BRPI0516303B1 - Método de produção de colágeno em planta ou em célula de planta isolada - Google Patents
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Abstract
método de produção de colágeno em planta ou em célula de planta isolada, planta geneticanente modificada ou célula de planta isolada, sistema de planta, método de produção de colágeno fibirilar e construção de ácido nucléico, compreende um método para produzir colágeno em uma planta e plantas para produzir colágeno são estabelecidos; o método é efetuado exprimindo na planta pelo menos um tipo de colágeno da cadeia alfa de maneira a permitir a acumulação de colágeno da cadeia alfa em um compartimento subcelular livre de atividade endógena p4h, por meio disso produzindo o colágeno na planta.
Description
[001] A presente invenção relaciona-se com o colágeno para produzir plantas e métodos para gerar e utilizar o mesmo. Mais particularmente, a presente invenção relaciona-se com o caminho para gerar plantas capaz de produzir altos níveis de cadeias de colágeno hidroxilado os quais são capazes de formar fibras de colágeno naturais de de três linhas espirais tipo 1.
[002] Os colágenos são as principais proteínas estruturais responsáveis pela integridade estrutural dos vertebrados e muitos outros organismos multicelulares. O colágeno tipo 1 representa o colágeno fototípico fibrilar e é o principal tipo de colágeno na maior parte dos tecidos.
[003] O colágeno tipo 1 é um colágeno predominante integrante do osso e tendão e é encontrado em grandes quantidades na pele, aorta e pulmão. As fibras do colágeno tipo 1 fornecem uma grande força elástica e extensibilidade limitada. A maior parte da forma molecular abundante do colágeno tipo 1 é um héterotrímero composto de duas diferentes cadeias alfa [alfal(I)]2 e alfa2(I) (Inkinen, 2003). Todas as moléculas de colágeno fibrilar contém três cadeias de polipeptídeos construídas de uma repetição do trio Gly-X-Y, onde X e Y podem ser qualquer aminoácido mas são frequentemente os iminoácidos prolina e hidroxiprolina.
[004] Os colágenos fibrilares padrões são sintetizados como procolágenos precursores contendo propeptídeos globulares de extensão terminal N- e C-. A biosíntese do procolágeno é um processo complexo que envolve um número de diferentes modificações pós-translacionais incluindo a hidroxilação prolina e lisina, glicosilação N-ligado e O-ligado e ambos formações intra- e inter-cadeias de ligação química de bissulfeto. As enzimas executam estas modificações de forma coordenada para assegurar o desdobramento e reunião de uma molécula tripla-helicoidal corretamente alinhada e termicamente estável.
[005] Cada molécula de procolágeno reúne-se dentro do retículo endoplasmático a partir das três cadeias de polipeptídeo constituinte. Conforme a cadeia de polipeptídeo é deslocada de modo co-translacional transversalmente à membrana do retículo endoplasmático, a hidroxilação dos resíduos de lisina e prolina ,ocorre dentro da região de repetição de Gly-X-Y. Uma vez que a cadeia de polipeptídeo está totalmente deslocada ao lúmen do retículo endoplasmático, o propeptídeo C é multiplicado. Três cadeias pró- alfa então associadas por meio de seus propeptídeos C para formar uma molécula trimérica permitindo que a região de repetição de Gly-X-Y forme um ponto de nucleação em sua extremidade do C-terminal, garantindo o alinhamento correto das cadeias. A região de Gly-X-Y então é multiplicada em uma direção C-para-N para formar um hélice triplo.
[006] A relação temporária entre a modificação da cadeia de polipeptídeo e a formação de hélice tripla é crucial conforme a hidroxilação dos resíduos de prolina é exigida para garantir a estabilidade da hélice tripla na temperatura corporal, uma vez formada, a hélice tripla não mais servirá como um substrato para a enzima de hidroxilação. Os propeptídeos C (e em uma menor medida os propeptídeos N) mantêm o procolágeno solúvel durante sua passagem através da célula (Bulleid et al., 2000). Após ou durante a secreção das moléculas de procolágeno na matriz extracelular, os propeptídeos são removidos pelo procolágeno e proteinases N e C, deste modo ativando a automontagem espontânea das moléculas de colágeno nas fibrilas (Hulmes, 2002). A remoção dos propeptídeos pelo procolágeno e proteinases C e N diminuem a solubilidade do procolágeno em >10000 vezes e é necessário e suficiente iniciar a automontagem do colágeno nas fibras. Crítico para este processo de montagem são os peptídeos não helicoidais triplos curtos denominados telopeptídeos nas extremidades do domínio helicoidal triplo, o que garante o registro correto das moléculas de colágeno dentro da estrutura de fibrila e diminui a concentração crítica para automontagem (Bulleid et al., 2000). Na realidade, a estabilidade da estrutura helicoidal tripla do colágeno exige a hidroxilação de prolinas pela enzima proli1-4-hidroxilase (P4H) para formar resíduos de hidroxiprolina dentro de uma cadeia de colágeno.
[007] As plantas que expressam as cadeias de colágeno são conhecidas na técnica, vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana N° 6.617.431 e (Merle et al., 2002, Ruggiero et al., 2000). Embora as plantas sejam capazes de sintetizar as proteínas que contêm hidroxiprolina, a prolil hidroxilase, que é responsável pela síntese da hidroxiprolina em células de planta, exibe especificidade de seqüência de substrato relativamente livre, conforme comparado com P4H de mamíferos e, deste modo, a produção do colágeno contendo somente hidroxiprolina na posição Y de trios de Gly-X-Y exige a co-expressão de planta do colágeno e genes de P4H (Olsen et al, 2003).
[008] Uma tentativa para produzir colágenos humanos que depende do mecanismo de hidroxilação naturalmente presente nas plantas resultou no colágeno que é deficiente na hidroxilação de prolina (Merle et al., 2002). Tal colágeno derrete ou perde sua estrutura helicoidal tripla em temperaturas abaixo de 302C. A co-expressão do colágeno e prolil-hidroxilase resulta em colágeno hidroxilado estável que é biologicamente relevante para as aplicações em temperaturas corporais (Merle et al., 2002).
[009] A Lisil hidroxilase (LH,EC 1.14.11.4), galactosiltransferase (EC 2.4.1.50) e a glicosiltransferase (EC 2.4.1.66) são enzimas envolvidas nas modificações pós-translacionais dos colágenos. Elas sequencialmente modificam os resíduos de lisil em posições específicas para resíduos de hidroxilisil, galactosilidroxilisil e glicosilgalactosil hidroxilisil. Essas estruturas são exclusivas com relação aos colágenos e essenciais para sua atividade funcional (Wang et al, 2002). Uma única enzima'humana, a lisil hidroxilase 3 (LH3) pode catalisar todas as três etapas consecutivas na hidroxilisina ligada à formação de carboidrato (Wang et al, 2002).
[0010] As hidroxilisinas de um colágeno humano expressas em tabaco formam menos de 2% das hidroxilisinas encontradas em um colágeno bovino (0,04% de resíduos / 1,88% de resíduos). Isto sugere que a Lisil hidroxilase endógeno é incapaz de suficientemente hidroxilar as lisinas no colágeno.
[0011] Ao reduzir a presente invenção para a prática, os presentes inventores revelaram que a hidroxilação eficiente das cadeias de colágeno depende do isolamento da cadeia de colágeno ao longo de uma enzima capaz de modificar corretamente este polipeptídeo.
[0012] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir colágeno em uma planta ou uma célula de planta isolada compreendendo a expressão na planta ou na célula de planta isolada de pelo menos um tipo de cadeia alfa de colágeno e P4H exógeno, de uma forma para habilitar o acúmulo de pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno e P4H exógeno em um compartimento subcelular isento de atividade de P4H endógeno, deste modo, produzindo o colágeno na planta.
[0013] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é fornecido [sic]
[0014] De acordo com características adicionais nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo, o método ainda compreende a expressão de LH3 exógeno no compartimento subcelular isento de atividade de P4H endógena.
[0015] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno inclui um peptídeo de sinal para direcionar a um apoplasto ou um vacúolo.
[0016] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo de cadeia alfa de colágeno está isenta de uma seqüência de retenção ou direcionamento de ER.
[0017] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo de cadeia alfa de colágeno é expressa em uma organela contendo DNA da planta.
[0018] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno inclui um peptídeo de sinal para direcionar a um apoplasto ou um vacúolo.
[0019] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é isento de uma seqüência de retenção ou direcionamento de ER.
[0020] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é expresso em uma organela contendo DNA da planta.
[0021] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno é a cadeia alfa 1.
[0022] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno é a cadeia alfa 2.
[0023] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno inclui um C-terminal e/ou um propeptídeo de N-terminal.
[0024] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a planta é selecionada do grupo consistindo de Tabaco, Milho, Alfafa, Arroz, Batata, Soja, Tomate, Trigo, Cevada, Canola e Algodão.
[0025] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno ou P4H exógeno é expresso em somente uma porção da planta.
[0026] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a porção da planta é: folhas, sementes, raízes, bulbos ou caules.
[0027] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é capaz de especificamente hidroxilar a posição Y dos trios de Gly-X-Y de pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno.
[0028] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é P4H humano.
[0029] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a planta está sujeita a uma condição de tensão.
[0030] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a condição de tensão é selecionada do grupo consistindo em aridez,- salinidade, dano, frio e pulverização com compostos que induzem a tensão.
[0031] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma planta geneticamente modificada ou célula de planta isolada capaz de acumular uma cadeia alfa de colágeno com um padrão de hidroxilação idêntico àquele produzido quando a cadeia alfa de colágeno é expressa em células humanas.
