CN112823208A - 烟草转基因事件及用于检测与使用烟草转基因事件的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多种产生胶原蛋白的植物事件、用于检测植物事件的DNA分子及所述DNA分子在植物育种方法中的用途。

Description

烟草转基因事件及用于检测与使用烟草转基因事件的方法
相关申请案
本申请主张于2018年7月31日提交的美国临时专利申请62/712,289的权益，其整体内容通过引用的方式并入本文中。
序列表声明
本申请的序列表为档案名称78292Sequence Listing.txt的ASCII文件，创建于2019年7月30日，包含131,072字节，所述序列表与本申请同时提交，并且通过引用的方式并入本文中。
技术领域及背景技术
在本发明的一些实施例中，本发明涉及烟草转基因事件及用于检测与使用烟草转基因事件的方法。
胶原蛋白(Collagens)是构成脊椎动物及许多其他多细胞生物结构完整性的主要结构蛋白。I型胶原是骨头及肌腱的主要胶原成分，在皮肤、主动脉及肺中也能发现大量的I型胶原。I型胶原纤维具有极高的抗拉强度及有限的延展性。I型胶原最丰富的分子形式是由两个不同的α链[α1(I)]2及α2(I)组成的异三聚体。所有原纤维胶原分子都含有三条由重复的Gly-X-Y三联体构成的多肽链，其中X及Y可以是任何的氨基酸，但通常是亚氨基酸脯氨酸(imino acids proline)及羟脯氨酸(hydroxyproline)。
由形成胶原的原纤维合成的前体前胶原含有球状的N及C末端延伸肽。前胶原的生物合成是一个复杂的过程，涉及许多不同的翻译后修饰，包括脯氨酸及赖氨酸羟基化、N键及O键糖基化以及链内及链间二硫键的形成。执行这些修饰的酶以协调的方式起作用，以确保正确折叠及组装对齐的热稳定三螺旋分子。在自然界中，胶原的三螺旋结构的稳定性需要通过脯氨酸-4-羟化酶(P4H)进行脯氨酸的羟基化，从而在胶原链中形成羟脯氨酸的残基。
每一个前胶原分子在粗糙内质网内由三条组成的多肽链构成。由于多肽链通过内质网膜进行共译易位，脯氨酸及赖氨酸残基的羟基化发生在Gly-X-Y重复区。一旦多肽链被完全转移到内质网的内腔，C-前肽就会折叠。三个前胶原α链通过它们的C前肽结合形成三聚体分子，使得Gly-X-Y重复区域在其C末端形成一个成核点，从而确保链的正确排列。然后，Gly-X-Y区域在C至N方向折叠形成一个三螺旋。
赖氨酰羟化酶(LH，EC 1.14.11.4)、半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.50)及葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.66)是参与胶原的翻译后修饰的酶。它们依次将特定位置的赖氨酸残基修饰为羟基赖氨酸、半乳糖基羟基赖氨酸及葡萄糖基半乳糖基羟基赖氨酸残基。这些结构是胶原蛋白所特有的，并且对胶原蛋白的功能活动至关重要(Wang等人，2002年)。赖氨酰羟化酶3(Lysyl hydroxylase 3，LH3)是一种单一的人体酶，它能催化羟赖氨酸连接的碳水化合物形成的所有三个连续步骤。
WO2006/035442及WO2009/128076描述了通过表达构成胶原链的所有5个转基因以及负责修饰胶原链的酶单位(如上文所述，P4H及LH3)，在转基因烟草植物中产生人类前胶原。如Stein等人(2009年)在生物大分子(10:2640-5)中所述，相较于来自动物或人类组织的任何组织源性胶原，合成的人类I型前胶原显示出优越的生物功能。
已知外源基因在植物中的表达受其在植物基因组中的位置的影响，可能是由于染色质结构(例如：异染色质)或靠近整合位点的转录调控元件的接近程度(例如：增强子)(Weising等人(1988年)Ann.Rev.Genet 22:421-477)。同时，在基因组中的不同位点处的转基因的存在以不同的方式影响植物的整体表型。由于这个原因，经常需要筛选大量的事件(events)，从而识别以导入感兴趣的基因的最佳表达为特征的一事件。例如，在植物及其他生物中已经观察到，在多个事件之间的导入基因的表达水平可能存在很大的差异。表达的空间或时间模式也可能存在差异，例如，转基因在各种植物组织中的相对表达是不同的，这可能与导入的基因构建物(gene construct)中存在的转录调控元件所预期的模式不符。转基因的插入也会影响内源基因的表达。基于这些原因，通常产生数百到数千个不同的事件，并且基于商业目的，筛选出具有所需转基因表达水平及模式的单个事件。对于使用常规育种方法而通过有性异型杂交将转基因导入其他遗传背景而言，具有所需转基因表达水平或模式的事件是有用的。这些杂交的后代保持了原始转化子的转基因表达特性。这种策略用于确保许多品种的可靠基因表达，这些品种在多种生长条件下都具有良好的适应性并可能确保全年高产。
其他相关技术：
WO2006/035442
WO2009/128076
发明内容
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种在含有烟草DNA的一样品中可检测到的重组DNA分子，其中所述分子的核苷酸序列为：
(a)与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列；
其中所述重组DNA分子的存在用于诊断所述样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18DNA或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18DNA的子代。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种DNA分子，其中所述DNA分子包括：一多核苷酸片段，具有足够的长度以作为一DNA探针，所述DNA探针在严格的杂交条件下与一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA进行特异性杂交，其中在所述严格的杂交条件下，所述DNA分子的杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代。
根据本发明的一些实施例，所述重组DNA分子包括：
(a)与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同的一核苷酸序列；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种成对的DNA分子，其中所述成对的DNA分子包括：一第一DNA分子及一第二DNA分子，所述第一DNA分子及所述第二DNA分子在与一样品一起用于一扩增反应时作为引物，其中所述样品包括：烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA，从而产生一扩增子以诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA，其中所述扩增子包括：与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同的一核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种检测一重组DNA的存在的方法，其中所述重组DNA分子的存在用于诊断一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18DNA的子代，所述方法包括：
(a)在严格的杂交条件下，将所述样品与所述DNA分子接触；以及
(b)检测所述DNA分子与所述重组DNA的杂交；
其中所述杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA的存在。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种在一样品中检测烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA的存在的方法，其中所述方法包括：
(a)将所述样品与所述的成对的DNA分子接触；
(b)使用所述成对的DNA分子来进行足以产生一DNA扩增子的一扩增反应；以及
(c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在；
其中所述DNA扩增子包括：与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同的一核苷酸序列，以及其中所述扩增子的存在用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA。
根据本发明的一些实施例，所述方法还包括：检测与SEQ ID NO:1至5、7至8、10至19具有至少99％相同的一核苷酸序列中的至少一个。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种烟草植物、植物部分或烟草植物的细胞，其中所述烟草植物、所述植物部分或所述烟草植物的细胞包括：与SEQ IDNO:6或9具有至少99％相同的一核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述方法或植物还包括：检测LH3、P4Hb、胶原α1及/或胶原α2的存在及/或方向。
根据本发明的一些实施例，所述存在及/或方向与事件A3-29-305-17-09-18的存在及/或方向至少99％相同。
根据本发明的一些实施例，所述存在及/或方向与事件A3-29-305-17-09-18的存在及/或方向相同。
根据本发明的一些实施例，所述烟草植物是包括所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的一烟草植物的任何世代的一子代。
根据本发明的一些实施例，所述烟草植物、所述植物部分或所述烟草植物的细胞包括：与SEQ ID NO:1至5、7至8、10至19具有至少99％相同的一核苷酸序列中的至少一个。
根据本发明的一些实施例，所述子代是一近交烟草植物或一杂交烟草植物。
根据本发明的一些实施例，所述子代是列于表20、21、21a及22中的任何一个。
根据本发明的一些实施例，所述重组DNA分子源自列于表20、21、21a及22中任何一个的一烟草事件或所述烟草事件的子代。
根据本发明的一些实施例，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:34及35所示。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种生产前胶原的方法，其中所述方法包括：
(a)种植本文所述的植物；以及
(b)从所述植物分离所述前胶原。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种前胶原，其中所述前胶原是根据本文所述的方法而获得的。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种处理前胶原的方法，其中所述方法包括：
(a)提供本文所述的植物的一蛋白制剂；以及
(b)将所述蛋白制剂与一有效量的一酶接触，所述酶能够将前胶原加工成胶原。
根据本发明的一些实施例，所述酶包括无花果蛋白酶。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种烟草种子，其中所述烟草种子包括：一可检测量的一核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同，或与SEQ ID NO:6或9完全互补。
根据本发明的一些实施例，所述烟草种子包括：一可检测量的一核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1至5、7至8、10至19具有至少99％相同，或与SEQ ID NO:1至5、7至8、10至19完全互补。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种非活体的烟草植物材料，其中所述非活体的烟草植物材料包括一可检测量的重组DNA分子。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种烟草植物及烟草植物部分，其中所述烟草植物及所述烟草植物部分包括：在一DNA扩增方法中被测试时作为一模板的一DNA，从而产生一扩增子以诊断事件A3-29-305-17-09-18DNA的存在。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种确定包括事件A3-29-305-17-09-18的一烟草植物或烟草种子的接合性的方法，其中所述方法包括：
将包括烟草DNA的一样品与一引物组接触，所述引物组能够产生一第一扩增子及一第二扩增子，其中所述第一扩增子用于诊断事件A3-29-305-17-09-18，所述第二扩增子用于诊断不包括事件A3-29-305-17-09-18的天然烟草基因组DNA；
(i)将所述样品及所述引物组进行一核酸扩增反应；以及
(ii)在所述核酸扩增反应中检测所述第一扩增子或所述第二扩增子，其中所述第一扩增子用于诊断事件A3-29-305-17-09-18，所述第二扩增子用于诊断不包括事件A3-29-305-17-09-18的天然烟草基因组DNA；其中只有所述第一扩增子的存在时用于在所述样品中诊断一纯合事件A3-29-305-17-09-18DNA，以及所述第一扩增子及所述第二扩增子的同时存在时用于诊断事件A3-29-305-17-09-18等位基因的一烟草植物杂合子；或
将包括烟草DNA的一样品与含有至少一第一探针及至少一第二探针的一探针组接触，所述第一探针特异性杂交事件A3-29-305-17-09-18DNA，以及所述第二探针特异性杂交烟草基因组DNA，其中所述烟草基因组DNA因被插入事件A3-29-305-17-09-18的异源DNA而被破坏，并且不与事件A3-29-305-17-09-18DNA杂交；
(i)在严格的杂交条件下，将所述探针组与所述样品杂交；
其中在所述杂交条件下，仅检测到所述第一探针的杂交时用以诊断事件A3-29-305-17-09-18的一纯合等位基因，以及其中在所述杂交条件下，同时检测到所述第一探针及所述第二探针的杂交时用以诊断事件A3-29-305-17-09-18的一杂合等位基因。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种生产具有一改良农业性状的一植物的方法，其中所述方法包括：
(a)使本文所述的植物经受一育种计划及/或转基因及/或基因组编辑；以及
(b)选择表现出一改良农业性状的一植物。
根据本发明的一些实施例，所述子代包括A3-29-305-17-09-18与沙姆逊品种(Samsun)的杂交种。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种在含有烟草DNA的一样品中可检测到的重组DNA分子，其中所述分子的所述核苷酸序列为：
(a)与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列；
其中所述重组DNA分子的存在用于诊断所述样品中的烟草事件A3-29-305-17-09DNA或所述烟草事件A3-29-305-17-09DNA的子代。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种DNA分子，其中所述DNA分子包括：一多核苷酸片段，具有足够的长度以作为一DNA探针，所述DNA探针在严格的杂交条件下与一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的一重组DNA进行特异性杂交，其中在所述严格的杂交条件下，所述DNA分子的杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代。
根据本发明的一些实施例，所述重组DNA分子包括：
(a)与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种成对的DNA分子，其中所述成对的DNA分子包括：一第一DNA分子及一第二DNA分子，所述第一DNA分子及所述第二DNA分子在与一样品一起用于一扩增反应时作为引物，其中所述样品包括：烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的一重组DNA，从而产生一扩增子以诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的所述重组DNA，其中所述扩增子包括：与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种检测一重组DNA的存在的方法，其中所述重组DNA分子的存在用于诊断一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09DNA的子代，所述方法包括：
(a)在严格的杂交条件下，将所述样品与如本文所述的DNA分子接触；以及
(b)检测所述DNA分子与所述重组DNA的杂交；
其中所述杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的所述重组DNA的存在。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种在一样品中检测烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的一重组DNA的存在的方法，其中所述方法包括：
(a)将所述样品与如本文所述的成对的DNA分子接触；
(b)使用所述成对的DNA分子来进行足以产生一DNA扩增子的一扩增反应；以及
(c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在；
其中所述DNA扩增子包括：与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列，以及其中所述扩增子的存在用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的所述重组DNA。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种烟草植物、植物部分或烟草植物的细胞，其中所述烟草植物、所述植物部分或所述烟草植物的细胞包括：与SEQ IDNO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述烟草植物是包括所述烟草事件A3-29-305-17-09的一烟草植物的任何世代的一子代。
根据本发明的一些实施例，一核苷酸序列中的至少一个与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同。
根据本发明的一些实施例，所述子代是一近交烟草植物或一杂交烟草植物。
根据本发明的一些实施例，所述子代是列于表20至30中的任何一个。
根据本发明的一些实施例，所述重组DNA分子源自列于表20至30中任何一个的一烟草事件或所述烟草事件的子代。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种生产前胶原的方法，其中所述方法包括：
(a)种植本文所述的植物；以及
(b)从所述植物分离所述前胶原。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种前胶原，其中所述前胶原是根据本文所述的方法而获得的。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种处理前胶原的方法，其中所述方法包括：
(a)提供本文所述的植物的一蛋白制剂；以及
(b)将所述蛋白制剂与一有效量的的一酶接触，所述酶能够将前胶原加工成胶原。
根据本发明的一些实施例，所述酶包括无花果蛋白酶。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种烟草种子，其中所述烟草种子包括：一可检测量的一核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1至19具有99％相同，或与SEQ ID NO:1至19完全互补。
根据本发明的一些实施例，所述烟草种子包括：一可检测量的一核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1至19具有99％相同，或与SEQ ID NO:1至19完全互补。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种非活体的烟草植物材料，其中所述非活体的烟草植物材料包括一可检测量的如本文所述的重组DNA分子。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种烟草植物及烟草植物部分，其中所述烟草植物及所述烟草植物部分包括：在一DNA扩增方法中被测试时作为一模板的一DNA，从而产生一扩增子以诊断事件A3-29-305-17-09DNA的存在。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种确定包括事件A3-29-305-17-09的一烟草植物或烟草种子的接合性的方法，其中所述方法包括：
将包括烟草DNA的一样品与一引物组接触，所述引物组能够产生一第一扩增子及一第二扩增子，其中所述第一扩增子用于诊断事件A3-29-305-17-09，所述第二扩增子用于诊断不包括事件A3-29-305-17-09的天然烟草基因组DNA；
(i)将所述样品及所述引物组进行一核酸扩增反应；以及
(ii)在所述核酸扩增反应中检测所述第一扩增子或所述第二扩增子，其中所述第一扩增子用于诊断事件A3-29-305-17-09，所述第二扩增子用于诊断不包括事件A3-29-305-17-09的天然烟草基因组DNA；其中只有所述第一扩增子的存在时用于在所述样品中诊断一纯合事件A3-29-305-17-09DNA，以及所述第一扩增子及所述第二扩增子的同时存在时用于诊断事件A3-29-305-17-09等位基因的一烟草植物杂合子；或
将包括烟草DNA的一样品与含有至少一第一探针及至少一第二探针的一探针组接触，所述第一探针特异性杂交事件A3-29-305-17-09DNA，以及所述第二探针特异性杂交烟草基因组DNA，其中所述烟草基因组DNA因被插入事件A3-29-305-17-09的异源DNA而被破坏，并且不与事件A3-29-305-17DNA杂交；
(i)在严格的杂交条件下，将所述探针组与所述样品杂交；
其中在所述严格的杂交条件下，仅检测到所述第一探针的杂交时用以诊断事件A3-29-305-17-09的一纯合等位基因，以及其中在所述严格的杂交条件下，同时检测到所述第一探针及所述第二探针的杂交时用以诊断事件A3-29-305-17-09的一杂合等位基因。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种生产具有一改良农业性状的一植物的方法，其中所述方法包括：
(a)使如本文所述的植物经受一育种计划及/或转基因及/或基因组编辑；以及
(b)选择表现出一改良农业性状的一植物。
根据本发明的一些实施例，所述子代包括A3-29-305-17-09与弗吉尼亚K358品种的杂交种。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解含意相同的含义。尽管可以在本发明实施例的实践或测试中使用与本文所描述的方法及材料类似或等效的方法及材料，但在下文中描述多个示例性方法及/或材料。如有冲突，以包括定义在内的专利说明书为准。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在限制本发明。
附图说明
本文仅通过举例的方式，参考多个附图来描述本发明的一些实施例。现在具体参考附图，应当强调，所示的细节是作为示例及用于对本发明的实施例的说明性讨论的目的。在这方面，结合附图所进行的描述对于本领域技术人员来说是显而易见的，本领域技术人员可以知道如何实践本发明的实施例。
在附图中：
图1是育种事件A3-29-305-17-09中F1至F5谱系的示意图。绿色填充表示选定的线条及谱系。
图2是所有F5谱系的前胶原(PC)库产量的分析图。酶联免疫吸附剂测定的阳性对照组(PC-ELISA)一致地显示，相对于其他测试的F4品系子代(分离到F5群体)，A3-29 F4品系305-09及其F5的各种衍生物的产量最高。在所有F5品系中n＝2，对照组中n＝3。误差线代表连续分析中PC浓度的范围。选定的植物以红色填充；对照的植物以空白填充。
图3是示出所选F5品系/谱系的单株植物的PC的产量分析的图表。F5 A3-29-305-17-09单株植物的PC浓度表示个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了7种最佳植物。
图4是显示A3-29-434-19-15F5单株植物的PC浓度的图表，所述图表显示个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了3种最佳植物。
图5是显示A3-29-305-17-17F5单株植物的PC浓度的图表，所述图表显示个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了3种最佳植物。应当注意，测试始终在特定植物的种子上进行，因此结果代表了后代。
图6是显示A3-29-305-17-02F5单株植物的PC浓度的图表，所述图表显示了个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)，这些植物都没有被选择。
图7是显示A3-29-353-04-19F5单株植物的PC浓度的图表，所述图表显示个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了3种最佳植物。
图8是显示A3-29-355-04-42F5单株植物的PC浓度的图表，所述图表显示个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了1种最佳植物。
图9是显示A3-29-353-04-72F5单株植物的PC浓度的图表，所述图表显示个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)，这些植物都没有被选择。
图10是显示A3-29-305-13-18F5单株植物的PC浓度的图表，所述图表显示个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)，这些植物都没有被选择。
图11是显示“优胜者”F5单株植物的比较PC产量分析的图表。两次连续分析优胜者ELISA(第一次为深色、第二次为浅色)。结果以控制线的百分比(A3-29-F1)给出。相较于对照组，所有样品均显示出较高的PC产量。在两个案例中，两个ELISA值的其中一个非常接近对照组(305-17-17#16及353-04-19#8)。每种颜色代表不同的谱系。
图12是所有F6谱系的集合前胶原(PC)产量的分析图。在F6幼苗中的总体PC浓度(n＝1)。在A3-29 F6品系的子代可发现一致且相对高的PC水平，特别是A3-29-305-17-09及A3-29-305-17-17谱系。每种颜色代表不同的谱系。
图13是显示完全发育的选定F6品系(n＝3)中集合PC浓度的图表。产量最高的PC品系是F5-305-17-09的子代。相较于A3-29 F1品系，PC水平提高约50％，并且相较于Z1生产品系，PC水平提高3.5倍。选取4个最佳品系进行单株植物的分析。每种颜色代表不同的谱系。
