KR20020008819A - 메틸로트로픽 효모 발현 시스템을 사용한 재조합 모넬린의생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안정하고, 중량을 기준으로 슈크로스와 비교하여 100배 이상의 감미도를 나타내는 단일쇄 모넬린형 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 모넬린 형 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 바람직하게, 핵산은 메틸로트로픽 효모인 피치아 파스토리스에서 암호화된 모넬린형 단백질의 발현 및 분비를 지시하는 프로모터 및 시그날 서열을 추가로 포함한다. 본 발명은 추가로 모넬린형 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포, 재조합 피치아 파스토리스로부터 모넬린형 단백질을 생산하는 방법 및 이러한 방법에 의한 생성물에 관한 것이다.

Description

메틸로트로픽 효모 발현 시스템을 사용한 재조합 모넬린의 생산방법{Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system}

2. 발명의 배경

2.1. 모넬린

모넬린은 열대 식물[문헌참조: Dansby, Nature Biotechnology, 1997, 15:419-420]로부터 유래된 강력한 감미 단백질 계열에 속한다. 모넬린은 슈크로스와 비교하여 약 3,000배의 감미도를 나타낸다. 또 다른 유사한 단백질은 타우마틴, 미라쿨린, 마비늘린, 펜타딘 및 아스파르탐(Id)을 포함한다. 모넬린은 최초로 서부 아프리카 식물인 디오스코레오필럼 콤미니시[문헌참조: 미국 특허 제3,878,184호 및 제3,998,798호; 및 Morris and Cagan, Biochim. Biophys. Acta, 1972, 261:114-122]로부터 분리되었다. 모넬린의 아미노산 서열, 3차원 구조 및 다양한 물리화학적 성질은 문헌[참조: Ogata, et al., Nature, 1987, 328:739-742; Morris et al., J. Biol. Chem., 1973, 248:534-539; Cagan, Science, 1973, 181:32-35; Bohak and Li, Biochim. Biophys. Acta, 1976, 427:153-170; Hudson and Beeman, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1976, 71:212-220; Van der Wel and Loeve, FEBS Lett., 1973, 29:181-183; and Frank and Zuber, HoppeSeyler's Z Physiol. Chem., 1976, 357:585-592]에서 특성화되었다.

미국 특허 제4,300,576호는 타우마틴 또는 모넬린을 함유하는 담배 제품을 기술하고 있다. 미국 특허 제4,562,076호는 타우마틴 또는 모넬린으로 피복된 츄잉 검을 기술하고 있다. 미국 특허 제4,412,984호는 타우마틴 또는 모넬린을 함유하는 향 강화 구강 조성물을 기술하고 있다. 그러나, 저칼로리의 감미제 만큼 강력하다 하더라도 모넬린이 열과 pH에 대해 안정성이 불량하고 식물 공급원으로의 접근 불가 및 식품 첨가제를 위한 기후조절의 불확실성으로 인해 모넬린은 상업용으로 사용되지 못하고 있다[문헌참조: Dansby, Nature Biotechnology, 1997, 15:419-420].

1989년에, 김성호(KIM, Sung-Hou)의 그룹은 유전자 공학에 의한 이. 콜리내에서의 단일쇄 모넬린의 생산을 보고하였다[문헌참조: Kim et al., Protein Eng., 1989, 2:571-575]. 정제된 단일쇄 모넬린은 보다 열 안정성이고 광범위한 pH에 내성이면서 감미도를 유지하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 다양한 측면은 특정 미국 특허들의 과제였다. 예를 들어, 미국 특허 제5,234,834호는 식물 세포에서 단일쇄 모넬린을 발현하기 위한 작제물을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,487,923호는 화학식 B-C-A[여기서, B는 천연 모넬린의 1번 내지 46번 잔기의 B 쇄와 90% 이상 상동성이고 단지 보존 치환(conservative substituitions)에 의해 변형된 펩타이드 부분을 나타내고 C는 공유 결합 또는 분자의 외곽 부분에 위치하도록 선택되고 천연 형태를 붕괴시키지 않는 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드와 동일한 공간 길이를 제공할 수 있는 생리학적으로 허용될 수 있는 친수성 공유 링커이고 A는 천연 모넬린의 6번 내지 45번 잔기의 A쇄와 90% 이상 상동성이고 단지 보존 치환에 의해 변형된 펩타이드를 나타낸다]의 단백질성 감미 화합물을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,487,983호는 미국 특허 제5,487,923호에 기술된 단일쇄 모넬린을 제조하기 위한 발현 시스템을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,670,339호는 미국 특허 제5,487,923호에 기술된 단일쇄 모넬린을 암호화하는 DNA를 기술하고있다. 미국 특허 제5,672,372호는 미국 특허 제5,487,923호에 기술된 단일쇄 모넬린을 사용하여 식품 조성물에 감미를 제공하는 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,264,558호는 표준 감미 시험에서 중량을 기준으로 슈크로스의 감미보다 50배 이상 높은 단일쇄 모넬린 단백질을 기술하고 있다.

최근에, 문헌[참조: Kondo et al., Nature Biotechnology, 1997, 15:453-457]은 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 효모의 세포내에서 단일쇄 모넬린 단백질을 이종 발현시키는 방법을 기술하고 있다. 이것은 모넬린이 가용성 단백질의 50% 이상을 차지하는 높은 수준으로 생산됨을 보고하고 있다.

2.2. 피치아 파스토리스에서의 이종 단백질의 발현

메틸로트로픽 효모인 피치아 파스토리스가 단백질 발현 시스템으로서 사용된다. 위의 발현 시스템의 다양한 측면은 특정 미국 특허들의 과제였다. 예를 들어, 미국 특허 제4,837,148호는 피치아 파스토리스의 자발적 복제 서열을 기술하고 있다. 미국 특허 제4,855,231호는 피치아 파스토리스 세포에서 이종 유전자 발현을 위한 조절 영역을 기술하고 있다. 미국 특허 제4,882,279호는 피치아 파스토리스의 게놈을 부위 특이적으로 변형시키는 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제4,929,555호는 피치아 파스토리스의 전체 세포를 형질전환용 컴피턴트 세포로 변형시키는 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,122,465호는 피치아 파스토리스 균주에서 선별성 표현형을 부여하는 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,324,639호는 피치아 파스토리스 세포를 포함하는 메틸로트로픽 세포에서 인슐린형 성장 인자-1를 생산하기 위한 방법을 기술하고 있다.