[0032] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma planta geneticamente modificada ou célula de planta isolada capaz de acumular uma cadeia alfa de colágeno em um compartimento subcelular isento de atividade de P4H endógena.
[0033] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a planta geneticamente modificada ainda compreende um P4H exógeno.
[0034] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno inclui um peptídeo de sinal para direcionar a um apoplasto ou um vacúolo.
[0035] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno está isento de uma seqüência de retenção ou direcionamento de ER.
[0036] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno é expresso em uma organela contendo DNA da planta.
[0037] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno inclui um peptídeo de sinal para direcionar a um apoplasto ou um vacúolo.
[0038] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno está isento de uma seqüência de retenção ou direcionamento de ER.
[0039] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é expresso em uma organela contendo DNA da planta.
[0040] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a cadeia alfa de colágeno é a cadeia alfa 1.
[0041] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a cadeia alfa de colágeno é a cadeia alfa 2.
[0042] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a cadeia alfa de colágeno inclui um C- terminal e/ou um propeptídeo de N-terminal.
[0043] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um sistema de planta compreendendo uma primeira planta geneticamente modificada capaz de acumular uma cadeia alfa 1 de colágeno e uma segunda planta geneticamente modificada capaz de acumular uma cadeia alfa 2 de colágeno.
[0044] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um sistema de planta compreendendo uma primeira planta geneticamente modificada capaz de acumular uma cadeia alfa 1 de colágeno e uma cadeia alfa 2 de colágeno e uma segunda planta geneticamente modificada capaz de acumular P4H.
[0045] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos uma primeira planta geneticamente modificada e uma segunda planta geneticamente modificada ainda compreendem o P4H exógeno.
[0046] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir colágeno fibrilar compreendendo: (a) a expressão em uma primeira planta de uma cadeia alfa 1 de colágeno; (b) a expressão em uma segunda planta de uma cadeia alfa 2 de colágeno, caracterizado pelo fato de que a expressão na primeira planta e na segunda planta é configurada de modo que a cadeia alfa 1 de colágeno e a cadeia alfa 2 de colágeno são cada uma capaz de acumular em um compartimento subcelular isento de atividade de P4H endógeno; e (c) cruzamento da primeira planta e segunda planta e seleção de progênie expressando a cadeia alfa 1 de colágeno e a cadeia alfa 2 de colágeno, deste modo, produzindo o colágeno fibrilar.
[0047] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o método ainda compreende a expressão de um P4H exógeno em cada uma da primeira planta e segunda planta.
[0048] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, cada uma da cadeia alfa 1 de colágeno e cadeia alfa 2 de colágeno inclui um peptídeo de sinal para direcionar a um apoplasto ou um vacúolo.
[0049] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, cada uma da cadeia alfa 1 de colágeno e cadeia alfa 2 de colágeno está isenta de uma seqüência de retenção ou direcionamento de ER.
[0050] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, as etapas (a) e (b) são efetuadas via a expressão em uma organela contendo DNA da planta.
[0051] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno inclui um peptídeo de sinal para direcionar a um apoplasto ou um vacúolo.
[0052] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é isento de uma seqüência de retenção ou direcionamento de ER.
[0053] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é expresso em uma organela contendo DNA da planta.
[0054] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, cada uma da cadeia alfa 1 de colágeno e cadeia alfa 2 de colágeno inclui um C-terminal e/ou um propeptídeo de N- terminal.
[0055] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é capaz de especificamente hidroxilar a posição Y dos trios de Gly-X-Y de pelo menos um tipo da cadeia alfa de colágeno.
[0056] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o P4H exógeno é o P4H humano.
[0057] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a primeira planta e a segunda planta estão sujeitas a uma condição de tensão.
[0058] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a condição de tensão é selecionada do grupo consistindo de aridez, salinidade, dano, toxicidade de metal pesado e tensão de frio.
[0059] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir colágeno fibrilar compreendendo: (a) a expressão em uma primeira planta de uma cadeia alfa 1 de colágeno e uma cadeia alfa 2 de colágeno, caracterizada pelo fato de que a expressão na primeira planta é configurada de modo que a cadeia alfa 1 de colágeno e a cadeia alfa 2 de colágeno são cada uma capaz de acumular em um compartimento subcelular isento de atividade de P4H endógeno; (b) a expressão em uma segunda planta de um P4H exógeno capaz de acumular no compartimento subcelular isento de atividade de P4H endógeno; e (c) cruzamento da primeira planta e segunda planta e seleção de progênie expressando a cadeia alfa 1 de colágeno, a cadeia alfa 2 de colágeno e o P4H, deste modo, produzindo o colágeno fibrilar.
[0060] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido uma construção de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo codificando um P4H humano posicionado sob o controle transcricional de um promotor funcional nas células de planta.
[0061] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o promotor é selecionado do grupo consistindo do promotor CaMV 35S, promotor de Ubiquitina, Promotor de rbcS e promotor de SVBV.
[0062] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma planta geneticamente modificada ou célula de planta isolada sendo capaz de expressar a cadeia alfa 1 de colágeno, cadeia alfa 2 de colágeno, P4H, LH3 e C protease e/ou N protease.
[0063] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a cadeia alfa 1 de colágeno e a cadeia alfa 2 de colágeno são cada uma capaz de acumular em um compartimento subcelular isento de atividade de P4H de planta endógeno.
[0064] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma planta geneticamente modificada ou célula de planta isolada sendo capaz de acumular colágeno com uma característica de estabilidade de temperatura idêntica ao do colágeno de mamífero.
[0065] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o colágeno é o colágeno de tipo I.
[0066] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o colágeno de mamífero é o colágeno humano.
[0067] Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma sequência codificando o colágeno otimizada para a expressão em uma planta.
[0068] Ainda de acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a seqüência codificando o colágeno é conforme estabelecida pela SEQ ID NO:l.
[0069] A presente invenção com êxito aborda as deficiências das configurações atualmente conhecidas, através do fornecimento de uma planta capaz de expressar corretamente as cadeias de colágeno hidroxiladas, as quais são capazes de montar-se ao colágeno com propriedades semelhantes ao do colágeno humano.
[0070] Exceto se de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuirão o mesmo significado conforme geralmente entendidos por aquele com habilidade na técnica a quem esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos no presente podem ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Além disso, os materiais, métodos e exemplos somente são ilustrativos e não têm a intenção de ser limitantes.
[0071] A invenção é pelo presente descrita, somente como exemplo, com referência aos desenhos anexos. Agora com referência específica aos desenhos em detalhes, é enfatizado que os detalhes demonstrados são somente como exemplo e para fins de discussão ilustrativa das configurações preferidas da presente invenção, e são apresentados para fornecer o que é julgado como sendo a descrição mais útil e prontamente entendida dos princípios e aspectos conceituais da invenção. Com relação a isso, nenhuma tentativa é feita para demonstrar os detalhes estruturais da invenção em mais detalhes do que é necessário para um entendimento fundamental da invenção, a descrição tomada em conjunto com os desenhos torna aparente para aqueles com habilidade na técnica como as diversas formas da invenção podem ser incorporadas na prática.
[0072] Nos desenhos: as figuras la-d ilustram a construção de diversos cartuchos e vetores de expressão utilizados para transformar as plantas de teste. Todas as seqüências de codificação sintetizadas como uma parte do presente estudo foram otimizadas para expressão no tabaco; a figura 2 ilustra diversas abordagens de co-transformações. Cada cartucho de expressão é representado pelo nome curto da seqüência de codificação. As seqüências de codificação são especificadas na tabela 1. Cada co-transformação foi realizada por dois vetores binários pBINPLUS. Cada retângulo representa um único vetor pBINPLUS transportando um, dois ou três cartuchos de expressão. O promotor e os terminadores são especificados no Exemplo 1; a figura 3 é uma triagem de PCR múltipla de transformantes demonstrando as plantas que são positivas para alfa 1 de Colágeno (fragmento 324bp) ou alfa 2 de Colágeno (fragmento 537bp) ou ambos; a figura 4 é uma análise Western Blot das plantas transgênicas geradas pelas co-transformações 2, 3 e 4. As proteínas totais solúveis foram extraídas dos co-transformantes de tabaco #2, #3 e #4 e testadas com o anticorpo anti-Colágeno I (#AB745 da Chemicon Inc.). Os marcadores de tamanho eram #SM0671 da Fermentas Inc. W.T. é um tipo selvagem de tabaco. As bandas de controle positivo são visíveis nas plantas positivas de PCR para alfa 1 ou alfa 2 de tipo I de colágeno, ou ambos. As bandas de controle positivo de 500ng de tipo I de colágeno da placenta humana (#CC050 da Chemicon, Inc., extraídas da placenta humana pela digestão de pepsina) representam aproximadamente 0,3% das proteínas totais solúveis (aproximadamente 150pg) nas amostras a partir das plantas transgênicas. A banda mais larga de aproximadamente 140 kDa na amostra de colágeno humano é um procolágeno com seu propeptídeo C conforme detectado por anti pró-peptídeo de carboxi-terminal do anticorpo tipo I de colágeno (#MAB1913 da Chemicon Inc.). A banda menor de aproximadamente 120 kDa na amostra de colágeno humano é um colágeno sem propeptídeos. Devido a suas proteínas ricas em prolina de composição incomum (incluindo colágenos) consistentemente migram nos géis de poliacrilamida como bandas sem massa molecular superior à esperada. Portanto, as cadeias de colágeno sem propeptídeos com um peso molecular de aproximadamente 95kDa migram como uma banda de aproximadamente 120kDa; a figura 5 é uma análise Western Blot de planta transgênica gerada pela co-transformação #8 (transportando sinais de apoplasto de modo translacional unificados às cadeias de colágeno). As proteínas totais solúveis foram extraídas das folhas de tabaco transgênico e testadas com o anticorpo de anti-Colágeno I (#AB745 da Chemicon Inc.). A banda alfa 2 de colágeno positivo é visível na planta 8-141. O tipo I de colágeno da placenta humana (#CC050 da Chemicon Inc.) serviu como controle; as figuras 6a-b ilustram a montagem de hélice tripla de colágeno e estabilidade termal conforme qualificadas pelo tratamento de calor e digestão de Tripsina e Pepsina. Na figura 6a - a proteína solúvel do tabaco 2-9 (expressando somente alfa 1 de colágeno e nenhum P4H) e 3-5 (expressando tanto alfa 1+2 de colágeno como alfa de P4H humano e subunidades beta) sujeita ao tratamento de calor (15 minutos em 382C ou 432C) seguido pela digestão de Tripsina (20 minutos em R.T.) e testada com o anticorpo de anti-Colágeno I em um procedimento Western Blot. Os controles positivos eram amostras de 500ng de colágeno humano I + proteínas totais solúveis de tabaco w.t. [do tipo selvagem]. Na Figura 6b - as proteínas totais solúveis foram extraídas do tabaco transgênico 13-6 (expressando cadeia alfa 1 e alfa 2 de colágeno - indicadas por setas, alfa P4H humano e subunidades beta e LH3 humano) e sujeitas ao tratamento de calor (20 minutos em 332C, 382C ou 422C), imediatamente resfriadas no gelo para impedir a nova montagem da hélice tripla e incubadas com pepsina por 30 minutos em temperatura ambiente (aproximadamente 222C) seguido pelo teste com anticorpo de anti-Colágeno I (#AB745 da Chemicon Inc.) em um procedimento Western Blot. O controle positivo era a amostra de -50ng de colágeno humano I (#CC050 da Chemicon Inc., extraída da placenta humana pela digestão de pepsina) que foi adicionada às proteínas totais solúveis extraídas do tabaco w.t; a figura 7 ilustra a análise Northern Blot conduzida no tabaco selvagem. As manchas foram sondadas com cDNA de P4H de tabaco; e a figura 8 é uma análise Western Blot das plantas transgênicas geradas pelas co-transformações 2, 3 e 13. A proteína total solúvel foi extraída dos co-transformantes de tabaco e testada com anti-alfa e beta de P4H humano e anticorpos de anti-Colágeno I.
