JP2003504010A - 新規なフィトケラチンシンターゼ及びその使用 - Google Patents

新規なフィトケラチンシンターゼ及びその使用

Info

Publication number
JP2003504010A
JP2003504010A JP2000620073A JP2000620073A JP2003504010A JP 2003504010 A JP2003504010 A JP 2003504010A JP 2000620073 A JP2000620073 A JP 2000620073A JP 2000620073 A JP2000620073 A JP 2000620073A JP 2003504010 A JP2003504010 A JP 2003504010A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
nucleic acid
phytokeratin
atpcs1
synthase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000620073A
Other languages
English (en)
Inventor
フィリップ エイ レア
オレナ ケイ ヴァタマニウク
ステファン マリ
ユ−ピン ル
ジュリアン アイ シュレーダー
ユージーン ジェイ キム
ステファン クレメンス
Original Assignee
ザ トラスティーズ オヴ ザ ユニヴァーシティー オヴ ペンシルバニア
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ トラスティーズ オヴ ザ ユニヴァーシティー オヴ ペンシルバニア filed Critical ザ トラスティーズ オヴ ザ ユニヴァーシティー オヴ ペンシルバニア
Publication of JP2003504010A publication Critical patent/JP2003504010A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8259—Phytoremediation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)
  • Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は新規なフィトケラチンシンターゼ及びその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 関連出願の相互参照 この出願は1999年５月20日に出願された米国特許出願第09/315,449号の一部継
続出願であり、それにより35U.S.C.§119(e)に従って1998年８月７日に出願され
た米国仮特許出願第60/095,624号の優先権を与えられ、これらの両方の特許出願
が参考として本明細書に含まれる。 連邦後援の研究又は開発に関する記述 本発明は米国政府からの資金（国立科学財団援助番号MCB-9604246、農業部門N
RICGP援助番号9337304、農業部門援助番号98-35304-6684、及びエネルギー部門
援助番号DE-FG02-91ER20055、DE-FG02-94ER20162、及びDE-FG07-96ER20253）に
より一部支持され、それ故、米国政府は本発明に或る種の権利を有し得る。
【０００２】 （背景技術） 必須重金属、例えば、銅及び亜鉛は、酸化還元反応及びリガンド相互作用にお
けるコファクターとして必要とされ、又それらは電荷安定化、水イオン化、及び
生物触媒作用中の荷電遮蔽に関与する（Voet及びVoet, 1995, Biochemistry, 第
２編, John Wiley＆Sons, Inc., New York）。必須重金属に加えて、非必須重金
属、例えば、ヒ素、カドミウム、水銀及び鉛が天然鉱物堆積物中に、又はヒト活
動の結果として見られ、それらが生きている生物により頻繁に遭遇される（Nria
gu及びPacyna, 1988, Nature 333:134-138）。必須重金属及び非必須重金属の両
方は、生物がしばしば最適を越える濃度の必須重金属及び過剰のマイクロモル濃
度の非必須重金属、例えば、As、Cd、Hg及びPbに遭遇するという点で全ての生き
ている生物に急な問題を課し得る。高濃度のこれらの非必須重金属はそれらの細
胞結合部位からの重金属又はその他の内在性金属コファクターの置換、タンパク
質及び補酵素のチオール基との異常な反応、並びに活性酸素種の生成の促進によ
り毒性作用を与える（AOS; Stadtman, 1990, Free Radic. Biol. Med. 9:315-32
5）。
【０００３】 農業活動の変化と組み合わされた過去20年中の工業活動及び鉱業活動の多量の
グローバルな拡張が重金属による地下水及び土壌の汚染を著しく増大した。実際
に、金属放出の年間の毒性は有機物及び放射性核種の合計のそれを超えると推定
される（Nriagu及びPacyna, 1988, Nature 333:134-138）。土壌及び水の汚染は
作物植物、そして最終的にはヒトによる重金属及び毒素の摂取をもたらすので、
食物連鎖への非必須重金属の侵入を防止するための環境浄化に対する緊急の要望
がある。 無柄性光合成生物として、重金属毒性を停止又は軽減するための導管植物によ
り動かされるメカニズムが一般に重要である。特殊排出器官のそれらの欠如が植
物をこれらの物質のレベルの大きな変動にさらし、厳格な細胞内ホメオスタシス
のメカニズムを必要とするだけでなく、食物連鎖へのこれらの物質の侵入の主要
な位置としての植物の特別な状況は植物が重金属を処理又は金属イオン封鎖する
メカニズムが全ての従属栄養生物に影響を有することを意味する。
【０００４】 加えて、生物改善、環境浄化のための生体内異物の抽出及び／又は分解のため
の植物又は微生物の使用が、通常の物理的方法及び化学的方法との比較によりそ
の潜在的に低いコストのために増大する興味をひいている。汚染物質、例えば、
分解し得ない重金属の場合、植物改善は植物が収穫し易いために特に魅力的であ
る。それ故、重金属に対する増大された耐性及び／又は重金属の増大された蓄積
のために作物種を操作するのに有益なモデル系からの天然植物種の同定又は遺伝
子の同定に現在大きな関心がある。後者のカテゴリーの中に、植物による重金属
ストレスの軽減の基礎となるメカニズムを更に理解し、このようなペプチドをコ
ードする遺伝子又はそれらの合成を担う酵素を得るという目的のための新規な重
金属結合ペプチドに関する検索がある。これらの遺伝子の同定及び特性決定は植
物改善されるべきである環境部位の型の特別な要件に従って植物重金属応答の操
作の“ミックス・アンド・マッチ”アプローチの開発を促進するであろう。
【０００５】 現在まで、三つのクラスのペプチドが植物の重金属耐性に寄与することが示さ
れていた：グルタチオン(GSH)、メタロチオネイン(MT)、及びフィトケラチン(PC
)。チオールペプチド、GSH（γ-Glu-Cys-Gly）、及び幾つかの種ではその変異体
ホモグルタチオン（h-GSH、γ-Glu-Cys-β-Ala）は幾つかの方法で重金属、例え
ば、As、Cd、Cu、Hg、及びZnの形態及び毒性に影響すると考えられている。これ
らとして、下記のメカニズムが挙げられる：直接の金属結合（Fuhr及びRabenste
in, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95:6944-6950）、その他のリガンドへの金属の移
入の促進（例えば、PC及びMT；Freedmanら, 1989, J. Biol. Chem. 264:5598-56
05）、MTそしておそらくPCによる結合を更に受けやすい金属酸化状態の発生のた
めの均等物を還元することの提供（Freedmanらの上記文献）、重金属への細胞の
暴露の結果として生成された活性酸素種の除去（Inze及びVan Montagu, 1995, C
urrent Opinion in Biotech. 6:153-158）、GSHとの輸送活性金属錯体の生成（L
iら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:42-47）、並びにPC及びその他
のシステイニルペプチドの生合成のための前駆体としての利用（Grillら, 1987,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:439-443; Meuwlyら, 1995, Plant J. 7:39
1-400）。
【０００６】 植物の重金属代謝に既に関係していた別のクラスのペプチドであるMTは重金属
の存在下で細胞中で誘導される小さい（4-8 kDa）システインに富む金属結合ポ
リペプチドである。MT（これらは多くのCys-Xaa-Cysモチーフを含む）は哺乳類