图14是显示选定F6品系中单株植物的PC产量的分析图表。A3-29-305-17-09-10F6单株植物的PC浓度示出个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了1种最佳植物。
图15是显示A3-29-305-17-09-18F6单株植物的PC浓度的图表，所述图表示出个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了2种最佳植物。
图16是显示A3-29-305-17-09-25F6单株植物的PC浓度的图表，所述图表示出个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了3种最佳植物。
图17是显示A3-29-305-17-09-37F6单株植物的PC浓度的图表，所述图表示出个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了4种最佳植物。
图18是显示A3-29-305-17-09-15F6单株植物的PC浓度的图表，所述图表示出个别最佳产量植物的分离。针对“优胜者”ELISA(红色填充)选择了1种最佳植物。
图19是蛋白质印迹法(Western Blot,WB)分析的照片。抗COL免疫印迹分析显示所有测试的植物的PC水平均高于A3-29 F1对照组(红色箭头)。
图20是蛋白质印迹法分析的照片。抗P4Hα免疫印迹分析。在所测试的候选植物中，植物37-01及18-25(红色箭头)表现出较低的P4Hα表达，而植物37-31及25-05表现出较高的P4Hα表达(蓝色箭头)。
图21是蛋白质印迹法分析的照片。抗P4Hα免疫印迹分析。在所测试的候选植物中，植物25-05及37-01(红色箭头)表现出P4Hα的下降，而植物18-33、37-10、18-25、15-13及25-04表现出P4Hα的增加(蓝色箭头)。
图22是插入特征的示意图。事件引物(EP)、基因引物(Gp)、左边界引物(LBP)、右边界引物(RBP)。
图23是事件1在基因组中位置的示意图；
图24A至图24B显示凝胶PCR上的事件1特征。图24A：针对右连接，使用事件1特异性引物的插入特征。图24B：针对左连接，使用事件1特异性引物的插入特征。在表35、事件#1及表36至表37中列出所述多个引物。
图25A至图25B示出边界连接PCR的结果。图25A至图25B：使用基因组引物及边界引物的左边界PCR、扩增子大小为1至400个碱基对(bp)；图25B：使用基因组引物及边界引物的右边界PCR，1至大约500个碱基对。在表35、事件#1及表36至表37中列出所述多个引物。
图26示出事件1的PCR产物及桑格测序(SEQ ID NO:1-4)。
图27是事件2(P4Hα)在基因组中位置的示意图。
图28A至图28B示出事件2的特征。图28A：针对事件2的左连接，使用特异性引物的插入特征。图28B：针对事件2的右连接，使用特异性引物的插入特征。在表35、表#2及表36至表37中列出所述多个引物。
图29A至图29C示出经由桑格分析的事件特征。边界连接PCR：图29A至图29B为使用基因组引物及边界引物的左边界PCR、扩增子的大小分别为1至400个碱基对及2至4500个碱基对。图29C为使用基因组引物及边界引物的右边界PCR，1至大约800个碱基对。在表35、事件#2及表36至表37中列出所述多个引物。
图30示出事件2的PCR产物及桑格测序(SEQ ID NO:5-9)。
图31是基因组中事件3的位置的示意图。
图32示出使用事件3左连接引物的插入特征(参见表35)。
图33A至图33B示出边界PCR：图33A至图33B，使用基因组引物及边界引物的左边界PCR，扩增子的大小为1至800个碱基对、2至大约2千个碱基对。在表35、事件#3及表36至表37中列出所述多个引物。
图34示出基于纳米孔的测序及桑格测序的结果(SEQ ID NO:10-14)。
图35是事件4在基因组中的位置的示意图。
图36示出使用事件4左边界引物的插入特征。在表35、事件#4及表36至表37中列出所述多个引物。
图37示出基于纳米孔的测序及桑格测序的结果(SEQ ID NO:15-16)。
图38示出事件5在基因组中的位置的示意图。
图39示出使用事件5左连接引物的插入特征。在表35、事件#5及表36至表37中列出所述多个引物。
图40示出边界连接PCR：使用基因组引物的左边界PCR，扩增子的大小为2至大约3千个碱基对、3至2千个碱基对。在表35、事件#5及表36至表37中列出所述多个引物。
图41示出基于纳米孔的测序及桑格测序的结果(SEQ ID NO:17-19)。
图42是显示选定F1植物中的PC浓度(毫克/公斤叶片)、叶片生物量(格令/株)及总PC(分克)的条形图。F1中的所有转基因都是半合子，因此PC浓度预计只有其潜力的一半。许多植物的生物产量(叶重)潜力似乎很高(1000格令/株或更高)。
图43是一个条形图，所述条形图显示选定的F3植物及“A3-29-305-17-09-18 F6混合”生产品系的3个对照组(红色条)中的PC浓度(毫克/公斤叶片)。相较于目前的生产品系，至少有14种不同的植物具有更好的PC产量(红色箭头)。
图44是一个条形图，所述条形图显示选定的F4植物的PC浓度(毫克/公斤叶片，蓝色条)及叶片重量(格令，橙色点)。相较于“A3-29-305-17-09-18 F6混合”生产品系，所有植物的PC浓度及/或生物量都更高。
图45显示预期的大小。P4hB+LH3及P4Ha:MW(梯状标志III)，A3-29-305-17-09-18F5，野生型，无模板对照组(NTC)。Cola2：MW:A3-29-305-17-09-18 F5，2至300，野生型，NTC，Cola1 MW，A3-29-305-17-09-18 F5，2至272，野生型，NTC。按照以下样品顺序评估所有品系：1：MW(PCRBIO梯形标志III)；2：A3-29 F1；3：A3-29-305-17-09 F4；4：A3-29-305-17-09-F4；5：A3-29-305-17-09-18 F6*；6：A3-29-305-17-09-18 F6**；7：A3-29-305-17-09-18F6***；8：Samson野生型*；9：Samson野生型**；10：Virginia K358野生型*；11：VirginiaK358野生型**；12：[K358 x A3-29-305-17-09]-35-19-21-18-13F6*；13：K358 x A3-29-305-17-09]-35-19-21-18-13 F6**。Asterix指的是重复序列。
图46显示上部分的P4Hb及LH3的右边界。下部分的P4Ha的右边界。按照以下样品顺序评估所有品系：1:MW(PCRBIO梯形图III)；2:A3-29 F1；3:A3-29-305-17-09 F4；4:A3-29-305-17-09-F4；5:A3-29-305-17-09-18 F6*；6:A3-29-305-17-09-18 F6**；7:A3-29-305-17-09-18 F6**；8:Samson野生型*；9:Samson野生型**；10:Virginia K358野生型*；11:Virginia K358野生型**；12：[K358 x A3-29-305-17-09]-35-19-21-18-13F6*；13:[K358x A3-29-305-17-09]-35-19-21-18-13 F6**。
图47显示了上部分的Cola2的左边界。下部分的Cola1的左边界引物MP_Col_3R及RP2。按照以下样本顺序评估所有品系：1:MW(PCRBIO梯形图III)；2:A3-29 F1；3:A3-29-305-17-09 F4；4:A3-29-305-17-09-F4；5:A3-29-305-17-09-18 F6*；6:A3-29-305-17-09-18 F6**；7:A3-29-305-17-09-18 F6**；8:Samson野生型*；9:Samson野生型**；10:Virginia K358野生型*；11:Virginia K358 WT**；12：[K358 x A3-29-305-17-09]-35-19-21-18-13 F6*；13:K358 x A3-29-305-17-09]-35-19-21-18-13 F6**。
图48显示Cola1左边界引物MP_Col_4R及RP2。
图49显示左上：MW PCRBIO梯形标志III P4Hb+LH3右边界的预期大小为800个碱基对。右上：MW PCRBIO梯形标志III P4Ha右边界，预期大小为800个碱基对。左下：MW PCRBIO梯形标志III Cola2左边界，预期大小为800个碱基对。右下：MW PCRBIO梯形标志II Cola1左边界，预期大小为3千个碱基对。
图50显示MW PCRBIO梯形标志II，Cola1左边界的预期大小为2千个碱基对。
具体实施方式
在本发明的一些实施例中，本发明涉及一种烟草转基因事件及用于检测与使用烟草转基因事件的方法。
在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明在其应用中不一定限于以下描述中阐述或通过示例示出的细节。本发明能够以其他实施例来实施或以各种方式实施。
本发明人先前已建立可用于生产人类前胶原的转基因植物品系。如WO2006/035442及WO2009/128076所述，这些转基因品系表达5个转基因，包括人类胶原蛋白1α1(Cola1)、人类胶原蛋白1α2(Cola2)、人类P4Hα(P4Ha)及P4Hβ(P4Hb)以及人类LH3。
在将本发明的实施例简化以进行实践的同时，本发明人已经开发出具有高产量的人类I型前胶原(PC)的转基因烟草植物品系。育种计划是基于重复的自交周期及高产量子代的选择，最终导致提高纯合性(homozygosity)。由于表现出较高的前胶原产量及能够通过种子进行繁殖的选择，因此纯合品系是优选的。以种子为基础的繁殖应显着降低植物的成本，缩短获得可供商业化生产植物的周期。所述结果是基于将F4、F5品系与Z1进行比较的结果，Z1是半合子沙姆逊品种(Samsun line)，即20-279(P4Hα；P4Hβ；LH3)与2-372(Col1；Col2)杂交的结果(参见图13)。F4(A3-29-305-17-09)及F5(A3-29-305-09-18)等子代以及其自交或杂交种证明了优越性，例如：具有不同的遗传背景(图42至图44以及下文的示例章节及示例章节中的表格)。
然后，本发明人理解，有利的是能够检测事件的存在，并且在这种情况下检测多个整合位点以确定有性杂交的子代是否包含感兴趣的转基因以及所述转基因在染色体中的位置。此外，一种检测特定事件的方式有助于遵守针对来自重组作物的产品进行上市前批准及贴标签的法规，或用于环境监测、田野中作物的性状监测、或来自收成作物的产物监测，以及用于确保受监管或合同条款约束的各方遵守规定。因此，本发明人已经识别出多个分子连接点，所述多个分子连接点可以用作检测获胜事件(winning event)(A3-29-305-17-09或A3-29-305-17-09-18)或所述获胜事件的子代或杂交种的存在的有价值标记。所述事件的特征是特定且独特的DNA片段，所述DNA片段能够用于检测一样品中的所述事件的存在。
A3-29-305-17-09或A3-29-305-17-09-18植物也用于育种计划，所述育种计划旨在将所述事件导入野生型烟草品种背景中，以便生产出更好的农业生产品系，并提高植物中前胶原的产量(参见示例3及示例4)。例如，杂交种(F1)，图42显示了A3-29-305-17-09-18与沙姆逊品种的杂交。杂交种K358 X A3-29-305-17-09(F4)如图43至图44所示。表20至30中提供了此类杂交种的进一步说明。
如本文所用的术语，“前胶原”是指包含N端前肽及C端前肽的人类胶原蛋白分子。人类前胶原氨基酸序列由SEQ ID NO:25及26确定。
这些序列经由核苷酸序列NO:20及21进行编码。
如本文所用的术语，“P4H”是指人类P4H酶，所述人类P4H酶能够羟基化所述胶原α链[即，仅羟基化Gly–X–Y三联体的脯氨酸(Y)的位置]。P4H由两个亚单位组成，α及β，如基因库编号P07237及P13674所示。两个亚单位都是形成一种活性酶所必需的，而β亚单位也具有伴侣功能(chaperon function)。所述序列由SEQ ID NO:22及23编码。
如本文所用的术语，“LH3”或“赖氨酰羟化酶3”是指基因库编号O60568，所述LH3能够催化如羟赖氨酸连接的碳水化合物形成中的所有三个连续修饰步骤。
LH3由SEQ ID NO:24编码。
WO2006/035442中提供了用于转化初始品系(参见图1)的表达盒(expressioncassettes)，并且因此表示构成所述事件的重组DNA序列的来源。
如上文所述，整合事件的分子特征是在品系上完成的，以及A3-29-305-17-09-18F5是“获胜”事件A3-29-305-17-09 F4的自花授粉的优良产物。
因此，根据本发明的一个方面，提供一种烟草植物、植物部分或所述烟草植物的细胞，所述烟草植物、所述植物部分或所述烟草植物的细胞包含与SEQ ID NO:1至19(例如：6或9)具有至少99％相同或完全互补的一核苷酸序列。
与多个SEQ ID NO至少99％相同的一核苷酸序列表示为“事件(event)”。
如本文所用的术语“事件”是指来自转基因植物的DNA，所述转基因植物包括：插入的DNA(重组DNA)以及紧邻所述插入的DNA的烟草侧翼基因组序列(5’或3’)，在本文中也称为“连接(junctions)”。这样的DNA是独特的，并且预期被转移到一子代，所述子代接收含有感兴趣的转基因的所述插入的DNA，这是包含插入的DNA(例如：A3-29-305-17-09-18 F5)的一个亲本系及不包含插入的DNA的稳定亲本系的一有性杂交的结果。
在本文件的任何地方，DNA事件的分析或存在与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同或完全互补，并且可能伴随与SEQ ID NO:1至5、7至8、10至18及/或19具有至少99％相同或完全互补的核苷酸序列的分析或存在。
替代地，可以对与SEQ ID NO:1至19(例如：6或9)具有至少99％相同或完全互补的多个核苷酸序列中的任何一个进行分析。
如本文所定义，所述短语“稳定的亲本系”是指开放式授粉的自交系，在自花授粉及种植的周期内对所需的植物来说是稳定的。根据一个具体的实施例，本发明的亲本系中95％的基因组呈纯合形式。
因此，所述事件可以经由杂交或自花授粉的方式传递到下一个世代(子代)。即使在与一轮回亲本重复回交后，所述事件也会在同一染色体位置的杂交后代中出现。
在这种情况下，所述事件包括由SEQ ID NO:1至19表示的10个DNA连接点或与SEQID NO:1至19具有至少99％(例如：至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8％，例如，100％)相同的一核苷酸序列。
可以经由确定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至全部(10个)的连接点来识别一事件。
根据一个特定的实施例，每个转基因在杂合植物的基因组中以至少一个拷贝存在，或在纯合植物(例如：P4Hb-LH3存在于两个位置)中以至少两个拷贝存在(例如：至少3个拷贝、至少4个拷贝)。
所述事件的DNA可以存在于每个细胞中，并且存在于所述烟草植物、烟草种子以及含有所述事件的烟草组织的一个染色体上的每个基因组中。由于烟草基因组是以孟德尔方式传递给子代的，如果烟草植物对于事件插入是纯合的，则每个子代烟草植物及细胞将在包含所述事件插入的亲本染色体的每个等位基因上包含事件DNA，并由来自亲本的子代继承。然而，如果含有所述事件DNA的所述烟草基因组是一杂合或杂交亲本，则大约50％的花粉及大约50％的与亲本交配的胚珠将包含所述烟草事件DNA，导致含有所述事件DNA的子代的一混合群体，以及在这种杂交产生的子代中，大约50％到75％的子代具有传递给这种子代的所述事件DNA。
如本文所用，本文在两个核酸序列的上下文中使用的“序列同一性”或“相同”或类似用语包括提及两个序列中的残基在对齐时是相同的。
同一性可以使用任何同源性比较软件来确定，所述软件包括：国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastN软件，例如：通过使用默认参数。
根据一个具体实施例，所述植物包括如本文所述的事件。
本文所用的术语“植物”包含全株、嫁接植物，以及植物及植物部分的子代，包括：种子、嫩枝、茎、根、砧木、接穗及植物细胞、组织及器官。所述植物可以是任何形式，包括：悬浮培养物、胚胎、分生区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉及小孢子。根据一个具体实施例，所述植物部分是种子的叶子。
根据一个具体实施例，所述植物部分包括DNA(例如：所述事件的DNA)。
如本文所用的术语“烟草”是指烟草属的任何植物，包括但不限于：烟草(N.tabacum)、粉蓝烟草(N.glauca)、黄花烟草(N.rustica)以及粘烟草(N.glutinosa)。
根据一个具体实施例，所述烟草属于烟草的一个品种。
根据一个具体实施例，所述烟草属于粉蓝烟草种的一个品种。
根据一个具体实施例，所述烟草属于黄花烟草种的一个品种。
根据一个具体实施例，所述品种是选自于由以下所组成的群组：N.tabacumcv.Cuban habano 2000、N.tabacum cv.Burley Original、N.glauca Blue tree、N.tabacum cv.Virginia、N.tabacum cv.KY160、N.tabacum cv.Virginia K326、N.tabacumcv.Virginia K358、N.tabacum cv.Burley TN86、N.tabacum cv.Burley TN90、N.tabacumcv.PG04、N.tabacum cv.KY171LC、N.tabacum cv.Maryland、N.tabacum cv.Samsun NN、N.tabacum cv.MD 609、N.tabacum cv.Tukish izmir、N.tabacum cv.Virginia gold 1、N.tabacum cv.Narrow leat Madole、N.tabacum cv.Banket AA、N.tabacum cv.Lizardtail Orinoco、N.tabacum cv.Virginiak346、N.tabacum cv.Black mammoth、N.tabacumcv.Cuban criollo 98、N.tabacum cv.Cuban criollo 98、N.tabacum cv.Cuban criollo98、N.tabacum perique、N.tabacum little wood、N.tabacum little wood N.以及tabacum cv.Burley Hampton.。
可使用的特定烟草品种的其他示例包括但不限于：亮叶(brightleaf)、白肋烟(burley)、板烟(cavendish)、克罗乔(corojo)、克里奥罗(criollo)、东方烟草(oriental)、petite Havana、SR1、thuoc lao、type22、野生烟草、Xanthi及Y1。
如本文所用的词语“子代(progeny)”是指本发明植物的后代或第一代(即A3-29-305-17-9-18)以及所有后续的后代，本发明的植物与任何其他植物(无论是否包括所述事件)的杂交包括所述事件。本发明的子代是本发明的植物的任何杂交后代。
“子代”还包括通过营养繁殖或繁殖获得的带有本发明的所述事件的植物。
因此，根据一个具体的实施例，所述烟草植物是指包含事件A3-29-305-17-9-18(如上所述)或其任何子代(由于具有相同背景或不同品种的自交或杂交的结果)或植物繁殖或增殖的烟草植物。
根据一个具体的实施例，所述子代是F5、F6、F7、F8、F9或F10。
根据一个具体的实施例，所述植物是杂交植物(例如：杂交种子)。
根据一个具体的实施例，所述植物是自交植物。
这样的子代的示例包括但不限于：A3-29-305-17-09-18 F6；A3-29-305-17-09-18-33-2 F7；A3-29-305-17-09-18-33-10 F7；A3-29-305-17-09-25-04-19 F7；A3-29-305-17-09-37-28-31 F7以及示例3及4所述的杂交种(如表20、21、21a及22所示)，只要所述杂交种包括所述事件。
子代植物可以自花授粉(也称为“自交”)，以产生真正的植物育种品系，即转基因的纯合植物。适当的子代自交可以产生转基因纯合的植物(至少1、2、3、4或5个转基因)。
替代地，子代植物可以与另一个不相关的植物杂交，从而产生一个品种种子或杂交种子或植物。其他不相关的植物可以是转基因植物或非转基因植物。因此，本发明的品种种子或杂交种子可以通过将包含所述烟草事件A3-29-305-17-9-18的特定且独特的DNA的第一亲本与包含农业上有价值性状(例如：对生物逆境及/或非生物逆境的耐受性、优势、产量、生物量等，参见示例3至4)的第二亲本有性杂交而获得，从而产生一个包含烟草事件A3-29-305-17-9-18的特定且独特DNA的杂交种，并且具有农业价值的性状，所述性状是杂交及选种的结果，并且可能是杂种优势的结果。只要杂交或自交能产生本发明的植物或种子，即具有至少一个包含烟草事件A3-29-305-17-9-18的DNA的等位基因的种子，则每个亲本可以是杂交种或自交种/品种。
本发明也考虑与亲本植物进行回交以及与非基因转殖植物进行外交(out-crossing)，营养繁殖也是如此。关于其他常用于不同性状及作物的育种方法的描述，可以在以下参考文献中找到，例如：Fehr，Wilcox J.ed.，美国农学会，Madison WI(1987年)的《品种培育的育种方法》中。
根据一个具体的实施例，所述植物的特征是生长温度介于12至36℃。
以下测量是在收获时进行的，例如：在收获阶段，例如：60天。
根据一个具体的实施例，所述植物(例如：杂种)的特征是其优势高于A3-29品系，所述优势表现为生物量至少增加10％、30％、50％、70％、100％、200％、250％或300％。
根据一个具体的实施例，所述植物(例如：杂种)的特征是其产量高于A3-29品系或Z1品系，表现为叶片的前胶原产量(mg/kg)至少增加30％、50％、70％、100％、200％、250％、300％、350％、400％、500％或更多。
根据一个具体的实施例，所述植物(例如：杂种)的特征是其叶片重量高于A3-29品系，例如：至少450克/植株。根据一个具体的实施例，所述叶片重量比A3-29品系高30％、40％、50％(例如：比A3-29-305-17-9 F4或A3-29-305-17-9-18 F5的杂交种至少高50％)。
根据一个具体的实施例，前胶原(例如：F4、F5或其杂交种)的浓度很高，例如：高于60毫克/公斤的湿叶片。
根据一个具体的实施例，前胶原的产量为60至200毫克/植株。
如上所述，本发明人已对事件进行了特征化，并在此提供用于识别所述事件的分子工具。
因此，根据本发明的一个方面，本发明提供一种在含有烟草DNA的一样品中可检测到的重组DNA分子，其中所述分子的核苷酸序列为：
(a)与SEQ ID NO:1至19(例如：6或9)具有至少99％相同；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列；
其中所述重组DNA分子的存在用于诊断所述样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18 DNA或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18 DNA的子代。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种DNA分子，所述DNA分子包括：一多核苷酸片段，具有足够的长度以作为一DNA探针，所述DNA探针在严格的杂交条件(例如：表31)下与一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA进行特异性杂交，其中在所述严格的杂交条件下，所述DNA分子的杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种成对的DNA分子，所述成对的DNA分子包括：一第一DNA分子及一第二DNA分子，所述第一DNA分子及所述第二DNA分子在与一样品一起用于一扩增反应时作为引物，其中所述样品包括：烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA，从而产生一扩增子以诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA，其中所述扩增子包括：与SEQ ID NO:1至19(例如：6或9)具有至少99％相同的一核苷酸序列(例如：至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8％，例如：100％相同)。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种检测一重组DNA的存在的方法，所述重组DNA分子的存在用于诊断一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18 DNA的子代，所述方法包括：
(a)在严格的杂交条件下，将所述样品与本文所述的DNA探针分子接触；以及
(b)检测所述DNA分子与所述重组DNA的杂交；
其中所述杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA的存在。示例性的严格杂交条件在表31中示出，但本领域的技术人员将知道如何在提供独特杂交的范围内修改杂交条件。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种在一样品中检测烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA的存在的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与一成对的DNA分子接触，所述成对的DNA分子可作为用于扩增所述事件的引物；
(b)使用所述成对的DNA分子来进行足以产生一DNA扩增子的一扩增反应；以及
(c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在；
其中所述DNA扩增子包括：与SEQ ID NO:1至19(例如：6或9)具有至少99％(例如：至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8％，例如：100％)相同的一核苷酸序列，以及其中所述扩增子的存在用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA。
根据一个具体的实施例，所述重组DNA分子包括：
(a)与SEQ ID NO:1至19(例如：6或9)具有至少99％相同的一核苷酸序列；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列。
根据一个具体的实施例，所述子代是列于表20、21、21a及22中的任何一个。
根据一个具体的实施例，所述重组DNA分子源自一烟草事件或所述烟草事件的子代，所述烟草事件或所述烟草事件的子代包括与SEQ ID NO:1至19(例如：6或9)具有至少99％相同或完全互补的一核苷酸序列。
根据一个具体的实施例，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:6或9所示。