[0073] A presente invenção é de plantas expressando e acumulando colágeno que pode ser utilizado para produzir o colágeno e fibras de colágeno que exibem características do colágeno de mamífero.
[0074] Os princípios e operação da presente invenção podem ser melhores entendidos com referência aos desenhos e descrições anexas.
[0075] Antes de explicar pelo menos uma configuração da invenção em detalhe, deve ser entendido que a invenção não é limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na seguinte descrição ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras configurações ou de ser praticada ou realizada em diversos modos. Também, deve ser entendido que a fraseologia e terminologia utilizadas no presente são para fins de descrição e não devem ser consideradas como limitastes.
[0076] As plantas que produzem colágeno são conhecidas na técnica. Embora tais plantas possam ser utilizadas para produzir as cadeias de colágeno, bem como o colágeno, tais cadeias são incorretamente hidroxiladas e, deste modo, a auto-montagem das mesmas, sejam na planta ou não, leva ao colágeno que é inerentemente instável.
[0077] Ao reduzir a presente invenção para a prática, os presentes inventores projetaram uma abordagem de expressão da planta que garante a hidroxilação correta das cadeias de colágeno e, deste modo, permite a produção na planta do colágeno que quase imita as características (p.ex., estabilidade da temperatura) do colágeno tipo I humano.
[0078] Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma planta geneticamente modificada que é capaz de expressar pelo menos um tipo de uma cadeia alfa de colágeno e acumular na mesma um compartimento subcelular que é isento de atividade de P4H endógeno.
[0079] Conforme utilizado no presente, a frase "planta geneticamente modificada" refere-se a qualquer planta inferior (p.ex., musgo) ou superior (vascular) ou um tecido ou uma célula isolada do mesmo (p.ex., de uma suspensão de célula) que é transformado estável ou transitoriamente com uma seqüência de polinucleotídeo exógeno. Os exemplos de plantas incluem o Tabaco, Milho, Alfafa, Arroz, Batata, Soja, Tomate, Trigo, Cevada, Canola, Algodão, Cenoura, bem como plantas inferiores, tais como o musgo.
[0080] Conforme utilizado no presente, a frase "cadeia de colágeno" refere-se a uma subunidade de colágeno, tal como as cadeias alfa 1 ou 2 das fibras de colágeno, preferivelmente as fibras tipo I. Conforme utilizado no presente, a frase "colágeno" refere-se a um trímero de colágeno montado, que, no caso do colágeno tipo I, inclui duas cadeias alfa 1 e uma cadeia alfa 2. Uma fibra de colágeno é o colágeno que é isento de propeptídeos C e N terminal.
[0081] Conforme utilizado no presente, a frase "compartimento subcelular isento de atividade de P4H endógeno" refere-se a qualquer região compartimentalizada da célula que não inclui o P4H de planta ou uma enzima com atividade de P4H semelhante à planta. Os exemplos de tais compartimentos subcelulares incluem o vacúolo, apoplasto e citoplasma, bem como organelas, tais como o cloroplasto, mitocôndria e semelhantes.
[0082] Qualquer tipo de cadeia de colágeno pode ser expressa pela planta geneticamente modificada da presente invenção. Os exemplos incluem colágenos que formam fibrilas (tipos I, II, III, V e XI), redes formando colágenos (tipos IV, VIII e X), os colágenos associados com superfícies de fibrila (tipos IX, XII e XIV), os colágenos que ocorrem como proteínas de membrana (tipos XIII e XVII), ou formam filamentos de conta periódicos de 11-nm (tipo VI). Para descrição adicional, vide Hulmes, 2002.
[0083] Preferivelmente, a cadeia de colágeno expressa é uma cadeia alfa 1 e/ou 2 do colágeno tipo I. A cadeia alfa de colágeno expressa pode ser codificada por quaisquer seqüências de polinucleotídeo derivadas de qualquer mamífero. Preferivelmente, as seqüências codificando as cadeias alfa de colágeno são humanas e são estabelecidas pela SEQ ID NOs: 1 e 4.
[0084] Tipicamente, as cadeias alfa de colágeno expressas em plantas podem ou não podem incluir seus propeptídeos terminais (isto é, propeptídeo C e propeptídeo N).
[0085] Ruggiero et al. (2000) observou que o procolágeno através da atividade proteolítica da planta é diferente do que o processamento normal em humano e que o propeptídeo C é removido pela atividade proteolítica da planta, embora o local de clivagem seja desconhecido. A clivagem do propeptídeo C pode ser realizada em um peptídeo de procolágeno antes da montagem do trímero (a associação dos três Propeptídeos C é essencial para iniciar a montagem dos trímeros).
[0086] A clivagem de propeptídeo N pela atividade proteolítica da planta ocorre em plantas maduras, porém não em plântulas. Tal clivagem remove 2 aminoácidos da telopeptídeo N (2 de 17).
[0087] Os propeptídeos C (e em uma menor medida os propeptídeos N) mantêm o procolágeno solúvel durante sua passagem através da célula animal (Bulleid et al., 2000) e são esperados para possuir um efeito semelhante na célula de planta. Após ou durante a secreção das moléculas de procolágeno na matriz extracelular, os propeptídeos são removidos pelas proteinases N e C de procolágeno, deste modo, acionando a auto-montagem espontânea das moléculas de colágeno em fibrilas (Hulmes, 2002). A remoção dos propeptídeos pelas proteinases C e N de procolágeno diminui a solubilidade do procolágeno em >10000 vezes e é necessário e suficiente iniciar a auto-montagem do colágeno em fibras. Crítico a este processo de montagem são os peptídeos não helicoidais triplos curtos denominados telopeptídeos nas extremidades do domínio helicoidal triplo, que garante o registro correto das moléculas de colágeno dentro da estrutura de fibrila e diminui a concentração crítica para auto-montagem (Bulleid et al., 2000). A técnica anterior descreve a utilização de pepsina para clivar os propeptídeos durante a produção do colágeno (Bulleid et al 2000). Entretanto, os danos de pepsina aos telopeptídeos e, como um resultado, o colágeno extraído de pepsina é incapaz de formar estruturas fibrilares ordenadas (Bulleid et al 2000).
[0088] A isomerase de dissulfeto da proteína (PDI) que forma a subunidade beta do P4H humano demonstrou ligar o propeptídeo C antes da montagem de trímero, deste modo, também atuando como um acompanhante molecular durante a montagem de cadeia (Ruggiero et al, 2000).
[0089] A utilização da proteinase N do Procolágeno I e proteinase C do Procolágeno expressa em diferentes plantas podem gerar o colágeno que é mais semelhante ao colágeno humano nativo e pode formar estruturas fibrilares ordenadas.
[0090] No caso em que os propeptídeos N ou C ou ambos estiverem incluídos na cadeia de colágeno expressa, a planta geneticamente modificada da presente invenção também pode expressar a respectiva protease (isto é, C ou N ou ambas). As seqüências de polinucleotídeo codificando tais proteases são exemplificadas pela SEQ ID NOs: 18 (protease C) e 20 (Protease N). Tais proteases podem ser expressas de modo que elas são acumuladas no mesmo compartimento subcelular que a cadeia de colágeno.
[0091] O acúmulo da cadeia de colágeno expressa é um compartimento subcelular isento de atividade de P4H endógeno pode ser efetuada via qualquer uma das diversas abordagens.