다수의 시그날 서열을 사용하여 피치아 파스토리스 세포에서 발현되는 이종 단백질을 분비시킬 수 있다. 이러한 시그날 서열의 예는 피치아 파스토리스 산 포스파타제의 시그날 서열, 아스퍼질러스 기간테우스(Aspergillus giganteus) α-사르신의 시그날 서열[문헌참조: Martinez-Ruiz et al., Protein Expr. Purif., 1998, 12(3):315-22; Abdulaev et al., Protein Expr. Purif., 1997, 10(1):61-9; Kotake et al., J. Lipid Res., 1996, 37(3):599-605], α-N-아세틸갈락토스아미다제(αNAGAL, EC 3.2.1.49)의 시그날 서열[문헌참조: Zhu et al., Arch. Biochem. Biophys., 1998, 352(1):1-8], OmpA 단백질의 시그날 펩타이드[문헌참조: Heim et al., Biochim. Biophys. Acta., 1998, 1396(3):306-19], 마우스 α-인자 시그날(cCell)의 시그날 서열 또는 후추의 엔도-β-1,4-글루카나제의 천연 시그날 서열[문헌참조: Ferraese et al., FEBS Lett., 1998, 422(1):23-6], 리그닌 분해성 진균류 트라메테스(Trametes)로부터 분리된 락카제의 시그날 펩타이드[문헌참조: Jonsson et al., Curr. Genet., 1997, 32(6): 425-30], 쥐의 리소좀 산 알파-만노시다제의 시그날 펩타이드[문헌참조: Merkle et al., Biochim. Biophys. Acta., 1997, 1336(2): 132-46], 돼지의 카보닉 언하이드라제의 시그날 펩타이드[문헌참조: Wuebbens et al., Biochemistry, 1997, 36(14):4327-36], 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)의 글루코아밀라제의 시그날 서열[문헌참조: Fierobe et al., Protein Expr. Purif., 1997, 9(2)-159-70], 마우스 주요 뇨 단백질의 시그날 서열[문헌참조: Ferrari et al., FEBS Lett., 1997, 401(1):73-7], phol의 시그날서열[문헌참조: Skory et al., Curr. Genet., 1996, 30(5):417-22], 래빗의 안지오텐신-전환 효소(ACE)의 시그날 서열[문헌참조: Sadhukhan et al., J. Biol. Chem., 1996, 271(31):18310-3], 피치아 파스토리스 아스파르틱 프로테이나제의 프레펩타이드 서열[문헌참조: Tsujikawa et al., Yeast, 1996, 12(6):541-53], 피치아 파스토리스 PRC1의 시그날 서열[문헌참조: Ohi et al., Yeast, 1996, 12(1):31-40], 세균의 열안정성 α 아밀라제의 시그날 서열 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 기원의 SUC 2 유전자 시그날 서열[문헌참조: Paifer et al., Yeast, 1994, 10(11):1415-9] 및 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열[문헌참조: Fidler et al., J. Mol. Endocrinol., 1998, 21(3):327-336]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

메틸로트로픽 효모인 피치아 파스토리스가 다양한 이종 단백질을 생산하기 위해 성공적으로 사용되었지만 미국 특허 제5,324,639호는 메틸로트로픽 효모 발현 시스템에 대한 현재 이해 수준에서 특정 유전자가 위의 효모에서 감지할만한 수준으로 발현될 수 있는지 또는 효모 숙주가 이의 세포내에 존재하게 되는 재조합 유전자 산물에 내성일지는 예측할 수 없다는 것을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,324,639호는 특정 단백질이 메틸로트로픽 효모 숙주에 의해 분비되는지, 및 분비되는 경우 어느 정도 효율로 분비되는지를 예측하기란 특히 어렵다는 것을 추가로 기술하고 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Vollmer et al., J. Immunol. Methods, 1996, 199(1):47-54]은, 사람 sIL-6R의 323개의 아미노산 잔기가 메틸로트로픽 효모 피치아 파스토리스에 적합한 발현/분비 벡터에 삽입되는 경우 어떠한 검출 가능한 재조합 단백질의 발현 및 분비가 일어나지 않음을 보고하고 있다. 현재까지, 모넬린은 피치아 파스토리스 발현 시스템을 사용하여 발현되고 분비되지 못하였다.

모넬린의 상업적 응용이 큰 관심으로 주목되고 있기 때문에 여전히 천연 감미도를 보유하는 안정한 모넬린을 생산하고 다운 스트림 정제 과정을 단순화시킨 보다 효율적인 방법이 크게 요구되고 있다. 본 발명은 당해 분야에서 이들 필요성을 해결하고자 하는 것이다. 위에서 인용된 문헌은 위의 문헌이 본 발명의 선행기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되지 말아야한다.

3. 발명의 요약

본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산에 관한 것이고 이때 키메릭 단백질은 N 말단에서 C 말단까지, 천연 모넬린 B 쇄의 1번 내지 50번의 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제1 펩타이드 단편 a)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린의 B쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 대해 결정된다], 펩타이드 결합 또는 1개 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 제2 펩타이드 단편 b) 및 천연 모넬린 A쇄의 1번 내지 45번의 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제3 펩타이드 단편 c)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린 A쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 대해 결정된다]를 포함하고 키메릭 단백질은 안정하고 주어진 양의 당해 키메릭 단백질은 동일한 양의 슈크로스와 비교하여 감미도가 100배 이상이고 당해 핵산내에서 바람직하게 효모 세포에 의해 사용되는 코돈이 사용된다. 바람직하게, 분리된 핵산은 추가로 피치아 파스토리스내에 단백질 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및/또는 피치아 파스토리스로부터 암호화된 키메릭 단백질의 분비를 지시할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하고 있다.

본 발명은 또한 위의 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암호화된 키메릭 단백질이 세포에 의해 발현되어 분비되도록 위의 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포를 증식시키고 발현되고 분비된 키메릭 단백질을 회수함을 포함하는 키메릭 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 최종적으로, 본 발명은 상기 방법에 의한 생성물에 관한 것이다.

본원은 35 U.S.C. §119(e)하에 1998년 12월 31일에 출원되고 발명의 명칭이 "메틸로트로픽 효모 발현 시스템을 사용한 재조합 모넬린의 생산방법"인, 링순 두안(Lingxun Duan)의 미국 가출원 번호 제60/114,529호를 우선권으로 주장한다.

1. 발명의 분야

본 발명은, 안정하고 중량을 기준으로 슈크로스와 비교하여 100배 이상의 감미도를 나타내는 단일쇄 모넬린형 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 위의 모넬린형 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 바람직하게, 핵산은 메틸로트로픽 효모인 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)내에 암호화된 모넬린형 단백질의 발현 및 분비를 지시하는 프로모터와 시그날 서열을 추가로 포함한다. 본 발명은 추가로 모넬린형 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포, 재조합 피치아 파스토리스로부터 모넬린형 단백질을 생산하는 방법 및 이들 방법에 의한 생성물에 관한 것이다.

4. 도면의 간단한 기술

도 1은 재조합 단일쇄 모넬린 단백질의 아미노산 서열 및 재조합 단일쇄 모넬린 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다. 1번 내지 50번의 아미노산 잔기는 천연 모넬린 B쇄의 1번 내지 50번의 아미노산 잔기에 상응하고, 51번의 아미노산 잔기는 링커로서 글라이신이고, 52번 내지 96번의 아미노산 잔기는 천연 모넬린 A쇄의 1 내지 45번의 아미노산 잔기에 상응한다.

도 2는 재조합 단일쇄 모넬린 단백질을 합성하기 위해 사용되는 올리고머의 DNA 서열을 나타낸다.

도 3은 합성된 모넬린 DNA내 각각의 DNA 올리고머의 위치 및 이의 효소 분해 부위의 위치를 나타낸다.

도 4는 재조합 모넬린 단백질 발현 벡터 pGWYS1의 제한 지도를 나타낸다.

도 5는 pGWYS1의 작제방법을 나타낸다.

