JP5517309B2 - コラーゲン生産植物及びその作成方法及びその使用 - Google Patents
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Description
構築及び形質転換スキーム
本研究で使用された発現カセットの構築は図1a−dに示されている。本研究におけるコード配列のすべては、タバコ中での発現のために最適化され、望ましいフランキング領域(配列番号1,4,7,12,14,16,18,20,22)を有するように化学的に合成された。図1a:液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル(配列番号7によってコードされる)に融合された又はシグナルなしのCol1及びCol2(配列番号1,4)をコードする合成遺伝子は、キクrbcS1プロモーター及び5′UTR(配列番号10)並びにキクrbcS1 3′UTR及びターミネーター(配列番号11)からなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットはpBINPLUS植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた(van Engelenら、1995年、Transgenic Res 4:288−290)。図1b:液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル(配列番号7によってコードされる)に融合された又はシグナルなしのP4Hベータヒト、P4Hアルファヒト及びP4H植物(配列番号12,14及び16)をコードする合成遺伝子は、ベクターpJD330によって担持されるCaMV 35Sプロモーター及びTMVオメガ配列及びアグロバクテリウムノパリン合成酵素(NOS)ターミネーターからなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットは、Col1又はCol2の発現ベクターを担持するpBINPLUSベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図1c:液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル(配列番号7によってコードされる)に融合されたプロテイナーゼC及びプロテイナーゼN(配列番号18,20)をコードする合成遺伝子は、キクrbcS1プロモーター及び5′UTR(配列番号10)並びにキクrbcS1 3′UTR及びターミネーター(配列番号11)からなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットはpBINPLUS植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図1d:液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル(配列番号7によってコードされる)に融合された又はシグナルなしのLH3(配列番号22)をコードする合成遺伝子(フランキングイチゴツル結合ウイルス(SVBV)プロモーター(NCBIアクセッションAF331666 REGION:623..950バージョンAF331666.1 GI:13345788)を有しかつアグロバクテリウムオクトピン合成酵素(OCS)ターミネーター(NCBIアクセッションZ37515 REGION:1344..1538バージョンZ37515.1 GI:886843)で末端停止されている)は、Col1及びP4Hベータの発現カセットを担持するpBINPLUSベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。
植物コラーゲン発現
以下の表1に提示されるタンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド配列が設計され、タバコ植物中での発現のために最適化された。
(i)チオールプロテアーゼアレウレイン(aleurain)前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列(NCBIアクセッションP05167 GI:113603)
(ii)アラビドプシスタリアーナのエンド1,4−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナル(Cel1、NCBIアクセッションCAA67156.1 GI:2440033);配列番号9、配列番号7によってコードされる
植物発現ベクターは実施例1に教示されるようにして構築された。それぞれの構築された発現ベクターの組成は制限酵素分析及び配列決定を介して確認された。
1.コラーゲンアルファ1
2.コラーゲンアルファ1+ヒトP4Hベータサブユニット
3.コラーゲンアルファ1+ヒトP4Hベータサブユニット+ヒトLH3
4.コラーゲンアルファ2
5.コラーゲンアルファ2+ヒトP4Hアルファサブユニット
6.コラーゲンアルファ2+アラビドプシスP4H
7.ヒトP4Hベータサブユニット+ヒトLH3
8.ヒトP4Hアルファサブユニット
上述のコード配列のそれぞれは、液胞輸送ペプチドもしくはアポプラスト輸送ペプチドに翻訳的に融合されたか、又はいかなる輸送ペプチド配列も欠いており、その場合、細胞質蓄積が期待される。
タバコ植物(ニコチアーナ・タバクム、Samsun NN)は、図2に教示される形質転換スキームに従って上述の発現ベクターで形質転換された。
トランスジェニックタバコ植物中でのヒトコラーゲンの検出
全可溶性タンパク質は、「完全な」プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics GmbHからの製造#1836145、50mlの緩衝液あたり一錠)を使用して0.5mlの50mM Tris−HCl pH7.5中で500mgの葉を粉砕することによってタバコ形質転換体2,3及び4から抽出された。粗抽出物は、10%ベータ−メルカプト−エタノール及び8%SDSを含む250μlの4Xサンプル適用緩衝液と混合され、サンプルは7分間沸騰され、13000rpmで8分間遠心分離された。20μlの上澄みは10%ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンI(変性)抗体(Chemicon Inc.からの#AB745)を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた(図4)。W.T.は野生型タバコである。陽性コラーゲンバンドは、コラーゲンI型アルファ1又はアルファ2又は両方についてPCR陽性である植物において見ることができる。ヒト胎盤(Chemicon Inc.からの#CC050)からの500ngのコラーゲンI型の陽性コントロールバンドは、トランスジェニック植物からのサンプル中の約0.3%の全可溶性タンパク質(約150μg)を表す。