に広範囲の金属に対するトレランスを与える（Hamer, 1986, Annu. Rev. Bioche
m. 55:913-951）が、植物中のCuホメオスタシスに主として関係することが明ら
かである（Zhou及びGoldsbrough, 1994, Plant Cell 6:875-884）。アラビドプ
シスMT1及びMT2はS.セレビジエのMT欠損cupIΔ変異体中で異種発現された時に高
レベルのCu2+に対するトレランスを与えるが低レベルのCd2+に対しわずかなトレ
ランスを与える（Zhou及びGoldsbrough, 1994, Plant Cell 6:875-884）。更に
、アラビドプシス幼植物中のMT発現はCu2+により強く誘発されるが、Cd2+により
誘発されず（Zhou及びGoldsbrough, 1994, Plant Cell 6:875-884; Murphyら, 1
997, Plant Physiol. 113:1291-1301）、アラビドプシス生態型（即ち、特別な
生育地内の選択から生じる、真の種からの亜種形態（これらはその種の別の員と
近親交配し得る））の間の比較はMT2発現がその他の金属に対するトレランスよ
りもCuトレランスと密接に相関関係があることを実証する（Murphy及びTaiz, 19
95, Plant Physiol. 109:945-954）。
【０００７】 重金属への植物の暴露はこれらの物質をキレート化し、それらの遊離濃度を減
少することにより植物及び菌類中で重金属トレランス、主としてCd2+に対するト
レランスに極めて重要な役割を果たすペプチドのクラスであるPCの同化を誘発す
る。PCはγ−グルタミルシステインの反復単位、続いてＣ末端グリシン{ポリ-(
γ-Glu-Cys)n-Glyポリマー}からなる（Rauser, 1990, Annu. Rev. Biochem. 59:
61-86; Steffens, 1990, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41:55
3-575）。MTと違って、PCはPCシンターゼ（即ち、γ−グルタミルシステインジ
ペプチジルトランスペプチダーゼ、EC 2.3.2.15）（これはGSHからのγ−グルタ
ミルシステイン部分を第二分子又は既に合成されたPC分子に移入する）によりGS
H（γ-Glu-Cys-Gly）から後翻訳合成される（Rauser, 1990, Annu. Rev. Bioche
m. 59:61-86; Zenk, 1996, Gene 179:21-30）。現在まで研究された或る種の菌
類及び全ての植物種（Rauser, 1990, Annu. Rev. Biochem. 59:61-86; Zenk, 19
96, Gene 179:21-30）に見られるように、PCは高アフィニティーでCd2+の如き重
金属を結合し、Cd2+と一緒に無傷細胞の液胞に局在化する（Vogeli-Lange及びWa
gner, 1990, Plant Physiol. 92:1086-1093）。Cu2+ではなくCd2+に対するPC欠
損アラビドプシスcad1突然変異の過敏性（Howdenら, 1995, Plant Physiol. 107
:1059-1066）により示されるように、PCはin plantaのCd2+解毒に最も顕著に寄
与する。PC依存性液胞Cd2+金属イオン封鎖は分裂酵母シゾサッカロミセス・ポン
ベで最も良く理解され、hmt1+遺伝子産物、PC選択的ATP結合カセット(ABC)トラ
ンスポーターがATPを犠牲にしてサイトゾルからのCd.PC及びapo-PCを液胞に輸送
する（Ortizら, 1992, EMBO J. 11:3491-3499; Ortizら, 1995, J. Biol. Chem.
270:4721-4728）。
【０００８】 GSH、MT、及びPCを伴う重金属トレランスメカニズムに加えて、最近の研究の
結果はCd2+/H+アンチポートによる植物液胞への遊離Cd2+の輸送と一致する（Sal
t及びWagner, 1993, J. Biol. Chem. 268:12297-12302）。しかしながら、この
ようなプロセスの生理学的重要性が決定されるべく残っている。 PCは植物の重金属トレランスに重要な役割を果たすが、これらのペプチドの同
化を担う一種以上の酵素の分子同一性がわかりにくいままであった。従来技術は
一種のチオールトリペプチドから別のチオールトリペプチド又は既に合成された
PC分子へのγ−グルタミルシステイン単位の移入によりGSH、ホモ-GSH又は関連
チオールペプチドからのPCの合成にコンピテントである重金属、主としてCd2+活
性化酵素（即ち、γ−グルタミルシステインジペプチジルトランスペプチダーゼ
、EC 2.3.2.15、更に普通はPCシンターゼと称される）の部分精製を教示してい
る（Grillら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6838-6842; Zenk, 199
6, Gene 179:21-30）。しかしながら、その従来技術はタンパク質レベル又は核
酸レベルでPC合成に関係する一つ以上の部分の単離又は同定を開示していない。 こうして、汚染された土壌及び地下水の生物改善のための有効かつコスト有効
な方法に対する要望、並びに植物中の重金属蓄積及び解毒に関するPCの証明され
た重要性にもかかわらず、PC生合成及び重金属の植物改善を担う一種以上の酵素
の同定及び単離は現在まで達成されていなかった。本発明はこれらの要望を満足
する。
【０００９】 （発明の開示） 本発明はフィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を含む。一局
面において、核酸がAtPCS1（配列番号１）、AtPCS2（配列番号３）、TaPCS1（配
列番号５）、SpPCS（配列番号７）、及びCePCS（配列番号９）の少なくとも一種
と少なくとも約15％の相同性を共有する。 別の局面において、単離された核酸が配列番号１、配列番号３、配列番号５、
配列番号７、配列番号９からなる群から選ばれる。 更に、本発明は植物フィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を
含み、そのフィトケラチンシンターゼはAtPCS1（配列番号２）、AtPCS2（配列番
号４）、TaPCS1（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS（配列番号10
）の少なくとも一種と少なくとも約15％の相同性を共有する。
【００１０】 又、本発明はフィトケラチンシンターゼを含む単離されたポリペプチドを含む
。一局面において、単離されたポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番
号６、配列番号８、及び配列番号10の少なくとも一種と少なくとも約15％の相同
性を共有する。 別の局面において、フィトケラチンシンターゼを含む単離されたポリペプチド
が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び配列番号10の少なく
とも一つである。 別の局面において、フィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸が
それに共有結合されたリポーター核酸を更に含む。 更に別の局面において、リポーター核酸がFLAGオクタペプチド、ヒトインフル
エンザウイルス血球凝集素エピトープ、β−グルクロニダーゼエピトープ、緑色
蛍光タンパク質エピトープ、及びルシフェラーゼエピトープからなる群から選ば
れたリポーターポリペプチドをコードする。
【００１１】 本発明は単離された核酸を含む組換え細胞を含み、その核酸はAtPCS1（配列番
号１）、AtPCS2（配列番号３）、TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７）
、及びCePCS（配列番号９）の少なくとも一種と少なくとも約15％の相同性を共
有する。 一局面において、細胞が原核生物細胞及び真核生物細胞からなる群から選ばれ
る。 又、本発明は単離された核酸を含むベクターを含み、その核酸がAtPCS1（配列
番号１）、AtPCS2（配列番号３）、TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７
）、及びCePCS（配列番号９）の少なくとも一種と少なくとも約15％の相同性を
共有する。
【００１２】 本発明は細胞、種子及び子孫がフィトケラチンシンターゼをコードする単離さ
れた核酸を含むトランスジェニック植物を含み、その核酸がAtPCS1（配列番号１
）、AtPCS2（配列番号３）、TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７）、及
びCePCS（配列番号９）の少なくとも一種、又はその断片を含み、かつその核酸