도 6은 배양 배지로부터 분리된 분비된 재조합 모넬린 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.

도 7은 분비된 재조합 모넬린 단백질를 정제하는 단계를 나타낸다.

5. 발명의 상세한 기술

본 발명은 안정하고 중량 기준으로 슈크로스와 비교하여 감미도가 100배 이상인 단일쇄 모넬린형 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 바람직하게, 핵산은 추가로 메틸로트로픽 효모인 피치아 파스토리스내 암호화된 모넬린형 단백질의 발현 및 분비를 지시하기 위한 프로모터 및 시그날 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 모넬린형 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포, 재조합 피치아 파스토리스로부터 모넬린형 단백질을 생산하는 방법 및 당해 방법의 생성물을 제공한다.

제한하기 위한 것이 아니라 명백하게 기술하기 위해 본 발명의 상세한 설명은 하기와 같이 서브섹션으로 나눈다.

5.1. 단일쇄 모넬린 단백질을 암호화하는 핵산

본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고 이때 키메릭 단백질은 N 말단에서 C 말단까지, 천연 모넬린 B 쇄의 1번 내지 50번의 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제1 펩타이드 단편 a)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린 B쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 대해 결정된다], 펩타이드 결합 또는 1개 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 제2 펩타이드 단편 b) 및 천연 모넬린 A쇄의 1번 내지 45번의 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제3 펩타이드 단편 c)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린 A쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 대해 결정된다]를 포함하고 키메릭 단백질은 안정하고 주어진 양의 당해 키메릭 단백질은 동일한 양의 슈크로스와 비교하여 감미도가 100배 이상이고 당해 핵산내에서 바람직하게 효모 세포에 의해 사용되는 코돈이 사용된다.

특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고 이때 제1 펩타이드 단편은 천연 모넬린 B쇄와 60% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어져 있다. 바람직하게, 제1 펩타이드 단편은 천연 모넬린 B쇄와 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 제1 펩타이드 단편은 천연 모넬린 B쇄의 1번 내지 50번의 아미노산 잔기로 이루어진다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고 이때 제2 펩타이드 단편은 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 1)의 아미노산 서열로 이루어져 있다. 바람직하게, 제2 펩타이드 단편은 Gly-Gly-Gly-Ser(서열 2)의 아미노산 서열로 이루어져 있다. 보다 바람직하게는, 제2 펩타이드 단편은 아미노산 잔기 Gly로 이루어져 있다.

여전히 또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고 이때 제3 펩타이드 단편은 천연 모넬린 A쇄와 60% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어져 있다. 바람직하게, 제3 펩타이드 단편은 천연 모넬린 A쇄와 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어져 있다. 보다 바람직하게는, 제3 펩타이드 단편은 천연 모넬린 A쇄의 1번 내지 45번의 아미노산 잔기로 이루어져 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고 이때 제1 펩타이드 단편은 천연 모넬린 B쇄의 1번 내지 50번의 아미노산 잔기로 이루어지고 제2 펩타이드 단편은 아미노산 잔기 Gly로 이루어지고 제3 펩타이드 단편은 천연 모넬린 1번 내지 45번의 아미노산 잔기로 이루어진다.

특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고 이때 키메릭 단백질은 면역 반응으로 항모넬린 또는 항타우마틴 항체와 결합할 수 있다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고 이때 키메릭 단백질은 추가로 피치아 파스토리스로부터 키메릭 단백질의 분비를 지시할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 분비 지시 서열은 피치아 파스토리스의 내인성 시그날 서열이다. 보다 바람직하게, 내인성 시그날 서열은 피치아 파스토리스의 산 포스파타제, 피치아 파스토리스의 아스파르틱 프로테이나제 및 피치아 파스토리스 PRC1에 의해 암호화된 피치아 파스토리스의 카복시펩티다제 Y의 시그날 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또한, 분비 지시 서열은 효모 시그날 서열이고 효모는 피치아 파스토리스가 아니다. 바람직하게, 효모 시그날 서열은 사카로마이세스 세레비지애 기원의 시그날 서열이다. 보다 바람직하게, 사카로마이세스 세레비지애 시그날 서열은 사카로마이세스 세레비지애 SUC2 및 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직하게, 사카로마이세스 세레비지애 시그날 서열은 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열이다. 본 발명에 사용될 수 있는 또 다른 분비-지시 서열의 예는 아스퍼질러스 기간테우스 α-사르신, α-N-아세틸갈락토스아미니다제, OmpA 단백질, 마우스 α-인자(cCell), 후추의 엔도-베타-1,4-글루카나제, 리그닌 분해 진균류 트라메테스로부터 분리된 락카제, 쥐의 리소좀 산 α-만노시다제, 돼지의 카보닉 언하이드라제의 억제제, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)의 글루코아밀라제, 마우스의 주요 뇨 단백질, phol, 래빗의 안지오텐신 전환 효소(ACE) 및 세균성 열안정성 α 아밀라제의 시그날 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고 이때 핵산은 DNA이다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 하이브리드화 할 수 있는분리된 핵산을 제공한다. 여전히 또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.

특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 DNA를 제공하고 이때 DNA는 추가로 피치아 파스토리스에서 단백질 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 바람직하게, 프로모터는 피치아 파스토리스의 내인성 프로모터이다. 보다 바람직하게, 내인성 프로모터는 피치아 파스토리스 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAP)의 프로모터이다. 또한, 바람직하지는 않지만, 메틸로트로픽 효모에서 메탄올 반응성 유전자들의 프로모터가 사용될 수 있다. 상기 메탄올 반응성 프로모터의 예는 피치아 파스토리스 AOX1 기원의 1급 알콜 옥시다제 유전자의 프로모터, 피치아 파스토리스 AOX2 기원의 2급 알콜 옥시다제 유전자의 프로모터, 피치아 파스토리스(DAS) 기원의 디하이드록시아세톤 신타제 유전자의 프로모터, 피치아 파스토리스 기원의 P40 유전자의 프로모터, 피치아 파스토리스 기원의 카탈라제 유전자의 프로모터등(문헌참조: 미국 특허 제5,324,639)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 DNA를 제공하고 DNA는 추가로 세균에서 이를 복제하고 분비할 수 있도록 하는 서열을 포함한다. 이러한 방법으로 대량의 DNA 단편이 세균에서 복제하여 생산될 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 DNA를 제공하고 이때 암호화된 키메릭 단백질내에서 제1 펩타이드 단편은 천연 모넬린 B쇄의 1번내지 50번의 아미노산 잔기로 이루어지고 제2 펩타이드 단편은 아미노산 잔기 Gly로 이루어지고 제3 펩타이드 단편은 천연 모넬린 A쇄의 1번 내지 45번의 아미노산 잔기로 이루어지고 당해 DNA는 추가로 피치아 파스토리스 GAP의 프로모터와 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 DNA를 제공하고, 이때 피치아 파스토리스 세포에 의해 바람직하게 사용되는 코돈이 사용된다.

가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 DNA를 제공하고 이때 DNA 분자는 도 1에 도시된 뉴클레오타이드 서열 또는 도 4에 도시된 DNA 벡터를 포함한다.