[0092] Por exemplo, a cadeia de colágeno expressa pode incluir uma seqüência de sinal para direcionar a proteína expressa a um compartimento subcelular, tal como o apoplasto ou uma organela (p.ex., cloroplasto). Os exemplos das seqüências adequadas de sinal incluem o peptídeo de trânsito de cloroplasto (incluído em P07689 de entrada Swiss-Prot, aminoácidos 1-57) e o peptídeo de trânsito de Mitocôndria (incluído em P46643 de entrada Swiss- Prot, aminoácidos 1-28). A seção de Exemplos a seguir fornece os exemplos adicionais das seqüências adequadas de sinal, bem como as diretrizes para utilizar tais seqüências de sinal na expressão das cadeias de colágeno nas células de planta.
[0093] Alternativamente, a seqüência da cadeia de colágeno pode ser modificada de um modo que altere a localização celular do colágeno quando expressa em plantas.
[0094] Conforme mencionado acima, o ER das plantas inclui um P4H, que é incapaz de hidroxilar corretamente as cadeias de colágeno. As cadeias alfa de colágeno nativamente incluem uma seqüência de direcionamento de ER que direciona o colágeno expresso ao ER em que é póstranslacionalmente modificado (incluindo a hidroxilação incorreta). Deste modo, a remoção da seqüência de direcionamento de ER levará ao acúmulo citoplasmático das cadeias de colágeno, que são isentas de modificação pós- translacional incluindo quaisquer hidroxilações.
[0095] O Exemplo 1 da seção de Exemplos que segue descreve a geração de seqüências de colágeno que são isentas de seqüências de ER.
[0096] Ainda alternativamente, as cadeias de colágeno podem ser expressas e acumuladas em uma organela contendo DNA, tal como o cloroplasto ou mitocôndria. A descrição adicional da expressão de cloroplasto é fornecida abaixo.
[0097] Conforme é mencionado acima, a hidroxilação das cadeias alfa é exigida para a montagem de um colágeno de tipo I estável. Considerando que as cadeias alfa expressas pela planta geneticamente modificada da presente invenção acumulada em um compartimento isento de atividade de P4H endógeno, tais cadeias devem ser isoladas da planta, tecido da planta ou célula e hidroxilado in-vitro. Tal hidroxilação pode ser atingida pelo método descrito por Turpeenniemi-Hujanen e Myllyla (Concomitant hydroxylation of proline and lysine residues in collagen using purified enzymes in vitro. Biochim Biophys Acta. 16 de julho de 1984;800(1):59-65).
[0098] Embora tal hidroxilação in-vitro possa levar às cadeias de colágeno corretamente hidroxiladas, pode ser difícil e dispendioso atingi-la.
[0099] Para superar as limitações da hidroxilação in-vitro, a planta geneticamente modificada da presente invenção preferivelmente também co- expressa o P4H que é capaz de corretamente hidroxilar a(s) cadeia(s) alfa de colágeno [isto é, somente a hidroxilação da posição de prolina (Y) dos trios de Gly-X-Y]. O P4H é uma enzima composta de duas subunidades, alfa e beta. Ambas são necessárias para formar uma enzima ativa, enquanto a subunidade Beta também possui uma função de acompanhante.
[00100] O P4H expresso pela planta geneticamente modificada da presente invenção é preferivelmente um P4H humano que é codificado pela, por exemplo, SEQ ID NO:12 e 14. Além disso, os P4H mutantes que exibem especificidade de substrato elevada, ou P4H homólogos também podem ser utilizados.
[00101] Um P4H homólogo adequado é exemplificado por uma oxidoreductase Arabidopsis identificada por NP_179363 de acessão de NCBI. O alinhamento em pares desta seqüência de proteína e subunidade alfa de P4H humano conduzido pelos presentes inventores revelou a homologia mais alta entre os domínios funcionais de qualquer P4H homólogo conhecido das plantas.
[00102] Considerando que o P4H necessita co-acumular com a cadeia de colágeno expressa, a seqüência de codificação da mesma é preferivelmente modificada adequadamente (adições às seqüências de sinal, exclusões que podem impedir o direcionamento de ER, etc.).
[00103] Nas células de mamífero, o colágeno também é modificado por lisil hidroxilase, galactosiltransferase e glicosiltransferase. Essas enzimas sequencialmente modificam os resíduos de lisil nas posições específicas para resíduos de hidroxilisil, galactosilidroxilisil e glicosilgalactosil hidroxilisil. Uma única enzima humana, lisil hidroxilase 3 (LH3) pode catalizar todas as três etapas consecutivas na formação de carboidrato ligado de hidroxilisina.
[00104] Deste modo, a planta geneticamente modificada da presente invenção preferivelmente também expressa o LH3 de mamífero. Uma seqüência codificando o LH3, tal como aquela estabelecida pela SEQ ID NO:22 pode ser utilizada para tais finalidades.
[00105] A(s) cadeia(s) de colágeno e enzimas de modificação descritas acima pode(m) ser expressa(s) a partir de uma construção de ácido nucléico expressa transitoriamente ou estavelmente integrada que inclui as seqüências de polinucleotídeo codificando as cadeias alfa e/ou enzimas de modificação (p.ex., P4H e LH3) posicionadas sob o controle transcricional dos promotores funcionais da planta. Tal construção de ácido nucléico (que também é designada no presente como uma construção de expressão) pode ser configurada para expressão por toda a planta, tecidos definidos da planta ou células definidas da planta, ou em etapas definidas de desenvolvimento da planta. Tal construção também pode incluir os marcadores de seleção (p.ex., resistência a antibiótico), elementos reforçadores e uma origem de replicação para replicação bacteriana.
[00106] Será apreciado que as construções, incluindo dois insertos passíveis de expressão (p.ex., dois tipos de cadeia alfa, ou uma cadeia alfa e P4H) preferivelmente incluem um promotor individual para cada inserto, ou alternativamente tais construções podem expressar uma única quimera de transcrição incluindo ambas as seqüências de inserto a partir de um único promotor. Em tal caso, a transcrição quimérica inclui uma seqüência de IRES entre as duas seqüências de inserto, de modo que o inserto a jusante pode ser traduzido a partir da mesma.
[00107] Os diversos promotores funcionais da planta e reforçadores, que podem ser qualidade específica de tecido, qualidade específica de maneira desenvolvida, constitutiva ou induzível, podem ser utilizados pelas construções da presente invenção, alguns exemplos são doravante fornecidos.
[00108] Conforme utilizado no presente na especificação e na seção de reivindicações que segue, a frase "promotor de planta" ou "promotor" inclui um promotor que pode direcionar a expressão do gene nas células de planta (incluindo organelas contendo DNA). Tal promotor pode ser derivado de uma origem de planta, bacteriana, viral, fúngica ou origem animal. Tal promotor pode ser constitutivo, isto é, capaz de direcionar o alto nível da expressão de gene em uma pluralidade de tecidos de planta, qualidade específica de tecido, isto é, capaz de direcionar a expressão do gene em um tecido ou tecidos de planta específicos, induzível, isto é, capaz de direcionar a expressão do gene sob um estímulo, ou quimérica, isto é, formada de porções de pelo menos dois promotores diferentes.
[00109] Deste modo, o promotor de planta utilizado pode ser um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido, um promotor induzível ou um promotor quimérico.
[00110] Os Exemplos dos promotores de planta constitutivos incluem, sem limitação a, promotores CaMV35S e CaMV19S, promotor FMV34S, promotor de badnavirus baciliforme de cana-de-açúcar, promotor CsVMV, promotor de actina ACT2/ACT8 Arabidopsis, promotor de ubiquitina UBQ1 Arabidopsis, promotor BTH6 de tionina de folha de cevada e promotor de actina de arroz.
[00111] Os Exemplos dos promotores específicos do tecido incluem, sem limitação a, promotor de proteína de armazenamento de faseolina do feijão, promotor DLEC, promotor PHS, promotor de proteína de armazenamento de zeína, promotor gama de conglutinina da soja, promotor de gene AT2S1, promotor de actina ACT11 de Arabidopsis, promotor napA de Brassica napus e promotor de gene de patatina de batata.
[00112] O promotor induzível é um promotor induzido por um estímulo específico, tal como as condições de tensão compreendendo, por exemplo, luz, temperatura, produtos químicos, aridez, alta salinidade, choque osmótico, condições oxidantes ou, no caso de patogenicidade inclui, sem limitação a, o promotor induzível por luz derivado do gene rcbS da ervilha, o promotor do gene rbcS da alfafa, os promotores DRE, MYC e MYB ativos na aridez; os promotores INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 e RD21 ativos em alta salinidade e tensão osmótica, e os promotores hsr203J e str246C ativos na tensão patogênica.
[00113] Preferivelmente, o promotor utilizado pela presente invenção é um forte promotor constitutivo, de modo que a sobreexpressão dos insertos de construção é efetuada após a transformação da planta.
[00114] Será apreciado que quaisquer dos tipos de construção utilizados na presente invenção podem ser co-transformados na mesma planta utilizando os mesmos marcadores ou marcadores diferentes em cada tipo de construção. Alternativamente, o primeiro tipo de construção pode ser introduzido em uma primeira planta, enquanto o segundo tipo de construção pode ser introduzido em uma segunda planta isogênica, após isso as plantas transgênicas resultantes disso podem ser cruzadas e a progênie selecionada para transformantes duplos. Os auto-cruzamentos adicionais de tal progênie podem ser utilizados para gerar linhas de homozigotos para ambas as construções.
[00115] Esses são diversos métodos para introduzir as construções de ácido nucléico nas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276). Tais métodos confiam na integração estável da construção do ácido nucléico ou uma porção da mesma no genoma da planta, ou na expressão transitória da construção do ácido nucléico, caso em que essas seqüências não são herdadas por uma progênie da planta.
