829375D00481
<210>9
<211>71
<212>PRT
<213>玉蜀黍
<400>9
<210>10
<211>60
<212>PRT
<213>玉蜀黍
<400>10

Claims (38)

1.核酸序列，含有：
第一核酸序列，它包含编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白的核苷酸序列或其片段，该片段包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在植物细胞内质网中的氨基酸序列的核苷酸序列；
第二核酸序列，它包含编码能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列的核苷酸序列；和
第三核酸序列，它包含编码目的产物的核苷酸序列；
其中所述第一核酸序列的3′末端与所述第二核酸序列的5′末端连接，且所述第二核酸序列的3′末端与所述第三核酸序列的5′末端连接。
2.根据权利要求1的核酸序列，其中所述第一核酸序列包括编码全长γ-玉米醇溶蛋白蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求1的核酸序列，其中所述第一核酸序列包括：
-编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白全部或部分重复结构域的一个或多个核苷酸序列；
-编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白全部或部分ProX结构域的一个或多个核苷酸序列；或
-编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白全部或部分重复结构域的一个或多个核苷酸序列，和编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白全部或部分ProX结构域的一个或多个核苷酸序列。
4.根据权利要求1的核酸序列，其中所述第一核酸序列选自下组：
-示于SEQ ID NO：1的核苷酸序列，
-示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列，
-示于SEQ ID NO：3的核苷酸序列，
-示于SEQ ID NO：4的核苷酸序列，和
-示于SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
5.根据权利要求1～4中任一项的核酸序列，其中所述第二核酸序列包含编码定义蛋白酶切割位点的氨基酸序列的核苷酸序列。
6.根据权利要求5的核酸序列，其中所述蛋白酶是肠激酶、Arg-C内切蛋白酶、Glu-C内切蛋白酶、Lys-C内切蛋白酶或Xa因子。
7.根据权利要求1～4中任一项的核酸序列，其中所述第二核酸序列包含编码可被化学试剂特异性切割的氨基酸的核苷酸序列。
8.根据权利要求7的核酸序列，其中所述化学试剂是溴化氰。
9.根据权利要求1～4中任一项的核酸序列，其中所述目的产物是蛋白质药物。
10.根据权利要求9的核酸序列，其中所述蛋白质药物是肽激素或干扰素，所述药物对治疗人或动物体有效。
11.根据权利要求10的核酸序列，其中所述肽激素选自降钙素、促红细胞生成素、血小板生成素和生长激素。
12.根据权利要求1的核酸序列，其中所述第三核酸序列含有编码降钙素的核苷酸序列，并且在编码降钙素的所述核酸序列3′末端含有甘氨酸密码子。
13.融合蛋白，含有：
(i)蛋白质γ-玉米醇溶蛋白的氨基酸序列，或其能够将蛋白质指导入和滞留在植物细胞内质网中的片段，
(ii)能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列，和
(iii)目的产物；
所述融合蛋白是权利要求1～12任一项的核酸序列在宿主植物系统中的表达产物。
14.根据权利要求13的融合蛋白，它含有全长γ-玉米醇溶蛋白蛋白质。
15.根据权利要求14的融合蛋白，它含有如附图1A所示并在SEQ ID NO：6中鉴定的氨基酸序列。
16.根据权利要求13的融合蛋白，它含有γ-玉米醇溶蛋白蛋白质的片段，所述片段包含能够将蛋白质指导入并滞留在植物细胞内质网中的氨基酸序列。
17.根据权利要求16的融合蛋白，它含有选自下组的γ-玉米醇溶蛋白蛋白质的片段：
-示于SEQ ID NO：7的氨基酸序列，
-示于SEQ ID NO：8的氨基酸序列，
-示于SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和
-示于SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
18.根据权利要求13的融合蛋白，其中可经酶手段特异性切割的所述氨基酸序列含有蛋白酶切割位点。
19.根据权利要求13的融合蛋白，其中可经化学手段特异性切割的所述氨基酸序列含有可被化学试剂切割的切割位点。
20.根据权利要求13的融合蛋白，其中所述目的产物是蛋白质药物。
21.核酸构建体，含有：(i)根据权利要求1至12任一项的核酸序列，和(ii)调控本发明核酸(i)转录的调控核苷酸序列，所述调控序列(ii)是在植物中有功能的。
22.根据权利要求21的构建体，其中所述调控序列(ii)是组织特异性的。
23.根据权利要求21的构建体，其中所述调控序列(ii)包含在植物中有功能的启动子。
24.根据权利要求22的构建体，其中所述调控序列(ii)包括启动子35SCaMV、“patatina”启动子、贮藏蛋白启动子、泛素基因启动子或γ-玉米醇溶蛋白基因的调控序列。
25.根据权利要求21的构建体，其中所述调控序列(ii)包含在植物中有功能的转录终止序列。
26.根据权利要求25的构建体，其中所述调控序列(ii)包含终止子35SCaMV、章鱼碱合酶基因的终止子、胭脂碱合酶基因的终止子或γ-玉米醇溶蛋白基因的终止子。
27.根据权利要求21的构建体，其中所述调控序列(ii)进一步包含在植物中有功能的翻译增强子。
28.根据权利要求27的构建体，其中所述在植物中有功能的翻译增强子包括番茄蚀刻病毒的转录促进序列。
29.含有根据权利要求1至12任一项的核酸序列、或根据权利要求21至28任一项的核酸构建体的载体。
30.转化的植物细胞，所述植物细胞已经用根据权利要求1至12任一项的核酸序列、或用根据权利要求21至28任一项的核酸构建体、或用根据权利要求29的载体转化。
31.转基因植物细胞，所述转基因植物细胞含有整合进其基因组的根据权利要求1至13之中任一项的核酸序列。
32.根据权利要求30或31的植物细胞，其中所述植物细胞是单子叶植物或双子叶植物的细胞。
33.根据权利要求32的植物细胞，其中所述植物细胞是谷类作物、豆类、十字花科植物或茄属植物的细胞。
34.在植物宿主系统中生产目的产物的方法，它包括使根据权利要求30～34中任一项的经转化的或转基因植物细胞在允许所述目的产物以融合蛋白形式生产和表达的条件下生长。
35.根据权利要求34的方法，它进一步包括所述融合蛋白的分离和纯化。
36.根据权利要求34或35的方法，它进一步包括所述目的产物从所述融合蛋白的释放。
37.在植物宿主系统中生产降钙素的方法，它包括：
a)用含有核酸序列的转录调控序列的表达载体或核酸构建体转
化植物宿主系统，所述核酸序列由以下组成：
第一核酸序列，它包含编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白的核苷酸序列或其片段，该片段包含编码能够将蛋白质指导入和滞留在植物细胞内质网中的氨基酸序列的核苷酸序列；
第二核酸序列，它包含编码能经酶或化学手段特异性切割的氨基酸序列的核苷酸序列；和
第三核酸序列，它包含编码降钙素的核苷酸序列；
其中所述第一核酸序列的3′末端与所述第二核酸序列的5′末端连接，且所述第二核酸序列的3′末端与所述第三核酸序列的5′末端连接；
b)从用所述表达载体或核酸构建体转化的所述植物宿主系统产生完整植株；和
c)使这样的转化植株在允许降钙素以融合蛋白形式生产和表达的条件下生长。
38.根据权利要求37的方法，其还包括步骤：
d)分离、纯化所述融合蛋白并处理所述融合蛋白以释放降钙素。
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