본원에서 기술된 키메릭 단백질 또는 임의의 단편, 이의 동족체 또는 유도체 를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 핵산은 전반적으로 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 키메릭 단백질의 각 단편, 즉, 제1 펩타이드 단편, 제2 펩타이드 단편 또는 제3 펩타이드 단편을 암호화하는 핵산은 분자 클로닝에 의해 수득될 수 있거나 목적하는 세포로부터 정제될 수 있다. 이어서 키메릭 단백질의 각 단편을 암호화하는 핵산은 화학적으로 또는 효소적으로 함께 연결되어 본원에 기술된 키메릭 단백질 또는 이의 단편, 이의 동족체 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 형성할 수 있다.

잠재적으로 임의의 디오스코레필럼 콤미니시(Dioscoreophyllum comminisii)세포가 모넬린을 암호화하는 핵산의 분리를 위한 핵산 공급원으로서 사용될 수 있다. 또한, 모넬린을 암호화하는 핵산이 도 1에 도시된 천연 모넬린의 아미노산 서열에 따라 다자인되고 합성될 수 있다[문헌참조: 미국 특허 제5,478,923호].

당해 DNA는 클론된 DNA(예를 들어, DNA 라이브러리)로부터 당해 기술 분야에 공지된 표준 방법, 화학적 합성, cDNA 클로닝, 또는 게놈성 DNA 또는 목적하는 세포로부터 분리된 이의 단편의 클로닝에 의해 수득될 수 있다[문헌참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M.(ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II.]. 게놈성 DNA로부터 유래된 클론은 암호 영역 뿐만 아니라 조절 DNA 영역 및 인트론 DNA 영역을 포함할 수 있고, cDNA로부터 유래된 클론은 엑손 서열만을 포함한다. 공급원이 무엇이든지 간에 유전자는 유전자의 증폭을 위해 적합한 벡터에 분자적으로 클론되어야만 한다.

cDNA 기원 유전자의 분자 클로닝에서, cDNA는 당해 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 전체 세포성 RNA 또는 mRNA로부터 합성된다. 유전자는 또한 게놈성 DNA로부터 수득될 수 있고 이때 DNA 단편이 합성되고(예를 들어, 제한 효소 또는 기계적 절단을 사용하여) 이중의 일부가 목적하는 유전자를 암호화하고 있다. 이어서, 선형 DNA 단편은 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 칼럼 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 기술에 의해 크기에 따라 분리될 수 있다.

본원에 기술된 키메릭 단백질 또는 이의 단편, 이의 동족체 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 수득되는 즉시, 이의 동일성은 핵산 서열 분석(당해 분야에 공지된 방법에 의해) 및 공지된 서열과의 비교에 의해 확인될 수 있다. DNA 서열 분석은 맥삼 및 길버트 방법[문헌참조: Maxam and Gilbert, 1980, Meth. Enzymol., 65:499-560], 생거 디데옥시 방법[문헌참조: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74:5463], T7 DNA 폴리머라제의 사용[문헌참조: Tabor and Richardson, 미국 특허 제4,795,699호], 자동화 DNA 서열 분석기의 사용[문헌참조: Applied Biosystems, Foster City, CA] 또는 PCT 공개공보 WO 97/15690에 기술된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

본원에 기술된 키메릭 단백질 또는 이의 단편, 이의 동족체 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 하이브리드화 할 수 있는 핵산은 낮은 스트린전시, 높은 스트린전시 또는 중간 스트린전시의 조건하에서 핵산 하이브리드화에 의해 분리될 수 있다[문헌참조: Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:6789-6792].

본원에 사용된 바와 같이, "안정한"은, 단백질이 약 4℃에서 6개월 이상, 또는 약 60℃에서 2.5시간 이상, 또는 약 100℃에서 5분 이상동안 방치된 후에 청구된 단일쇄 모넬린 키메릭 단백질이 70% 이상의 감미를 보유한다는 것을 의미한다. 또한 "안정한"은 단백질이 6시간 이상동안 약 2.0 내지 약 11.0의 pH 범위에 방치된 후에 청구된 단일쇄 모넬린 키메릭 단백질이 70% 이상의 감미를 보유한다는 것을 의미한다.

청구된 단일쇄 모넬린 키메릭 단백질의 감미도는 당해 기술분야에 공지된 통상적인 미각 테스트를 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 슈크로스의 감미도와 비교하여 중량을 기준으로 적합하게 희석시킬 수 있다[문헌참조: 미국 특허 제5,478,923호].

효모 세포에 의한 바람직한 코돈 사용은 문헌[참조: Sharp et al., Nucleic Acids Res., 1986, 14(13):5125-43 and in Li and Luo, J. Theor. Biol., 1996, 181(2):111-24.]에 기술된 바와 같이 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 샤프(Sharp)에 따르면, 효모내 바람직한 코돈의 중요한 특징은 tRNA가 풍부하고 3번째 염기가 피리미딘으로 고도로 편중되어 있고 A + T 염기쌍이 보다 드문 경향을 나타내는 것과 크게 연관되어 있음을 포함한다. 리 및 루오는 이. 콜리 및 효모 세포에서의 유전자 발현을 분류하고 예상하는 방법[자가-일치 정보(Self-Consistent Information(SCIC))]을 기술하고 있다. 변형된 코돈 적응 지수(CAI) 값을 사용하여 리 및 루오는 에스케리치아 콜리 및 효모에서 염기 조성, 염기 상호 관계 및 유전자 발현 수준간의 관계에 대해 선형 퇴행 분석을 성취하였다. 또한 리 및 루오는 발현-증진-네트워크 부위(Expression-Enhancing-Network Site)(EENS)에 대한 가설을 제안하였고 이의 존재는 유전자 발현과, 코돈, 인접 코돈 및 비인접 코돈의 염기 상호 관계간의 선형 방정식에 의해 입증될 수 있다. 또한 피치아 파스토리스내에서 이종 단백질을 발현시키는데 성공적으로 사용되는 코돈이 사용될 수 있다. 상기 코돈의 예는 문헌[참조: 미국 특허 제4,837,148호, 미국 특허 제4,855,231호, 미국 특허 제4,882,279호, 미국 특허 제4,929,555호, 미국 특허 제5,122,465호, 미국 특허 제5,324,639호, Martinez-Ruiz et al., Protein Expr. Purif., 1998, 12(3):315-22; Abdulaev et al., Protein Expr. Purif., 1997, 10(1):61-9, Kotake et al., J. Lipid Res., 1996, 37(3):599-605, Zhu et al., Arch. Biochem. Biophys., 1998, 352(1):1-8 Heim et al., Biochim. Biophys. Acta., 1998, 1396(3):306-19; Ferrarese et al., FEBS Lett., 1998, 422(1):23-6, Jonsson et al., Curr. Genet., 1997, 32(6): 425-30; Merkle et al., Biochim. Biophys. Acta., 1997, 1336(2):132-46; Wuebbens et al., Biochemistry, 1997, 36(14):4237-36; Fierobe et al., Protein Expr. Purif., 1997, 9(2):159-70; Ferrari et al., FEBS Lett., 1997, 401(1): 73-7; Skory et al., Curr. Genet., 1996, 30(5):417-22; Sadhukhan et al., J. Biol. Chem., 1996, 271(31):18310-3; Tsujikawa et al., Yeast, 1996, 12(6):541-53; Ohi et al., Yeast, 1996, 12(1):31-40; Paifer et al., Yeast, 1994, 10(11): 1415-9; Fidler et al., J. Mol. Endocrinol., 1998, 21(3):327-336; and Brocca et al., Protein Sci., 1998, 7(6):1415-22]에서 찾을 수 있다.