[00116] Além disso, diversos métodos existem em que a construção do ácido nucléico pode ser diretamente introduzida no DNA de uma organela contendo DNA, tal como um cloroplasto.
[00117] Esses são os dois métodos de princípio para efetuar a integração genômica estável das seqüências exógenas, tal como aquela incluída dentro das construções do ácido nucléico da presente invenção nos genomas de planta: (i) transferência do gene mediado por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 225; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93112.
[00118] (ii) absorção direta de DNA: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo os métodos para absorção direta de DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:10721074. Absorção de DNA induzida pelo breve choque elétrico das células da planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células ou tecidos de planta por bombardeio de partícula, Kein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pela utilização dos sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; ou pela incubação direta do DNA com pólen de germinação, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; and Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.
[00119] O sistema de Agrobacterium inclui a utilização dos vetores plasmídeos que contêm os segmentos definidos de DNA que integram o DNA genômico da planta. Os métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo das espécies da planta e o sistema de liberação de Agrobacterium. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco da folha que pode ser realizado com qualquer transplante de tecido que fornece uma boa fonte para iniciação de toda a diferenciação da planta. Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar utiliza o sistema de liberação de Agrobacterium em combinação com a infiltração a vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação das plantas dicotiledôneas transgênicas.
[00120] Existem diversos métodos de transferência direta de DNA nas células de planta. Na electropuração, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeio de micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis, tais como cristais de sulfato de magnésio, partículas de tungstênio ou partículas de ouro, e os microprojéteis são fisicamente acelerados nas células ou tecidos da planta.
[00121] Após a transformação, a propagação da planta é exercida. O método mais comum da propagação da planta é por semente. A regeneração pela propagação de semente, entretanto, possui uma deficiência que devido à heterozigosidade, existe uma falta de uniformidade na safra, considerando que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas leis de Mendel. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferido que a planta transformada seja produzida de modo que a planta regenerada possua trações e características idênticas da planta transgênica precursora. Então, é preferido que a planta transformada seja regenerada pela micropropagação que fornece uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.
[00122] Os métodos de expressão temporários que podem ser utilizados para temporariamente expressar o ácido nucléico isolado incluído na construção do ácido nucléico da presente invenção incluem, sem limitação a, a microinjeção e o bombardeio conforme descrito acima, porém sob as condições que favorece a expressão temporária, e a expressão mediada viral caracterizada pelo fato de que um vetor de vírus recombinante embalado e não embalado, incluindo a construção do ácido nucléico, é utilizada para infectar as células ou tecidos da planta de modo que um vírus recombinante de propagação estabelecido na mesma expressa a seqüência do ácido nucléico não viral.
[00123] Os vírus que foram demonstrados como úteis para a transformação dos hospedeiros da planta incluem CaMV, TMV e BV. A transformação das plantas utilizando os vírus de planta é descrita na Patente Norte-Americana N2 4.855.237 (BGV), EP-A 67.553 (TMV), Pedido Publicado Japonês N2 63-14693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278-667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Virai Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). As partículas de pseudovirus para utilização na expressão do DNA estranho em diversos hospedeiros, incluindo as plantas, é descrita em WO 87/06261.
[00124] A construção dos vírus de RNA de planta para a introdução e expressão das seqüências do ácido nucléico exógeno não viral nas plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; and Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76.
[00125] Quando o vírus é um virus de DNA, as construções podem ser realizadas ao próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser primeiramente clonado em um plasmídeo bacteriano para facilidade de construir o vetor viral desejado com o DNA estranho. Então o vírus pode ser removido do plasmídeo. Se o vírus é um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser ligada ao DNA viral, que é então replicado pela bactéria. A transcrição e tradução deste DNA produzirão a proteína de revestimento que encapsida o DNA viral. Se o vírus é um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídeo. Então, o plasmídeo é utilizado para fazer todas as construções. O vírus de RNA é então produzido pela transcrição da seqüência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento, as quais encapsidam o RNA viral.
[00126] A construção dos vírus de RNA da planta para a introdução e expressão nas plantas de seqüências do ácido nucléico exógeno não-viral, tais como aquelas incluídas na construção da presente invenção, é demonstrada pelas referências acima, bem como na Patente Norte-Americana N2 5.316.931.
[00127] Em uma configuração, um ácido nucléico viral de planta é fornecido em que a seqüência de codificação da proteína de revestimento nativa foi excluída de um ácido nucléico viral, uma seqüência de codificação da proteína de revestimento viral da planta não nativa e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor sub-genômico da seqüência de codificação da proteína de revestimento não nativa, capaz de expressão no hospedeiro da planta, empacotamento do ácido nucléico viral da planta recombinante, e garantia de uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo ácido nucléico viral da planta recombinante, foi inserido. Alternativamente, o gene da proteína de revestimento pode ser desativado pela inserção da seqüência do ácido nucléico não nativo dentro do mesmo, de modo que uma proteína seja produzida. O ácido nucléico viral da planta recombinante pode conter um ou mais promotores sub-genômicos não-nativos adicionais. Cada promotor sub- genômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar genes adjacentes ou seqüências do ácido nucléico no hospedeiro da planta e incapaz de recombinação entre si e com promotores sub-genômicos nativos. As seqüências do ácido nucléico (estranho) não nativas podem ser inseridas adjacente ao promotor sub-genômico viral da planta nativa e aos promotores sub-genômicos virais da planta não nativos, se mais de uma seqüência do ácido nucléico for incluída. As seqüências do ácido nucléico não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle do promotor sub- genômico para produzir os produtos desejados.
[00128] Em uma segunda configuração, um ácido nucléico viral da planta recombinante é fornecido na primeira configuração, exceto que a seqüência de codificação da proteína de revestimento nativa é colocada adjacente a um dos promotores sub-genômicos da proteína de revestimento não nativos, ao invés de uma seqüência de codificação da proteína de revestimento não nativa.
[00129] Em uma terceira configuração, um ácido nucléico viral da planta recombinante é fornecido em que o gene da proteína de revestimento nativo está adjacente ao seu promotor sub-genômico e um ou mais dos promotores sub-genômicos não nativos foram inseridos no ácido nucléico viral. Os promotores sub-genômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar os genes adjacentes em um hospedeiro de planta e são incapazes de recombinação entre si e com promotores sub-genômicos nativos. As seqüências do ácido nucléico não nativas podem ser inseridas adjacente aos promotores virais da planta sub-genômicos não nativos, de modo que as referidas seqüências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle dos promotores sub-genômicos para produzir o produto desejado.
[00130] Em uma quarta configuração, um ácido nucléico viral da planta recombinante é fornecido conforme na terceira configuração, exceto que a seqüência de codificação da proteína de revestimento nativa é substituída por uma seqüência de codificação da proteína de revestimento não nativa.
[00131] Os vetores virais são encapsidados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo ácido nucléico viral da planta recombinante para produzir um vírus de planta recombinante. O ácido nucléico viral da planta recombinante ou vírus da planta recombinante é utilizado para infectar as plantas hospedeiras apropriadas. O ácido nucléico viral da planta recombinante é capaz de replicação no hospedeiro, propagação sistêmica no hospedeiro, e transcrição ou expressão do(s) gene(s) estranho(s) (ácido nucléico isolado) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.
[00132] Uma técnica para introduzir as seqüências de ácido nucléico exógeno ao genoma dos cloroplastos é conhecida. Esta técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células da planta são quimicamente tratadas de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente um. Então, o ácido nucléico exógeno é introduzido via bombardeio de partícula nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula do ácido nucléico exógeno nos cloroplastos. O ácido nucléico exógeno é selecionado, de modo que é passível de integração no genoma do cloroplasto via recombinação homóloga que é prontamente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para esta finalidade, o ácido nucléico exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma camada do ácido nucléico que é derivado do genoma de cloroplasto. Além disso, o ácido nucléico exógeno inclui um marcador selecionável, que serve através dos procedimentos de seleção seqüencial para verificar se todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto após tal seleção incluirão o ácido nucléico exógeno. Os detalhes adicionais relacionados a esta técnica são encontrados nas Patentes Norte-Americanas N°s 4.945.050 e 5.693.507, as quais são incorporadas no presente por referência. Um polipeptídeo pode deste modo ser produzido pelo sistema de expressão da proteína do cloroplasto e tornar-se integrado à membrana interna do cloroplasto.
[00133] As abordagens de transformação acima descritas podem ser utilizadas para produzir as cadeias de colágeno e/ou modificar as enzimas, bem como o colágeno montado (com ou sem propeptídeos) em quaisquer espécies de planta, ou tecido de planta ou célula de plantas isoladas derivadas das mesmas.
[00134] As plantas preferidas são aquelas que são capazes de acumular grandes quantias de cadeias de colágeno, colágeno e/ou as enzimas de processamento descritas no presente. Tais plantas também podem ser selecionadas de acordo com sua resistência às condições de tensão e a facilidade em que os componentes expressados ou colágeno montado possam ser extraídos. Os exemplos das plantas preferidas incluem o Tabaco, Milho, Alfafa, Arroz, Batata, Soja, Tomate, Trigo, Cevada, Canola e Algodão.
[00135] As fibras de colágeno são extensivamente utilizadas na indústria alimentícia e de produtos cosméticos. Deste modo, embora os componentes da fibra de colágeno (cadeias alfa) e enzimas de modificação expressadas pelas plantas encontrem a utilidade na síntese industrial do colágeno, a produção completa do colágeno nas plantas é preferida por sua simplicidade e custo de eficácia.