如本文所用的术语“重组DNA”是指合成的DNA，所述合成的DNA包含转基因序列、顺式作用调节序列(例如：启动子、增强子、终止子)或用于表达的DNA盒的序列(例如：左边界、右边界等)。
根据一个具体的实施例，重组DNA不具有内含子序列。
根据一个具体的实施例，所述连接包括：所述重组序列及所述烟草植物的基因组序列，所述基因组序列在5’到3’或3’到5’方向上取决于重组序列在基因组DNA的有义链或反义链中的整合。
如本文所用的术语“样品”是指一种基本上为纯烟草DNA或含有烟草DNA的组合物。在任何一种情况下，所述样品都是生物样品，即含有生物材料(但也可含有非生物材料)，包括但不限于：直接或间接从烟草基因组中获得或衍生的DNA，所述烟草基因组包括事件或其后代。“直接”是指本领域技术人员通过裂解烟草细胞(或通过获得含有裂解烟草细胞的烟草样品)并暴露基因组DNA以进行检测而直接从烟草基因组获得DNA的能力。
“间接”是指本领域技术人员通过除了直接将烟草细胞裂解或获得含有裂解DNA的烟草样品之外，获得目标或特定参考DNA的能力，即如本文所述的一种新颖且独特的连接，所述连接利用除了通过直接经由破裂烟草细胞或获得包含破裂烟草细胞的烟草样品之外的手段来诊断特定样品中事件的存在。这种间接手段包括但不限于：扩增核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在使用特定探针或设计为特异性结合到靶序列的引物的情况下，或扩增可测量及表征的DNA，即通过一些有效的基质，如琼脂糖或丙烯酰胺凝胶等，从其他DNA序列中分离以进行测量，或通过扩增子的直接序列分析或将扩增子克隆到一载体中，并对存在于这种载体中的插入的扩增子进行直接测序来表征。替代地，DNA的核苷酸序列对应于所述烟草染色体内的位置，在所述位置处，转基因DNA被插入烟草染色体并可用于定义所述事件，可以经由各种方法克隆所述事件，然后识别并表征所述事件在特定样品或特定烟草基因组中的存在。这种DNA序列被称为连接序列或序列，并且可以是插入的DNA及相邻(侧翼)烟草染色体DNA的任何长度，只要插入的DNA与所述烟草基因组之间的连接点包含在所述序列中。SEQ ID NO:1至19(例如：6或9)(或其同系物，与SEQ ID NO:1至19具有至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8％相同，例如：与SEQ ID NO:1至19具有100％相同)以及这些序列的反向互补序列都代表这样的片段(以及上述所定义的具有至少99％相同的同系物)。
本文所识别的特定序列在其中包含的事件或构造中唯一地存在，当存在于一特定烟草种质或基因组中及/或存在于含有烟草DNA的特定生物样品中时，无论是通过直接序列分析、通过与这种序列结合的检测探针，或通过观察本文所描述的特定扩增子的大小或组成，这些序列的识别可诊断所述样品中是否存在所述事件或其中包含的构建体。众所周知，侧翼基因组序列(即邻近插入的转基因DNA的DNA序列的烟草基因组片段)经受些微的变异，因此，至少99％或更高的同一性(例如：至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％，例如：100％)是关于烟草基因组之间的这种异常或多态性(polymorphisms)。
本发明的核苷酸序列(转基因)的位置/方向如图23、27、31、35及38所示。代表性扩增子的SEQ ID NO:1至19如图26、30、34、37及40所示。当样品中含有烟草细胞或其部分，并且因此含有烟草DNA(选择性地，SEQ ID NO:1至5、7至8、10至19中的任何一个，以及与SEQID NO:1至5、7至8、10至19中的任何一个具有至少99％相同或完全互补的序列)时，样品中存在一个(例如，SEQ ID NO:6或9)或两个或多个这些核苷酸序列，从而用于诊断所述事件的存在。
使用“源自(derived)”一词的目的是说明特定的DNA分子存在于烟草植物的基因组中，或能够在烟草植物DNA中被检测到。“能够被检测”是指特定DNA序列被扩增以及所述特定DNA序列的大小及/或序列被DNA序列分析表征或阐明的能力，也可以是指探针与特定DNA序列(即靶DNA序列)特异性结合的能力，以及随后检测探针与目标结合的能力。本发明的特定DNA片段或靶DNA片段存在于含有所述事件的烟草中。
本发明的DNA分子对于插入的转基因事件DNA的任一端及与所述插入的DNA的每一端相邻(即侧翼)的烟草基因组DNA的连接是独特的，或者对于烟草事件插入的DNA是独特的。当这些分子存在于通过本文所述方法使用探针、引物及在某些情况下使用DNA序列分析进行分析的特定样品中时，可以诊断所述样品中是否存在一定量的烟草事件。所述烟草事件DNA所特有的这种DNA分子可通过多种方式进行识别及表征，包括使用设计为与独特DNA分子结合的探针核酸分子，然后检测这种探针与独特DNA的结合，通过使用作为探针的至少两个不同的DNA分子的热扩增方法，但是这些分子的序列的特异性可能略低于上述探针的特异性。本领域的技术人员应当理解在适当的杂交条件下，将一特定的靶DNA与一探针或引物接触会导致所述探针或引物与所述靶DNA片段结合。
本发明的DNA分子可以是能够扩增的DNA的靶片段，并且当检测为通过特定样品的扩增方法获得的表示长度的一个或多个扩增子时，可以诊断所述样品中是否存在事件或包含在所述事件中的构建体。这种DNA分子或多核苷酸片段可具有如SEQ ID NO:6或9及选择性地SEQ ID NO:1至5、7至8、10至18及/或19中所述的核苷酸序列或与上述序列具有至少99％相同的序列(参见上文)，并且在本段落及下文的示例中进一步定义。引物分子及/或探针可以以试剂盒的形式与必要的试剂(包括对照组)一起提供，并与使用说明书一起包装。
本文中使用的探针可包含具有足够长度的DNA分子或多核苷酸片段，从而在本文中所定义的严格杂交条件下发挥作用，与特定靶DNA片段(即，存在于样品中并对样品中事件DNA的存在进行诊断的一独特DNA片段)结合。这样的探针可以被设计成仅与所述烟草事件DNA中存在的单个连接或其他新序列结合，或者与两个或更多这样的单个连接片段结合。在疑似含有烟草DNA的特定样品中检测这种探针与DNA分子的结合，可以诊断所述样品中是否存在所述烟草事件。
由于本事件包括多个连接，因此可以对多个连接执行多重扩增反应(即，同时使用多于一种成对的引物)。
引物可包含成对的不同寡核苷酸或多核苷酸片段，以用于放大特定DNA靶片段的热扩增反应。成对的引物中的每一个被设计成与感兴趣的DNA片段内或附近的特定DNA片段结合，以进行扩增。引物以这样的方式结合，随后所述引物作为核酸序列聚合的局部区域，从而产生一个或多个扩增子(DNA的扩增靶片段)。在本发明中，使用设计用于结合特定生物样品中烟草事件DNA的独特片段的引物，并扩增包含本文所述连接片段中的一个或多个的特定扩增子，以及在完成或终止聚合酶反应时检测及/或表征所述扩增子，从而用于诊断特定样品中是否存在烟草事件。本领域的技术人员非常熟悉这种扩增方法，在本文中不需要重复描述扩增的细节。
如本文所用的术语“探针(probe)”是指一段分离的核酸序列，所述核酸序列可连接到一常规可检测标记或报告分子(例如：放射性同位素、配体、化学发光剂、荧光剂或酶)。在本发明的情况下，无论是来自含有事件的植物还是来自包括事件DNA的样品，这种探针与靶核酸的一条链互补、与来自烟草的DNA链互补。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括聚酰胺及其他能够与靶DNA序列特异性结合的探针材料，并且所述特针可用于检测所述事件的存在。
DNA引物是分离的多核酸，通过核酸杂交将所述多核酸黏着为互补事件DNA链(靶DNA链)，从而在引物及靶DNA链之间形成杂交，然后通过聚合酶沿着所述靶DNA链延伸，例如：DNA聚合酶。本发明的一种成对的DNA引物或DNA引物组是指可用于扩增一靶核酸序列(即通过聚合酶链锁反应(PCR)或其他常规多核酸扩增方法的事件A3-29-305-17-09)的两个DNA引物。
DNA探针及DNA引物可以是至少11个核酸或更多个核酸，或至少18个核酸或更多个核酸、至少24个或更多的核酸，或至少30个或更多的核酸(例如：长度为11至100、15至100、20至100、30至100、11至50、15至50、20至50、30至50个核苷酸)。选择的这种探针及引物具有足够的长度，以便在严格的杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，尽管与靶序列不同的探针(保留与靶序列杂交的能力)可以通过常规方法设计(例如：包括至少1个错配、2个错配、3个错配，4个错配，5个错配或模式，例如：在至少300个碱基对(bp)的序列上的至少10个错配)，根据本发明的探针及引物与靶序列具有完全的序列相似性。
基于本文公开的侧翼基因组DNA及插入(重组)序列的引物及探针可用于通过常规方法(例如：通过重新克隆及测序此类DNA分子)来确认(并且，如有必要，进行修正)公开的DNA序列。
根据一个具体的实施例，本发明的核酸探针及引物能够在严格的条件下与靶DNA分子(即所述事件)杂交。任何常规或非常规的核酸杂交或扩增方法都可用于识别样品中转基因植物的DNA存在。多核酸分子也称为核酸片段或多核酸分子的片段，在某些情况下所述多核酸分子能够特异性地与其他核酸分子杂交。如本文所用，如果两个多核酸分子能够形成反平行的双链核酸结构，两个多核酸分子就能够特异性地相互杂交。如果一个核酸分子表现出完全的互补性，那么这个核酸分子就与另一个核酸分子“互补”。如本文所用，当其中一个分子的每个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，分子表现出“完全互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性相互杂交，使它们至少在传统的“低严格性”条件下保持退火，那么这两个分子是“最低程度互补”的。如果两个分子能够以足够的稳定性相互杂交，使它们至少在其他传统的“高严格性”条件下保持退火，那么这两个分子是“高程度互补”的。Sambrook等人(1989年)及Haymes等人(1985年)在《核酸杂交，实用方法，IRL出版社，华盛顿特区》中描述了传统的严格条件。因此，完全互补性的偏离是允许的，只要这种偏离不完全排除分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子作为引物或探针，所述核酸分子只需要在序列上具有足够的互补性，就能够在特定的溶剂及盐浓度下形成稳定的双链结构。
如本文所用，一个基本上同源的序列是指在高严格的条件下，会与被比较的核酸序列的互补体进行特异性杂交的核酸序列。适当的严格条件能够促使DNA杂交，例如：本领域技术人员已知约45℃下6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃下洗涤2.0×SSC，或可在分子生物学的当前方案中找到(John Wiley&Sons，N.Y.(1989年)6.3.1-6.3.6)。例如，洗涤步骤中的盐浓度可从50℃时约2.0×SSC的低严格条件到50℃时约0.2×SSC的高严格条件中选择。此外，洗涤步骤中的温度可从室温下约22℃的低严格条件增加到约65℃的高严格条件。温度及盐浓度都可以改变，或者温度或盐浓度中的一个可以保持不变，而另一个变量可以改变。在一个优选的实施例中，本发明的多核酸将在严格的条件下(如本文及本领域所述的条件下)特异性地杂交到SEQ ID NO:6或9及选择性地SEQ ID NO:1至5、7至8、10至18及/或19中所述的一个或多个核酸分子或所述核酸分子的互补物或片段。
示例2提供可用的探针及引物的示例，如下文所述。
探针与靶DNA分子的杂交可经由多种本领域技术人员所熟知的技术来检测，这些技术包括但不限于：萤光标记、放射性标记、基于抗体的标记、荧光标记及化学发光标记。
关于使用成对的特定扩增引物的靶核酸序列的扩增(例如：通过PCR)，“严格的条件”是能够允许成对的引物只与靶核酸序列杂交，并且与具有相应野生型序列(或其互补物)的引物结合，从而优选地在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物，即扩增子。在下文的示例章节的示例2中描述这种情况的示例。
所述术语“特异于(靶序列)”表示探针或引物仅能与包括所述事件的样品中的所述靶序列杂交(例如：在严格的杂交条件下)，或不可避免地与不构成所述事件的序列杂交，这可以容易地区分(例如：通过大小、序列等)。
如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”是指多核酸扩增方法的产物，直接指向作为多核酸模板一部分的靶多核酸分子。
例如，为了确定由有性杂交产生的烟草植株是否包含本发明的事件，从烟草植物组织样品中提取的DNA可使用一成对的引物进行多核酸扩增方法，所述成对的引物包括：第一引物，源自事件的异源插入DNA的侧翼区域中的基因组DNA序列，并且通过聚合酶在插入DNA的5’至3’方向上延长。第二引物衍生自异源插入DNA分子，所述DNA分子通过聚合酶在所述第一引物衍生的侧翼基因组的5’至3’方向上延长。
替代地，成对的引物可以衍生自插入异源DNA的两侧的基因组序列，从而产生包括整体插入多核苷酸序列的一扩增子。
成对的引物中的一个衍生自植物基因组序列，所述植物基因组序列邻近所述插入转基因DNA，所述转基因DNA与所述插入DNA序列相隔一距离，这个距离可以从一个碱基对到大约20000个碱基对。
所述术语“扩增子”具体地不包括引物二聚体，所述引物二聚体可以在DNA热扩增反应中形成。
出于实际目的，应该设计能够产生有限大小范围的扩增子的引物，例如，在100到1000碱基之间。通常，较小(较短的多核苷酸长度)的扩增子在热扩增反应中能够更可靠地产生，允许较短的循环时间，并且可以容易地在琼脂糖凝胶上分离及可视化，或者适合用于端点
Figure BDA0002948379850000401
样分析。可以通过DNA扩增子检测领域中已知的方法产生及检测较小的扩增子。此外，使用成对的引物产生的扩增子可以被克隆到载体中，进行繁殖、分离及测序，或者可以使用本领域中公认的方法直接测序。此外，引物的设计应使其覆盖(通过扩增)烟草基因组的一小部分。即使由于与另一个遗传背景杂交而丢失了较长的基因组序列，这样一小部分应该足以识别所述事件。
在下文的示例2(例如，SEQ ID NO：27至47)中提供本发明所教示的特定引物的示例。
多核酸的扩增可以通过本领域中已知的多种多核酸扩增方法来达成，所述方法包括：聚合酶链锁反应(PCR)。扩增方法在本领域中是已知的，并且尤其在美国专利第4683195号及第4683202号以及PCR实验方案：方法及应用指南中描述(ed.Innis et ah，学术出版社，圣地亚哥(1990年))。PCR扩增方法已被开发用于扩增高达22kb(千碱基)的基因组DNA及高达42kb的噬菌体DNA(Cheng等人，美国国家科学院院刊。美国91:5695-5699，1994年)。在DNA扩增领域中已知的这些方法及其他方法可用于实践本发明。
可以通过多种技术来检测由这些方法产生的诊断扩增子。
桑格测序及基于纳米孔的测序在下文的示例章节的示例2中详细地示出。
另一种方法是遗传位点分析(Nikiforov等人，核酸研究22：4167-4175，1994年)，其中设计的DNA寡核苷酸与相邻的侧翼基因组DNA序列及插入的DNA序列重叠。所述寡核苷酸被固定在微孔板上。对感兴趣的区域进行PCR后(在插入序列中使用一个引物，在相邻的侧翼基因组序列中使用一个引物)，单链PCR产物可与固定化的寡核苷酸杂交，并且被用作使用一DNA聚合酶的单碱基延伸反应的一模板，标记对预期的下一个碱基特异的双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)。读数可以是荧光或基于ELISA的。信号表示由于成功的扩增、杂交及单碱基延伸而存在的转基因/基因组序列。
其他方法是如Winge(制药科技的创新00：18-24，2000年)描述的焦磷酸测序技术。在这个方法中，设计了一种与相邻基因组DNA及插入的DNA连接重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(插入序列中的一个引物及侧翼基因组序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶、ATP、磺酰化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷酸硫酸酐及荧光素存在下培养。单独添加多个脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)，并且测量的光信号中的掺入结果。萤光信号表示由于成功的扩增、杂交及单碱基延伸或多碱基延伸而存在的转基因/基因组序列。
如Chen等人(基因组研究，9；492-498，1999年)描述的荧光偏振是可用于检测本发明的扩增子的方法。利用这种方法设计了一种与基因组侧翼及插入的DNA连接重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(插入的DNA中的一个引物及侧翼基因组DNA序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶及荧光标记的双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)存在下培养。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。掺入量可以用荧光计测量极化的变化。偏振变化表示由于成功的扩增、杂交及单碱基延伸而存在的转基因/基因组序列。
Figure BDA0002948379850000421
(PE应用生物系统公司，福斯特市，加利福尼亚州)被描述为检测及量化DNA序列的存在的方法，并且能够在制造商提供的说明书中完全理解所述方法。简要地，FRET寡核苷酸探针被设计成与所述基因组侧翼及插入DNA连接重叠。所述FRET探针及PCR引物(插入DNA序列中的一个引物及侧翼基因组序列中的一个引物)在耐热聚合酶及多个dNTP存在下循环。所述FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的猝灭部分(quenchingmoiety)分裂及释放。萤光信号表示由于成功的扩增、杂交及单碱基延伸或多碱基延伸而存在的转基因/基因组序列。
分子信标已被描述用于序列检测，如Tyangi等人所述(Nature Biotech.U:303-3081996)。简要地，FRET寡核苷酸探针被设计成与所述基因组侧翼及插入DNA连接重叠。所述FRET探针的结构导致它含有二级结构，使荧光部分及猝灭部分保持在很近的距离。所述FRET探针及PCR引物(插入DNA序列中的一个引物及侧翼基因组序列中的一个引物)在耐热聚合酶及多个dNTP存在下循环。PCR扩增成功后，将所述FRET探针与靶序列杂交，从而去除探针的二级结构，并使荧光部分及猝灭部分在空间上分离。萤光信号的结果。萤光信号表示由于成功的扩增、杂交及单碱基延伸或多碱基延伸而存在的转基因/基因组序列。
基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒包含DNA引物分子，所述DNA引物分子与靶DNA特异性杂交，并在适当的反应条件下扩增一诊断扩增子。所述试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或本领域已知的任何检测所述诊断扩增子的方法。DNA检测盒可以使用本文所公开的组合物来进行开发并且有助于在样品中识别烟草事件DNA，所述DNA检测盒可用于培育含有事件DNA的烟草植物。
本发明提供示例性DNA分子，所述DNA分子可被用作引物或探针，从而检测样品中含有事件DNA的来自烟草植物的DNA的存在。这种引物或探针特异于靶核酸序列，因此有利于通过本发明所述的方法来识别烟草事件核酸序列。
如上所述，虽然可以通过常规的方法来设计与靶序列不同的引物及探针(所述引物及探针保留优先杂交靶序列的能力)，根据本发明的探针及引物可以与靶序列具有完全的序列同一性。为了使核酸分子作为引物或探针，所述核酸分子只需要与序列具有足够的互补性，就可以在特定的溶剂及盐浓度下形成稳定的双链结构。任何传统的核酸杂交或扩增方法可用于识别来自样品中的烟草事件的转基因DNA的存在。探针及引物通常为至少约11个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约24个核苷酸、或至少约30个核苷酸或更多个核苷酸的长度。在严格的杂交条件下，这种探针及引物特异性杂交一靶DNA序列。
根据一个具体的实施例，所述引物或探针为至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38，至少39个，或至少40个核苷酸的长度(例如：与SEQ ID NO:1至19完全互补)。
Sambrook等人及Haymes等人(1989年)在《核酸杂交，实用方法，IRL出版社，华盛顿特区(1985年)》中描述了传统的严格条件。
本领域技术人员熟知的任何数量的方法可用于分离及操纵本发明公开的DNA分子或其片段，所述方法包括：热扩增方法。DNA分子或其片段也可以通过其它技术获得，例如，通过化学手段直接合成片段，这通常是通过使用自动寡核苷酸合成仪来实践的。
因此，本文提供的DNA分子及对应的核苷酸序列有助于识别烟草事件(除了其他事项外)，选择包含烟草事件的植物品种或杂交种、检测样品中来自转基因烟草事件的DNA的存在，以及监测样品中是否存在烟草事件或源自包含所述事件的烟草植物的植物部分。
因此，根据本发明的一个方面，本发明提供一种生产具有一改良农业性状的一植物的方法，所述方法包括：
(a)使包含所述事件的所述植物经受一育种计划及/或转基因及/或基因组编辑；以及
(b)选择表现出一改良农业性状的一植物。
转基因转化及基因组编辑技术对于本领域技术人员来说是已知的。
不论使用哪种识别的技术，一旦识别出表达前胶原的子代，就在使其表达最大化的条件下进一步培育这些植物。通过使用核酸或蛋白质探针(例如：抗体)来验证外源mRNA及/或多肽的存在，也可以选择来自转化植物的后代。后一种方法能够定位表达的多肽成分(例如：通过探测分离的植物提取物来进行定位)，因此也验证了正确加工及组装的可能性。
种植这种植物后，通常会收获前胶原。在成熟时收获植物组织/细胞，并且使用本领域已知的任何生物化学方法来分离前胶原分子。
因此，根据本发明的一个方面，本发明提供一种生产前胶原的方法，所述方法包括：
(a)种植包括所述事件的所述植物；以及
(b)从所述植物分离所述前胶原。
根据本文所述的方法，本发明还提供一种可获得的前胶原。
应当理解，可以根据选择的栽培品种的需求来种植所述植物。例如，本发明人能够生产包括所述事件的杂交种，并且能够在12至36℃的温度范围内生产高产量的前胶原(如上所述，例如：高于60毫克/植株)。
因此，本发明的实施例还提供一种纯化前胶原的方法。
所述方法包括提供前胶原制剂(前胶原分离的产物)及纯化前胶原。
可使用本领域已知的任何蛋白质纯化技术来完全纯化或部分纯化前胶原。这些方法通常基于大小、电荷或结合亲和纯化。
根据一个实施例，前胶原包含在含有前胶原的组合物中，其中至少0.1％、至少0.25％、至少0.5％、至少1％、至少2.5％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％，至少99％或100％是前胶原。其他包含在前胶原组合物中的成分包括但不限于：胶原蛋白、透明质酸、海藻酸盐、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、氧化纤维素、纤维素晶须(cellulose whiskers)及淀粉。
如本文所用，“纯化”是指将蛋白质从其自然环境或重组宿主内的积累部位分离出来。从小分子进行分离通常通过透析来实现，例如使用纤维素膜。凝胶过滤色谱仪是一种典型的鉴别技术。替代地或附加地，可以使用盐析，例如：利用经常用于蛋白质纯化的硫酸铵，例如：沉淀纤维蛋白原。替代地或附加地，离子交换色谱法是根据净电荷来分离前胶原。亲和层析是分离感兴趣蛋白质的另一种有效方法。更具体地，可以使用抗体或基于蛋白质对某些化学基团的自然吸引力的亲和结合方法。
纯化或半纯化本发明的前胶原的示例性方法在下文的示例章节中说明。
前胶原可被进一步加工成胶原蛋白。
如本文所用，“胶原蛋白”是指一种具有三螺旋结构并含有重复的Gly-X-Y三联体的多肽，其中X及Y可以是任何氨基酸，但通常是亚氨基酸脯氨酸及羟脯氨酸。根据本发明，胶原蛋白是不含N及C前肽的I型胶原蛋白。
胶原蛋白可以是端胶原(telocollagen)或去端胶原(atelocollagen)。
根据一个实施例，本发明的胶原蛋白包含其末端肽的足够部分，使得在适当条件下所述胶原蛋白能够形成原纤维。
因此，例如，所述胶原蛋白可以是去端胶原、端胶原或消化前胶原。
如本文所用，术语“去端胶原”是指缺乏前胶原中典型的N端及C端前肽但包括足够部分的端肽的胶原分子，以便在适当条件下能够形成原纤维。
如本文所用，术语“端胶原”是指缺少前胶原中通常包含的N及C端前肽但仍包含端肽的胶原分子。纤维胶原的端肽是天然N/C蛋白酶消化后N端及C端前肽的残余。
多种能够正确切割包含胶原的重组前肽或端肽的蛋白酶在本领域中是已知的。这些蛋白酶包括某些植物源性蛋白酶，例如：无花果蛋白酶(EC 3.4.22.3)及某些细菌源性蛋白酶，例如：枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)、中性酶。
前胶原或端胶原在使蛋白酶能够从中切割前肽或端肽的条件下与蛋白酶接触。通常，根据选择的特定蛋白酶来确定条件。因此，例如前胶原可与蛋白酶在浓度为1至25毫克/毫升且温度为约10至20℃下培养长达15小时。
在蛋白酶消化之后，如WO2009/053985中所述，例如，可通过盐沉淀进一步纯化产生的去端胶原，以使最终产物包含去端胶原的纯化组合物，所述组合物经由通过蛋白酶产生的植物或植物细胞的前胶原加工而成，所述蛋白酶选自由以下所组成的群组：中性酶、枯草杆菌蛋白酶、无花果蛋白酶及重组人胰蛋白酶，并使用本领域已知的方法进行分析(例如：通过考马斯染色的尺寸分析、蛋白质印迹法等)。
在纯化之后，可通过添加酸性溶液(例如：10mM HCl)再溶解去端胶原。这种酸性溶液可用于储存纯化的去端胶原蛋白。
在消化之后，例如，利用无花果蛋白酶，在中和上述酸溶液时，去端胶原保持其形成原纤维的能力。根据一个实施例，根据本发明的方法产生的至少70％的纯化及再溶解的去端胶原能够形成原纤维。根据一个实施例，根据本发明的方法产生的至少90％的纯化及再溶解的去端胶原能够形成原纤维。
形成纤维的能力表明，产生的去端胶原可用于医疗目的，包括但不限于：整容手术、烧伤患者的愈合辅助、骨重建以及各种牙科、骨科及外科用途。
根据另一实施例，胶原是上述胶原及/或前胶原类型的混合物。
无论使用哪种生产方法，一旦前胶原或胶原在手上，就可以将所述前胶原或胶原给药于受试者本身或与药物组合物或医疗器械一起给药。
如本文所用，“药物组合物”是指本文所述活性成分与其它化学成分(例如：生理上合适的载体及赋形剂)的制剂。药物组合物的目的是有助于向受试者给药活性成分(例如：前胶原)。
如本文所用，术语“活性成分”是指负责预期生物效应(即促进伤口愈合及治疗纤维化)的前胶原或胶原。
在下文中，可以互换使用的短语“生理上可接受的载体”及“医药上可接受的载体”是指不会对受试者造成显着刺激并且不会消除给药的活性成分的生物活性及特性的载体或稀释剂。这些短语中包括一种佐剂(adjuvant)。
如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进给药本发明活性成分的惰性物质。
药物的配制及给药技术可在“雷明顿的药物科学(Remington’s PharmaceuticalSciences)”(Mack出版社，Easton，PA，最新版本)中找到，其通过引用的方式并入本文中。