コラーゲン三重らせん会合及びトランスジェニック植物中での熱安定性
コラーゲン三重らせん会合及びトランスジェニック植物中でのらせん熱安定性は、トランスジェニック植物の全粗タンパク質抽出物の熱変性及び続くトリプシン又はペプシン消化によってテストされた(図6a〜b)。第一の実験では、タバコ2−9(Colアルファ1のみを発現し、P4Hを発現しない)及びタバコ3−5(Colアルファ+2及びP4Hの両方を発現する)からの全可溶性タンパク質は、0.5mlの50mM Tris−HCl pH=7.5中で500mgの葉を粉砕して13000rpmで10分間遠心分離し、上澄みを収集することによって抽出された。50μlの上澄みは熱処理(33℃又は43℃で15分間)に供され、次に直ちに氷上に置かれた。トリプシン消化は、各サンプルに50mM Tris−HCl pH=7.5中の1mg/mlトリプシン6μlを添加することによって開始された。サンプルは室温(約22℃)で20分間インキュベートされた。消化は、10%ベータメルカプトエタノール及び8%SDSを含む20μlの4Xサンプル適用緩衝液の添加によって停止され、サンプルは7分間沸騰され、13000rpmで7分間遠心分離された。50μlの上澄みは10%ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンI抗体(Chemicon Inc.からの#AB745)を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた。陽性コントロールは、w.t.タバコから抽出された50μlの全可溶性タンパク質に添加された約500ngのヒトコラーゲンI(Chemicon Inc.からの#CC050であり、ペプシン消化によってヒト胎盤から抽出されたもの)のサンプルであった。
植物のP4H発現
生来的な植物P4Hの誘導
タバコP4H cDNAは、クローニングされ、内因性P4H発現を誘導する条件及び処理を決定するためのプローブとして使用された。ノーザンブロット分析(図7)は、P4Hは茎頂では比較的高レベルでそして葉では低レベルで発現されることを明らかに示す。P4Hレベルは擦傷処理(下方パネルの「傷つけられた」)の4時間後に葉で有意に誘導された。同様の結果が他のストレス条件を使用して達成された(図示せず)。
トランスジェニックタバコ植物中でのヒトP4Hアルファ及びベータサブユニット及びコラーゲンアルファ1及びアルファ2鎖の検出は、抗ヒトP4Hアルファサブユニット抗体(ICN Biomedicals Inc.からの#63−163)、抗ヒトP4Hベータサブユニット抗体(Chemicon Inc.からの#MAB2701)及び抗コラーゲンI抗体(Chemicon Inc.からの#AB745)を使用して行われた。これらの抗体でプローブされたウェスタンブロットの結果は図8に示される。
配列番号2及び3は、ヒトコラーゲンアルファ1(I)鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号4及び6は、ヒトコラーゲンアルファ2(I)鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号5は、ヒトコラーゲンアルファ2(I)鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号7は、アラビドプシスタリアーナのエンド−1,4−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナルのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号8及び9は、アラビドプシスタリアーナのエンド−1,4−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナル及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号10は、キクrbcS1プロモーター及び5′UTRの配列である。
配列番号11は、キクrbcS1 3′UTR及びターミネーターの配列である。
配列番号12は、ヒトプロリル4−ヒドロキシラーゼベータサブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号13は、ヒトプロリル4−ヒドロキシラーゼベータサブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号14は、ヒトプロリル4−ヒドロキシラーゼアルファ−1サブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号15は、ヒトプロリル4−ヒドロキシラーゼアルファ−1サブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号16は、植物プロリル4−ヒドロキシラーゼに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号17は、植物プロリル4−ヒドロキシラーゼに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号18及び19は、ヒトプロコラーゲンC−プロテイナーゼのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号20及び21は、ヒトプロコラーゲンI N−プロテイナーゼのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号22は、ヒトリシルヒドロキシラーゼ3に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号23は、ヒトリシルヒドロキシラーゼ3に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号24は、チオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列である。
配列番号25〜28は、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの配列である。
Claims (23)
- 植物又は単離された植物細胞中で生産された組み換えI型コラーゲンであって、組み換えI型コラーゲンが、植物又は単離された植物細胞の液胞にコラーゲンアルファ1鎖、コラーゲンアルファ2鎖、外因性プロリル−4−ヒドロキシラーゼ(P4H)及び外因性リシルヒドロキシラーゼ(LH3)を標的化して、前記液胞中の前記P4H及び前記LH3によって前記コラーゲンアルファ1鎖及び前記コラーゲンアルファ2鎖のヒドロキシル化を可能にすることによって生産され、組み換えI型コラーゲンがC末端及び/又はN末端プロペプチドを含む、組み換えI型コラーゲン。