[00136] Diversas abordagens podem ser utilizadas para gerar o colágeno tipo I nas plantas. Por exemplo, a cadeia alfa 1 de colágeno pode ser isolada de uma planta expressando alfa 1 de colágeno e P4H (e opcionalmente LH3) e misturada com uma cadeia alfa 2 de colágeno, que é isolada de uma planta expressando alfa 2 de colágeno e P4H (e opcionalmente LH3 e N e/ou C protease). Considerando que a cadeia alfa 1 de colágeno é auto-montada em uma hélice tripla, pode ser necessário desnaturar tal homotrímero antes de misturar e renaturar com a cadeia alfa 2 de colágeno.
[00137] Preferivelmente, uma primeira planta expressando alfa 1 de colágeno e P4H (e opcionalmente LH3 e N e/ou C protease) pode ser cruzada com uma segunda (e . preferivelmente isogênica) planta que expressa alfa 2 de colágeno ou alternativamente, uma primeira planta expressando ambas as cadeias alfa pode ser cruzada com uma segunda planta expressando P4H e, opcionalmente, LH3 e N e/ou C protease.
[00138] Deve ser observado que, embora as abordagens de reprodução da planta acima descritas utilizam duas plantas individualmente transformadas, as abordagens que utilizam três ou mais plantas individualmente transformadas, cada uma expressando um ou dois componentes, também podem ser utilizadas.
[00139] Aqueles com habilidade na técnica estariam cientes das diversas técnicas de reprodução da planta e, como tal, nenhuma descrição adicional de tais técnicas é fornecida no presente.
[00140] Embora as abordagens de reprodução da planta sejam preferidas, deve ser observado que uma única planta expressando alfa 1 e 2 de colágeno, P4H e LH3 (e opcionalmente N e/ou C protease) pode ser gerada via diversos eventos de transformação, cada um projetado para introduzir mais um componente passível de expressão na célula. Em tais casos, a estabilidade de cada evento de transformação pode ser verificada utilizando os marcadores específicos de seleção.
[00141] Em qualquer caso, as abordagens de reprodução da planta e transformação podem ser utilizadas para gerar qualquer planta, expressando qualquer número de componentes. Presentemente preferidas são as plantas que expressam cadeias alfa 1 e 2 de colágeno, P4H, LH3 e pelo menos uma protease (p.ex., N e/ou C protease). Conforme é adicionalmente descrito na seção de Exemplos que segue, tais plantas acumulam o colágeno que exibe estabilidade em temperaturas de até 42°C.
[00142] A progênie resultante da reprodução ou alternativamente das plantas múltiplas transformadas pode ser selecionada, pela verificação da presença de mRNA exógeno e/ou polipeptídeos através da utilização do ácido nucléico ou sondas de proteína (p.ex., anticorpos). A última abordagem é preferida, considerando que a mesma permite a localização dos componentes expressos de polipeptídeo (através de, por exemplo, sondagem de extratos fracionados de plantas) e, deste modo, também verifica um potencial para corrigir o processamento e montagem. Os exemplos das sondas adequadas são fornecidos na seção de Exemplos a seguir.
[00143] Uma vez que a progênie expressando colágeno for identificada, tais plantas são ainda cultivadas sob as condições que maximizam a expressão das cadeias de colágeno, bem como das enzimas de modificação.
[00144] Considerando que o acúmulo de prolina pode facilitar a produção de diferentes proteínas ricas em prolina, incluindo as cadeias de colágeno expressas pelas plantas geneticamente modificadas da presente invenção, as condições de cultivo preferidas são aquelas que aumentam o acúmulo livre de prolina na planta cultivada.
[00145] Os acumulados livres de prolina em uma variedade de plantas em resposta a uma ampla variedade de tensões ambientes, incluindo escassez de água, salinização, baixa temperatura, alta temperatura, infecção patogênica, toxicidade de metal pesado, anaerobiose, deficiência de nutriente, poluição atmosférica e irradiação UV (Hare and Cress, 1997).
[00146] A prolina livre também pode acumular em resposta ao tratamento da planta ou solo com componentes, tais como componentes que induzem tensão ou ABA, tais como sal de cobre, paraquate, ácido salicílico e semelhantes.
[00147] Deste modo, a progênie expressando o colágeno pode ser cultivada sob diferentes condições de tensão (p.ex., concentrações diferentes de NaCl variando de 50mM até 250mM). Com a finalidade de adicionalmente otimizar a produção de colágeno, o efeito de diversas condições de tensão sobre a expressão de colágeno examinará e otimizará com relação à viabilidade da planta, biomassa e acúmulo de colágeno.
[00148] As células/tecidos de planta são preferivelmente colhidos quando amadurecidos, e as fibras de colágeno são isoladas utilizando as abordagens de extração bem conhecidas da técnica anterior, sendo uma tal abordagem detalhada abaixo.
[00149] As folhas das plantas transgênicas são ligadas a um pó sob nitrogênio líquido e o homogenado é extraído em ácido acético a 0,5 M contendo NaCl a 0,2 M por 60 h em 42C. O material insolúvel é removido por centrifugação. O sobrenadante contendo o colágeno recombinante é fracionado por sal em NaCl a 0,4 M e 0,7 M. O precipitado de NaC1 a 0,7 M, contendo o colágeno heterotrimérico recombinante, é dissolvido e dialisado contra um ácido acétido a 0,1 M e armazenado a -202C (seguindo Ruggiero et al., 2000).
[00150] Os objetos, vantagens e características recentes adicionais da presente invenção tornar-se-ão aparentes àqueles com habilidade na técnica, mediante exame dos seguintes exemplos, que não têm a intenção de serem limitastes. Adicionalmente, cada uma das diversas configurações e aspectos da presente invenção conforme doravante delineadas e conforme reivindicadas na seção de reivindicações abaixo encontra suporte experimental nos seguintes exemplos.
[00151] Referência agora é feita aos seguintes exemplos, os quais conjuntamente com as descrições acima, ilustram a invenção de uma forma não limitaste.
[00152] De modo geral, a nomenclatura utilizada no presente e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas de DNA moleculares, bioquímicas, microbiológicas e recombinantes. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); as metodologias conforme estabelecidas nas Patentes Norte-Americanas N2s 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); os imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e literatura científica, vide, por exemplo, Patentes Norte-Americanas N2s 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas as quais são incorporadas por referência conforme completamente estabelecidas no presente. Outras referências gerais são fornecidas por todo este documento. Os procedimentos nos mesmos são julgados como sendo bem conhecidos na técnica e são fornecidos para conveniência do leitor. Todas as informações contidas nos mesmos são incorporadas por referência no presente. EXEMPLO 1 Esquemas de Transformação e Construções
[00153] As construções dos cartuchos e vetores de expressão utilizados neste trabalho são ilustradas na Figura la-d. Todas as seqüências de codificação neste trabalho foram otimizadas para expressão no tabaco e quimicamente sintetizadas com as regiões desejadas de flanqueamento (SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 12, 14, 16, 18, 20, 22). A Figura la - os genes sintéticos codificando para Coll e Col2 (SEQ ID 1 e 4) misturados ao sinal vacuolar ou ao sinal do apoplasto (codificado pela SEQ ID NO: 7) ou sem sinais foram clonados nos cartuchos de expressão compostos de um promotor rbcSl de Crisântemo e 5' UTR (SEQ ID NO: 10) e um 3'UTR rbcSl de Crisântemo e terminador (SEQ ID NO: 11). Os cartuchos completos de expressão foram clonados no local de clonagem múltiplo do vetor de transformação da planta pBINPLUS (van Engelen et al., 1995, Transgenic Res 4: 288-290). A Figura lb - Os genes sintéticos codificando o P4H beta humano, P4H alfa humano e P4H de planta (SEQ ID NOs: 12, 14 e 16) combinados ao sinal vacuolar ou ao sinal de apoplasto (codificados pela SEQ ID NO: 7) ou sem sinais foram clonados nos cartuchos de expressão compostos do promotor CaMV 35S e seqüência ômega TMV e terminador da nopalina-sintetase de Agrobacterium (NOS) transportado pelo vetor pJD330 (Galili et al., 1987, Nucleic Acids Res 15: 3257-3273). Os cartuchos completos de expressão foram clonados no local múltiplo de clonagem dos vetores pBINPLUS transportando os cartuchos de expressão de Coll ou Co12. A Figura lc - Os genes sintéticos codificando a Proteinase C e Proteinase N (SEQ ID NOs: 18, 20) combinados ao sinal vacuolar ou ao sinal do apoplasto (codificado pela SEQ ID NO: 7) foram clonados nos cartuchos de expressão compostos de um promotor rbcSl de Crisântemo e 5' UTR (SEQ ID NO: 10) e um 3'UTR rbcSl de Crisântemo e terminador (SEQ ID NO: 11). Os cartuchos completos de expressão foram clonados no local múltiplo de clonagem do vetor de transformação da planta pBINPLUS. A Figura ld - O gene sintético codificando o LH3 (SEQ ID NO: 22) com promotor do vírus de bandeamento de nervura de Morango de flanqueamento (SVBV) (REGIÃO AF331666 de acessão de NCBI: versão 623..950 AF331666.1 GI:13345788) e terminado pelo terminador de octopina-sintase de Agrobacterium (OCS) (REGIÃO Z37515 de acessão de NCBI: versão 1344..1538 Z37515.1 GI:886843) combinados ao sinal vacuolar ou ao sinal do apoplasto (codificado pela SEQ ID NO: 7) ou sem sinais foi clonado no local múltiplo de clonagem do vetor pBINPLUS transportando os cartuchos de expressão de Coll e P4H beta.