が配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、及び配列番号９の少なく
とも一種と少なくとも約15％の相同性を共有する。 更に、本発明は細胞、種子及び子孫がフィトケラチンシンターゼ、又はその断
片をコードする単離された核酸を含むトランスジェニック植物を含み、そのフィ
トケラチンシンターゼがAtPCS1（配列番号２）、AtPCS2（配列番号４）、TaPCS1
（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS（配列番号10）の少なくとも
一種と少なくとも約15％の相同性を共有する。
【００１３】 本発明は土壌からの重金属の除去の防止方法を含む。その方法は土壌中でアン
チセンス配向でフィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を含むト
ランスジェニック植物を生育し、植物を土壌から収穫し、それにより土壌からの
重金属の除去を防止することを特徴とする。 又、本発明は土壌からの重金属の除去方法を含む。その方法はフィトケラチン
シンターゼをコードする単離された核酸を含むトランスジェニック植物を土壌中
で生育し、植物を土壌から収穫し、それにより重金属を土壌から除去することを
特徴とする。一局面において、重金属がカドミウム、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、水銀、
鉛、亜鉛、ニッケル、ビスマス、セレン、銀、金、及び銅からなる群から選ばれ
る。
【００１４】 本発明はトランスジェニック重金属耐性植物の発生方法を含む。その方法は植
物の細胞にフィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を導入し、そ
れによりトランスジェニック重金属耐性植物を発生することを特徴とする。 更に、本発明はフィトケラチンの生合成方法を含む。その方法は単離されたフ
ィトケラチンシンターゼを充分な量のグルタチオン、又はグルタチオン関連チオ
ールペプチドと、グルタチオン又は関連チオールペプチドからのフィトケラチン
生合成を可能にする条件下で接触させ、それによりフィトケラチンを生合成する
ことを特徴とする。 一局面において、生合成がin vitroで行なわれる生合成、及びin vivoで行な
われる生合成からなる群から選ばれた生合成である。 別の局面において、グルタチオン関連チオールペプチドがホモグルタチオン、
PC2、PC3、PC4、ホモグルタチオン、ヒドロキシメチル−グルタチオン、及びγ
−グルタミルシステイニルグルタミン酸からなる群から選ばれる。 更に別の局面において、フィトケラチンがPC2、PC3、PC4、ホモ−PC2、ヒドロ
キシメチル−PC2、イソ−PC2(Glu)、及びdesGly-PC2からなる群から選ばれる。 更に別の局面において、フィトケラチンシンターゼがAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1
、SpPCS、及びCePCSからなる群から選ばれる。
【００１５】 本発明は一種のチオールペプチドからのγ−グルタミルシステイン単位を別の
チオールペプチドに移入する方法を含む。その方法は単離されたフィトケラチン
シンターゼをグルタチオン、又は関連チオールペプチドと、一種のチオールペプ
チドから別のチオールペプチドへのγ−グルタミルシステイン単位の移入を可能
にする条件下で接触させ、それによりγ−グルタミルシステイン単位を一種のチ
オールペプチドから別のチオールペプチドに移入することを特徴とする。
【００１６】 又、本発明は植物の収穫可能な部分中の重金属のレベルの減少方法を含む。そ
の方法は植物の非収穫可能な部分中でフィトケラチンシンターゼをコードする核
酸を発現し、それにより植物の収穫可能な部分中の重金属のレベルを減少するこ
とを特徴とする。 一局面において、その方法が植物の収穫可能な部分中のフィトケラチンシンタ
ーゼの発現を抑制することを更に含む。 本発明は地下水からの重金属の除去方法を含む。その方法は地下水中でフィト
ケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を含むトランスジェニック植物
を生育し、植物を地下水から収穫し、それにより重金属を地下水から除去するこ
とを特徴とする。
【００１７】 （発明を実施するための最良の形態） 以上の要約、並びに以下の発明の詳細な説明は添付図面と一緒に読まれる場合
に良く理解されるであろう。本発明を説明する目的のために、現在好ましい図面
実施態様が示される。しかしながら、本発明は示された正確な配置及び手段に限
定されないことが理解されるべきである。 本発明は植物、酵母及び線虫からの新規なフィトケラチンシンターゼの発見に
基づいている。本開示の前に、フィトケラチンシンターゼはいずれの源からも同
定又は単離されておらず、その結果、アミノ酸配列又は核酸配列情報がこれらの
タンパク質について入手できなかった。これらの酵素はフィトケラチンがとりわ
け重金属に結合し、これらを金属イオン封鎖する有益な分子である点で重要であ
る。本発明の結果として、重金属トレランス及び／又は耐性並びに植物改善と関
連する現象についての新しい識見が可能である。PCシンターゼの分子同定は、本
発明の記載から明らかであるように、汚染された土壌及び地下水の生物改善のた
めのPCシンターゼ触媒PC生合成と関連する重金属トレランス、耐性及び蓄積に影
響するために、植物及びその細胞の操作に関する手段を提供する。それ故、フィ
トケラチンシンターゼ及びこれらをコードする核酸の単離及び精製はこれらの有
益な化合物の大規模生成及び全てが環境浄化努力を助ける生物改善に有益である
このような化合物を生成する組換え植物及び細胞の開発を可能にする。
【００１８】 “貯蔵排泄”のプロセスは植物に必要である。哺乳類はバイオトキシンを腎臓
による排除のために細胞外媒体に排泄するという選択肢を有するが、植物は中央
液胞中の有害化合物の金属イオン封鎖にほぼ完全に依存しており、その液胞は頻
繁に全細胞内容積の40-90％に相当する。植物中の特殊排泄器官の実際の不在及
び多量の液胞の存在のために、おそらく哺乳類細胞のサイトゾルからの生体内異
物の排除における中間工程にすぎない細胞内区画化と称されるプロセスが植物に
おける解毒の終期を構成すると考えられる。 本明細書に開示されたデータはアラビドプシス・タリアーナから単離された２
種の植物核酸、AtPCS1及びAtPCS2、小麦からの核酸、TaPCS1、C.エレガンスから
の核酸、CePCS、並びにS.ポンベからの核酸、SpPCSeの夫々がフィトケラチンシ
ンターゼをコードすることを証明する。更に、データは新規なフィトケラチンシ
ンターゼがフィトケラチン生合成、更に重要なことには、カドミウム、ヒ酸塩、
亜ヒ酸塩、鉛、水銀及び銅の結合及び輸送により例示されるような重金属イオン
封鎖に関与することを証明する。
【００１９】 本発明におけるこれらの遺伝子の発見は幾つかのレベルで重要である。これら
の遺伝子の同定及びそれらの翻訳産物の触媒活性の解明はあらゆる生物からのフ
ィトケラチンシンターゼの最初の組み合わされた分子同定及び生化学的特定に相
当する。本発明において、PCシンターゼをコードする核酸が植物、酵母及び虫か
ら同定され、単離され、それによりコードされたタンパク質の生化学的機能が特
定された。更に、これらの遺伝子及びそれらのコードされた産物の同定及び単離
がGSHコンジュゲートを生成し得るサイトゾルからの化合物の除去に重要な植物
要素が研究され、操作されることを可能にする。
【００２０】 アラビドプシス・タリアーナから単離された２種の新規な植物遺伝子、AtPCS1
及びAtPCS2（これらはPCの生合成に関係する植物フィトケラチンシンターゼをコ
ードする）が本発明において開示された。これらの遺伝子は夫々AtPCS1及びAtPC
S2である配列番号１及び配列番号３として本明細書に例示される。植物AtPCS1及
びAtPCS2によりコードされたタンパク質（夫々、配列番号２及び配列番号４）は
こうしていずれの源からも以前に特性決定又は単離されなかった新規な酵素に相
当する。 更に、アミノ酸配列配列番号６を有するタンパク質をコードする小麦、トリチ
カム・エスチバム(Triticum aestivum)から単離された新規な遺伝子、TaPCS1（
配列番号５；GenBank受理番号AF093752；図18）が、新規な酵母PCSポリペプチド
、SpPCS（配列番号８）をコードする酵母シゾサッカロミセス・ポンベから単離
された核酸、SpPCS（配列番号７；GenBank受理番号Q10075；図19）と同様に、又
開示される。更に、本発明は又新規な動物PCS、CePCS（配列番号10）をコードす
るセノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)遺伝子、CePCS（配
列番号９；GenBank受理番号Z66513；図20）を含む。AtPCS1、TaPCS1、CePCS、及
びSpPCSの予想アミノ酸配列が図9Aに開示される。