所述药物组合物可以配制成单位剂型。在这种形式下，制剂被细分为单位剂量，含有适当量的活性成分，例如：单次给药。单位剂型可以是包装的制剂，所述包装含有离散量的制剂，例如：粘性绷带、非粘合性绷带、湿巾、婴儿湿巾、纱布、垫及卫生垫。
本发明的药物组合物可以以局部方式给药，例如，通过将所述组合物直接给药到受试者的组织区域(例如：伤口)上。例如，药物组合物的适当给药途径可包括局部给药(例如：施加到角质组织，诸如皮肤、头发、指甲、头皮)、皮下给药、粘膜给药(例如：口腔、阴道、眼睛)、肌肉内给药。
本发明的药物组合物也可以通过注射包含活性成分及生理上可接受的载体的组合物来进行给药。对于局部给药，可将所述组合物注射到伤口中及/或注射到围绕所述受伤组织的健康组织(例如：皮肤)中或同时注射到两者中，例如：皮下注射。
本发明的药物组合物可经由本领域公知的方法来制造，例如：通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣制造、研磨、乳化、填料、包埋或冻干方法。
活性成分也可以是粉状形式，以便在使用前与适当的载体混合构成，例如：无菌、无热原的水基溶液。
因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体并且以常规方式配制，所述载体包括赋形剂及助剂，所述赋形剂及助剂有助于将活性成分加工成制剂。正确的配方取决于所选择的给药方法。
治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是鉴于本文详细公开的内容。例如，治疗可以在形成大量瘢痕组织之前进行，例如：在纤维母细胞被招募到受影响部位之前。然而，本发明还设想在愈合的任何其他阶段给药前胶原或胶原。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可通过体外试验初步估计。此外，可以在组织培养系统或动物模型中配制剂量以达到所需浓度或滴定量。动物模型可用于建立给药标准。例如，可以使用糖尿病大鼠或小鼠伤口模型[Galeano等人，糖尿病，(2004年)53(9):2509-17]。诸如灌注及生存率的结果指标以及组织学及功能标准，可以被用来评估不同参数的功效，以达到最佳的效果。
这些信息可用于更准确地确定人体的有效剂量。
本文所述的活性成分的毒性及治疗功效可通过体外、细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定。从这些体外及细胞培养分析以及动物研究中获得的数据可用于调制用于人体的剂量范围。剂量可能因所用制剂类型及所用给药途径而变化。医生可以根据患者的情况选择具体的配方、给药途径及剂量。(参见，例如：Fingl等人(1975年)，“治疗学的药理学基础”，第1章，第1页。)
根据病情的严重程度(例如：伤口或疤痕的面积、深度及程度)以及皮肤的反应性，可以单次或多次给药，疗程为数天至数周，或者直到治愈或病情减轻为止。在示例性实施例中，每天至少施用一次本发明的药物组合物。
当然，给药的量取决于受试者、痛苦的严重程度、给药方式、处方医生的判断等。
如果需要，本发明的组合物可以以包装或分配装置的方式呈现，例如：FDA批准的试剂盒，所述试剂盒可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，所述包装可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。所述包装或分配装置可附有给药说明。所述包装或分配装置也可附有由管制药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式通知，所述通知反映管理局对人体或兽医用药成分的形式批准。例如，此类通知可能包括美国食品及药物管理局批准的处方药标签或批准的产品说明书。还可以制备包含用药学上可接受的载体配制的本发明制剂的组合物，将所述组合物放置在适当的容器中，并对所述组合物进行标记以治疗指定的状况，如上文进一步详述的内容。
由于本发明的药物组合物在体内使用，因此所述组合物优选具有高纯度且基本上不含潜在有害污染物，例如，至少为国家食品(NF)级、通常至少为分析级且优选至少为医药级。如果给定化合物必须在使用前合成，则这种合成或随后的纯化较佳地能够得到基本上不含污染性有毒物质的产品，所述污染性有毒物质可能在合成或纯化过程中使用。
为了提高治疗效果，可将附加试剂并入本发明的药物组合物中。用于促进伤口愈合、治疗纤维化及/或促进血管生成的药剂可以与前胶原(例如：单个容器)或胶原一起以单个组合物配制，或者在需要时，包装在单独的容器中并包含在制品中，其可进一步包括使用说明书。这样的制剂包括但不限于：细胞外基质成分(例如卵黄连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白)、生长因子(例如：FGF 1、FGF 2、IGF 1、IGF 2、PDGF、EGF、KGF、HGF、VEGF、SDF-1、GM-CSF、CSF、G-CSF、TGFα、TGFβ、NGF、PDWHF及ECGF)、缺氧诱导因子(例如：HIF-1α及β以及HIF-2)、激素(例如：胰岛素、生长激素(GH)、CRH、瘦素、催乳素、氧雄龙及TSH)、血管生成因子(例如：血管生成素及血管位蛋白)、凝血及抗凝因子(例如：因子I、因子XIII、组织因子、钙、vWF、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤维连接蛋白、抗凝血酶、肝素、纤溶酶原、低分子量肝素(Clixan)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶、纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制因子-2(PAI2)、尿激酶、血栓调节蛋白、组织纤溶酶原激活物(tPA)、α2-抗纤维蛋白酶及蛋白Z相关蛋白酶抑制物(ZPI))、细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13及IFN-α、IFN-β及IFN-γ)、骨形态发生蛋白(BMP)、趋化因子(例如：MCP-1或CCL2)、酶(例如：内切糖苷酶、外切糖苷酶、核酸内切酶、核酸外切酶、肽酶、脂肪酶、氧化酶、脱羧酶、水解酶、软骨素酶、软骨素酶ABC、软骨素酶AC、透明质酸酶、角质素酶、肝素酶、肝素酶剪接变异、胶原酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶)、神经传导物质(例如：乙酰胆碱及单胺类)、神经肽(例如：P物质)、维生素(例如：D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、钙盐、盐酸吡多醇、盐酸吡哆辛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、维生素E、维生素C、维生素D、维生素B1-6、维生素K、维生素A及维生素PP)、碳水化合物(例如：单/双/多糖，包括葡萄糖、甘露糖、麦芽糖及果糖)、离子、螯合剂(例如：铁螯合剂、钙螯合剂)、抗氧化剂(例如：维生素E、檞皮素、超氧化物清除剂、超氧化物歧化酶、H2O2清除剂、自由基清除剂、铁清除剂)、脂肪酸(例如：甘油三酯、磷脂、胆固醇、游离脂肪酸及非游离脂肪酸、脂肪醇、亚油酸、油酸及硫辛酸)、抗生素(例如：青霉素、头孢菌素及四环素)、镇痛剂、麻醉剂、抗菌剂、抗酵母剂、抗真菌剂、抗病毒剂、益生菌制剂、抗原虫制剂、止痒剂、抗皮炎剂、止吐剂、消炎剂、抗角化剂、止汗剂、抗银屑病剂、抗脂溢剂、抗组胺药、氨基酸(例如：必需胺基酸及非必需胺基酸，特别是谷氨酰胺及精氨酸)、硫酸盐(例如：硫酸钙)、类固醇(例如：雄激素、雌激素、孕前激素、糖皮质激素及盐皮质激素)、儿茶酚胺(例如：肾上腺素及去甲肾上腺素)、核苷类及核苷酸(例如：嘌呤及嘧啶)、前列腺素(例如：前列腺素E2)、白三烯、红细胞生成素(例如：血小板生成素)、蛋白多糖(例如：硫酸肝素、硫酸角质素)、羟基磷灰石(例如：羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2))、结合珠蛋白(Hp1-1、Hp2-2及Hp1-2)、超氧化物歧化酶(例如：SOD1/2/3)、一氧化氮、一氧化氮供体(例如：硝普钠(西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)、谷胱甘肽过氧化物酶、水合化合物(例如：加压素)、细胞(例如：血小板)、细胞培养基(例如：M199、DMEM/F12、RPMI、Iscovs)、血清(例如：人血清、胎牛血清、胎牛血清)、缓冲液(例如：HEPES、碳酸氢钠)、洗涤剂(例如：吐温(Tween))、消毒剂、草药、水果提取物、蔬菜提取物(例如：卷心菜、黄瓜)、花提取物、植物提取物、类黄酮(例如：石榴汁)、香料、叶子(例如：绿茶、洋甘菊)、多酚(例如：红酒)、蜂蜜、凝集素、微粒、纳米粒子(脂质体)、微胶粒、碳酸钙(CaCO3，例如：沉淀碳酸钙、研磨/粉状碳酸钙、Albacar、PCC、GCC)、方解石、石灰石、碎大理石、磨碎石灰石、石灰及白垩(例如：白垩粉、香槟粉笔、滑石粉)。
本发明的组合物还可包括多种成分、物质、元素，以及多种材料，所述材料含有氢、烷基、芳基、卤基、羟基、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、酰基、羧基、酰胺基、磺酰胺基、氨酰基、酰胺基、胺基、硝基、有机硒化合物、碳氢化合物及环烃。
本发明的组合物可与诸如过氧化苯甲酰、血管收缩剂、血管扩张剂、水杨酸、维甲酸、壬二酸、乳酸、乙醇酸、丙酮酸、单宁、亚苄基樟脑及其衍生物、α-羟基、表面活性剂等物质结合。
本发明的一些实施例的组合物可生物结合到保持稳定性(例如：抗蛋白酶活性)及/或溶解度(例如：在诸如血液的生物流体中)的聚乙二醇(例如：PEG、SE-PEG)，消化液)，并且保持其生物活性及延长其半衰期。
本发明的组合物可以配制成油灰、软膏、吸入剂、编织/无纺布垫、绷带、海绵、凝胶或水凝胶(例如：利用明胶、透明质酸来配制)或基于聚丙烯酸酯或油凝胶(例如：由水及优塞林制成)。
包括水相及脂肪相两者的油凝胶尤其以羊毛脂醇软膏(Eucerinum anhydricum)为基础，以羊毛蜡醇及石蜡为基底，其中水及基底的百分比可以变化。此外，可添加用于影响稠度的额外亲脂性成分，例如：甘油、不同链长的聚乙二醇(例如：PEG400)、植物油(例如：杏仁油、液体石蜡、中性油等)。本发明的水凝胶可通过使用凝胶形成剂及水来制备，其中第一种水凝胶特别选自天然产物，诸如纤维素衍生物，例如：纤维素酯及醚，例如：羟乙基羟丙基衍生物，例如：侵填体(tylose)，或者也选自合成产物，诸如聚丙烯酸衍生物，例如：卡波普或卡波姆，例如：P934、P940、P941。根据已知的规则，这些成分可以从酒精悬浮液中通过添加用于凝胶形成的碱来生产或聚合。
凝胶中前胶原的示例性含量包括：每100克凝胶含有0.01至30克、每100克凝胶含有0.01至10克、每100克凝胶含有0.01至8克、每100克含有凝胶0.1至5克。
此外，本发明这方面的药物组合物还包括皮肤学上可接受的载体。
短语“皮肤学上可接受的载体”是指适合局部施用到皮肤(即角质组织)上的载体，所述载体具有良好的美学特性，与本发明的活性剂及任何其他成分相容，并且能够安全无毒地用于哺乳动物。
为了增强活性物质的经皮吸收，可向药物组合物中添加一种或多种药剂，包括但不限于：二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、表面活性剂、氮酮、醇、丙酮、丙二醇及聚乙二醇。
本发明的组合物中使用的载体可以具有多种形式。这些形式包括乳状载体，包括但不限于：水包油、油包水、水包油包水、硅酮乳液中的水包油、乳膏、软膏、水溶液、乳液、肥皂、糊状物、乳状液、凝胶、喷雾、泡沫或气溶胶。如本领域技术人员将理解的，给定成分将主要分布到水或油/硅酮相中，这取决于所述成分在组合物中的水溶性/分散性。
根据本发明的乳液通常包含医药上有效量的本文公开的试剂及脂质或油。脂质及油可以来自动物、植物或石油，并且可以是天然的或合成的(即人造的)。合适的乳化剂的实例在美国专利中描述，例如：1973年8月28日公告的美国专利第3755560号(Dickert等人)；1983年12月20日公告的美国专利第4421769号(Dixon等人)；以及McCutcheon's洗涤剂及乳化剂，北美版，第317至324页(1986年)，上述的每件专利都通过引用整体的方式并入本文中。
所述乳液还可包含消泡剂，以在应用于角质组织时使泡沫最小化。消泡剂包括高分子量的硅酮及本领域已知的其他用于此用途的材料。
根据所需的产品形式，合适的乳液可具有广泛的粘度范围。
美国专利中描述了包含水包油乳液的合适载体的实例。1991年12月17日公告的美国专利第5073371号专利(Turner，D.J.等人)以及1991年12月17日公告的美国专利第5073372号(Turner，D.J.等人)，上述的每件专利都通过引用整体的方式并入本文中。在下文详中细描述一种特别优选的水包油乳液，所述水包油乳液含有结构剂、亲水性表面活性剂及水。
优选的水包油乳液包含有助于形成液晶凝胶网络结构的结构剂。在不受理论限制的情况下，据信结构剂有助于向组合物提供有助于组合物稳定性的流变特性。结构剂也可以用作乳化剂或表面活性剂。
在本文中也有使用多种阴离子表面活性剂。例如，参见1975年12月30日公告的美国专利第3929678号(Laughlin等人)，其全部的内容通过引用的方式完全并入本文中。此外，在本文中也有使用两性及两性离子表面活性剂。
本发明的药物组合物可以配制成医药或化妆品行业中用于皮肤应用的各种形式中的任何一种，包括：溶液、乳液、喷雾剂、乳霜、软膏、药膏、凝胶、油、洗液液等，如下所述。
本发明的药物或化妆品组合物可被配制成足够粘稠以保持在经治疗的皮肤区域上、并且不易蒸发及/或不易经由水冲洗而去除，但可借助肥皂、清洁剂及/或洗发剂而去除。
制备具有此类性质的组合物的方法为本领域技术人员所熟知，并在雷明顿的药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences，1990年(上))及药物剂型及药物输送系统(Pharmaceutical Dogures and Drug Delivery Systems，第6版，Williams&Wilkins(1995))中详细描述。
本发明的局部组合物(包括但不限于乳液及乳霜)可包含皮肤学上可接受的润肤剂。如本文所用，“润肤剂”是指用于预防或缓解干燥以及保护皮肤的材料。在本文中使用多种合适的已知润肤剂。例如，参见化妆品科学技术(Sagarin，第2版，Vol.1，pp.3243(1972年))，其中包含许多适合用作润肤剂的材料的实例，其全部的内容通过引用的方式完全并入本文中。一种优选的润肤剂是甘油。
根据本发明的乳液及乳霜通常包括溶液载体系统及一种或多种润肤剂。
本发明的局部应用的药物或化妆品组合物还可以包括添加的附加成分，例如，为了使药物或化妆品组合物更丰富而使用的香味及皮肤营养因子。
在合理的医学判断范围内，选择适合用于在人类角质组织上使用而不引起毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等的成分。此外，只要这些可选的成分不会不可接受地改变本发明的活性化合物的益处，则这些可选的成分是有用的。
CTFA化妆品成分手册(第二版(1992年))描述了皮肤护理行业中常用的各种非限制性化妆品成分，它们适用于本发明的组合物。这些成分类别的示例包括：研磨剂、吸收剂、美学成分，例如：香料、色素、着色剂/色素、精油、皮肤感觉剂、收敛剂等(例如：丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁香酚、乳酸薄荷酯、金缕梅蒸馏物)、抗粉刺剂、抗结块剂、消泡剂、抗菌剂(例如：碘丙炔正丁胺甲酸酯)、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、化妆品收敛剂、化妆品杀菌剂、变性剂、药物收敛剂、外用镇痛剂、成膜剂或多种材料，例如：聚合物，用于辅助组合物的成膜性能及直接性(例如：二十碳烯及乙烯基吡咯烷酮的共聚物)、不透明剂、酸碱值调节剂、推进剂、还原剂、螯合剂、皮肤调理剂(例如：保湿剂，包括其他成分及封闭性保湿物质)，皮肤舒缓剂及/或愈合剂(例如，泛醇及衍生物，例如：乙基泛醇)、芦荟、泛酸及其衍生物、尿囊素、红没药醇及甘草酸二钾、皮肤治疗剂、增稠剂、维生素及其衍生物。
应当理解，本发明的前胶原可并入化妆品公司已开发或正在开发的产品中，包括但不限于：雅诗兰黛、海伦娜鲁宾斯坦及欧莱雅。
本发明的药物或化妆品组合物可直接应用于皮肤。或者，可以通过本领域已知的各种经皮给药系统(例如：以时间释放方式将组合物释放到皮肤中的经皮贴片)经由正常皮肤施用来递送。本领域已知的其它药物递送系统包括加压气雾瓶、电离子透入疗法或超声透入疗法。电离子透入疗法是用来增加皮肤渗透性及促进经皮给药。美国专利第5667487号及第5658247号公开了一种适用于治疗剂通过皮肤的超声离子透入介导传输的离子声装置。替代地或附加地，脂质体或微胶粒也可以用作递送载体。
由于伤口及缺血可能会影响头皮，本发明的药物组合物还包括：适合用于头皮皮肤及头发的润肤剂、表面活性剂及/或调节剂。
润肤剂包括但不限于：烃油及蜡，例如：矿物油、凡士林等，植物油、动物油及脂肪，例如：橄榄油、棕榈油、蓖麻油、玉米油、大豆油等，以及羊毛脂及其衍生物，例如：羊毛脂、羊毛脂油、羊毛脂蜡、羊毛脂醇等。其他润肤剂包括具有10到20个碳原子的脂肪酸的酯类，例如包括：肉豆蔻酸、硬脂酸、异硬脂酸、棕榈酸等，例如：肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻酸丙酯、肉豆蔻酸丁酯、硬脂酸丙酯、异硬脂酸丙酯、棕榈酸丙酯等。其他润肤剂包括具有10到20个碳原子的脂肪酸，包括：硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、异硬脂酸、棕榈酸等。润肤剂还包括具有10到20个碳原子的脂肪醇，例如：十六烷基、肉豆蔻基、月桂基、异硬脂基、硬脂基等。
优选地，乳化剂/表面活性剂在配制用于头发的本发明的药物组合物时使用。
表面活性剂的示例包括但不限于：具有自由活性氢的疏水性烷基、烯烃或烷基芳香官能团的聚氧化烯氧化缩合产物，所述自由活性氢能够与亲水性氧化烯、聚氧化乙烯、氧化丙烯、氧化丁烯、聚氧化乙烯或聚乙二醇缩合。辛基酚与大约7至13摩尔的氧化乙烯的缩合产物是特别有效的，所述产物经由Rohm&Haas公司以其商标TRITON
Figure BDA0002948379850000591
系列产品进行销售。
其他成分，例如：香料、稳定剂、染料、抗微生物剂、抗菌剂、抗结块剂、紫外线吸收剂等，也包括在配制用于头发的本发明的组合物中。
优选地，使用对酸水解稳定的调节剂，例如：具有至少一个季铵部分及乙氧基化单夸克的硅酮化合物，以便稳定及选择性地增稠配制用于头发的本发明的组合物。
本发明的组合物还可包括一种选择性的增稠剂以改善组合物的美感并有助于将组合物应用于头发。示例性的增稠剂为甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基乙基纤维素及羟乙基纤维素、二(氢化牛脂)邻苯二甲酸酰胺、交联马来酸酐-甲基乙烯基醚共聚物、瓜尔胶、黄原胶及阿拉伯树胶。
调理组合物的载体主要是水，但是也可以包括有机溶剂，以便有助于组合物的制造或提供美学特性，例如：粘度控制。合适的溶剂包括低级醇，例如：乙醇及异丙醇；乙二醇醚，例如：2-丁氧基乙醇、乙二醇单乙醚、丙二醇及二甘醇单乙醚或单甲醚及其混合物。可用于不透明调节剂的非限制性调节剂包括：硬脂基三甲基氯化铵、二十二烷基三甲基氯化铵、西曲溴铵、大豆油基三甲基氯化铵、牛油三氯化铵、二氢牛脂二甲基氯化铵、二十二烷基三甲基甲基硫酸铵、PEG-2油基甲基氯化铵、双氢牛脂二甲基溴化铵、双氢牛脂甲基硫酸铵、棕榈基三甲基氯化铵、氢化牛油三甲基氯化铵、氢化牛油三甲基溴化铵、联十六烷基二甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、二棕榈酰基二甲基氯化铵、氢化牛油三甲基甲氯化铵、甲苯磺酸西曲铵、二十基三甲基甲硫酸铵及二牛脂二甲基氯化铵。
在某些情况下，洗发剂的配方有助于治疗头皮的皮肤状况(例如：损伤、牛皮癣)。
根据需求，本发明的洗发剂组合物可以以液体、粉末、凝胶及颗粒中选择的任何形式来提供。使用水或低级醇作为溶剂的液体组合物是优选的，使用水的液体组合物是更优选的。可根据本发明的教导使用的洗发剂组合物在美国专利第6194363号及美国专利第6007802号中详细描述。
应当理解，如WO2009/128076中所述，本发明的前胶原可并入基于生物相容性及/或可生物降解聚合物的基质中，包括：片材、薄膜、海绵及凝胶。其他示例性应用在WO2014/147622中描述。
此外，在组织及器官的三维(3D)生物打印中可包括如本文所述产生的胶原。
近年来，3D生物打印技术在许多医学领域得到了广泛的应用，从而满足适合用于移植及组织建模的复杂支架、组织及器官的需求。为此目的，胶原蛋白被化学修饰以适应用于打印的生物分子，使得生物墨水在打印过程中保持受控的流动性，并且当受到从紫外光到可见光的光照射时固化以形成水凝胶。改性胶原蛋白的独特的粘度及剪切稀化特性使其能够灵活地配制用于不同打印技术的生物油墨，所述打印技术包括：挤压、喷墨、激光诱导正向转移(LIFT)及立体光刻。结合光照能量对化学修饰的控制可以严格控制获得的支架的物理性质，从而匹配自然组织(从僵硬的软骨到柔软的脂肪)的性质。
如本文所述产生的胶原可用于美容及整形外科适应症。为此目的，胶原可单独使用或与其它成分(例如：透明质酸)组合使用以形成真皮填充组合物，所述真皮填充组合物可作为注射在皮肤下的填充物。
本文所用的术语“约”表示±10％。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“蕴含”、“具有”及其变化用语表示“包括但不限于”。
术语“由…组成”是指“包括并限于”。
术语“基本上由…组成”是指该组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤及/或部分，但只有在额外的成分、步骤及/或部分不会实质性地改变所要求的组合物、方法或结构的基本及新颖特征的情况下，才可以包括额外的成分、步骤及/或部分。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述”包括复数引用。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可包括多个化合物，包括其混合物。
在本申请中，本发明的各种实施例可以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便及简洁，不应被解释为对本发明范围的不灵活限制。因此，范围的描述应视为具体公开所有可能的子范围以及该范围内的个别数值。例如，对诸如从1到6的范围的描述应当被认为具有具体公开的子范围，例如：从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等等，以及在该范围内的单个数字，例如：1、2、3、4、5及6。不管范围有多宽，这一点都适用。
每当在此指示数字范围时，意味着包括所指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字及第二指示数字之间的范围”及“从第一指示数字到第二指示数字之间的范围”在本文中可交换地使用，并且意指包括第一指示数字及第二指示数字以及它们之间的所有分数及整数。
本文所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、方法、技术及程序，包括但不限于：化学、药理学、生物学、生物化学及医学领域的从业者已知的或从已知的方式、方法、技术及程序发展而来的那些方式、方法、技术及程序。
本文所用的术语“治疗”包括消除、实质上抑制、减缓或逆转病况的进展、实质上改善病况的临床或美学症状或实质上防止病况的临床或美学症状的出现。
当参考特定序列表时，这种参考应理解为还包括基本上与其互补序列对应的序列，例如包括：由测序错误、克隆错误或导致碱基替换的其他改变引起的微小序列变化，碱基缺失或碱基增加，前提是此类变异的频率少于50个核苷酸中的1个，或者少于100个核苷酸中的1个，或者少于200个核苷酸中的1个，或者少于500个核苷酸中的1个，或者少于1000个核苷酸中的1个，或者少于5000个核苷酸中的1个，或者少于10000个核苷酸中的1个。
应当理解，本发明公开的序列识别号(SEQ ID NO)可以是指DNA序列或RNA序列，其取决于提及该SEQ ID NO的上下文，即使该SEQ ID NO仅以DNA序列格式或RNA序列格式表达。
应当理解，为了清楚起见，在个别实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反地，为了清楚起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供，或者适合在本发明的任何其他描述的实施例中提供。在各个实施例的上下文中描述的某些特征不被视为这些实施例的基本特征，除非没有这些元素，该实施例就不能运作。
如上所述及在下文的权利要求部分中所要求保护的本发明的各种实施例及方面在以下示例中得到实验的支持。
示例：
现在参考以下示例，以下示例与以上描述一起以非限制性方式示出本发明的一些实施例。
现在参考以下示例，以下示例与以上描述一起以非限制性方式示出本发明的一些实施例。
通常，本文使用的命名法及本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物及重组DNA技术。这些技术在以下文献中有详尽的解释。例如，参见“分子克隆：实验室手册”(Sambrook等人，1989年)，“分子生物学中的当前协议”第一至第三卷Ausubel，R.M.，ed.(1994年)；Ausubel等人，“分子生物学中的当前协议”(John Wiley及Sons)，马里兰州巴尔的摩(1989年)；Perbal，“分子克隆实用指南”，John Wiley&Sons，纽约(1988年)；Watson等人，“重组DNA”，美国科学出版社，纽约；Birren等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列”，卷。1-4，冷泉港实验室出版社，纽约(1998年)；美国专利第4666828号、第4683202号、第4801531号、第5192659号及第5272057号；“细胞生物学：实验室手册”，第一卷至第三卷Cellis，J.E.版(1994年)；“动物细胞培养：基本技术手册”，Freshney，Wiley Liss，N.Y.(1994年)，第三版；“当前免疫学协议”第一至三卷Coligan J.E.，ed.(1994年)；Stites等人(编辑)，“基础和临床免疫学”(第八版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994年)；Mishell即Shiigi(编辑)，“细胞免疫学中的选定方法”，W.H.Freeman and Co.，纽约(1980年)；专利及科学文献中广泛描述了可用的免疫测定方法，例如，参见美国专利：3791932；3839153；3850752；3850578；3853987；3867517；3879262；3901654；3935074；3984533；3996345；4034074；4098876；4879219；5011771及5281521；“寡核苷酸合成”Gait，M.J.编辑(1984年)；“核酸杂交”Hames，B.D.及Higgins S.J编辑(1985年)；“转录与翻译”Hames，B.D.及HigginsS.J.编辑(1984年)；“动物细胞培养”Freshney，R.I.编辑(1986年)；“固定化细胞及酶”IRL出版社(1986年)，“分子克隆实用指南”Perbal，B.，(1984年)及“酶学方法”第1-317卷，学术出版社；“PCR试验方案：方法及应用指南”，学术出版社，圣地亚哥，CA(1990年)；Marshak等人，“蛋白质纯化及特性的策略-实验室课程手册”CSHL出版社(1996年)；所有这些文献都以引用的方式并入本文中，如同在此完全阐述一样。本文件还提供其他的一般参考资料。其中的操作程序被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息通过引用的方式并入本文中。