[00154] Os esquemas de co- transformação utilizando os cartuchos de expressão descritos na Figura 1 em uma planta hospedeira são ilustrados na Figura 2. Cada inserto do cartucho de expressão é representado por um nome breve da seqüência de codificação. As seqüências de codificação e SEQ ID NOs relacionados estão descritos na Tabela 1. Cada co-transformação é pré- formada por dois vetores binários pBINPLUS. Cada retângulo representa um único vetor pBINPLUS transportando um, dois ou três cartuchos de expressão. Os promotores e terminadores estão especificados na Figura 1. EXEMPLO 2 Expressão do Colágeno da Planta
[00155] As seqüências de polinucleotídeo sintético codificando as proteínas listadas na Tabela 1 abaixo foram projetadas e otimizadas para expressão nas plantas de tabaco. Tabela 1 - Lista de proteínas expressas
Peptídeos de Sinal
[00156] (i) Seqüência de sinal do vacúolo do gene de cevada para precursor de aleuraína tiolprotease (acessão NCBI P05167 GI:113603) MAHARVLLLALAVLATAAVAVASSSSFADSNPIRPVTDRAASTLA (SEQ ID NO: 24).
[00157] (ii) Sinal do apoplasto de endo-1, 4-beta—glucanase Arabidopsis thaliana (Cell, acessão NCBI CAA67156.1 GI:2440033); SEQ ID NO. 9, codificado por SEQ ID NO. 7. Construção de plasmídeos
[00158] Os vetores de expressão da planta foram construídos conforme instruído no Exemplo 1, a composição de cada vetor de expressão construído foi confirmada via sequenciamento e análise de restrição.
[00159] Os vetores de expressão incluindo os seguintes cartuchos de expressão foram construídos: 1. Alfa 1 de Colágeno 2. Alfa 1 de Colágeno + subunidade beta de P4H humano 3. Alfa 1 de Colágeno + subunidade beta de P4H humano + LH3 humano 4. Alfa 2 de Colágeno 5. Alfa 2 de Colágeno + com subunidade alfa de P4H humano 6. Alfa 2 de Colágeno + com PH4 de Arabidopsis 7. Subunidade beta de P4H humano + LH3 humano 8. Subunidade alfa de P4H humano
[00160] Cada uma das seqüências de codificação acima descrita foi combinada de modo translacional a um peptídeo de trânsito do vacúolo ou a um peptídeo do trânsito do apoplasma ou estava isenta de quaisquer seqüências de peptídeo de trânsito, caso em que o acúmulo citoplasmático é esperado. Transformação de planta e triagem de PCR
[00161] As plantas de tabaco (Nicotiana tabacum, Samsun NN) foram transformadas com os vetores de expressão acima descritos de acordo com o esquema de transformação instruído na Figura 2.
[00162] As plantas transgênicas resultantes foram Escolhidas via PCR múltiplo utilizando quatro primers que foram projetados capazes de amplificar um fragmento de 324bp de alfa 1 de Colágeno e um fragmento de 537bp de alfa 2 de Colágeno (Tabela 2). A Figura 3 ilustra os resultados de uma tela de PCR múltiplo. Tabela 2 - Lista de primers para PCR múltiplo para amplificação de um fragmento de 324bp de alfa 1 de Colágeno e um fragmento de 537bn de alfa 2 de Colácreno
EXEMPLO 3 Detecção do colágeno humano em plantas transgênicas de tabaco
[00163] As proteínas totais solúveis foram extraídas dos transformantes de tabaco 2, 3 e 4 pela trituração de 500 mg das folhas em 0,5 ml de 50 mM de Tris-HC1 ph=7,5 um coquetel inibidor de protease "Completo" (produto #1836145 da Roche Diagnostics GmbH, 1 comprimido por 50 ml tampão). O extrato bruto foi misturado com 250“1 4X de aplicação de Amostra tampão contendo 10% de beta-mercaptoetanol e 8% de SDS, as amostras foram fervidas por 7 minutos e centrifugadas por 8 minutos em 13000 rpm. 20111 do sobrenadante foi carregado em 10% de um gel de poliacrilamida e testado com anticorpo (#AB745 da Chemicon Inc.) de anti-Colágeno I (desnaturado) em um procedimento padrão Western blot (Figura 4). W.T. é um tabaco de tipo selvagem. As bandas positivas de colágeno são visíveis nas plantas que são positivas de PCR para alfa 1 tipo I de colágeno ou alfa 2, ou ambos. A banda de controle positivo de 500ng de tipo I do colágeno da placenta humana (#CC050 da Chemicon Inc.) representa aproximadamente 0,3% das proteínas totais solúveis (aproximadamente 150pg) nas amostras das plantas transgênicas.
[00164] As plantas que expressam o colágeno no peso molecular esperado de até -1% das proteínas totais solúveis foram detectadas quando o colágeno foi direcionado ao vacúolo (Figura 4). O direcionamento subcelular do colágeno de comprimento total ao apoplasto foi atingido com êxito (Figura 5). As plantas que expressam o colágeno no citoplasma (isto é, nenhum peptídeo de direcionamento) não acumularam colágeno em níveis detectáveis demonstrando que o direcionamento subcelular do colágeno nas plantas é critico para o sucesso.
[00165] Além disso, em contraste com os estudos de Ruggiero et ai. 2000 e Merle et al. 2002, os quais demonstraram que o colágeno deficiente em propeptídeo N estava sujeito à proteólise significativa, utilizando a presente abordagem das proteínas de colágeno de comprimento total com propeptídeo C e propeptídeo N acumulado em compartimentos subcelulares em altos níveis.
[00166] Os presentes dados claramente demonstram que o cruzamento de duas plantas, cada uma expressando um tipo de cadeia de colágeno diferente, é vantajoso de modo que permite a seleção das plantas expressando níveis ideais de cada tipo de cadeia e cruzamento de plantas subseqüentes para conseguir a planta desejada de produção do colágeno.
[00167] O colágeno produzido pelas plantas da presente invenção inclui os propeptídeos nativos e, portanto, é esperado para formar uma proteína maior do que o controle humano que foi purificada pela proteólise. O peso molecular calculado das cadeias alfa 1 do Colágeno e alfa 2 sem hidroxilações ou glicosilações é o seguinte: Col1 com propeptídeos - 136kDa, Coll sem propeptídeos - 95kDa, Col2 com propeptídeos - 127kDa, Col2 sem propeptídeos -92 kDa.
[00168] Conforme pode ser observado na Figura 4, as bandas de Col1 nos transformantes 3-5 e 3-49 constam como maiores do que as bandas da Col1 em outras plantas. Isto indica a hidroxilação de prolina nas cadeias de colágeno pela holoenzima de prolina-4-hidroxilase humana composta de subunidades alfa e beta que foram co-expressadas nessas plantas e direcionadas ao mesmo compartimento subcelular conforme a cadeia de colágeno humana (p.ex., vacilolo). EXEMPLO 4 Montagem da hélice tripla do colágeno e estabilidade térmica nas plantas transgênicas
[00169] A montagem da hélice tripla do colágeno e a estabilidade térmica da hélice nas plantas transgênicas foram testadas pela desnaturação térmica seguida por digestão de tripsina ou pepsina do extrato de proteína bruta total das plantas transgênicas (Figuras 6a-b).
[00170] Em um primeiro experimento, as proteínas totais solúveis do tabaco 2-9 (expressando somente alfa 1 de col e nenhum P4h) e 3-5 (expressando alfa 1 + 2 de col e P4H) foram extraídas pela trituração de 500 mg de folhas em 0,5 ml de 50mM de Tris-HC1 pH=7,5, centrifugando por 10 minutos em 13000 rpm e coletando o sobrenadante. 50p1 do sobrenadante foi sujeito ao tratamento de calor (15 minutos em 332C ou 432C) e, então, imediatamente, colocado no gelo. A digestão de tripsina foi iniciada pela adição a cada amostra de 6p1 de 1 mg/ml.de Tripsina em 50 mM de Tris-HC1 pH=7,5. As amostras foram incubadas por 20 minutos em temperatura ambiente (aproximadamente 222C). A digestão foi terminada pela adição de 20p1 4X a aplicação da amostra tampão contendo 10% de beta- mercaptoetanol e 8% de SDS, as amostras foram fervidas por 7 minutos e centrifugadas por 7 minutos a 13000 rpm. 50p1 do sobrenadante foi carregado em 10% de um gel de poliacrilamida e testado com anticorpo de anti- Colágeno I (#AB745 da Chemicon Inc.) utilizando um procedimento padrão Western Blot. Os controles positivos eram amostras de -500 ng de colágeno humano I (#CC050 da Chemicon Inc., extraído da placenta humana pela digestão de pepsina) que foi adicionado a 50p1 das proteínas totais solúveis extraídas do tabaco w.t.
[00171] Conforme mostrado na Figura 6a, o hélice triplo do colágeno que se formou nas plantas #3-5, bem como o colágeno humano de controle foi resistente à desnaturação a 332C. Em contraste, o colágeno formado pelas plantas #2-9 desnaturado a 33°C. Esta diferença na estabilidade térmica indica uma montagem de hélice tripla bem sucedida e hidroxilação de prolina pós- translacional nos transformantes #3-5, que expressou tanto o alfa 1 do colágeno e alfa 2 do colágeno, bem como as subunidades alfa e beta do P4H.
[00172] Duas bandas nos transformantes #2-9 podem representar dímeros ou trímeros, que são estáveis após 7 minutos de fervura com SDS e mercaptoetanol. As bandas semelhantes são visíveis no colágeno humano (painel superior) e nos transformantes #3-5. Uma explicação possível é uma ligação covalente entre os dois peptídeos em diferentes hélices triplas (ligação cruzada), formada após a deaminação oxidativa de duas lisinas pela oxidase de Lisina.