【００２１】 AtPCS1をコードする核酸がカドミウム毒性に敏感である突然変異体酵母株に導
入される時に、その核酸がカドミウム感受性表現型を抑制し、実際に、突然変異
体が誘導される野生型酵母株により寛容されるレベルを超えるカドミウムレベル
に対する耐性を与えることが本発明において更に発見された。同様に、酵母への
小麦、酵母、及びC.エレガンス遺伝子の導入が又Cd2+に対する耐性を与え、それ
によりこれらの遺伝子が機能性フィトケラチンシンターゼをコードすることを実
証した。更に、S.セレビジエ中の小麦TaPCS1核酸又はSpPCS核酸の発現がCd2+ト
レランスを生じた。又、S.セレビジエ中のTaPCS1の発現が低いCd2+レベルでさえ
も細胞中のCd2+の蓄積の増大を生じた。加えて、本明細書に開示されたデータは
精製された組換えSpPCSタンパク質がin vitroでグルタチオンからフィトケラチ
ンを合成し、又S.セレビジエ中のTaPCS1又はSpPCSの発現がin vivoでフィトケラ
チン生合成を誘発したことを実証する。更に、S.ポンベ中のSpPCSの欠失はカド
ミウム及び銅に対する増大された感受性を生じ、この欠失突然変異体（ΔSpPCS
）はフィトケラチンを合成しなかった。
【００２２】 “コードする”はヌクレオチド（即ち、rRNA、tRNA及びmRNA）の特定の配列又
はアミノ酸の特定の配列を有する生物学的プロセスにおけるその他のポリマー及
び巨大分子の合成の鋳型として利用できるポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、
cDNA、又はmRNA中のヌクレオチドの特定配列の固有の性質及びそれから得られる
生物学的性質を表す。こうして、遺伝子はその遺伝子に相当するmRNAの転写及び
翻訳が細胞又はその他の生物系中でタンパク質を生じる場合にタンパク質をコー
ドする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同じであり、通常配列表に示されるコー
ディングストランド、及び遺伝子又はcDNAの転写の鋳型として使用される非コー
ディングストランドの両方が、その遺伝子又はcDNAのタンパク質又はその他の産
物をコードすると称し得る。
【００２３】 特に明記しない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は互い
の変性バージョンであるヌクレオチド配列及び同じアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列の全てを含む。タンパク質及びRNAをコードするヌクレオチド配
列はイントロンを含んでもよい。 本明細書に使用される“単離された核酸”は、天然で生じる状態でそれに隣接
する配列から分離された核酸配列、例えば、その断片に通常隣接する配列から除
去された核酸断片、例えば、それが天然に生じるゲノム中のその断片に隣接する
配列を表す。又、その用語はその天然状態で核酸（例えば、RNA、DNA又はタンパ
ク質）を自然に伴うその他の成分から実質的に精製された核酸に適用される。そ
れ故、その用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミドもしくはウイルス、
又は原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAにとり込まれ、又はその他の配列と
は独立の別の分子（例えば、cDNA又はPCRもしくは制限酵素消化により生成され
るゲノム断片もしくはcDNA断片）として存在する組換え核酸を含む。それは又付
加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え核
酸を含む。
【００２４】 本発明の植物フィトケラチンシンターゼが夫々のAtPCS1について約６カドミウ
ム分子の化学量論比でカドミウムを直接結合するという事実が本発明において更
に発見される。加えて、本明細書に開示されたデータはAtPCS1の発現がPC2、PC3 及びPC4を含むPCの合成を媒介し、それによりPCによる重金属の液胞輸送及び貯
蔵を促進することを実証する。 ２種の植物フィトケラチンシンターゼ、AtPCS1及びAtPCS2（夫々、配列番号２
及び配列番号４；夫々、図16及び17を参照のこと）の同定が実験詳細部分に詳し
く記載される。更に、小麦（TaPCS1{配列番号５}及びTaPCS1{配列番号６}）、酵
母（SpPCS{配列番号７}及びSpPCS{配列番号８}）、並びに線虫（CePCS{配列番号
９}及びCePCS{配列番号10}）からのPCシンターゼの同定が本明細書中のいずれか
に詳しく記載される。本発明により一旦武装されると、当業者は本明細書に記載
される操作に従うことによる種々の化合物の金属イオン封鎖に関係する、植物及
びその他の生物からその他のフィトケラチンシンターゼをコードする付加的な遺
伝子を同定し、単離する方法を知るであろう。
【００２５】 PCシンターゼをコードする遺伝子は幾つかの既知の分子操作のいずれか一つを
使用して単離される。例えば、AtPCS1（配列番号１）、AtPCS2（配列番号３）、
TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７）、及びCePCS（配列番号９）のいず
れかの配列の保存領域を含むプライマーが、特定のDNAを含むDNAライブラリー中
の未だ知られていないAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、及びCePCS同族体をポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)又は直接ハイブリダイゼーションにより単離するための
プローブとして使用し得る。又、AtPCS1（配列番号２）、AtPCS2（配列番号４）
、TaPCS1（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、又はCePCS（配列番号10）に対
し誘導された抗体が特定のDNAを含む発現ライブラリーからPCシンターゼをコー
ドするクローンを単離するのに使用し得る。プライマーの単離、プローブ、分子
クローニング及び抗体の産生は当業界で公知の操作であり、例えば、Sambrookら
（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New
York）、Ausubelら（1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green＆
Wiley, New York）、及びHarlowら（1988, Antibodies, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, New York）に記載されている。
【００２６】 本発明はフィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を含み、その
フィトケラチンシンターゼは順にカドミウムを含む重金属を結合するPCを合成す
ることができる。フィトケラチンシンターゼをコードする核酸はAtPCS1（配列番
号１）、AtPCS2（配列番号３）、TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７）
、及びCePCS（配列番号９）の少なくとも一種に少なくとも約15％相同であるこ
とが好ましい。フィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸はAtPCS1
（配列番号１）、AtPCS2（配列番号３）、TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列
番号７）、及びCePCS（配列番号９）の少なくとも一種に少なくとも約25％、好
ましくは少なくとも約35％、更に好ましくは少なくとも約45％、更に好ましくは
少なくとも約55％、更に好ましくは少なくとも約65％、更に好ましくは少なくと
も約75％、更に好ましくは少なくとも約85％相同、更に好ましくは少なくとも約
95％、更に好ましくは少なくとも約99％相同であることが更に好ましい。フィト
ケラチンシンターゼをコードする単離された核酸はアラビドプシスAtPCS1、もし
くはAtPCS2、又は小麦TaPCS1、或いは酵母SpPCS、又は虫CePCSであることが更に
好ましい。フィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸は配列番号１
、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９であることが最も好ま
しい。
【００２７】 こうして、本発明はアラブドプシスAtPCS1（配列番号２）及びAtPCS2（配列番
号４）、小麦TaPCS1（配列番号６）、酵母SpPCS（配列番号８）、及び虫CePCS（