示例1
在源自A3-29 F1的F5及F6谱系中选择具有高产量前胶原的品系，并与Z1进行比较。
育种计划旨在培育含有高产量的人类Ⅰ型前胶原(PC)转基因烟草植物品系。育种计划是以5种人类基因转化的烟草为基础的[参见WO2006/035442]。育种计划的目标是通过重复的自交周期及高产子代的选择来增加半合子A3-29品系中转基因的拷贝数，最终导致纯合性的提高。纯合子品系由于其较高的前胶原产量及通过种子繁殖的选择，因此纯合子品系是首选的。以种子为基础的繁殖应显着降低幼苗成本，缩短获得可供商业化生产的幼苗的周期。
本研究选择的种子祖先是A3-29 F1品系的23个F5同胞子代(图1)。在23个F5同胞子代中，根据其PC产量，选出17个品系作为F6子代进一步筛选的最佳候选品系。
随着育种计划进行到后生子代，原始半合子植株成为纯合子的几率就越高。本研究评估了最佳分离品系的PC产量水平，以确定替换当前半合子Z1品系的最佳候选品系(如上文所述)。
目标：
本实验的范围是从育种计划(品系A3-29的谱系)中分离出具有最佳前胶原产量的植物品系，并与PC生产品系Z1进行比较。评估个别植株间的异质性水平，以及通过蛋白质印迹法(WB)确认Col1α1、Col1α2、P4Hα及P4Hβ所需的遗传组成。从选定的F5植物中收集F6种子，并从选定的F6植物中收集F7种子以供进一步的现场试验。
这个例子概述了两个连续的繁殖周期(F5到F6及F6到F7)。
材料及方法：
通过酶联免疫吸附剂测定(ELISA)来评估叶子中的前胶原水平：
建立一种夹心ELISA法来测定叶片提取物中前胶原的含量。这种ELISA检测是基于通过一层小鼠抗人前胶原蛋白I型C端(TAKARAcat.No.MO12)，然后通过大鼠单克隆抗体对前胶原蛋白I型-N端克隆M-58(Millipore MAB1912)对前胶原蛋白进行的特异性捕获。通过使用ALP结合的山羊抗鼠抗体(Chemicon International Cat#AP136A)以及合适基质的比色分析来实现量化。
通过蛋白质印迹法评估胶原蛋白：
首先使用SDS-PAGE分离叶片提取物或纯化材料，并将分离的蛋白质转移到硝化纤维素膜上。利用抗I型胶原兔多克隆抗体(Millipore#234167)或抗人Ⅰ型胶原兔多克隆抗体(Chemicon#AB745)来检测胶原相关的肽。随后利用ALP结合亲和纯化的山羊抗兔IgG(Chemicon#AP132A)及合适的底物(SIGMA-FAST BCIP/NBT:Sigma#B5655)对所述硝化纤维素膜进行探测。
植物繁殖与栽培
F5繁殖周期：
利用组织培养法繁殖品系Z1及A3-29 F1的植株，并在温室中进行硬化处理。23株经种子繁殖的F5品系的植株在托盘中种植。图1描述谱系杂交。WO2009/128076中也描述了A3-29。特异性序列通过cDNA分析(SEQ ID NO:20至24)及相关AA序列(SEQ ID NO:25至26)进行验证。
F6繁殖周期：
利用组织培养法繁殖Z1及A3-29 F1植株，并在温室中进行2.5周的硬化处理。
25个基于种子品系的植株在苗圃繁殖。
谱系与现场规划
F5繁殖周期：
A3-29 F5品系中的每一株都种植在不同排。对照组的A3-29 F1及Z1植株设置在每排中间，以确保对照组的植株与实验组的植株品系能够进行同等比较。
下表是所述研究中F5谱系的列表(表1)
表1
Figure BDA0002948379850000671
Figure BDA0002948379850000681
F6繁殖周期：
在接下来的周期中，所有17个“优胜者”(参见上文)的种子都在托盘中生长并在幼苗阶段以整体进行分析。超级家族353-04-19扩增了4个额外的F6家族。分析3个不同的F5种子品系A3-29-366-02及Z1谱系作为参考及对照(参见图12)。
选择13个具有高PC产量的F6品系进行种植。每个品系都种在不同排。对照组的A3-29 F1及Z1植株设置在每排的中间，以确保对照组的植株与实验组的植株品系能够进行同等比较。
下文的表2列出本研究的F5至F6谱系。
表2
Figure BDA0002948379850000682
Figure BDA0002948379850000691
叶片采样及分析
F5周期：
在温室中种植约45天后，首先进行集合前胶原取样。通过从底部收集位于位置7到12的6片叶子，将每株植物取样到集合的品系袋中。对所选的23个品系及对照植株进行了分析。在每个对照品系中，取样3个叶片集合(leaves pools)，处理3个100克样品。在每个F5品系中，对2个叶片集合进行采样(参见图2)。
选择8个最佳PC产量的品系进行单株PC分析：2个最高产量品系中的所有单株及6个次优品系中的20个随机单株。在位置10至13到16至18处，从每种所选植物中取样固定数量及位置的后续叶片，并对所述后续叶片进行分析(参见图3至图10)。
结果相对于6个对照样品(Z的3个及A3-29的3个)进行分析，在每个ELISA板上同时进行重复分析，以消除不同测试之间的差异。
在比较的“几乎优胜者”的ELISA中，再次分析5个不同谱系中17个最佳PC产量的单株(图11)。
从每一个选定的植物中收集自花授粉的成熟种子。
F6周期：
取3至4周龄的40株幼苗，集合成大约40至60格令的单个样品，磨碎并通过ELISA进行分析。(图12)。
在两个PC产量最好的家族中选择11个高PC产量品系进行单株前胶原分析，在单株分析中增加两个额外的F6品系(305-17-09-10及305-17-17-02)(图12)。在温室种植61天后进行个别的前胶原取样，并分析以下例外情况：对每株植物进行类似的取样：从底部10至13到16至18之间(直到植物生长)的3到6片固定数量及位置的后续叶片进行取样。对13个品系及24个A3-29 F1对照植株进行测定。对于对照组的植物，在较低位置取样集合：从底部起5至7到9至12的位置处。从每个集合品系袋(pooled line bag)中取样3个样品，并研磨3个100克的样品，从而最佳地代表集合取样。每种样品制备约20管以用于ELISA分析。分别利用对照组及选定的植株来进行两个独立的ELISA检测。将结果与对照样品进行比较分析(参见图13)。选择5个品系进行单株分析(参见图14至18)。
通过蛋白质印迹法分析(提取物被消化成胶原蛋白)对胜出的植株进行测试，以确保相较于对照植株，存在相关蛋白质(图19至21)。
选择的植株通过嫩枝及组织培养进行繁殖，导入主植物库，并用于自种生产，以便进一步育种选择。
示例2：
A3-29-305-17-09-18 F5中的事件特征
对4种不同重组DNA构件体的转基因植物A3-29-305-17-09-18F5的基因组DNA进行了分析。采用了Illumina短读、Illumina短读配对、纳米孔超长读及基于纳米孔的测序技术。采用PCR及桑格(Sanger)测序对结果进行验证。
总共发现5个插入事件。
所有引物序列、描述及相关图的引用详见表#35至38。
表3：5个插入事件
Figure BDA0002948379850000711
注记：
边界PCR：一旦确定事件，就为插入事件(载体区)的左右边界设计引物。这些引物与基因组(事件)特异性引物结合使用。
基因PCR：采用基因特异性引物结合基因组(事件特异性)引物进行PCR。使用纳米孔测序平台进行扩增。参见表35。
事件1：P4Hβ+LH3
事件1的位置如图23所示。所述构件体如上述方案所示。
表4：事件信息(以表格格式呈现)
Figure BDA0002948379850000721
表5：用于纳米孔测序的引物组
Figure BDA0002948379850000722
右连接＝右边界
注记：
在事件1中，Rightjunc引物扩增。对于转化后的品系，预计产物为约800个碱基对。然而，在对照品系及转化品系中，预期有350个碱基对的非特异性扩增带。
在事件1中，Leftjunc引物扩增(沿着左连接跨越整个插入)；对于转化品系，预计产物为约8000个碱基对。转化品系中存在一条约2500个碱基对的非特异性扩增带。
使用引物事件1Rightjunc(图24A、图24B)对转化品系的PCR产物进行的测序结果如下。所述序列捕获构件物及基因组重叠群(genome contig)之间的连接。
表6：用于边界PCR的引物组(桑格验证)
Figure BDA0002948379850000731
图25及图26分别显示通过凝胶电泳及测序进行的事件1的扩增结果。
结论：
通过基于纳米孔的测序及桑格测序方法，在左、右边界确认了作为事件1(P4Hβ+LH3)的插入的构建体。
事件2：P4Hα
图27显示了植物的基因组中的事件2整合的示意图。
表7：事件信息(以表格形式呈现)
Figure BDA0002948379850000741
表8：用于纳米孔测序的引物组
Figure BDA0002948379850000742
事件特征如图28A至图28B所示，通过基于纳米孔的测序而获得。
通过桑格PCR进一步对所述事件进行表征，桑格PCR的引物在下文及表9中列出。
表9：用于边界PCR的引物组(桑格验证)
Figure BDA0002948379850000743
结果分别通过凝胶电泳及测序显示在图29A至图29及图30中。
对于插入的作为P4Hα的事件2的构建体，通过基于纳米孔的测序以及桑格测序方法确认了左右边界。所述插入的方向相反(图27)。
事件3：Colα2
图31显示基因组中的事件3的位置的示意图。
表10：事件信息(以表格形式呈现)
Figure BDA0002948379850000751
图32显示使用事件3的左连接引物的插入特征示意图。
表11：用于纳米孔测序的引物组
Figure BDA0002948379850000752
表12：用于边界PCR的引物组(桑格验证)
Figure BDA0002948379850000753
图33A至图33B显示边界连接PCR：图33A至图33B)左边界PCR使用基因组引物及边界引物，扩增子大小为1至800个碱基对，2至大约2千个碱基对。
基于纳米孔的测序及桑格测序的结果如图34所示。
通过基于纳米孔的测序及桑格测序方法确认作为Colα2事件3插入的构建物的左边界。边界PCR扩增了右边界，但由于技术原因，桑格测序失败。在图34中，区域(右边界载体及基因组支架)用浅色标记。
事件4：P4Hβ(LH3)
图35显示基因组中的事件4的位置的示意图。
表13：事件信息(以表格形式呈现)
Figure BDA0002948379850000761
表14：用于纳米孔测序的引物组
Figure BDA0002948379850000762
图36显示使用事件4左连接引物的插入特征。
表15：用于边界PCR的引物组(桑格验证)
Figure BDA0002948379850000763
作为P4Hβ(LH3)的事件4的插入的构建物，通过基于纳米孔的测序以及桑格测序方法确认左边界。边界PCR扩增了右边界，但由于技术原因，桑格测序失败。
事件5：Colα1
图38显示基因组中的事件5的位置的示意图。
表16：事件信息(以表格形式呈现)
Figure BDA0002948379850000771
表17：用于基于纳米孔测序的引物组
Figure BDA0002948379850000772
图39显示使用事件5左连接引物的插入特征。
表18：用于边界PCR的引物组(桑格验证)
Figure BDA0002948379850000781
图40显示边界连接PCR：左边界PCR使用基因组引物及边界引物，扩增的子大小为2至大约3千个碱基对，3至2千个碱基对。
对于作为colα1的事件5的插入的构建物，通过基于纳米孔的测序以及桑格测序方法确认左边界。colα1是反向的。边界PCR扩增了右边界，但由于技术原因，桑格测序失败。在图41中，区域(右边界载体及基因组支架)用浅色标记。
示例3：
产生前胶原蛋白的植物品种
目标：
本研究的目的是检验具有较高的前胶原(PC)产量及更佳的农业生产品系的可能的新品种；
为了达到上述目标，在品种筛选的同时，进行杂交计划，从而基于5个不同的半合子供体，将所有5个PC转基因导入这些品种。5个PC转基因：A3-29-305-17-09-18 F6bulk；A3-29-305-17-09-18-33-2 F7；A3-29-305-17-09-18-33-10 F7；A3-29-305-17-09-25-04-19 F7；A3-29-305-17-09-37-28-31 F7。
主要的范围是选择具有提高的总生物量及PC产量潜力的品系(相较于A3-29-305-17-09-18F5)。
材料及方法：
品种筛选与杂交方案
来自28个不同品种的种子在苗圃种植，40至50天后移植到四个产区：梅伦戈兰(Merom Golan，MG)、恩亚哈夫(Ein Yahav，EY)、卡利亚(Kalia，K)及一个实验温室。秧苗的密度为每排5株/米(plants/meter row)。
F1筛选：
从杂交中收获F1种子，并种植在苗圃。移植(transplantations)分为两次进行。
现场规划
品种筛选及杂交方案：
在每个生产地点，每个品种移植了6至10株(下表19)。
在温室中，以2.5株/米的密度将每个品种的4株植物移植，并将5个PC转基因供体(参见下文)的4株植物移植到树形流程图中(每两排)。在所有生长季节对植物进行监测。
在温室的每株植物中，一个花序被一个纸袋覆盖，以维持品系(产生更多的自花授粉种子)。
在杂交方案中，每个变种的10个花序进行雄性不育(male sterilized)，以便进行杂交：每个变种的每两个花序与不同的PC转基因雄性供体杂交(总共10个杂交/品种)(下表20)。
4个雄性供体选自F8品系(A3-29-305-17-09-18-33-2、A3-29-305-17-09-18-33-10、A3-29-305-17-09-25-04-19,、A3-29-305-17-09-37-28-31)以及生产品系(A3-29-305-17-09-18 F5)。
表19：种植在不同产区的品种，以及每个地点的每个品种的植株数量。根据发育的殃苗数确定的重复次数。
Figure BDA0002948379850000791
Figure BDA0002948379850000801
表20：在温室里进行的杂交。每个品种由5个不同的供体导入5个产生PC的转基因。
Figure BDA0002948379850000811
Figure BDA0002948379850000821
Figure BDA0002948379850000831
Figure BDA0002948379850000841
Figure BDA0002948379850000851
Figure BDA0002948379850000861
Figure BDA0002948379850000871
Figure BDA0002948379850000881
F1筛选：
在温室种植F1杂交种，其中每个F1杂交种种植10株，密度为每排2.5株/米，采用2排的每个杂交种5株的区块设计。为了获得更好的杂种优势，杂交组合按雌性品系分组排列(参见下表21)。
表21：F1家族的苗圃列表。每个新品种(母系)与5个不同的PC生产转基因供体(父系)杂交。如上文所述，F1在两个波中移植。
Figure BDA0002948379850000882
Figure BDA0002948379850000891
Figure BDA0002948379850000901
Figure BDA0002948379850000911
Figure BDA0002948379850000921
Figure BDA0002948379850000931
植物生长及监测：
品种筛选：
根据总体农艺性能对每个地点的植物进行目测评分，其中的重点是结构及生物量产量潜力(无特定特征)(参见下表22)。研究的主要范围是寻找适合的生产地点及高效生物量生产潜力的品种。
同时，在温室里与5个雄性供体进行杂交。
在生产区种植植物，直到完成观察后结束。杂交植物在温室里生长，直到自花授粉的种子及异花授粉的种子已经成熟且可以收获为止。
杂交：
由于排水问题导致的茎病，杂交育种计划分成两次进行。
确定杂交计划的优先顺序，以及在生产地点对品种进行连续筛选及监测的基础上放弃部分的杂交。通过目视的方式来进行选择，17个品种被鉴定为潜在亲本(表21a)。
F1筛选：
在温室中种植植物。在每个植株中，为了产生自花传粉的种子(F2种子)，一个花序被一个纸袋覆盖。植物在温室中生长，直到自花传粉的种子成熟并收获种子。
在整个生长季节，对F1植物的农艺性状进行目视监测，尤其是其结构及生物量的生产潜力。
表21a
Figure BDA0002948379850000941
Figure BDA0002948379850000951
分析：
分子分析：
在每一个F1家族中，利用RT-PCR对5株植物进行取样及分析，以确定是否存在5个PC(前胶原)产生基因。通过RT-PCR分析显示5个转基因中至少有3个转基因存在于述植株中，对所述植株进行取样，使用ELISA进一步分析PC含量。在ELISA分析中，从移植日起后64天，每株植物的所有叶片都被采摘，并用ELISA进行处理及分析。此外，对每株植物的叶片进行称重(图42)。
结果：
品种筛选：评分及优先顺序
表22：被确定为潜在亲本的品种的综合农艺性状得分，分别在每个地点及优先顺序的综合得分。
Figure BDA0002948379850000952
Figure BDA0002948379850000961
Figure BDA0002948379850000971
Figure BDA0002948379850000981
Figure BDA0002948379850000991
Figure BDA0002948379850001001
Figure BDA0002948379850001011
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Figure BDA0002948379850001031
Figure BDA0002948379850001041
Figure BDA0002948379850001051
Figure BDA0002948379850001061
Figure BDA0002948379850001071
Figure BDA0002948379850001081
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Figure BDA0002948379850001101
Figure BDA0002948379850001111
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Figure BDA0002948379850001131
Figure BDA0002948379850001141
Figure BDA0002948379850001151
Figure BDA0002948379850001161
F1的转基因、生物量及PC：
通过RT-PCR分析，大部分选择的植株均含有5个转基因。为了在下一代的选择周期中评估分析方法的准确性及敏感性，选择几个对其中一个基因呈阴性结果的植株作为对照组。
在缺少Col2的植株中，PC的生产可以解释为产生同三聚体。在缺少其他转基因的植株中，PC的生产可以用RT-PCR分析的不准确性来解释。
示例4：
来自近纯合品系A3-29 F4与N.tabacum vr.VirginiaK358品种的半合子植物育种计划
为了提高制造烟草品系的前胶原(PC)产量，育种计划研究了将PC生产基因导入烟草新品种的可能性。这样做是为了取代目前的生产品系(基于Samsun NN的A3-29-305-17-09-18)。
为了这个目的，对不同烟草品种进行大量筛选，从中选出4个品种作为Samsun NN的潜在替代品，并且作为生产PC的遗传背景。所有四个品系均与A3-29-305-17-09F4植株杂交，以便将胶原蛋白生产系统引入这些新品种：1号品种(N.tabacum vr.Sylvestris)、3号品种(N.tabacum vr.Cuban Habano 2000)、11号品种(N.tabacum vr.Black mammoth)及15号品种(N.tabacum vr.Virginia K358)。基于这个研究的结果，决定将重点放在A3-29-305-17-09F4 x N.tabacum VirginiaK358的杂交种上。
选择表现最好的杂交种(A3-29-305-17-09F4 x N.tabacum vr.Virginia K358)以进行进一步的育种。
本研究的主要目的是研究基于几乎纯合种子的A3-29 F6品系(Samsun背景；PY14/006)以及新的烟草遗传背景的可能的杂种优势组合，从而提高总生物量及PC产量以产生新的、品种混合的、未来的生产品系。一个最初的品系大概是50％由以种子为基础的品系A3-29(F4)组成，所述品系在N.tabacum cv.Samsun NN背景中捐献了一套完整的PC生产转基因。所述最初的品系将与一个(50％)新的遗传背景相结合，从而提供优良的农艺性状，使得相较于仅以种子为基础的品系A3-29(F6)，PC*生物量产量的总产量提升。选择的遗传背景是生物量的最佳产量及可能的附加期望农艺性状。
本研究的具体目的是在选定的杂交种(A3-29-305-17-09 F4 x N.tabacumvr.Virginia K358)的基础上培育一个新的育种品系，从而取代目前的生产品系。
材料及方法：
植物繁殖、栽培与筛选
通过杂交产生F1代植株[A3-29-305-17-09F4(雌性)x N.tabacum vr.VirginiaK358(雄性)]。
F2至F4的种子是用纸袋覆盖每个植株的一个花序，以确保自花授粉的种子。收获含有种子的成熟胶囊，然后将种子分离并储存在隔离的盒子中
种子在苗圃播种并生长约45天，然后转移到温室，种植密度为每排2.5株/米。
活力(vigor)与结构：
根据一般农艺性状，以目测的方式选择每一代的植株。在F4子代测定叶片的生物量。
基因筛选：
通过RT-PCR证实了5个转基因的存在。
根据已确认的cDNA序列(SEQ ID No:20至24)与从新鲜叶片中提取的DNA为每个基因设计RT-PCR。
前胶原的水平：
采用上述的标准提取方法及ELISA试验方案，通过ELISA测定植物中的前胶原的水平。
F2子代：
在Yessod实验温室移植了35株来自F1种子的植物(参见表25)。
在每株植物中，为了产生自花传粉的种子，一个花序被一个纸袋覆盖。在此阶段，植株通过基因测试进行筛选，而不是通过PC含量进行筛选。使用RT-PCR对F2子代的植株进行两次筛选，以确定5个转基因的存在。在第一次筛选时，35个植株中有25株表现出全部5个基因的存在(表28)。为了验证遗传筛选方法的有效性，选择32株植物进行自交及进一步育种。
F3子代：
每32个F2家族的约35株(共1050株)移植到Yessod实验温室(表26)，密度为每排5株/米。在每株植物中，为了产生自花传粉的种子，一个花序被一个纸袋覆盖。
植物及植物家族在整个生长季节都有活力及结构的记录。利用RT-PCR筛选出农艺性状最好的家族。基于一系列的阳性对照组，RT-PCR结果高于0.1即为阳性(存在转基因)。使用ELISA对获得最佳结果的RT-PCR植株进行采样以进一步分析其PC含量。对于ELISA分析，在移植后77天，在每个植株的1米高度处采摘3至4片叶子，按照ELISA实验方案进行处理及分析(表29)。
根据植株的PC浓度及所有转基因的RT-PCR值，选择30株植物进行进一步育种(图45)。选择的植株在自花授粉种子成熟之后进行收获以供下一代进行繁殖。
F4子代：
在Yessod实验温室(参见表27)中，每30个F3选择的植株(共1250株)中约有40株进行移植，密度为每排5株/米。在每株植物中，为了产生自花传粉的种子，一个花序被一个纸袋覆盖。
植物及植物家族在整个生长季节都有活力及结构的记录。利用RT-PCR筛选出农艺性状最好的家族。RT-PCR的结果与稳定的N.tabacum基因(scfld8)进行比较。等于或高于scfld8基因的数值被视为阳性(存在转基因)。使用ELISA对获得最佳结果的RT-PCR植株进行采样以进一步分析其PC含量。对于ELISA分析，在移植后77天，在每个植株的1米高度处采摘3至4片叶子，按照ELISA实验方案进行处理及分析(表30)。
此外，在被送去进行ELISA分析的每个植株中，收获叶片并进行称重(表30)。
根据叶片的重量、PC浓度及RT-PCR的结果，选择30株植物进行进一步育种(图44)。选择的植株在自花授粉种子成熟之后进行收获以供下一代进行繁殖。
表25：来自F1自花授粉的种子的F2子代
Figure BDA0002948379850001191
Figure BDA0002948379850001201
Figure BDA0002948379850001211
表26：来自大部分F2种子的F3子代。在温室中各家族植物的号码及位置(流程图的号码)。
Figure BDA0002948379850001212
Figure BDA0002948379850001221
Figure BDA0002948379850001231
Figure BDA0002948379850001241
表27：来自大部分F3种子的F4子代。在温室中各家族植物的号码(重复)及位置(流程图的号码)。
Figure BDA0002948379850001242
Figure BDA0002948379850001251
Figure BDA0002948379850001261
结果：
F2子代
表28：F2子代植株中5个转基因的PCR结果综述
Figure BDA0002948379850001262
Figure BDA0002948379850001271
F3子代：
表29：相较于品系“A3-29-305-17-09-18 F6Bulk”，使用两种方法分析的F3单株的PC浓度及RT-PCR结果的综述。选择30株PC产量最好的植株进行进一步育种(粗体)。任何高于0.1的RT-PCR值均为阳性。
Figure BDA0002948379850001272
Figure BDA0002948379850001281
Figure BDA0002948379850001291
Figure BDA0002948379850001301
Figure BDA0002948379850001311
Figure BDA0002948379850001321
F4子代：
表30：使用两种方法分析的F4单株的PC浓度及RT-PCR结果的综述，以及植株的PC产量：叶片生物量、总PC含量(毫克)。选择28株表现最佳的植株进行进一步育种(植株名称以粗体表示)。将RT-PCR分析值与另一个N.tabacum基因scfld8进行比较。scfld8的水平及以上的数值被认为是阳性。
Figure BDA0002948379850001322
Figure BDA0002948379850001331
Figure BDA0002948379850001341
Figure BDA0002948379850001351
Figure BDA0002948379850001361
Figure BDA0002948379850001371
Figure BDA0002948379850001381
示例5：
在产生的品系中验证基因组插入事件