키메릭 단백질이 면역반응적으로 항모넬린 또는 항타우마틴 항체에 결합될 수 있는지는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 항모넬린 또는 항타우마틴 항체의 예는 문헌[참조: Slootstra et al., Chem. Senses, 1995, 20(5):535-43; Antonenko and Zanetti, Life Sci., 1994, 55(15):1187-92; Bodani et al., Hybridoma, 1993, 12(2):177-83; Mandal et al.,Hybridoma, 1991, 10(4):459-66 and Haimovich, Isr. J. Med. Sci., 1975, 11(11):1183]에 기술된 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

5.2 재조합 피치아 파스토리스 세포로부터 모넬린 단백질의 생산

특정 양태에서, 본 발명은 키메릭 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포를 제공하고 키메릭 단백질은 N-말단에서 C-말단까지, 천연 모넬린 B 쇄의 1번 내지 50번의 잔사와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제1 펩타이드 단편 a)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린의 B쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 대해 결정된다], 펩타이드 결합 또는 1개 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 제2 펩타이드 단편 b) 및 천연 모넬린 A쇄의 1번 내지 45번의 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제3 펩타이드 단편 c)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린 A쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 대해 결정된다]를 포함하고 키메릭 단백질은 안정하고 주어진 양의 위의 키메릭 단백질은 동일한 양의 슈크로스와 비교하여 감미도가 100배 이상이고 당해 핵산내에서 바람직하게 효모 세포에 의해 사용되는 코돈이 사용된다. 바람직하게, 재조합 피치아 파스토리스 세포는 도 1에 도시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 도 4에 도시된 DNA 벡터를 포함한다. 섹션 4.1에 기술된 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포가 또한 제공된다.

이종 단백질을 암호화하는 유전자를 게놈중에 포함하는 메틸로트로픽 효모 세포를 배양하기에 적합한 방법 뿐만 아니라 피치아 파스토리스와 같은 메틸로트로픽 효모를 형질전환시키는 방법이 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있다. 바람직하게, 문헌[참조: 미국 특허 제4,837,148호, 미국 특허 제4,855,231호, 미국 특허 제4,882,279호, 미국 특허 제4,929,555호, 미국 특허 제5,122,465호, 미국 특허 제5,324,639호]에 기술된 형질전환법, 양성 형질전환 선별법 및 배양 방법이 본 발명에 사용될 수 있다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 암호화된 키메릭 단백질이 세포에 의해 발현되고 분비되도록 섹션 4.1에 기술된 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포를 증식시키고 발현되고 분비된 키메릭 단백질을 회수함을 포함하는 모넬린 키메릭 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 도 1에 도시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 도 4에 도시된 DNA 벡터를 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포가 사용된다.

당해 분야에 임의로 적합한 발효 방법이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 피치아 파스토리스와 같은 메틸로트로픽 효모에서 GAP 프로모터에 의해 진행되는 재조합 DNA-기본 산물의 대량 생산을 위해 바람직하게 3단계의 세포 고밀도 유가식 발효 시스템이 사용된다. 당해 발효 시스템의 제1 또는 증식 단계에서, 발현 숙주 피치아 파스토리스 세포가 과량의 비유도성 탄소원(예: 글리세롤)과 함께 BMGY(완충된 최소 글리세롤-복합 배지)와 같은 합성 최소 배지에서 배양된다. 발현 숙주 피치아 파스토리스 세포가 위의 탄소원에서 증식하는 경우 이종 유전자 발현이 억제되어 이종 단백질 발현의 부재하에 세포 매쓰가 증가한다. 위의 증식 단계동안에, 또한 배지의 pH가 약 pH 5로 유지되는 것이 바람직하다. 이어서, 발현 숙주피치아 파스토리스 세포는 제한된 비유도성 탄소원에서 증식하여 단기간동안 추가로 세포 매쓰가 증가하고 글루코스 응답 프로모터가 억제된다. 위의 제한된 증식 기간동안에 배지의 pH는 4이하, 바람직하게는 약 2.0 내지 약 3.5의 범위로 유지된다. 최종 단계는 생산 단계이고 여기서, "글루코스 과량 유가식 방법" 또는 복합 유가식 방법"이 사용될 수 있다. 글루코스 과량 유가식 방법에서, 2%의 글루코스만이 첨가된다. 복합 유가식 방식에서, 제한된 양의 비유도성 탄소원 및 글루코스가 발효기에 첨가되어 모넬린 유전자가 GAP 프로모터에 의해 발현되도록 유도한다.

분비된 모넬린 키메릭 단백질은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 피치아 파스토리스로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허 제3,878,184호 및 제3,998,798호; Moriis and Cagan, Biochim. Biophys. Acta, 1972, 261:114-122; Kim et al., Protein Eng., 1989, 2:571-575; and Recently, Kondo et al., Nature Biotechnology, 1997, 15:453-457]에 기술된 방법이 분비된 모넬린 키메릭 단백질을 회수하고 분리하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 발현되고 분비된 키메릭 단백질은 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 회수된다. 보다 바람직하게, 발현되고 분비된 키메릭 단백질은 CM-세파덱스 칼럼 크로마토그래피 또는 DEAE-세파덱스 칼럼 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 회수된다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 상기 방법의 산물을 제공한다.

6. 실시예

6.1 합성 재조합 모넬린 DNA의 제조

재조합 모넬린 단백질의 아미노산 서열 및 재조합 모넬린 단백질을 암호화하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 도 1에 나타낸다. 도 1에 도시된 바와 같이 1번 내지 150번의 뉴클레오타이드가 천연 모넬린 단백질 B쇄의 1번 내지 50번의 잔기를 암호화하고 150번 내지 152번의 뉴클레오타이드가 "L" 연결부로서 글라이신을 암호화하고, 153번 내지 287번의 뉴클레오타이드가 천연 모넬린 단백질 A쇄의 1번 내지 45번의 잔기를 암호화한다. 재조합 모넬린 단백질은 Met 잔기 및 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열에 상응하는 아래의 아미노산 서열에 선행한다: Met-Leu-Leu-Phe-Ile-Asn-Thr-Thr-Ile-Ala-Ser-Ile-Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe(서열 3).

사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열 및 재조합 모넬린 단백질을 암호화하는 당해 합성 DNA는 ACTG 캄파니의 어플라이드 바이오시스템스 380D DNA 합성기를 사용하여 합성된 올리고머 M1-M4 및 N1-N4로부터 제조된다(도 2, 도 3 및 도 5 참조). 올리고머를 우레아-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고 Sep-pak C18 칼럼(와트만)에 통과시켜 정제하고 도 3에 나타낸 바와 같이 어넬링하고 연결하여 EcoRI 부위를 포함하는 합성 DNA를 수득한다.