配列番号10）をコードする核酸、並びにアラブドプシスAtPCS1（配列番号１）、
AtPCS2（配列番号３）、小麦TaPCS1（配列番号５）、酵母SpPCS（配列番号７）
、及び虫CePCS（配列番号９）に相同の核酸を含むものと見なされるべきである
。 加えて、“相同性”という用語が核酸及びタンパク質を表すために本明細書に
使用される場合、それは核酸レベル及びアミノ酸レベルの両方で相同性に適用さ
れると見なされるべきである。
【００２８】 こうして、本発明は又核酸が好ましくはAtPCS1（配列番号２）、AtPCS2（配列
番号４）、TaPCS1（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS（配列番号
10）の少なくとも一種に少なくとも約15％相同であるタンパク質をコードする場
合のフィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を含む。更に好まし
くは、単離された核酸はAtPCS1（配列番号２）、AtPCS2（配列番号４）、TaPCS1
（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS（配列番号10）の少なくとも
一種に少なくとも約25％、更に好ましくは少なくとも約35％、更に好ましくは少
なくとも約45％、更に好ましくは少なくとも約55％、更に好ましくは少なくとも
約65％、更に好ましくは少なくとも約75％、更に好ましくは少なくとも約85％相
同、更に好ましくは少なくとも約95％、更に好ましくは少なくとも約99％相同で
あるフィトケラチンシンターゼをコードする。更に好ましくは、単離された核酸
はアラビドプシスAtPCS1もしくはAtPCS2、又は小麦TaPCS1である植物フィトケラ
チンシンターゼ、或いは酵母SpPCS、又は線虫CePCSをコードする。最も好ましく
は、単離された核酸はアミノ酸配列配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列
番号８、又は配列番号10を有するフィトケラチンシンターゼをコードする。
【００２９】 それ故、本発明はアラブドプシスAtPCS1（配列番号２）及びAtPCS2（配列番号
４）、トリチカムTaPCS1（配列番号６）、酵母SpPCS（配列番号８）、及びセノ
ルハブジチスCePCS（配列番号10）をコードする核酸、並びにAtPCS1、AtPCS2、T
aPCS1、SpPCS、及びCePCSに相同のタンパク質をコードする核酸を含むと見なさ
れるべきである。 本明細書に使用される“フィトケラチンシンターゼ”はフィトケラチンの生合
成に関係しているタンパク質を意味する。これらのタンパク質（又、γ−グルタ
ミルシステインジペプチジルトランスペプチダーゼと称される）はチオールペプ
チドから別のチオールペプチド又は既に合成されたPC分子へのγ−グルタミルシ
ステイン単位の移入によりPCをGSH、ホモ-GSH、及び関連チオールペプチドから
合成する（Rauser, 1996, Annu. Rev. Biochem. 59:61-86; Zenk, 1990, Gene 1
79:21-30）。 “フィトケラチン”は順に高アフィニティーで重金属を結合するポリ-(γ-Glu
-Cys)n-Xaaポリマーである。 本明細書に使用される“フィトケラチンシンターゼをコードする核酸”という
用語はフィトケラチンを生成することができ、又はその蓄積と関連しているポリ
ペプチドをコードする核酸を意味する。
【００３０】 本発明はフィトケラチンシンターゼの生物学的活性なポリペプチド断片をコー
ドする単離された核酸を含む。フィトケラチンシンターゼの生物学的活性なポリ
ペプチド断片をコードする単離された核酸はAtPCS1（配列番号１）、AtPCS2（配
列番号３）、TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７）、及びCePCS（配列番
号９）の少なくとも一種の断片をコードする核酸に少なくとも15％相同であるこ
とが好ましい。フィトケラチンシンターゼの生物学的活性なポリペプチド断片を
コードする単離された核酸はAtPCS1（配列番号１）、AtPCS2（配列番号３）、Ta
PCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７）、及びCePCS（配列番号９）の少なく
とも一種の断片に少なくとも約25％、更に好ましくは少なくとも約35％、更に好
ましくは少なくとも約45％、更に好ましくは少なくとも約55％、更に好ましくは
少なくとも約65％、更に好ましくは少なくとも約75％、更に好ましくは少なくと
も約85％、更に好ましくは少なくとも約95％、更に好ましくは少なくとも約99％
相同であることが更に好ましい。フィトケラチンシンターゼの生物学的活性なポ
リペプチド断片をコードする単離された核酸はAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS
又はCePCSの断片をコードする核酸であることが更に好ましい。フィトケラチン
シンターゼの生物学的活性なポリペプチド断片をコードする単離された核酸は配
列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９の断片をコー
ドする核酸であることが最も好ましい。
【００３１】 本明細書に使用される“生物学的活性な”という用語は、それが本明細書に使
用されるフィトケラチンシンターゼ活性を表す際に、ポリペプチド、又はその断
片を意味し、これはγ−グルタミルシステイン単位をチオールペプチドから別の
チオールペプチド又は既に合成されたフィトケラチン分子に移入することができ
る。 又、フィトケラチンシンターゼの生物学的活性なポリペプチド断片をコードす
る単離された核酸が本発明に含まれる。フィトケラチンシンターゼの生物学的活
性なポリペプチド断片をコードする単離された核酸はAtPCS1（配列番号２）、At
PCS2（配列番号４）、TaPCS1（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS
（配列番号10）の少なくとも一種の生物学的活性なポリペプチド断片をコードす
る核酸に少なくとも15％相同であることが好ましい。フィトケラチンシンターゼ
の生物学的活性なポリペプチド断片をコードする単離された核酸はAtPCS1（配列
番号２）、AtPCS2（配列番号４）、TaPCS1（配列番号６）、SpPCS（配列番号８
）、及びCePCS（配列番号10）の少なくとも一種の生物学的活性なポリペプチド
断片をコードする核酸に少なくとも約25％、更に好ましくは少なくとも約35％、
更に好ましくは少なくとも約45％、更に好ましくは少なくとも約55％、更に好ま
しくは少なくとも約65％、更に好ましくは少なくとも約75％、更に好ましくは少
なくとも約85％、更に好ましくは少なくとも約95％、更に好ましくは少なくとも
約99％相同であることが更に好ましい。フィトケラチンシンターゼの生物学的活
性なポリペプチド断片をコードする単離された核酸はAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、
SpPCS又はCePCSの生物学的活性なポリペプチド断片をコードする核酸であること
が更に好ましい。フィトケラチンシンターゼの生物学的活性なポリペプチド断片
をコードする単離された核酸は配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８、又は配列番号10の生物学的活性なポリペプチド断片をコードする核酸である
ことが最も好ましい。
【００３２】 PCシンターゼの生物学的活性なポリペプチド断片をコードする単離された核酸
は長さ約200ヌクレオチドであることが好ましい。PCシンターゼの生物学的活性
なポリペプチド断片をコードする単離された核酸は長さ約400ヌクレオチド、更
に好ましくは、少なくとも約600、更に好ましくは、少なくとも800、更に好まし
くは、少なくとも約1000、更に好ましくは、少なくとも約1200、更に好ましくは
1300、更に好ましくは1400ヌクレオチドであることが更に好ましい。 更に、本発明はPCシンターゼをコードする単離された核酸を含むベクター及び
その生物学的活性な断片をコードする核酸配列を含むベクターを含む。PCシンタ
ーゼ、又はその断片をコードするベクターの生成のための操作はその遺伝子の配
列が一旦知られると、当業界で公知であり、例えば、Sambrookらの上記文献、Au
subelらの上記文献に記載されている。好適なベクターとして、本明細書のいず
れかに記載される酵母-E. coliシャトルベクター、及びカリフラワーモザイクウ
イルス(CaMV)35Sプロモーター（Lagriminiら, 1990, Plant Cell 2:7-18）、そ
の内在性プロモーター又は誘導プロモーター（Bevan, 1984, Nucl. Acids Res.