[00173] Em um segundo experimento, as proteínas totais solúveis do tabaco transgênico 13-6 (expressando as cadeias alfa 1 e alfa 2 do colágeno - indicadas por setas, subunidades alfa e beta do P4H e LH3 humano) foram extraídas pela trituração de 500 mg de folhas em 0,5 ml de 100 mM de Trís- HC1 pH=7,5 e 300 mM de NaC1, centrifugando por 7 minutos a 10000 rpm e coletando o sobrenadante. 50p1 do sobrenadante foi sujeito ao tratamento de calor (20 minutos em 332C, 38°C ou 422C) e, então, imediatamente colocado no gelo. A digestão de pepsina foi iniciada pela adição a cada amostra de 4,5p1 de 0,1M de HC1 e 4p1 de 2,5 mg/ml de Pepsina em 10 mM de ácido acético. As amostras foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente (aproximadamente 222C). A digestão foi concluída pela adição de 5 pl de 1M de Tris sem tampão. Cada amostra foi misturada com 22p1 4X aplicação de Amostra tampão contendo 10% de beta-mercaptoetanol e 8% de SDS, fervida por 7 minutos e centrifugada por 7 minutos em 13000 rpm. 40p1 do sobrenadante foi carregado em 10% de um gel de poliacrilamida e testado com anticorpo de anti-Colágeno I (#AB745 da Chemicon Inc.) em um procedimento Western Blot. O controle positivo foi a amostra de -50 ng do colágeno humano I (#CC050 da Chemicon Inc., extraído da placenta humana pela digestão de pepsina) adicionado às proteínas totais solúveis do tabaco w.t.
[00174] Conforme ilustrado na Figura 6b, a hélice tripla do colágeno que se formou na planta #136 foi resistente à desnaturação a 42°C. A clivagem dos propeptídeos é primeiramente visível em 332C e gradualmente aumenta em eficiência quando a temperatura é elevada a 38°C e novamente a 42°C. O domínio de hélice tripla do colágeno clivado demonstra uma migração semelhante no gel para a migração do colágeno humano tratado com pepsina. O colágeno humano que foi utilizado neste experimento foi extraído da placenta humana pela proteólise de pepsina e, portanto, é deficiente em propeptídeos e alguns dos telopeptídeos. EXEMPLO 5 Expressão de P4H da Planta Indução do P4H da planta nativo
[00175] O cDNA de P4H do tabaco foi clonado e utilizado como uma sonda para determinar as condições e tratamentos que induziriam a expressão de P4H endógeno. A análise Northern Blot (Figura 7) claramente demonstra que o P4H é expresso em níveis relativamente altos no ápice do alvo e em baixos níveis nas folhas. O nível de P4H foi induzido significativamente nas folhas 4 horas após o tratamento de abrasão ("ferido" no painel inferior). Os resultados semelhantes foram atingidos utilizando outras condições de tensão (não mostradas). Detecção de subunidades alfa e beta do P4H humano e cadeias alfa 1 e alfa 2 do colágeno em plantas transgênicas do tabaco
[00176] A detecção das subunidades alfa e beta do P4H e cadeias alfa 1 e alfa 2 do tipo I do colágeno nas plantas transgênicas do tabaco foi efetuada utilizando o anticorpo de subunidade alfa de P4H anti-humano (#63-163 da ICN Biomedicals Inc.), o anticorpo de subunidade beta de P4H anti-humano (#MAB2701 da Chemicon Inc.) e o anticorpo de anti-Colágeno I (#AB745 da Chemicon Inc.). Os resultados de um western blot sondado com esses anticorpos são demonstrados na Figura 8.
[00177] A expressão das bandas alfa P4H, beta P4H, alfa 1 e alfa 2 do colágeno I foi confirmada na planta 13-6 (também transformada com LH3 humano). Os pesos moleculares calculados de alfa e beta do P4H, incluindo o peptídeo de sinal vacuolar são 65,5 kDa e 53,4 kDa, respectivamente. Os pesos moleculares calculados das cadeias alfa 1 e alfa 2 do Colágeno com propeptídeos, sem hidroxilações ou glicosilações, são 136 kDa e 127 kDa, respectivamente.
[00178] É apreciado que determinadas características da invenção, que são, para clareza, descritas no contexto de configurações separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única configuração. Opostamente, diversas características da invenção, que são, para brevidade, descritas no contexto de uma única configuração, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.
[00179] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as configurações específicas da mesma, fica claro que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes àqueles com habilidade na técnica. Adequadamente, pretendem-se admitir todas as tais alternativas, modificações e variações que ficam dentro do espírito e amplo escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e números de Acessão ao GenBank mencionados nesta especificação são incorporados no presente em sua totalidade por referência à especificação, na mesma medida como se cada publicação individual, patente, pedido de patente ou número de Acessão ao GenBank fosse especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado no presente por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não será interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anterior relacionada à presente invenção. Legenda das figuras FIGURA lA
[00180] 1A.1: As ligações são numeradas em círculos Locais únicos em negrito 1A.2: Fragmento sintetizado 1A.3: Sinal do apoplasto 1A.4: NdeI cancelado 1A.5: Genes sintetizados 1A.6: Promotor rbcSl 1A.7: Sinal Vac 1A.8: Aminoácidos 1A.9: Segunda Etapa 1A.10: Interrupção IA.11: Promotor rbcSl + 5UTR 1030bp 1A.12: 3UTR rbcSl + Term. 970bp 1A.13: Primeira Etapa 1A.14: Promotor pUCl8rbcSl+terminador 1A.15: O resgate é possível 1A.16: Também por EcoRI 1A.17: Terceira Etapa 1A.18: Primer reverso 1A.19: Primer à frente 1A.20: Observação: Sphl e PstI não são únicos! 1A.21: Esquema de Clonagem, Nível 1 1A.22: pBINPLUS clonagem múltipla localizada em lacZ gene com 10 unicas localizações (van Engelen et al., 1995, Transgeic Res 4: 288-290) FIGURA 1B
[00181] 1B.1: Esquema de Clonagem, Nível 2 18.2: Locais únicos em negrito 18.3: Fragmento sintetizado 18.4: Sinal do apoplasto 18.5: Segunda Etapa 18.6: Genes sintetizados 18.7: 252 aminoácidos 18.8: Sinal Vac 18.9: P4H beta humano ou p4H alfa humano ou P4H de planta 18.10: Interrupção 18.11: Promotor 35S + Ômega 480bp 18.12: Glicoronidase 18.13: Primeira Etapa 18.14: Os locais de restrição em GUS não são apresentados! 18.15: (somente se primeiro em pBINPLUS Resgate também é possível por BamHI & BgIII) 18.16: Terceira Etapa 18.17: Primer reverso 18.18: Primer à frente 18.19: Observação: Sphl e PstI não são únicos! 18.20: pBINPLUS clonagem múltipla localizada em lacZ gene com 10 unicas localizações (van Engelen et al., 1995, Transgeic Res 4: 288-290) FIGURA 1C
[00182] 1C.1: Esquema de Clonagem, Nível 3 1C.2: Locais únicos em negrito 1C.3: 958 aminoácidos 1C.4: Interrupção 1C.5: Genes sintetizados 1C.6: Proteinase C ou proteinase N 1C.7: Sinal Vac 1C.8: Primeira Etapa 1C.9: Sinal do apoplasto 1C.10: O resgate é possível Também por EcoRI 1C.11: Segunda Etapa 1C.12: Primer reverso 1C.13: Primer à frente 1C.14: Observação: Sphl e PstI não são únicos! 1C.15: pBINPLUS clonagem múltipla localizada em lacZ gene com 10 unicas localizações (van Engelen et al., 1995, Transgeic Res 4: 288- 290) FIGURA 1D
[00183] 1D.1: Esquema de Clonagem, Nível 4 1D.2: Locais únicos em negrito 1D.3.: Fragmento sintetizado 1D.4: Sinal do apoplasto 1D.5: Primeira Etapa 1D.6: 714 aminoácidos 1D.7: Sinal Vac 1D.8: LH3 humano 1D.9: Resgate e auto-ligação 1D.10: Primeira Etapa ver. 2 1D.11: Segunda Etapa 1D.12: Primer reverso 1D.13: Primer-à frente 1D.14: Observação: Sphl e PstI não são únicos! 1D.15: pBINPLUS clonagem múltipla localizada em lacZ gene com 10 unicas localizações (van Engelen et al., 1995, Transgeic Res 4: 288-290) FIGURA 2 2.1: Vacúolo 2.2: Citoplasma 2.3: Apoplasmo Figura 3 3.1: Co-transformação #2 3.2: Marcador de tamanho 3.3: Co-transformação #3 3.4: Controle negativo 3.5: Controle positivo REFERÊNCIAS (as outras referencias estão mencionadas no documento)
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Claims (3)
1. Método de produção de colágeno em uma planta ou em uma célula de planta isolada, caracterizado pelo fato de compreender expressar na planta ou célula de planta isolada uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência degenerada da SEQ ID NO: 1 que codifica uma cadeia alfa de colágeno conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3, uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência degenerada da SEQ ID NO: 4 que codifica uma cadeia alfa 2 de colágeno conforme estabelecida na SEQ ID NO: 6, uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida na SEQ ID NO: 12 ou uma sequência degenerada da SEQ ID NO: 12 que codifica a subunidade beta P4H conforme estabelecida na SEQ ID NO: 13 e uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência degenerada da SEQ ID NO: 14 que codifica a subunidade alfa I de P4H conforme estabelecida na SEQ ID NO: 15, deste modo produzindo o colágeno na planta.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo de Tabaco, Milho, Alfafa, Arroz, Batata, Soja, Tomate, Trigo, Cevada, Canola, Cenoura o Algodão.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta está sujeita a uma condição de tensão.
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