在温室中种植13株植物。对每株植物的幼芽进行DNA提取及PCR分析。植物碎片(大约0.5公分)被采摘到小试管中，然后放入冰中提取DNA。
DNA提取采用标准CTAB/氯仿法。使用Nanodrop评估DNA的质量。根据下表进行PCR。
表31
Figure BDA0002948379850001382
Figure BDA0002948379850001391
结果：
结果如图45至48所示。请特别注意图46下部分所示的P4Ha右边界的独特整合位点，其特征为A3-29-305-17-09-18 F5及其子代在泳道5至7中。
更具体地说，边界PCR在所有对照样品(Samson-WT及K358-WT)中都是非特异性的。对于P4Hb+LH3，PCR显示出预期的条带：A3-29 F1、A3-29-305-17-09 F4、A3-29-305-17-09-F4、A3-29-305-17-09-18 F6*、A3-29-305-17-09-18 F6**及A3-29-305-17-09-18 F6***。对于P4Ha，预期条带显示在以下品系中：A3-29-305-17-09-18 F6*、A3-29-305-17-09-18F6**及A3-29-305-17-09-18 F6***。对于Cola2，在所有转基因品系中都显示了预期的条带。对于Cola1，在两对引物的所有转基因品系中都显示了预期的条带。星星代表来自种子的个别植株。
表32：测试的植物品系的列表
表32
Figure BDA0002948379850001401
1括号中的数字/字母表示从主植物库(Yessod)保存的植物的插条中产生的特定品系；
2星星代表来自种子的植物个体。
表33：分子验证PCR检测中的F1子代杂交种列表
Figure BDA0002948379850001411
表34：PCR结果的综述
+/-指示预期尺寸的条带的存在/不存在。如果出现非预期大小的条带，则其大小在+/-指示标志旁边。
Figure BDA0002948379850001412
Figure BDA0002948379850001421
所有样品按表34排序[品系号码是指表33中的“vs”列]。
表35：引物的ID
Figure BDA0002948379850001422
Figure BDA0002948379850001431
表36
Figure BDA0002948379850001441
纳米孔PCR序列
*引物组1-2F、1-2R跨越整个基因
表37：桑格验证
Figure BDA0002948379850001442
Figure BDA0002948379850001451
表38：序列表
Figure BDA0002948379850001452
尽管已经结合本发明的具体实施例来描述本发明，但是对于本领域技术人员来说，许多替代方案、修改及变化将是显而易见的。因此，本发明旨在包括落入所附权利要求书的精神及广泛范围内的所有此类替代、修改及变型。
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此外，通过引用的方式将本申请的任何优先权文件的整体内容并入本文。
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ctacttcgtt cagttatagc cctagacttt ggtcaaggta cagtcactgt agcttcaagg 60
tccatcaacg gttggaattt gaccctcatt aacctcagca agatataagg caaaccaaac 120
caaggtgtac aacagccacc ccagaatgct atctcattca aagattttgc atgctagaat 180
agtcaaactc aagagctcaa gatatcaagg tcacaacaaa tatcaaagat taaggctttg 240
gctccgagcc tcaagaagat aaggaggtca tatagtgccg acaagattgc gtatccccgg 300
tgctcaggcc tcaggcctca agaaatccaa gggtttaaaa cgcgatggtt gctgaaccac 360
ccaaatcaag ttttggggtc ggtgccgtaa agcactgatc ggaacctaaa ggaatttgat 420
ttaggcaaac aggaaagcca gcagacaatg gcgaaggaag gaagaagcga agggcaggcg 480
ccattcgatg cgcaactggg aagggcgatc ggtgggcctc ttcgctaacc gccagctagc 540
tgaaagaggg atgtgctgca aggcggtcag ttaggtaacc agggttttcc agtcgacgtt 600
caaaggcgac ggccagtggg tgttaattaa gaattcgctg gctatcactg aaagacaact 660
acagacagtg gtgtctcgat gcgcagaacc atctttgcag cagatgtagg caatagatgg 720
tccgggcctc cagaaagcgt cttcgacaca gaaaagacaa ccacagctca tcatgtatat 780
ggagctgtcg tgccatcggc tgagataaga ctgactgagc cagcactaaa gaaataatgc 840
aagtagtcta gctccgctgg ctttaataat tatatttcat tattattctc tgcttttact 900
ctctatgagg cttgtatttt cattgaaggc caggcgaaca cacacagaac ctcgcttaca 960
aacagatctt aaaccatggc tcacgctggt tttgtacctc ttgctattct tactgctgct 1020
gctgttgctg taagctactt taagttcttt cttaattcag caattaggcc agtgactgat 1080
gagctgcttc tactcttact caattggatc tatgtctgat agaccaagga aggatcagtt 1140
aatccagaag ttgcttatga ttgcatggct actgctgaga caggatacct tagattcctt 1200
ggagtgctga gttcttcaac ttcactggac tcttggactt gaagaatgga ggaggaaatg 1260
tactagaact attggaggag gacagaagta ggatgaagca gaaagagatg atacgctgtg 1320
aaggacaggt gtatatttca ttggattctt acgatgtagt tcttgctgga tctcaatagg 1380
cttttgaagg ctacgttcag tctggatcga ctactctctg ctgggtcttt tgttgtagag 1440
tagggacttg ctgacaatat caggaaatta ggaactggag attcctgctc ctggaggatt 1500
cattggattc gctattctgg gtgtgaggcg gtggagtaca ggatgacgat gatgatcagc 1560
ttttcactgt ttacatgaat caggacggga gattgtcgcc aaccttgatc acaagtctgg 1620
ttccagaacc ttaacggtgc tctccagtgg tggttatact tagaagttca atggagcagg 1680
tagggattag aacgtgaagc gatactcttc tattgtggtg catagaacgg accaacaagg 1740
ctgtaacctt gaaaccattc caaacggatg gactcagaag gaggatgctg gattctgcaa 1800
tcagatggag aactcttcag gaggacaacc acacaagagt tttccttgct gtattcgtta 1860
gacatgctcc attccttcca gattcttcag agcttcttca ctggattacc gcagatgggt 1920
aacgcttttc cttccttagc agttttccga cacattattt agaccccgcg gacagcttcg 1980
gatgtttctc tgctgtgaag ttggttggtc agagaagctc tttctcagga agctagggat 2040
atggctatgg atttgtaggc aggatcaagt gcagttctac ttctcttgat gctgatgctg 2100
tgctactaac tggactctta ggattcatga tgagaacagg aaagtggtgc tcaatgcttt 2160
ctaggcgggg ctagtctaat ttctgattat ctttctcctg atgagtacta cgctagatca 2220
gaggactaag tagggcttat tcagagaaga gtaggagttg ggcgttctta tatttctcga 2280
acgtgattgg ggagatactc tggatgggct tcacagagga tgttttctct ggatctggta 2340
ctggtcagat ggcttctgca agtcaccagg gataaggaat ttccttcacg ctgtgtaggt 2400
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gttggtttgg acataaagaa aataagacct ctaaaaccat tggtcttaag tagaaataaa 8820
taagttaatt acttcatttt gattataatt tagaatctaa atttaaataa cgtctggtac 8880
ggacaacatg agtaaataca gatttccttt taaacaatga atagttgtca tattttcctc 8940
acaaagcgac tggcgcacta agctccgtta tggtgaattg gagaagacca aaccaaagat 9000
tacattatgc gtggcgctta tcgccgttct ggtattcgtg gctcggtcag gtgacctcat 9060
gacaacaact ttgattctgc aaggctcctc tcgtaccaag aacaaagcaa aaatataatc 9120
aaagaaaagc agtcaaaatg ttaattttgt taattatcaa tatgaaataa tgatacaaag 9180
cataaataaa tgaaatgggt atgcaagaca caaaatggta gaacttgggc atgctaacag 9240
atgaaatggt tttaacataa caatgaacct agacttgtca ttgttataat gagaaattcg 9300
aacatgttcg aaactcagtg aataatgaac ctgctaatcc tctccatttt aaaggctagg 9360
ttttgataag aattcaaact cgcaataagc taactcacac attacatgtt gcactcatgc 9420
cactagatca gcacttgtta tcaacatggc agacaattga tattatggga caatatattt 9480
actctaatga acaagttttc atatgtaaaa tgaaacttcc ttttctaaca aaattgtatt 9540
gtcctagtct ttgaaactag cataaagtat gggtttactc tgcaaatgcc tacaatagtt 9600
gaaaaatatg aatgaagagc ataaaaatgc aggaactaaa tttgagcgaa gctttagatt 9660
ctctggtggg aatatcagga ccaacgcgcg gtgttgttca ctccattacc atgaaagttg 9720
cagcgcctgg tggtgtgtgg atgaagttga cgtcgtgacc ggtgtagtcg tccctccagt 9780
cattgccacc accagggtgc tcaggtaaat agagccacca gcagtgctga aattacagaa 9840
tccaagtttg gtcagaatgc cattttacta cagaattgac tacgaataat agcatgcatg 9900
atagtatgct tgtccatata catgttggtt gaacgagcaa atgatcttta atacagatac 9960
tagcagattg attgatgcat tagcatgcat gtctaaaact agtgtttggc agatcaaaat 10020
ttaggcgtgg ggtactaaaa tgcatatcta agaaattagt ttgaatgcga gcgataaggg 10080
ataagtaatc gagattaaat ttaaaatgag tttatcggtt gatttgggat aagtggtaag 10140
tataataatt cgggattagt tgtgcaggat tgtagtgctt ttatcccatg ggagagtggg 10200
ataactaatg tcgaatagtg tcatgagata atttatttcc cagcaaacaa cctaagtgta 10260
tctatgctta ttttctgcac atatggccat aagctacgca ctgtatggtt ttctcaaaat 10320
ataggtagca aaaagttgca aacatatata atgccacaat agtggcgtta tacgatgcgt 10380
taagcgcacg ttcgtatggc gtagctattg tggcgttatc tgacacataa ccgtgtagtg 10440
gcattatact actaatgcag cccttaatat ttacggattt aataatttaa tcgtgtaaag 10500
ccacttttgt ggctatatac aaaaatccgg ctagccattt ctatataaac ataagtagaa 10560
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gcatttttca ttatgtttag cgataggaat aataatatat cgttatgata ttggggtgag 10680
gttgtgatga agaataataa gtagactcta cagtttacac gctgagtgta atgttaagtg 10740
ccactcaatg gagtctgaaa cattgatgtc gttgttatgc aaaaatgagt gtaagaaagc 10800
gttaagtgat actcaaagta gcaggaagat atcaggtgtt aaattcgcat aaaggagtta 10860
cttttactcg ggagtttaac atgcgacgat gatgacactt tgatggaatt tcttggggac 10920
tcacgggata aatttcttgt aatcacaatg ttggagatat gcgtgaaggt gaaggcgttc 10980
aaaaatgagt tgtcgtggta aagataaccc cggtcatccg ggtggttatt acggatcatt 11040
ttagcgtatt agaatgaaaa gatttttctt gatttaaatt tatccgtcgg caaatgaagc 11100
ggccgagaaa ataatttata ccacctttcc ataattcaca agaaagtggt agcttcaatt 11160
ttcatttgtg ttaattatgt atattttctt gcattaatta attttagcag ctcatttatt 11220
taatagggag atgccggtag gatatagatt tacaagtagc ccatcggtga gtcatcacct 11280
aagcgaaagc gtccatcatg gaatgtcatc acattacgac ttgtaaagtg gctacagcca 11340
tatataagca tttgataatt tagtaaccca tatttttgtt gaagtaatgg tgaaggcgag 11400
caagttgaac taccgtgcca tggtgcgaaa gcggcgtatt acatgggatc acggcggatg 11460
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ggactgctgt aatgcactct ttgattttat accttatggg cggccgatgt cgcggaatag 11580
tacagaatat caagtcaata tccaagttga tgattccgtt gaaagtgttc atttaagctg 11640
tgtgggtggg aatgtattta cccgcatgtc gtgtcgttat aacttcctca ctatacagct 11700
gctggtgcag tgcgttactg tatgcgccac tatttgtggc gttatatatg gatttggctt 11760
agctttttac acttatttgg tattttgggt aaaaac 11796
<210> 3
<211> 687
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件1的边界PCR桑格序列，左边界
<400> 3
ccgggcgaat tcgaatgcct ttagatactt tttgggaaac cagcgtggac ctcttgctgc 60
aactctctca gggccaggcg gtgaagggca attagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa 120
gaaaaaccac cccagtacat taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaaccac aagaaaatca 180
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acaaataata tatcaaagat taaaactttt gcaaaatagc ccaaagaaaa tcaaaatgga 300
tcatataact agagaatatg ctcctaataa ccaaattcta ggcaaagaac ttcaaaaaac 360
caaaagggtt tacaaaaagt atatcaaaga ttaaaacttt agcacaatta caccaagaaa 420
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gggggccccc caaaaaaatt ttggggggcc ccccaaaaaa atttgggggg cccccaaaaa 600
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ggtattatgg gagggggggc taggtag 687
<210> 4
<211> 602
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件1的边界PCR桑格序列，右边界
<400> 4
caaaaggtag ggtggactga ggcggcgctg gtggaaggct tagagccccg gagacatcaa 60
gatactgaca gttacttatt ttcttaggcg aaacgcagct ctttgaataa gaactcactt 120
cctctatatt atccgcctct gagcctaatt caccagtata attttcaggg gagggaatat 180
aaaagatccg actaggccta aggatcaaaa caaatagctc caaacctcaa gaaaatcaaa 240
aggggtcata taattatacc aaacaaattt gcatgtccca aaattatcaa actccaaacc 300
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ga 602
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<211> 5164
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件2的纳米孔PCR序列:左连接
<400> 5
atcctttagt tcggtgcatg tgctaggtta ataggaaaca cacgatagaa tccgaacggc 60
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cgatgttgga gtggacggca tggtaatcaa cagcaacaga caatacagcg ttaatgctgt 300
agcctgagac ccgggcacgt tgttcttggc ggttatcgcc cagggcccac agcaacgcac 360
cattagaagc tgtgtctgct gcagaaggat attggcccca ggtcgggcac tttcccgggt 420
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gctggtttgc ccagcagagc cgaaaatcct gtttgatgtt gtagtttccg aaatcgagcc 600
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atgacgccag gttaaaccgt ttacgtttag attgacaaga accaccgcaa catttgaagg 840
agccactcag ccgcgggttt cctggagttt cacaatgagc tagtatacac gtccagaaac 900
cattattgca tagatttcaa gtcacctaag gtcactatct cagctagcaa atattcttaa 960
taaaatgctc cactgacgtt tccgccaagt gattcccctc agtatccagt agagtctcat 1020
attcactctc aatccaaata ataatctgca ccggatctgg atcgtttcgc atgattgaac 1080
aagatggaat tgcacgcagg ttctcggcgc ttgggtggag agctactaaa ctatgactgg 1140
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cggctgcata cgcttgatcg actacctgcc cattcaccga ccaccaagca acatcgcgca 1500
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gatgatcccc gatcgttcaa acattttggc aataagtttc ttagattgaa tcctgttgcc 2340
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tacggctcta attccccaat gttcagatca ttcaggtgac ggtgataatt caccgcacaa 2940
tgaagatggg ctgatcaatg ttaccttcct ctatcaatca ggttgaatgt cgcccttttg 3000
tctttatttt aatgcactga gctacgcctc tctcccgcgt tgtacaatgg gattcgtggc 3060
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atgttgtgtg tggaattgtg gacaacaatt tcacacggga aacagcaggc atcatgatta 3240
cgcaagctgg cgccaaacat gcctgcaaga agttaggctt ccaggaatct aaagtaacat 3300
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tcatgtatgc atttacatgt tacatgaagc tggcatgatt caacagaaat tatatgagta 3480
atcatcgcag agaccgacag caggattcaa tcttaaggaa acttttattg ccggcaatgt 3540
ttgaacaggt agtccagagc tcatcactca agaagctcag aaagagtgca tggccttcct 3600
aaactcttgt ccctctctga agccatattt ttttgacacc acttgtttct gcccgtaaga 3660
actgggcaag caacatgcct agtagaggta atctccctct ccagaagcag aaaaggttgt 3720
gggaactggg ttccatttgg gcagggagca aaagctggga aggcaggcat cagtcacttg 3780
ggttcgagtg tggtctgctt gaaatcgaaa ttgtggctca taaacgtgtc ctccaactcc 3840
acgtagttag caacttgaag ctctcctcta gcagtagagc acactcagag tcagtaagat 3900
cctgaatctc atgttaatcc tagacaccac tgggttcccg tatccgaaag ccaagcagac 3960
ttagaaatct gtgcacagtc tcaagatctg ccaatgacag ggttgaaaat agtagcctct 4020
gcgtcttggc ttgccaaaga tccttcacaa tctccagtag cactcaagaa atatatcgtg 4080
gggaacctaa taatcacttg gcttgctcca ctcatcttct tgcttaagct gggcaagaat 4140
gaacttcagg ttcctgtttc catcaccgtg atacacagaa cagcttcttc tgccccttca 4200
gcaggtcatc ttaaccaccc tctcccccta cacaacacat ctcatcactt cacttgcttg 4260
cctctcaggg aagataatca acagccactc cttcttcttt gggagtgtct ttttagtcag 4320