12:8711-8721）の制御下で標的遺伝子を含む武装解除されたアグロバクテリウム
腫瘍誘発(Ti)プラスミド（例えば、pBIN19）が挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００３３】 更に、本発明は当業界で公知であるような植物組織特異性プロモーターを含む
。これらのプロモーターは或る組織中でそれに機能し得る形で連結された核酸の
発現を誘導するが、その他の組織中では誘導しない。当業者は、本明細書に示さ
れた開示に基づいて、組織特異性プロモーターが植物の或る部分中でPCSをコー
ドする核酸の発現を誘導し、それにより重金属を、例えば、植物の非収穫部分に
、植物の収穫部分から離れて局在化するのに有益であることを認めるであろう。 本発明は既に説明された組織特異性プロモーターを使用してPCシンターゼをコ
ードする核酸を植物の別の組織ではなく或る組織中で発現する方法を含む。そう
することにより、本発明は、例えば、ヒト又は非ヒト動物の消費のために収穫さ
れない植物の部分中で毒性金属を蓄積するための手段を提供する。こうして、本
発明は重金属を動物消費にかけられない植物の部分、例えば、葉又は根に蓄積す
るとともに同植物の食用部分中の毒性重金属のレベルを最小にするための方法を
含む。
【００３４】 本明細書に使用される“収穫可能な部分”という用語は、培養され、消費を含
むヒト用のために集められる植物のあらゆる部分を意味する。このような収穫可
能な部分として、種々の植物の果実、種子、幹、及び根が挙げられるが、これら
に限定されない。当業者は、本明細書に示された開示に基づいて、或る植物の収
穫部分が別の植物の収穫されない部分であってもよいことを認めるであろう。例
えば、タバコ植物の収穫部分は根ではなく、葉であってもよいが、ジャガイモ植
物の収穫部分は植物の葉ではなく、根、又は塊茎部分であろう。更に、本発明は
果実及び葉の両方がヒト消費に使用されてもよい場合に収穫される多くの部分を
有する植物、例えば、ブドウつるを含む。
【００３５】 “収穫されない部分”はヒト消費に使用されない植物の一つ以上の部分を含む
。これらの部分は、建築材料に使用される植物の部分（これらに限定されない）
の如きヒト又は非ヒト動物の消費以外の目的のために使用されてもよい。それ故
、植物の収穫されない部分は有益かつ／又は商業上重要であるが、ヒト又は非ヒ
ト動物の消費に使用されない部分を含み、即ち、その部分は摂取されず、又は食
物製剤中に使用されない。 又、PCシンターゼをコードする単離された核酸を含む細胞及びその生物学的活
性な断片をコードする単離された核酸を含む細胞が本発明に含まれる。 PCシンターゼ、又はその断片をコードする細胞の発生方法はその遺伝子の配列
が一旦知られると当業界で公知であり、例えば、Sambrookらの上記文献、又はAu
subelらの1997年の上記文献に記載されている。好適な細胞として、PCシンター
ゼポリペプチドを生成する発現目的のための遺伝子で形質転換された酵母細胞、
細菌細胞、哺乳類細胞、及びバキュロウイルス感染昆虫細胞が挙げられるが、こ
れらに限定されない。加えて、重金属に対する増大された耐性及び重金属蓄積に
ついて増大された能力を有する細胞及び再生植物を生産する目的のための遺伝子
で形質転換された植物細胞が本発明に含まれる。
【００３６】 又、本発明はPCをGSH又はその他の好適な基質から生成することができるPCシ
ンターゼを含む単離されたポリペプチドを含む。PCシンターゼを含む単離された
ポリペプチドはAtPCS1（配列番号２）、AtPCS2（配列番号４）、TaPCS1（配列番
号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS（配列番号10）の少なくとも一種に少
なくとも15％相同であることが好ましい。PCシンターゼを含むポリペプチドの単
離された製剤はAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、及びCePCSの少なくとも一種に
少なくとも約25％、更に好ましくは少なくとも約35％、更に好ましくは少なくと
も約45％、更に好ましくは少なくとも約55％、更に好ましくは少なくとも約65％
、更に好ましくは少なくとも約75％、更に好ましくは少なくとも約85％、更に好
ましくは少なくとも約95％、更に好ましくは少なくとも約99％相同であることが
更に好ましい。PCシンターゼを含むポリペプチドの単離された製剤はAtPCS1、At
PCS2、TaPCS1、SpPCS又はCePCSであることが更に好ましい。PCシンターゼを含む
ポリペプチドの単離された製剤は配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番
号８、又は配列番号10の少なくとも一種であることが最も好ましい。
【００３７】 本明細書に使用される“単離されたポリペプチド”という用語はそれを自然に
伴う成分から分離されたポリペプチドを記載する。典型的には、ポリペプチドは
サンプルの全物質の少なくとも10％、更に好ましくは少なくとも20％、更に好ま
しくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは少なく
とも75％、更に好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％（容
積基準、湿潤もしくは乾燥重量基準、又はモル％もしくはモル分率基準）が関係
するポリペプチドである場合に単離される。ポリペプチドの単離の程度はあらゆ
る適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動、又はHPLC分析により測定し得る。例えば、ポリペプチドはそれが天然混
在成分を実質的に含まない場合又はそれがその天然状態でそれを伴う天然化合物
から分離される場合に単離される。
【００３８】 又、PCシンターゼの単離された生物学的活性なポリペプチド断片が本発明に含
まれる。PCシンターゼの単離された生物学的活性なポリペプチド断片はAtPCS1、
AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、及びCePCSの少なくとも一種の生物学的活性なポリペプ
チド断片に少なくとも15％相同であることが好ましい。PCシンターゼの単離され
た生物学的活性なポリペプチド断片はAtPCS1（配列番号２）、AtPCS2（配列番号
４）、TaPCS1（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS（配列番号10）
の少なくとも一種の生物学的活性なポリペプチド断片に少なくとも約25％、更に
好ましくは少なくとも約35％、更に好ましくは少なくとも約45％、更に好ましく
は少なくとも約55％、更に好ましくは少なくとも約65％、更に好ましくは少なく
とも約75％、更に好ましくは少なくとも約85％、更に好ましくは少なくとも約95
％、更に好ましくは少なくとも約99％相同であることが更に好ましい。PCシンタ
ーゼの単離された生物学的活性なポリペプチド断片はAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、
SpPCS又はCePCSの生物学的活性なポリペプチド断片であることが更に好ましい。
PCシンターゼの単離された生物学的活性なポリペプチド断片は配列番号２、配列
番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号10の生物学的活性なポリペプチ
ド断片であることが最も好ましい。
【００３９】 PCシンターゼの単離された生物学的活性なポリペプチド断片は長さ約60アミノ
酸であることが好ましい。PCシンターゼの単離された生物学的活性なポリペプチ
ド断片は長さ約130アミノ酸、更に好ましくは少なくとも約200、更に好ましくは
少なくとも約300、更に好ましくは少なくとも約350、更に好ましくは少なくとも
約400アミノ酸であることが更に好ましい。 本明細書に使用される“相同”という用語は２種のポリマー分子間、例えば、
２種の核酸分子間、例えば、２種の核酸分子、又は２種のポリペプチド分子の間
のサブユニット配列類似性を表す。２種の分子の両方中のサブユニット位置が同
じモノマーサブユニットにより占有される場合、例えば、２種のポリペプチド分
子の夫々中の位置がフェニルアラニンにより占有される場合、それらはその位置
で相同である。二つの配列の間の相同性はマッチング又は相同位置の数の直接関
数であり、例えば、二つのポリペプチド配列中の位置の半分（例えば、長さがポ