사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열 및 재조합 모넬린 단백질을 암호화하는 DNA를 합성하기 위해 100㎕ PCR 반응 용적에서, 각각의 올리고머 M2 내지 N3 2pM을 M1 및 N4 10pM과 혼합하고 Tag DNA 폴리머라제의 부재하에 5분동안 94℃로 가열한다. 반응 홉합물을 서서히 37℃로 냉각시킨다. 1 유니트의 벤트 DNA 폴리머라제(제조원: New England Biolaps, Inc)를 첨가한 후에 표준 프로토콜에 따라 PCR 반응을 수행한다. 100㎕의 PCR 반응 혼합물은 50mM 트리스-HCl( pH 8.0), 2.5mM MgCl₂, 10mM DTT, 1mM dNTP 및 1 유니트의 벤트 DNA 폴리머라제를 포함한다. PCR 반응을 다음과 같이 수행한다: 각각의 사이클내에서 1분동안 94℃, 1.5분동안 53℃, 2분동안 72℃로 전체 30회 사이클.

최종적으로 반응 혼합물을 10분동안 72℃에서 항온처리한다. 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시키고 1.2%의 저융점 아가로스 겔중에서 겔 정제한다. 정제된 DNA 단편을 pT7bleu(R) 벡터(Novagen, Inc.)에 삽입하여 pT7yM 플라스미드(도 5 참조)를 작제한다. 20㎕의 DNA 연결 반응에서, 2㎕의 10mM ATP, 40유니트의 T4 DNA 리가제(New England Biolab, Inc.)를 첨가하고 1㎍의 정제된 모넬린 DNA 단편과 50ng의 pT7blue(R) 벡터와 혼합한다. 반응 혼합물을 16시간동안 16℃에서 유지한다. 5 ㎕의 연결 혼합물을 이. 콜리 NovaBlue 컴피턴트 세포 200㎕에 첨가하여 연결 혼합물로 숙주 세포를 형질전환시키고[문헌참조: Messing, Methods in Enzymology, 1983, 101:20-78] 목적하는 서열을 T7 및 U19 프라이머를 사용하는 디데옥시 서열 분석에 의해 확인한다[문헌참조: Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1985, 74:5463-5467].

6.2. 발현 벡터 pGWYS-1의 작제

pGAPZa 발현 벡터를 제조원(Invitrogen, Inc)으로부터 구입한다. 합성 모넬린 DNA 단편을 EcoRI를 사용하여 pT7yMenallin으로부터 제거하고 pGAPZa 벡터의 EcoRI 부위에 삽입하여 pGWYS를 수득한다. 간략하게, 5㎍ 정제된 pT7yMenallion 플라스미드를 20㎕의 반응 용적중에서 2시간동안 37℃에서 5 유니트의 EcoRI(Promega Inc.)를 사용하여 분해한다. 반응 혼합물을 1% 저융점 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 합성 모넬린 DNA 단편을 Wizard PCR Preps DNA 정제 키트(Promega Inc.)를 사용하여 정제한다. 100ng의 정제된 모넬린 DNA 단편을 pGAPZa 발현 벡터에 연결하는데 사용한다. 10㎕의 연결 반응에서, 50ng의 EcoRI 분해된 pGAPZa 벡터를 100ng의 정제된 모넬린 DNA 단편과 혼합한다. 20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl, 10mM DTT 및 200 유니트의 T4 DNA 리가제(New England Biolabs, Inc.) 10㎕의 존재하에 16℃에서 밤새 연결 반응시켜 pGWYS를 수득한다. 연결 혼합물로 이. 콜리 TOP10F 세포(Invitrogen, Inc)를 형질전환시킨다. 20개의 제오신 내성 클론을 선별하고 삽입체의 배향을 α-인자(5'CTATTGCCAGCATTGCTGC3')(서열 4)와 N4 올리고머를 사용한 PCR 반응으로 검색한다. 각각의 선별된 클론을 200㎍/ml의 제오신을 포함하는 LB 배양 배지 3ml에 계대하고 37℃에서 밤새 진탕시키면서 배양한다. 재조합 플라스미드 pGWYS를 Qiagen Tip 20 키트 시스템(Qiagen, Inc)을 사용하여 1.5ml의 배양된 세균 세포로부터 작제한다. 50ng의 정제된 pGWYS 플라스미드를 PCR 주형으로서 사용하여 삽입체의 배향을 결정한다. 25㎕의 PCR 반응에서, 50ng의 pGWYS 플라스미드를 1 유니트의 Taq DNA 폴리머라제(Promega, Inc.)의 존재하에 2.5pM의 α인자 및 N4 올리고머와 혼합한다. PCR 반응을 아래의조건하에서 수행한다: 각각의 사이클에서 1분동안 94℃, 1분동안 55℃. 2분동안 72℃로서 전체 40회 사이클. 최종적으로 반응 혼합물을 72℃에서 10분동안 배양한다. PCR 반응 혼합물을 1.2% 아가로스 겔위에서 분리한 후에 목적하는 배향을 갖는 삽입체를 포함하는 클론중 하나를 pGWYS-1으로 명명한다. 삽입체의 서열을 DNA 서열 분석으로 추가로 확인한다.

6.3. pGWYS-1을 사용한 피치아 파스토리스 세포의 형질전환

피치아 파스토리스에서 고농도로 안정하게 모넬린을 발현시키기 위해 전기천공 장치 II(Invitrogen Inc.)를 사용하는, 피치아 파스토리스 발현 키트 매뉴얼에 기술된 전기천공 기술에 의해 정제된 pGWYS-1 플라스미드로 피치아 파스토리스 세포를 형질전환시킨다. 간략하게, 500ml의 피치아 파스토리스 GS115 세포를 OD₆₀₀이 1.3이 될때까지 30℃의 YPD 배지에서 증식시킨다. 세포를 4℃에서 5분동안 1,500g에서 원심분리하여 펠렛화한다. 펠렛화된 세포를 500ml의 빙냉 살균수로 세척한다. 세척 단계를 250ml과 20ml의 빙냉 살균수로 반복한다. 이어서, 세포를 20ml의 빙냉 1M 소르비톨로 세척하고 1ml 빙냉 소르비톨중에 재현탁시킨다. 1M 소르비톨중의 효모 GS115 세포 40㎕를 최종 용적이 50㎕가 되도록 10㎍의 정제된 pGWYS-1 플라스미드와 혼합하고 혼합물을 빙냉 큐벳으로 옮긴다. 혼합물을 함유하는 큐벳을 5분동안 빙상에서 항온처리한다. 전기천공 장치 II 매뉴얼 계수(Invitrogen Inc manufacture)에 따라 전기천공을 수행한다. 전기적 펄스후에, 1ml의 빙냉 1M소르비톨을 큐벳에 첨가하고 큐벳의 내용물을 소형원심분리기 튜브로 옮긴다. 200㎕의 형질전환된 세포를 400㎍/ml의 제오신을 함유하는 5 RDB 플레이트위에 도말한다. 플레이트를 콜로니가 출현할때까지 30℃에서 배양한다. 양성 형질전환체는 다양한 농도, 예를 들어, 400㎍/ml, 600㎍/ml, 800㎍/ml 및 1000㎍/ml의 제오신 존재하에 증식함을 특징으로 한다.