- ウェスタンブロットによってアッセイされた場合に33℃で15分間安定である請求項1に記載の組み換えコラーゲン。
- 前記外因性P4Hは、ヒトのP4Hである請求項1に記載の組み換えコラーゲン。
- 前記コラーゲンは、哺乳類のコラーゲンである請求項1に記載の組み換えコラーゲン。
- 前記哺乳類のコラーゲンは、ヒトのコラーゲンである請求項1に記載の組み換えコラーゲン。
- 組み換えコラーゲンのコラーゲン鎖がGly−X−YトリプレットのY位置でヒドロキシル化されている請求項1に記載の組み換えコラーゲン。
- 前記哺乳類のP4Hは、ヒトのP4Hである請求項3に記載の組み換えコラーゲン。
- 植物又は単離された植物細胞中でコラーゲンを生産する方法であって、少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖及び外因性P4Hを植物又は単離された植物細胞中で発現させ、それにより植物中でコラーゲンを生産させることを含み、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、KDEL配列を欠いており、前記外因性P4Hは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のGly−X−YトリプレットのY位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性P4Hは、ヒトのP4H又はその相同体である、方法。
- 少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及びP4Hをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞であって、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、KDEL配列を欠いており、前記外因性P4Hは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のGly−X−YトリプレットのY位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性P4Hは、ヒトのP4H又はその相同体である、植物又は単離された植物細胞。
- 以下のものを含む植物システム:
(i)コラーゲンアルファ1鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び(ii)P4Hをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝的に改変された植物;及び
(i)コラーゲンアルファ2鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び(ii)P4Hをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝的に改変された植物
ただし、前記コラーゲンアルファ1鎖及びコラーゲンアルファ2鎖のそれぞれは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、KDEL配列を欠いており、前記外因性P4Hは、前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のGly−X−YトリプレットのY位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性P4Hは、ヒトのP4H又はその相同体である。 - (a)請求項10の植物システムを得ること;
(b)前記第一植物と前記第二植物を交配させること;及び
(c)前記コラーゲンアルファ1鎖及び前記コラーゲンアルファ2鎖を発現する子孫を選択し、それによりコラーゲンを生産すること
を含む、請求項8に記載の方法。 - 以下のものを含む植物システム:
(i)コラーゲンアルファ1鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び(ii)コラーゲンアルファ2鎖をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝的に改変された植物;及び
P4Hをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝的に改変された植物
ただし、前記コラーゲンアルファ1鎖及びコラーゲンアルファ2鎖のそれぞれは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、KDEL配列を欠いており、前記外因性P4Hは、前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のGly−X−YトリプレットのY位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性P4Hは、ヒトのP4H又はその相同体である。 - ヒトのP4H及び液胞に標的化するためのシグナルペプチドをコードし、かつKDEL配列を欠いているポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能的なプロモーターの転写制御下に配置されている、核酸構築物。
- 前記コラーゲンは、I型コラーゲンである請求項9に記載の植物又は単離された植物細胞。
- 外因性LH3を発現させることをさらに含む請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ1鎖を含む請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ2鎖を含む請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、C末端及び/又はN末端プロペプチドを含む請求項8に記載の方法。
- 前記植物は、ストレス条件に供される請求項8に記載の方法。
- 前記ストレス条件は、渇水、塩分、傷害、寒さ、及びストレス誘導化合物の噴霧からなる群から選択される請求項19に記載の方法。
- 前記コラーゲンアルファ1鎖及び前記コラーゲンアルファ2鎖のそれぞれは、C末端及び/又はN末端プロペプチドを含む請求項10に記載の方法。
- 外因性LH3を発現させることをさらに含む請求項9に記載の植物又は植物細胞。
- 前記コラーゲンアルファ1鎖の配列は、配列番号1に規定される配列であり、前記コラーゲンアルファ2鎖の配列は、配列番号4に規定される配列である請求項1に記載の組み換えコラーゲン。
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