リマー10サブユニット中の５の位置）が相同である場合、二つの配列は50％相同
であり、位置の70％、例えば、10のうちの７がマッチされ、又は相同である場合
、二つの配列は70％相同姓を共有する。例として、ポリペプチド配列5'-ACDEFG-
3'及び5'-ACDHIK-3'（夫々、配列番号９及び配列番号10）は50％相同性を共有し
、ヌクレオチド配列5'-CAATCG-3'及び5'-CAAGAC-3'は50％相同性を共有する。
【００４０】 要するに、本発明はAtPCS1又はATPCS2を含み、又は配列番号１、配列番号３、
配列番号５、配列番号７、又は配列番号９、及びこれらのあらゆる断片と少なく
とも15％の相同性を共有する核酸（これらはフィトケラチンシンターゼ生物学的
活性をコードする）、並びにAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、及びCePCSを含み
、又は配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号10、及
びこれらのあらゆる断片と少なくとも15％の相同性を共有するポリペプチド（こ
れらはフィトケラチンシンターゼ生物学的活性を含む）を含むと見なされるべき
である。 更に、本発明はAtPCS1、ATPCS2、TaPCS1、SpPCS、CePCSを含み、又は配列番号
１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９の少なくとも一つ、
及びこれらのあらゆる断片と少なくとも15％の相同性を共有するフィトケラチン
シンターゼをコードする核酸の一部又は全部に配向がアンチセンスである単離さ
れた核酸を特徴とし、そのアンチセンス核酸、又はその断片はフィトケラチンシ
ンターゼをコードする核酸を含む細胞に導入された時にフィトケラチンシンター
ゼをコードする核酸の発現を抑制することができる。
【００４１】 “アンチセンス”は特にタンパク質をコードする二本鎖DNA分子の非コーディ
ングストランドの核酸配列、又はその非コーディングストランドに実質的に相同
である配列を表す。本明細書に特定されたように、アンチセンス配列はタンパク
質をコードする二本鎖DNA分子の配列に相補性である。アンチセンス配列はDNA分
子のコーディングストランドのコーディング部分にのみ相補性であることは必要
ではない。アンチセンス配列はタンパク質をコードするDNA分子のコーディング
ストランドに特定の調節配列に相補性であってもよく、その調節配列はコーディ
ング配列の発現を調節する。 本明細書に使用される“相補性”は２種の核酸、例えば、２種の核酸分子の間
のサブユニット配列相補性を表す。両方の分子中のヌクレオチド位置が通常互い
に塩基対合することができるヌクレオチドにより占有される場合、これらの核酸
はこの位置で互いに相補性であると考えられる。こうして、２種の核酸はその分
子の夫々中の相当する位置の実質的な数（少なくとも50％）が通常互いに塩基対
合するヌクレオチド（例えば、A:Tヌクレオチド対及びG:Cヌクレオチド対）によ
り占有される場合に互いに相補性である。
【００４２】 又、本発明はAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、又はCePCSによりコードされた
タンパク質又はペプチドの類似体を提供する。類似体は保存アミノ酸配列の相違
もしくは配列に影響しない修飾、又はその両方により天然産のタンパク質又はペ
プチドとは異なり得る。 例えば、保存アミノ酸変化がなされてもよく、それらはタンパク質又はペプチ
ドの一次配列を変えるが、通常その機能を変化しない。保存アミノ酸置換として
、典型的には下記のグループ内の置換が挙げられる。 グリシン、アラニン； バリン、イソロイシン、ロイシン； アスパラギン酸、グルタミン酸； アスパラギン、グルタミン； セリン、スレオニン； リシン、アルギニン； フェニルアラニン、チロシン。
【００４３】 修飾（これらは通常一次配列を変化しない）として、ポリペプチドのin vivo
、又はin vitro化学誘導体化、例えば、アセチル化又はカルボキシル化が挙げら
れる。又、グリコシル化の修飾、例えば、ポリペプチドをグリコシル化に影響す
る酵素、例えば、哺乳類のグリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素に暴露する
ことにより、ポリペプチドのグリコシル化パターンをその合成及びプロセシング
中又は更なるプロセシング工程で修飾することにより行なわれるものが挙げられ
る。又、リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、又は
ホスホスレオニンを有する配列が含まれる。 又、タンパク質分解に対するそれらの耐性を改良し、もしくは可溶化特性を最
適化し、又はそれらを治療薬として更に適するようにするように通常の分子生物
学的技術を使用して修飾されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチ
ドの類似体として、天然産L-アミノ酸以外の残基、例えば、D-アミノ酸又は非天
然産合成アミノ酸を含むものが挙げられる。本発明のペプチドは本明細書にリス
トされた特定の例示プロセスのいずれかの産物に限定されない。
【００４４】 更に、本発明はPCを生成することができる、植物フィトケラチンシンターゼ、
又はその断片をコードする単離された核酸を含むトランスジェニック植物を含む
。本発明のトランスジェニック植物は植物フィトケラチンシンターゼポリペプチ
ド、又はその断片をコードするトランスジーンを含んでもよく、又はそれはその
植物核酸及び／又はタンパク質と少なくともΔSpPCS相同性を共有する非植物種
からのフィトケラチンシンターゼをコードするトランスジーンを含んでもよく、
その異種トランスジーンは植物中で発現されて生物学的活性なフィトケラチンシ
ンターゼタンパク質産物を生じる。例として、アラビドプシスフィトケラチンシ
ンターゼAtPCS1トランスジーンを含む酵母形質転換体が本明細書中の実施例に示
され、トランスジーンが酵母細胞中で発現される時に、これはそうしなければ非
トランスジェニック酵母の増殖を阻止する濃度の重金属（カドミウム）を含む媒
体で増殖する能力を細胞に与える。同様に、実施例は小麦から単離されたフィト
ケラチンシンターゼトランスジーン、(i)TaPCS1を発現する酵母形質転換体を開
示し、その酵母はCd2+に対する増大されたトレランス、低レベルのCd2+でさえも
この重金属の増大された蓄積を示し、酵母形質転換体中のPCの増大された生合成
を誘発した。それ故、本発明は別の種からのPCシンターゼをコードする核酸の発
現が別の生物にPCシンターゼ生物学的活性を与えることを教示する。
【００４５】 本明細書に使用される“トランスジェニック植物”はその細胞、種子及び子孫
がその中に挿入された単離された核酸を含む植物を意味し、その単離された核酸
は組換えDNA技術により植物の細胞に挿入されるように操作されていた。操作さ
れた単離された核酸が“トランスジーン”と称される。 重金属解毒がPC生合成の速度により制限される場合、増大されたAtPCS1、AtPC
S2、TaPCS1、SpPCS、及び／又はCePCS発現を有するトランスジェニック植物が重
金属の毒性作用に対し更に耐性であると予想されるであろう。言い換えると、液
胞の重金属イオン封鎖がPC生合成の速度により制限される場合、増大されたAtPC
S1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、及び／又はCePCS発現を有するトランスジェニック
植物がそれ以外は同じ非トランスジェニック植物よりも高い液胞重金属レベルを
蓄積することができると予想されるであろう。前者の性質は通常のレベルのPCシ
ンターゼ発現を示す植物の生長を遅延する重金属濃度の存在下でトランスジェニ
ック植物の持続された生長を可能にする。後者の性質は液胞重金属過剰蓄積の能
力をトランスジェニック植物に与える。
【００４６】 本明細書に使用される“重金属耐性”という用語は、生物が重金属耐性ではな
いそれ以外は同じ生物よりも高い細胞内レベルの重金属を寛容することができる
。寛容するこのような能力は生物がそれ以外は同じであるが非耐性の生物を死滅
し、かつ／又は生長もしくは分裂させなくする重金属の存在下で生存し、更には
成長し、かつ／又は分裂する能力により実証し得る。 一実施態様において、酵母形質転換体は同じ株のそれ以外は同じ非形質転換体
酵母と比較して高濃度のヒ酸塩、亜ヒ酸塩、銅、又は水銀に対し重金属耐性であ
った。しかしながら、本発明はこれらの重金属又は酵母形質転換体に限定される