actgatcatc cagaagcaga cttgttcaca tccttttcct tagccataat gtactcagta 4380
cttaaggttt ccgaattagc ccctctgatg ttctggatca agctcaacct tcttagtaag 4440
caagagcctt atcaggagat caccctgctg tggtacacag cgtaagaaga gatgaaatca 4500
gcactgacac tgcttatcaa tgaagtagaa atctctccct ctaaataatt tgctaagagc 4560
ttgttcctgt ccaaagctca gtgtgttggt aatcggctac tcccattgta tgcaacaccc 4620
aagctcccag aagcaatcct cagcagcagg aagacttgtt gcttaactcc tggaaggttt 4680
cccttaagac aactaacaat aaaatgtatc aagtttgtaa gtatctgtga cctagaagga 4740
gcagcaactt agctcccact tgatcctctt catcatttgg aagtactact tacctctctg 4800
aatagtaggt tagaaactaa gatccatcag acatatcctc atacttttga ggttctccag 4860
ctcactcact cggttaagcc tcttcatcaa cttgaaactt cactggatga ccaacggaat 4920
ccctctggat ctttgtagca gtagaggcaa aaagcctatc caactataag cccacttctt 4980
aatctgctcc aacttagctc catctctcag ccttaatgta atcacttaga gaagtcacaa 5040
gattaagcta ctcagtgtga ataaagatca gtcatctgtc caatagaagt gaagaatcct 5100
gggtgagtgc tgttggattc tatcttatca tttcccctaa tgccttagca atacatggcg 5160
taaa 5164
<210> 6
<211> 2834
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件2的纳米孔PCR序列:右连接
<400> 6
aattgaataa tgaatgtttt ggtgagaggt cgctcattat attttgctgc ctttatgctg 60
aatttgttgt tgtataagga tgtagtctac taccttgatg gtgctaattt cttatcatat 120
tataacggat tcagactgac tttttcaagt tgtatagctt aattgtgttt caagccaatc 180
gcgacggtca ggatttggta cttagaatga gtcatcttgc cggccatatt attgaacaaa 240
atttcaactg tatgcagtgt acaatacgtt atagaaaaac ataggagatc tttaaatcaa 300
ctttattaat tttcagaaag gagaaacata catgtgaaat tttgtagaat ccatttattt 360
ctcagcaggg tctgttcttt catgaataca ggctatttac gcaaattcaa tcgaacgaca 420
aatttttgaa atttcagcat caaaatgtca ataattcaca ctagtgtttg caagttgagg 480
ttttgggtcc catagcggaa gcaaatattt tctgatgcat caaacgctga tagtttgtga 540
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atgccatcat tgcgataagg aaggctatcg ttcaagatac tctaccgaca gtggtcccaa 1020
agatggttac cgaacatcgt ggaaagacgt tcaaccacgt ctttaaagca agtggattga 1080
tgtgatatct ccactgacgt gagatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagaccttcc 1140
tctatatgga agttcatttc attggaagga caggctgccc gagatccttc aacagtacca 1200
acaacaacaa acaacaacac aattactgta caattgcagt cgagtaaacc atggctcatg 1260
ctagggtttt gcttttggct cttgtgttct tgctactgct gttgctgtgg cttcttcttc 1320
atctttcgct gattcttagt gggccagtga ctgactactc ttgctcaatt ggtcgacatg 1380
caggattctt cacttctatt ggacagatga ctgatcttat tcacgcagga aggatcttga 1440
cttcttaagt tacattagtg aggaggataa gttgggcaga ttaagtgggc tgaagttgga 1500
taggcttact tctactgcca caagatcaga gttcgttggt catcagtgac gctttcaagt 1560
tgatgaagaa gcaacactga gtgggtgagc ttgaaccttg tgcttaggat atgactgatg 1620
gattcatttc taaccttact attcagaggt gagtacttaa atgatgagag tcaagtggga 1680
gctgctaagg ctcttcttag gctttgggat acttacaacc ttgatactga tacaatttct 1740
gaaaccttcc ggggttaagc acaagtcttt ccttactgct gaggattgct tcgagcttgg 1800
aaggttgcat acactgaggc tgattgctac cacactgact ttgagatgga acaagctctt 1860
aggcagcgat gaggagattt ctactattga taaggtgtca attagcgatt acctttctta 1920
cgctgtgtgt accagcaggg tgatcttgat aaggctcttt tgcctactaa gttgcttgag 1980
cttgatcgaa catcagaggg ctaacggaaa ccttaagcgc tggtacattg gctaaggaaa 2040
ggataacaag tctgcttctg atgatcagtc tgatcaaaga ctactcaaga aggggtggct 2100
gttgattatc ttcctgagag gcagaagtat gagatgttgt gtgggagagg tattaagatg 2160
actcaaggag gcagaagttg ttctgcaggc tcacgatgaa gcaaggcaaa gttcattctt 2220
actcaataag caagaagatg agtgggataa gccaagttat taggttccac gatatttctg 2280
atgctggggt ggtgtgagga tcttgccaag gcttaggagg cctacaacct attactggtg 2340
atcttgagac tgtgcactac aggttctaag tctgcttggc tttctggata cgagaacccg 2400
gtggtgtcac aagttaacat gattcaggat cttactggac ttgatgtgtc tactgtgagg 2460
cttcggttgc taactacgag ttggagacaa tatgagccac acttcgattt cgctgggaag 2520
gatgaccaga tgcttttaag gagcttggaa ctgaagcagg attgctactt ggctttcatg 2580
tccgatgttt ctgctggagg agctactgtt ttcccagaag tgaacttctg tttggccaag 2640
aaggaactgc tgtgttctgg tacagcctct tcatctggag gaaattactc tactaggcat 2700
gctgcttgcc cagttcttgt gaaacaagtg ggtgtcaaac aagtatttca tgagaggaca 2760
aaagtttaga aggccatgca ctctttctga gcttggtgat gagctcgaat tgatcgttca 2820
aacatttgta tgct 2834
<210> 7
<211> 407
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件2的边界PCR桑格序列;左边界序列2-3F(1825F)
<400> 7
cgtttgacta tgtcggttat gtgcatggca ttctataagc tatcgtcgga cagaacgccg 60
tgttagatgt catcatgcca tgttgcagtg gaccgtaagg ttttcaacca agcacagttt 120
tgcgtgtaca gtaacgaacc catttgatgg cggatatcac ccgggcccaa ctacgcatca 180
ttggaagctg tgtctccttg gccgggatat ttgggtcggg cgctttcccc aggttcccgg 240
gtcagacgtt ggttgacaaa aaaactggtg ctagctacca tgcggacggg caacagctga 300
ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt tgcagccagc cgtccacgct ggtttgcccc 360
ccaggcgaaa atcctgtatg atggtggtcc gaaatcggca aatcttt 407
<210> 8
<211> 477
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件2的边界PCR桑格序列;左边界2-4F(正向序列_9R)
<400> 8
ccgggttgga acaacggtgg ctgagggaca agtttgcata ccttgggtgg gtaactgggc 60
aagccaatgt ccgggtcaat gtgatggcca ttctataagc caatcgtagg accacaaacg 120
ccgcctttgg ttgctccaaa tggcgatgtt ggagtggacg gcatggtgat caacctagca 180
acagtattag cgtgtactgt aacgaacccg tttgatggcg gatatcacca gggcccagct 240
aacgcaccat tagaagctgt gtctgcttgc accgggatat ttgggtcggg cgctttcccc 300
gggttcccgg gagagaaatt ggttgataaa aaaactggtg ctagctacaa tgcggacggg 360
caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct 420
ggtttgcccc agcgggcgaa aatcctgttt gaggcggttc caaaataaag aattaaa 477
<210> 9
<211> 889
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件2的边界PCR桑格序列;右边界
<400> 9
gcgaaagcct tggttcatca ggttgtaaca tcacgaccgt agagtgtttt ttttagtaag 60
aggcgccctt tctccctatt tttgcatacc ctttaacttc ttttgatttt gttgttgtat 120
aaaggatgtt agttactacc ttgatagcac cccagtttct tatccattaa taacggattc 180
agataacttt tttcaagttt gtatagctta attgtgtttc agaaaccaat catgacggtc 240
aagagtttgg tacttagaat atgaaaaggt catcttgccg gccatattat tggaacaaaa 300
tttcaactgt atgcggtgta caatacgtta tagaaaaaca taggagatct ttaaaatcaa 360
ctttattaat tttcagaaag gagaaacata catgcaataa agaattttgt agaatccatt 420
ttatttctca gcagggtctg ttctttcatg aatacaggct atacacgcaa attcaatcga 480
acgaacgaat tttttttgaa atttcatatc aaaatgtatc aataattcac actagtgttt 540
tgcaagttga ggttttttgg gtcccacata gccggaagca aatcttttct acgatgcatc 600
acacactgat agtttgtgaa ccatcaccca tattaagttt ttgtggggtc gaggtgccgg 660
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gccaacgtgc gagaaggagg gaagaaagcg aaggagcggc ccaataggct gccacttggg 780
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aattggggac accattgttt actacacccc ccccgcgcta gatataagg 889
<210> 10
<211> 10063
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件3的纳米孔PCR序列:左边界
<400> 10
tgtgttgtac ttcggtttca gttacgtatt actaaaaggt taataggaaa cacgatagaa 60
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tacacatatt aaaaaattta ccttttagcg atagtgtata gtgagccata ttaactatca 180
atttgtttga atacaataaa tactcttaaa tcttgatatt ttaaaaaatt aaatatttat 240
cgaccacaaa aaaaatcaaa aaatcactta agtggagggc ttgtaaagta ttaataagga 300
atcataaaat attttaataa tacagatttt tttgtaattt tactagcaaa aaactagtac 360
tcttgcgtaa aattaacctt tgttttaatt aacttagatg cttaattaat tgagaaaaaa 420
taattacatg ggttattacc acagcaggtc agttgagaca ttattgtttg aaacaatgat 480
agattacaaa ccagagtttt tctgacaaaa gtagttccta ggatgtctgt ccagagtgca 540
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gtgaagatcg gttccagttg agtcatcagg gacctgcgtt caaaacaaag ttatcataaa 720
attaaccttt ttttatttta aaataacctt tcgttgatga tatggtgacg tttctttgtc 780
caccgtagag aaagtctcat aatagagcac tttgtatctt tgtaacacca aaactctgta 840
atcctataat tatttaacat cgtacaaaaa tttcaaacaa tttcggctgc gctgaagaac 900
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tttaaaatga aatagagatt atcaaactta agaaatttat caccagaaat aaatcaaact 1320
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agcacgtatg cggtgatctc agacttaatc acccaaagta ttcagagtgg ctattattgg 8580
attgaagtct aatcaggggt tgtacaatga gagctatcaa gttgtgattt ttccaactgg 8640
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<211> 657
<212> DNA
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<220>
<223> 事件3的边界PCR桑格序列;左边界序列1-3R(反向_RP1)
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<212> DNA
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<223> 事件3的边界PCR桑格序列;左边界3-1F(正向序列_MP_Col_5R)
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cgggggttta cccattaggt atcttacaac gttcggtcat tttgagagct gtcgccatgt 60
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tgttaacgac cggtccccag cgggatttgc ctaaataccg attcttttgg gaatacagga 180
gatttatcca aaatgtcaat cacaacaagg gcatctgatg cagcatccta tatagtttct 240
actgaagtat cctaattagt aagttatgga caaaccatcc atatgtctta ttttaggaga 300
agtgaaataa ccattgttgc cggcttagga tgaattttga tgccagagaa tggtaaatac 360
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cattaattgt tttctttttc aagtttcaag tgatattagt ccttcttgat aaggacatga 480
ttcagcaagc tgttcagtat attatcttgt gagaaataca aacaaaacaa cttaaggaag 540
aagatcaaat aagaagctgg cgacagtgat cttgtgataa agaaaagaag aaaagacgcg 600
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agcttagtca ttgctgtatt atctttgact tattcaccac agtcacatca cctgtatatc 780
ttccccttga cgggacgagt ctcacattag ttgttaaccg taactaatac taacgatagt 840
gattactaat tgtttaaccc ttaagaagtt tgcggacaag taaggccttt cttaggagtt 900
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gtgtcgttgg tattaatgat gaaaattaat catctagttc aaaaactgta tgattcacta 1020
ctagaatagc ttatcggagg tcactgcgag actcaattca agaaccgctt atcatcgact 1080
taagtcatag ctcgcaagca ctgcgtgatg ccgtatcgcg tgtactcgaa tacagactaa 1140
gccaatgttc caggcacatg gttgatcaca tcgacgctta aggttgcatc tctcgaattg 1200
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<210> 14
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<212> DNA
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<220>
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ctatatctag ctttcactgt taatttatct agtacgtact tcatttgttt catagtaaaa 480
atctctgcgt tattttccaa attgaaaaga aatgcaacat tttaaacgga ccaaatggta 540
attaacacta ttcttttaga cataggagta tatgctgtta ttctaaagta caacgtaata 600
cgagcaatta aaggctaatg cttttctgct aggaattaaa tttggaatga ttaagcgttt 660
ctttatattg agtttaattt gcaaattact ccataagtat ttctaagtaa gtgattataa 720
aattatttaa ccaaaagatt aaatatcatt atatatacaa accaacaaca acgactccta 780
acctatagtt tgactggtca ttatttcatt attagtactt ctcaagtaat ctcagaaagc 840
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taaaaactaa tgtgagactc tcccgtttag gggaaaaaat acatgtgatg tgacttggta 960
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ctcactttca gatgatttta tttcatagac agctataaca tattatattt gtcatagctc 1080
acaaagattt ttgtaaatac tcgtccggct ttcttcttac catttcaaaa gcacaactgt 1140
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at 1262
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件4的纳米孔PCR序列:左边界
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cacccatctt catcccaagc aaactccttt ctgcaatatt cattcttttt ccatacggca 360
accatcattc caagaaaata cgtataccga atcaccttct atcaggattc ccaaaccctt 420
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 事件5的纳米孔PCR序列:左边界
<400> 17
atcggtgtgc ttcgttcagt tacgtattgc taaggttaat agggaaacac gatagaatca 60
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttaa catgggcatc 360
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tcttgtgaaa agaaagaaag aaaagacgcg gaaggtcata attttcaaaa gatctttgta 780
gtattatcaa ataataatat gttattactt gtctatgaaa ataaaatcat ctgaaattaa 840
tttttggact ctaatatttg tgtttaaaac ttttacaact tagtaattgc tgtattatct 900
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gaatacgtta agcatgtaat gagtggcatg cttaatgcat gacgttattt atgagatggg 3720
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cttgattctg tcgctactga ttacggtgct gctatcgatg gtttcgtggt gacgtttcat 4140
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actcgttaca gaaaggttaa tattcaaaaa atcttggtaa atagtaaaac atgcggccgc 5520
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atagccacat cagctggatc ataccttgac cgccgtactc aaattgaaat ccatcagtca 5940
catactttcc gcagacaacg tgcctcttat ctttaggatt tgagatgctc tggattttct 6000
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actttgatag catcaagaga ttacagccac tgatttggat cagcagtatt caccactttt 6120
ccaatcaggt gacacatttt caaatcacga catgttctag ctgggtttta cgtgaacctt 6180
ctggaagtct aatgttttca atttgctggg agagaggatt tccaaagttg tatcacttgg 6240
aaatctctat cctaacaacg ttgcatcatc aacacggtaa tatctgccgc catcgtgagc 6300