6.4. 양성 형질전환체의 안정성 시험

3개의 양성 형질전환체를 800㎍/ml의 제오신 존재하에서의 이의 증식 및 2% 글루코스 유도에 의한 재조합 모넬린의 발현을 기본으로 하는 추가의 특징을 밝히기 위해 선별한다. 다음의 실험은 유전자적 안정성을 시험하기 위해 수행한다. 이들 3개의 양성 형질전환체 각각을 살균된 이쑤시개를 사용하여 따내고 콜로니가 출현할때까지 30℃에서 임의의 선별없이 YPD 플레이트에서 배양한다. 콜로니를 따내고 신규 콜로니가 출현할때까지 새로운 YPD 플레이트에 도말한다. 위와같은 비선택적 증식을 50회 반복한 후에 각각의 계대 콜로니를 800㎍/ml의 제오신을 함유하는 선별 플레이트에서 배양한다. 2% 글루코스 유도 즉시 단백질 발현을 SDS-PAGE로 분석한다. 모든 3개의 양성 형질전환체가 YPD 플레이트에서 50회 계대후에 최초 콜로니와 동일한 표현형을 나타낸다.

6.5 재조합 모넬린 단백질의 생산

섹션 5.4.에서 선별된 3개의 양성 형질전환체 각각을 30℃에서 왕성한진탕(250 rpm)과 함께 1ℓ YPD 배지에서 증식시킨다. 2ml의 상등액을 각각 24시간, 48시간 및 72시간 후에 배양물로부터 수득한다. 각 시점에서 수거된 5㎕의 샘플을 15 내지 20%의 농도 구배 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분석한다. 분비된 재조합 모넬린 단백질은 12kD 단백질 밴드로서 관찰된다. 밀도 측정기(Molecular Dynamic, Inc.)를 사용한 SDS-PAGE 분석의 정량은 양성 균주중 하나가 약 10g/ℓ의 분비된 재조합 단일쇄 모넬린 단백질을 생산한다는 것을 지적한다. 이러한 균주를 GWyS1으로 명명한다.

6.6 분비된 재조합 모넬린 단백질의 정제

단백질 방법을 사용하여 GwyS-1 효모 균주로부터 분비된 재조합 모넬린 단백질을 정제한다. 제1 방법에 따라, 72시간 배양후에 상등액을 12,000(17,000g)에서 원심분리하여 수거한다. 수거후에, 상등액 pH를 0.1N NaOH 용액을 사용하여 약 6.8로 조정한다. 1M NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH6.8)을 1:100(v/v)이 될때까지 상등액에 첨가하고 잘 혼합한다. 이어서 상등액을 0.01M의 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 6.8) 용액을 사용하여 예비-평형화된 CM-세파덱스 칼럼(Pharmacia, Inc.)에 로딩한다. 칼럼을 5칼럼 용적의 0.01M NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 6.8) 용액을 사용하여 세척하고 재조합 모넬린 단백질을 0.3M의 NaCl-0.01 M NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 6.8) 용액으로 용출시킨다. 물에 대해 투석한후에 단백질 순도가 겔 전기영동에 의해 약 98%임을 측정한다.

제2 방법에 따라, 72시간 배양후에 상등액을 12,000(17,000g)에서 원심분리하여 수거한다. 수거후에, 상등액 pH를 0.1N NaOH 용액을 사용하여 약 7.2로 조정한다. 1M NaCl-1M Na₂HPO₄-Na₂HPO₄(pH 7.2)을 !:100(v/v)가 될때까지 첨가하고 잘 혼합한다. 이어서 상등액을 1M의 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 7.2) - 1M NaCl 용액을 사용하여 예비-평형화된 DEAE-세파덱스 칼럼(Pharmacia, Inc)에 로딩한다. 유동 통과 분획물을 수거하고 물에 대해 투석한다. 단백질의 순도가 겔 전기영동에 의해 약 98%임을 결정한다.

2개의 방법중 하나의 방법에 따라 정제된 재조합 모넬린 단백질을 추가로 이의 감미도를 테스트하기 위해 건조 분말로 냉동건조시킨다.

6.7. 감미도 및 안정성 시험

정제된 재조합 모넬린 단백질의 감미도를 통상적인 미각 테스트를 사용하여 평가한다. 중량을 기준으로 적합하게 희석하여 슈크로스의 감미도와 비교한다. 전형적인 시험에서, 1㎎/ml, 10mg/ml, 25mg/ml 및 50mg/ml의 슈크로스 수용액을 표준 용액으로서 사용한다. 감미를 나타낼 수 있는 정제된 재조합 모넬린 단백질의 최소 중량을 슈크로스의 최소 중량과 비교한다. 본 발명의 재조합 모넬린은 슈크로스의 양보다 약 1000배 적은 양으로 첨가해도 된다. 예를 들어, 50ng/ml의 재조합 모넬린 단백질 용액은 50mg/ml의 슈크로스와 동일한 감미도를 나타낸다[문헌참조: Lucky Supermarket's Lady Lee brand sugar).

pH 2.0, 4.0, 6.3 및 7.5에서, 100㎍/ml의 농도로 천연 모넬린(Sigma, Inc.)및 정제된 재조합 모넬린 단백질을 용해시켜 안정성을 측정한다. 각각의 샘플을 15분동안 37℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃ 및 100℃로 가열하고 시험전에 실온으로 냉각시킨다. 가장 현저한 차이는 천연 모넬린이 pH 2.0에서 50℃로 가열되는 경우 감미를 상실하는 반면에 정제된 재조합 모넬린 단백질은 5분동안 100℃에서 가열한 후에도 이의 감미를 유지한다는 것이다.

본 발명은 기탁된 미생물 또는 본원에 기술된 특정 양태에 의해 특정 범위로 제한되지 않는다. 실질적으로, 본원에 기술된 것 외에도 본 발명의 다양한 변법이 이전의 기술된 내용과 첨부된 도면으로부터 당해 분야의 기술자에게 명백하다. 변법은 첨부된 청구의 범위내에 포함되는 것으로 의도된다.

다양한 문헌이 본원에 인용되었고 이의 기술된 내용은 전반적인 참조문헌으로서 인용되었다.

Claims (49)

1. 천연 모넬린의 B 쇄의 1번 내지 50번 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제1 펩타이드 단편 a)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린의 B쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 걸쳐 측정된다],

   펩타이드 결합 또는 1개 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 제2 펩타이드 단편 b) 및