cttctcttgt agtggctgtg gaaataatca gatccagctg atggggggcc aggtggacct 6360
ggtggaccag gaggtcctgg aggagccaac aggagccagc atctcctgtt cttcctctag 6420
gtcacagagg ccggtggtcc taaggggagg ccattaagac catctttttc aggaggtgca 6480
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<210> 18
<211> 1287
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 边界PCR桑格序列;左边界序列5-2F(MP_Col_3R)
<400> 18
gggaaccggc ctgcatttta tttaatacaa tagggaacca gcgtgggccg caatgctgca 60
actctctcag ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag 120
aaaaaccacc ccagtacatt aaaaacgtcc gcaatgtgtt attaagttgt ctaagcgtca 180
atttgtttac accacaatat taatatatat acatgtattt ggacatatat ttttatttaa 240
tcataattaa ttattatata ttttacctca taaatcattt aactatgaaa agtttatata 300
gtttggtgtg gataaatttt taccgctttg accgcgtctc atctcctacg taaattccat 360
gcatttgcag tgttgttgaa gaaaaatact cctccggtgt caagttattt tcgacaacgt 420
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<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 合成的序列含有硫醇蛋白酶aleurain前体的大麦基因与人胶原蛋白α1(I)链融合的液泡信号序列的编码区
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<210> 21
<211> 4176
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 合成的序列含有硫醇蛋白酶aleurain前体的大麦基因与人胶原蛋白α2(I)链融合的液泡信号序列的编码区
<400> 21
atggctcacg ctcgtgttct cctcctcgct ctcgctgttt tggcaacagc tgctgtggct 60
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<223> 合成的序列含有硫醇蛋白酶aleurain前体的大麦基因与人脯氨酸4-羟化酶β亚基融合的液泡信号序列的编码区
<400> 23
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ccagttaagg tgttggtggg taaaaacttc gaggatgtgg ctttcgatga gaagaagaac 1260
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aagttccttg agtctggagg acaagatgga gctggagatg atgatgatct tgaggatttg 1560
gaagaagctg aggagccaga tatggaggag gatgatgatc agaaggctgt gtgatgag 1618
<210> 24
<211> 2299
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 合成的序列含有硫醇蛋白酶aleurain前体的大麦基因与人赖氨酰羟化酶3融合的液泡信号序列的编码区
<400> 24
atggctcacg ctagggtttt gcttcttgct cttgctgttc ttgctactgc tgctgttgct 60
gtggcttctt caagttcttt cgctgattct aacccaatta ggccagtgac tgatagagct 120
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aatccagaga agttgcttgt gattactgtg gctactgctg agactgaagg ataccttaga 240
ttccttagga gtgctgagtt cttcaactac actgtgagga ctcttggact tggagaagaa 300
tggaggggag gagatgttgc tagaactgtt ggaggaggac agaaagtgag atggcttaag 360
aaagagatgg agaagtacgc tgatagggag gatatgatta ttatgttcgt ggattcttac 420
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ccagaagtgg gaactggaaa gagattcctt aactctggag gattcattgg attcgctact 600
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<213> homo sapiens
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<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 33
cacccaggat tcttcacttc t 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 34
aaccctggcg ttacccaact 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 35
tgtgtttggg ggttgaggat 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 36
gtttgcatac gcttgggtgg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 37
aattgttctg tgaaggcggg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 38
attttgccga tttcggaacc 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 39
tcatcaagga cctgcgttca a 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 40
agactcgcct tttgatccag 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 41
aggagtcgtt gttgttggtt 20
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 42
ataagggatt ttgccgattt cg 22
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 43
taagcagaca accacgcgat 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 44
taaggttcgc cggtgctatg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 45
tggatcaact tagcgggagt 20
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 46
cacatcaaaa ccgaactctt ga 22
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 47
acggttttaa agtcttgcaa cc 22

Claims (51)

1.一种在含有烟草DNA的一样品中可检测到的重组DNA分子，其特征在于：所述分子的核苷酸序列为：
(a)与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列；
其中所述重组DNA分子的存在用于诊断所述样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18DNA或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18DNA的子代。
2.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子包括：一多核苷酸片段，具有足够的长度以作为一DNA探针，所述DNA探针在严格的杂交条件下与一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA进行特异性杂交，其中在所述严格的杂交条件下，所述DNA分子的杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述重组DNA分子包括：
(a)与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同的一核苷酸序列；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列。
4.一种成对的DNA分子，其特征在于：所述成对的DNA分子包括：一第一DNA分子及一第二DNA分子，所述第一DNA分子及所述第二DNA分子在与一样品一起用于一扩增反应时作为引物，其中所述样品包括：烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA，从而产生一扩增子以诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA，其中所述扩增子包括：与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同的一核苷酸序列。
5.一种检测一重组DNA的存在的方法，其特征在于：所述重组DNA分子的存在用于诊断一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18DNA的子代，所述方法包括：
(a)在严格的杂交条件下，将所述样品与如权利要求2或3所述的DNA分子接触；以及
(b)检测所述DNA分子与所述重组DNA的杂交；
其中所述杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA的存在。
6.一种在一样品中检测烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的一重组DNA的存在的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)将所述样品与如权利要求4所述的成对的DNA分子接触；
(b)使用所述成对的DNA分子来进行足以产生一DNA扩增子的一扩增反应；以及
(c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在；
其中所述DNA扩增子包括：与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同的一核苷酸序列，以及其中所述扩增子的存在用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09-18或所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的子代的所述重组DNA。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：检测与SEQ ID NO:1至5、7至8、10至19具有至少99％相同的一核苷酸序列中的至少一个。
8.一种烟草植物、植物部分或烟草植物的细胞，其特征在于：所述烟草植物、所述植物部分或所述烟草植物的细胞包括：与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同的一核苷酸序列。
9.如权利要求6至8任一项所述的方法或植物，其特征在于：所述方法或植物包括：检测LH3、P4Hb、胶原α1及/或胶原α2的存在及/或方向。
10.如权利要求9所述的方法或植物，其特征在于：所述存在及/或方向与事件A3-29-305-17-09-18的存在及/或方向至少99％相同。
11.如权利要求9所述的方法或植物，其特征在于：所述存在及/或方向与事件A3-29-305-17-09-18的存在及/或方向相同。
12.如权利要求8所述的烟草植物、植物部分或烟草植物的细胞，其特征在于：所述烟草植物是包括所述烟草事件A3-29-305-17-09-18的一烟草植物的任何世代的一子代。
13.如权利要求8所述的烟草植物、植物部分或烟草植物的细胞，其特征在于：所述烟草植物、所述植物部分或所述烟草植物的细胞包括：与SEQ ID NO:1至5、7至8、10至19具有至少99％相同的一核苷酸序列中的至少一个。
14.如权利要求1至12任一项所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述子代是一近交烟草植物或一杂交烟草植物。
15.如权利要求14所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述子代是列于表20、21、21a及22中的任何一个。
16.如权利要求1至12任一项所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述重组DNA分子源自列于表20、21、21a及22中任何一个的一烟草事件或所述烟草事件的子代。
17.如权利要求1、3、4、5至12任一项所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO:34及35所示。
18.一种生产前胶原的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)种植如权利要求8至17任一项所述的植物；以及
(b)从所述植物分离所述前胶原。
19.一种前胶原，其特征在于：所述前胶原是根据权利要求18所述的方法而获得的。
20.一种处理前胶原的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)提供如权利要求8至18任一项所述的植物的一蛋白制剂；以及
(b)将所述蛋白制剂与一有效量的一酶接触，所述酶能够将前胶原加工成胶原。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述酶包括无花果蛋白酶。
22.一种烟草种子，其特征在于：所述烟草种子包括：一可检测量的一核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:6或9具有至少99％相同，或与SEQ ID NO:6或9完全互补。
23.如权利要求22所述的烟草种子，其特征在于：所述烟草种子包括：一可检测量的一核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1至5、7至8、10至19具有至少99％相同，或与SEQID NO:1至5、7至8、10至19完全互补。
24.一种非活体的烟草植物材料，其特征在于：所述非活体的烟草植物材料包括一可检测量的如权利要求1所述的重组DNA分子。
25.一种烟草植物及烟草植物部分，其特征在于：所述烟草植物及所述烟草植物部分包括：在一DNA扩增方法中被测试时作为一模板的一DNA，从而产生一扩增子以诊断事件A3-29-305-17-09-18DNA的存在。
26.一种确定包括事件A3-29-305-17-09-18的一烟草植物或烟草种子的接合性的方法，其特征在于：所述方法包括：
将包括烟草DNA的一样品与一引物组接触，所述引物组能够产生一第一扩增子及一第二扩增子，其中所述第一扩增子用于诊断事件A3-29-305-17-09-18，所述第二扩增子用于诊断不包括事件A3-29-305-17-09-18的天然烟草基因组DNA；
(i)将所述样品及所述引物组进行一核酸扩增反应；以及
(ii)在所述核酸扩增反应中检测所述第一扩增子或所述第二扩增子，其中所述第一扩增子用于诊断事件A3-29-305-17-09-18，所述第二扩增子用于诊断不包括事件A3-29-305-17-09-18的天然烟草基因组DNA；其中只有所述第一扩增子的存在时用于在所述样品中诊断一纯合事件A3-29-305-17-09-18DNA，以及所述第一扩增子及所述第二扩增子的同时存在时用于诊断事件A3-29-305-17-09-18等位基因的一烟草植物杂合子；或
将包括烟草DNA的一样品与含有至少一第一探针及至少一第二探针的一探针组接触，所述第一探针特异性杂交事件A3-29-305-17-09-18DNA，以及所述第二探针特异性杂交烟草基因组DNA，其中所述烟草基因组DNA因被插入事件A3-29-305-17-09-18的异源DNA而被破坏，并且不与事件A3-29-305-17-09-18DNA杂交；
(i)在严格的杂交条件下，将所述探针组与所述样品杂交；
其中在所述严格的杂交条件下，仅检测到所述第一探针的杂交时用以诊断事件A3-29-305-17-09-18的一纯合等位基因，以及其中在所述严格的杂交条件下，同时检测到所述第一探针及所述第二探针的杂交时用以诊断事件A3-29-305-17-09-18的一杂合等位基因。
27.一种生产具有一改良农业性状的一植物的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)使如权利要求8至17任一项所述的植物经受一育种计划及/或转基因及/或基因组编辑；以及
(b)选择表现出一改良农业性状的一植物。
28.如权利要求1至27任一项所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述子代包括A3-29-305-17-09-18与沙姆逊品种的杂交种。
29.一种在含有烟草DNA的一样品中可检测到的重组DNA分子，其特征在于：所述分子的所述核苷酸序列为：
(a)与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列；
其中所述重组DNA分子的存在用于诊断所述样品中的烟草事件A3-29-305-17-09DNA或所述烟草事件A3-29-305-17-09DNA的子代。
30.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子包括：一多核苷酸片段，具有足够的长度以作为一DNA探针，所述DNA探针在严格的杂交条件下与一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的一重组DNA进行特异性杂交，其中在所述严格的杂交条件下，所述DNA分子的杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代。
31.如权利要求30所述的DNA分子，其特征在于：所述重组DNA分子包括：
(a)与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列；或
(b)与(a)完全互补的一核苷酸序列。
32.一种成对的DNA分子，其特征在于：所述成对的DNA分子包括：一第一DNA分子及一第二DNA分子，所述第一DNA分子及所述第二DNA分子在与一样品一起用于一扩增反应时作为引物，其中所述样品包括：烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的一重组DNA，从而产生一扩增子以诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的所述重组DNA，其中所述扩增子包括：与SEQ IDNO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列。
33.一种检测一重组DNA的存在的方法，其特征在于：所述重组DNA分子的存在用于诊断一样品中的烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09DNA的子代，所述方法包括：
(a)在严格的杂交条件下，将所述样品与如权利要求30或31所述的DNA分子接触；以及
(b)检测所述DNA分子与所述重组DNA的杂交；
其中所述杂交用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的所述重组DNA的存在。
34.一种在一样品中检测烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的一重组DNA的存在的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)将所述样品与如权利要求32所述的成对的DNA分子接触；
(b)使用所述成对的DNA分子来进行足以产生一DNA扩增子的一扩增反应；以及
(c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在；
其中所述DNA扩增子包括：与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列，以及其中所述扩增子的存在用于诊断所述样品中的所述烟草事件A3-29-305-17-09或所述烟草事件A3-29-305-17-09的子代的所述重组DNA。
35.一种烟草植物、植物部分或烟草植物的细胞，其特征在于：所述烟草植物、所述植物部分或所述烟草植物的细胞包括：与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列。
36.如权利要求35所述的烟草植物、植物部分或烟草植物的细胞，其特征在于：所述烟草植物是包括所述烟草事件A3-29-305-17-09的一烟草植物的任何世代的一子代。
37.如权利要求35所述的烟草植物、植物部分或烟草植物的细胞，其特征在于：所述烟草植物、所述植物部分或所述烟草植物的细胞包括：与SEQ ID NO:1至19具有至少99％相同的一核苷酸序列中的至少一个。
38.如权利要求29至36任一项所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述子代是一近交烟草植物或一杂交烟草植物。
39.如权利要求38所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述子代是列于表20至30中的任何一个。
40.如权利要求29至36任一项所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述重组DNA分子源自列于表20至30中任何一个的一烟草事件或所述烟草事件的子代。
41.一种生产前胶原的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)种植如权利要求35至40任一项所述的植物；以及
(b)从所述植物分离所述前胶原。
42.一种前胶原，其特征在于：所述前胶原是根据权利要求41所述的方法而获得的。
43.一种处理前胶原的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)提供如权利要求35至41任一项所述的植物的一蛋白制剂；以及
(b)将所述蛋白制剂与一有效量的的一酶接触，所述酶能够将前胶原加工成胶原。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于：所述酶包括无花果蛋白酶。
45.一种烟草种子，其特征在于：所述烟草种子包括：一可检测量的一核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1至19具有99％相同，或与SEQ ID NO:1至19完全互补。
46.如权利要求45所述的烟草种子，其特征在于：所述烟草种子包括：一可检测量的一核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1至19具有99％相同，或与SEQ ID NO:1至19完全互补。
47.一种非活体的烟草植物材料，其特征在于：所述非活体的烟草植物材料包括一可检测量的如权利要求29所述的重组DNA分子。
48.一种烟草植物及烟草植物部分，其特征在于：所述烟草植物及所述烟草植物部分包括：在一DNA扩增方法中被测试时作为一模板的一DNA，从而产生一扩增子以诊断事件A3-29-305-17-09DNA的存在。
49.一种确定包括事件A3-29-305-17-09的一烟草植物或烟草种子的接合性的方法，其特征在于：所述方法包括：
将包括烟草DNA的一样品与一引物组接触，所述引物组能够产生一第一扩增子及一第二扩增子，其中所述第一扩增子用于诊断事件A3-29-305-17-09，所述第二扩增子用于诊断不包括事件A3-29-305-17-09的天然烟草基因组DNA；
(i)将所述样品及所述引物组进行一核酸扩增反应；以及
(ii)在所述核酸扩增反应中检测所述第一扩增子或所述第二扩增子，其中所述第一扩增子用于诊断事件A3-29-305-17-09，所述第二扩增子用于诊断不包括事件A3-29-305-17-09的天然烟草基因组DNA；其中只有所述第一扩增子的存在时用于在所述样品中诊断一纯合事件A3-29-305-17-09DNA，以及所述第一扩增子及所述第二扩增子的同时存在时用于诊断事件A3-29-305-17-09等位基因的一烟草植物杂合子；或
将包括烟草DNA的一样品与含有至少一第一探针及至少一第二探针的一探针组接触，所述第一探针特异性杂交事件A3-29-305-17-09DNA，以及所述第二探针特异性杂交烟草基因组DNA，其中所述烟草基因组DNA因被插入事件A3-29-305-17-09的异源DNA而被破坏，并且不与事件A3-29-305-17DNA杂交；
(i)在严格的杂交条件下，将所述探针组与所述样品杂交；
其中在所述严格的杂交条件下，仅检测到所述第一探针的杂交时用以诊断事件A3-29-305-17-09的一纯合等位基因，以及其中在所述严格的杂交条件下，同时检测到所述第一探针及所述第二探针的杂交时用以诊断事件A3-29-305-17-09的一杂合等位基因。
50.一种生产具有一改良农业性状的一植物的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)使如权利要求35至40任一项所述的植物经受一育种计划及/或转基因及/或基因组编辑；以及
(b)选择表现出一改良农业性状的一植物。
51.如权利要求29至50任一项所述的DNA分子、方法或植物，其特征在于：所述子代包括A3-29-305-17-09与弗吉尼亚K358品种的杂交种。
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