   천연 모넬린의 A쇄의 1번 내지 45번 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제3 펩타이드 단편 c)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린의 A쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 걸쳐 측정된다]를 N 말단에서 C 말단까지 포함하는 키메릭 단백질[당해 키메릭 단백질은 안정하며, 소정량의 키메릭 단백질은 동일한 양의 슈크로스와 비교하여 100배 이상의 감미도를 나타낸다]을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 효모 세포에 의해 바람직하게 사용되는 코돈을 사용하는 분리된 핵산.
2. 제1항에 있어서, 제1 펩타이드 단편이 천연 모넬린의 B쇄와 60% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 분리된 핵산.
3. 제1항에 있어서, 제1 펩타이드 단편이 천연 모넬린의 B쇄와 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 분리된 핵산.
4. 제1항에 있어서, 제1 펩타이드 단편이 도 1(서열 5)의 1번 내지 50번 아미노산 잔기로서 도시된 바와 같은 천연 모넬린의 B쇄의 1번 내지 50번 아미노산 잔기로 이루어지는 분리된 핵산.
5. 제1항에 있어서, 제2 펩타이드 단편이 아미노산 잔기 Gly로 이루어지는 분리된 핵산.
6. 제1항에 있어서, 제2 펩타이드 단편이 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Ser(서열 2)로 이루어지는 분리된 핵산.
7. 제1항에 있어서, 제2 펩타이드 단편이 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 1)로 이루어지는 분리된 핵산.
8. 제1항에 있어서, 제3 펩타이드 단편이 천연 모넬린의 A쇄와 60% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 분리된 핵산.
9. 제1항에 있어서, 제3 펩타이드 단편이 천연 모넬린의 A쇄와 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 분리된 핵산.
10. 제1항에 있어서, 제3 펩타이드 단편이 도 1(서열 5)의 52번 내지 96번 아미노산 잔기로 도시된 천연 모넬린의 A쇄의 1번 내지 45번 아미노산 잔기로 이루어지는 분리된 핵산.
11. 제1항에 있어서, 도 1(서열 5)의 1번 내지 96번 아미노산 잔기를 암호화하는 분리된 핵산.
12. 제1항에 있어서, 키메릭 단백질이 항모넬린 항체와 면역반응적으로 결합할 수 있는 분리된 핵산.
13. 제1항에 있어서, 키메릭 단백질이 항타우마틴 항체와 면역반응적으로 결합할 수 있는 분리된 핵산.
14. 제1항에 있어서, 키메릭 단백질이 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 당해 키메릭 단백질의 분비를 지시할 수 있는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 분리된 핵산.
15. 제14항에 있어서, 분비를 지시하는 서열이 피치아 파스토리스의 내인성 시그날 서열인 분리된 핵산.
16. 제15항에 있어서, 내인성 시그날 서열이 피치아 파스토리스의 산 포스파타제, 피치아 파스토리스의 아스파르트산 프로테이나제 및 피치아 파스토리스 PRC1에 의해 암호화된 피치아 파스토리스의 카복시펩티다제 Y의 시그날 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 핵산.
17. 제14항에 있어서, 분비를 지시하는 서열이 피치아 파스토리스가 아닌 효모의 시그날 서열인 분리된 핵산.
18. 제17항에 있어서, 효모의 시그날 서열이 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 시그날 서열인 분리된 핵산.
19. 제18항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 시그날 서열이 사카로마이세스 세레비지애 SUC 2 및 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 핵산.
20. 제19항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 시그날 서열이 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열인 분리된 핵산.
21. 제11항에 있어서, 피치아 파스토리스로부터 키메릭 단백질의 분비를 지시할 수 있는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 분리된 핵산.
22. 제21항에 있어서, 분비를 지시하는 서열이 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열인 분리된 핵산.
23. 제14항에 있어서, 분비를 지시하는 서열이, 아스퍼질러스 기간테우스(Aspergillus giganteus) α-사르신, α-N-아세틸갈락토스아미니다제, OmpA 단백질, 마우스 α-인자(c세포), 후추의 엔도-β-1,4-글루카나제, 리그닌 분해성의 진균 트라메테스(Trametes)로부터 분리된 락카제, 쥐의 리소좀 산 α-만노시다제, 돼지의 카본산 안하이드라제의 억제제, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제, 마우스 주요 뇨 단백질, pho1, 래빗 안지오텐신 전환 효소(ACE) 및 열안정성의 세균성 α 아밀라제의 시그날 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 핵산.
24. 제1항에 있어서, DNA인 핵산.
25. 제1항에 따르는 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
26. 제24항에 따르는 DNA 서열과 하이브리드화 할 수 있는 분리된 핵산.
27. 제24항에 있어서, 피치아 파스토리스 내에서 단백질 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 추가로 포함하는 DNA.
28. 제27항에 있어서, 프로모터가 피치아 파스토리스의 내인성 프로모터인 DNA.
29. 제28항에 있어서, 내인성 프로모터가 피치아 파스토리스의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제의 프로모터인 DNA.
30. 제24항에 있어서, 도 1(서열 5)의 1번 내지 96번 아미노산 잔기를 암호화하고, 피치아 파스토리스의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제의 프로모터와 사카로마이세스 세레비지애 교배 페로몬 α-인자의 시그날 서열을 추가로 포함하는 DNA.
31. 제24항에 있어서, 피치아 파스토리스 세포에 의해 바람직하게 사용되는 코돈이 사용되는 DNA.
32. 도 1에 도시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
33. 도 4에 도시된 바와 같은 pGWYS1 DNA 벡터.
34. 제1항에 따르는 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포.
35. 제32항에 따르는 DNA를 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포.
36. 제33항에 따르는 DNA를 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포.
37. 제1항에 따르는 핵산을 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포를 증식시켜, 암호화된 키메릭 단백질이 당해 세포에 의해 발현되어 분비되도록 하는 단계 및

    발현되어 분비된 키메릭 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 키메릭 단백질의 생산방법.
38. 제32항에 따르는 DNA를 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포를 증식시켜, 암호화된 키메릭 단백질이 당해 세포에 의해 발현되어 분비되도록 하는 단계 및

    발현되어 분비된 키메릭 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 키메릭 단백질의 생산방법.
39. 제33항에 따르는 DNA를 포함하는 재조합 피치아 파스토리스 세포를 증식시켜, 암호화된 키메릭 단백질이 세포에 의해 발현되어 분비되도록 하는 단계 및

    발현되어 분비된 키메릭 단백질을 회수함을 포함하는, 키메릭 단백질의 생산방법.
40. 제37항에 있어서, 발현되어 분비된 키메릭 단백질이 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 회수되는 방법.
41. 제40항에 있어서, 사용되는 이온 교환 크로마토그래피가 CM-세파덱스 칼럼 크로마토그래피인 방법.
42. 제40항에 있어서, 사용되는 이온 교환 크로마토그래피가 DEAE-세파덱스 칼럼 크로마토그래피인 방법.
43. 제37항의 방법에 의해 생산된 생성물.
44. 제38항의 방법에 의해 생산된 생성물.
45. 제39항의 방법에 의해 생산된 생성물.
46. 제40항의 방법에 의해 생산된 생성물.
47. 제41항의 방법에 의해 생산된 생성물.
48. 제42항의 방법에 의해 생산된 생성물.
49. 천연 모넬린의 B 쇄의 1번 내지 50번 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제1 펩타이드 단편 a)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린의 B쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 걸쳐 측정된다],

    펩타이드 결합 또는 1개 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 제2 펩타이드 단편 b) 및

    천연 모넬린의 A쇄의 1번 내지 45번 잔기와 40% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제3 펩타이드 단편 c)[여기서, % 동일성은 천연 모넬린의 A쇄와 동일한 크기의 아미노산 서열에 걸쳐 측정된다]를 N 말단에서 C 말단까지 포함하며 당해 핵산내에서 효모 세포에 의해 바람직하게 사용되는 코돈을 사용하는, 안정하고, 소정량은 동일한 양의 슈크로스와 비교하여 100배 이상의 감미도를 나타내는 키메릭 단백질.