べきではない。むしろ、本発明はあらゆる生きている生物を含むと見なされるべ
きであり、生物により遭遇されるかもしれないあらゆる重金属に対する耐性を含
む。 更に、酵母重金属形質転換体は増殖培養液の増大された光学密度により測定し
て成長の50％減衰を生じるのに必要とされる重金属の量により測定されるように
重金属塩の存在下で培養中に成長し、分裂することができた。しかしながら、本
発明はあらゆる特別な様式の細胞成長及び分裂に関する重金属暴露の一つ以上の
毒性作用を測定することに限定されない。むしろ、本発明はそれ以外は同じ生物
（これは重金属に耐性ではない）と比較して重金属暴露の前、その間又はその後
の生きている生物の生長及び／又は生存を測定するあらゆる方法を含むと解され
るべきである。その他の重金属アッセイとして、LD50、乾燥又は新鮮な重量、組
織クロロシス／壊死、CO2固定、O2消費、CO2発生、活性化酸素種の生成、細胞又
は組織濁度等の測定が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４７】 重金属に対する増大された耐性は生体内異物で汚染された生育地における植物
技術及び植物成長に用途を有する。植物液胞は全細胞内容積の40-90％を頻繁に
構成し、かつPCはこの区画への重金属の吸収を媒介するので、フィトケラチンシ
ンターゼによるPCの増大された生成の結果としての組織重量基準における過剰蓄
積の潜在性が大きい。次いで過剰蓄積剤は重金属の固定／イオン封鎖及び土壌か
らのそれらの除去に使用し得る。 植物フィトケラチンシンターゼ、又はその断片の核酸配列又はアミノ酸配列を
含む単離された核酸を含むトランスジェニック植物の発生は、所望の核酸配列を
コードするプラスミドによる植物の形質転換により行ない得る。好適なベクター
として、強力な構成的CaMV 35Sプロモーターの制御下又は誘導プロモーターの制
御下に置かれたセンスストランド又はアンチセンスストランドを含む武装解除さ
れたアグロバクテリウム腫瘍誘発(Ti)プラスミド(Lagriminiら, 1990,上記文献;
van der Krolら, 1988, Gene 72:45-50)が挙げられるが、これらに限定されな
い。このような構築物の発生、植物形質転換及び植物再生に関する方法は、所望
の遺伝子の配列が一旦知られると、当業界で公知であり、例えば、Ausubelら(19
93, Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, New York)
に記載されている。
【００４８】 好適なベクター及び植物組み合わせは当業者に容易に明らかであり、例えば、
Maligaら(1994, Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, New York)に見られる。 “ベクター”は単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送
出するのに使用し得る組成物である。多数のベクターが当業界で知られており、
線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性の化合物と会合されたポリヌクレ
オチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。こ
うして、“ベクター”という用語は自律複製プラスミド又はウイルスを含む。又
、その用語は細胞への核酸の移入を促進する非プラスミド化合物及び非ウイルス
化合物、例えば、ポリリシン化合物、リポソーム等を含むと見なされるべきであ
る。
【００４９】 “発現ベクター”は発現すべきヌクレオチド配列に機能し得る形で連結された
発現調節配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを表す。発現ベクタ
ーは発現のための充分なシス作用性要素を含む。発現のためのその他の要素は宿
主細胞により、又はin vitro発現系中で供給し得る。発現ベクターとして、当業
界で知られている全てのベクター、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、裸
又はリポソーム中に含まれる）及び組換えポリヌクレオチドをとり込むウイルス
が挙げられる。 植物の形質転換はHorschら(1988, Leaf Disc Transformation, Plant Molecul
ar Biology Manual A5:1)により記載されたアグロバクテリウム媒介葉盤形質転
換方法を使用して行ない得る。 幾つかの操作が、トランスジェニック植物が所望の核酸を含むか否かを評価す
るのに使用し得る。例えば、トランスジェニック植物の細胞から得られたゲノム
DNAがサザンブロットハイブリダイゼーション又はPCRにより分析されてその中に
存在する挿入されたトランスジェニック核酸の長さ及び配向を測定し得る。ノー
ザンブロットハイブリダイゼーション分析又はPCRがトランスジェニック植物の
細胞中で転写されたmRNAを特性決定するのに使用し得る。トランスジェニック植
物の細胞がフィトケラチンシンターゼポリペプチド、又はその断片を発現するこ
とが予想される状況では、ウェスタンブロット分析がフィトケラチンシンターゼ
、又はその断片に対し産生された抗体を使用してこうして発現されたポリペプチ
ドを同定し、特性決定するのに使用し得る。フィトケラチンシンターゼポリペプ
チドが触媒活性形態で発現される状況では、PC生合成がこうして発現された酵素
分子を同定し、特性決定するのに使用し得る。このような分析を行なうための操
作は当業界で公知であり、例えば、Sambrookらの上記文献に記載されている。
【００５０】 本発明のトランスジェニック植物は重金属解毒の操作に有益である。例えば、
AtPCS1又はAtPCS2をコードするトランスジェニック植物は重金属を含む土壌で生
育される場合に重金属解毒に有益である。このような植物は重金属を土壌から除
去し、それにより環境の総合の健康に有害である化合物の減少されたレベルを有
する土壌を生じることができる。 それ故、本発明はフィトケラチンシンターゼをコードするトランスジーンを有
するトランスジェニック植物を発生し、植物又は植物の種子を土壌に植えること
を特徴とする土壌からの重金属の除去方法を含み、土壌中の重金属が土壌中の植
物の成長中に植物内に過剰蓄積／イオン封鎖される。次いで植物が当業界で公知
の通常の農業方法又は植物の収穫のために将来開発される方法及び／又は植物改
善のために特別に開発された方法により土壌から収穫される。 土壌中の重金属のレベルが充分に低減された時、トランスジェニック植物は土
壌から除去され、環境に安全な様式で分解又は廃棄されてもよい。例えば、収穫
された植物は熱、微生物、物理的又は化学的手段により体積及び／又は重量を低
減されて取扱、処理及び潜在的なその後の埋め立てコストを低減し得る（Cunnin
ghamら, 1996, Plant Physiol. 110:715-719）。有益な金属の場合、金属のその
後の精錬及び回収がコスト有効であり得る（Raskin, 1996, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93:3164-3166）。
【００５１】 土壌を改善するこの技術は殆どの化学的又は物理的方法よりも有効、安価かつ
容易である。改善の推定コストは以下のとおりである：植物を使用するin situ
改善による揮発性又は水溶性の汚染物質の除去について土壌１立方メートル当り
10-100米国ドル；同化合物で汚染された土壌の埋め立て又は低温熱処理改善につ
いて土壌１立方メートル当り60-300米国ドル；及び特別な埋め立て配置又は高温
熱処理を必要とする物質で汚染された土壌の改善について土壌１立方メートル当
り200-700米国ドル（Cunninghamら, 1995, Trends Biotechnol. 13:393-397）。 本発明のトランスジェニック植物中のトランスジーンはAtPCS1、AtPCS2、又は
AtPCS1、AtPCS2の断片もしくは類似体をコードする遺伝子であることが好ましく
、又はそのトランスジーンはAtPCS1（配列番号１）、AtPCS2（配列番号３）、Ta
PCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７）、及びCePCS（配列番号９）に少なく
とも約15％相同である核酸である。
【００５２】 本明細書に使用される“トランスジーン”という用語はアミノ酸配列をコード
する核酸に機能し得る形で連結されたプロモーター／調節配列をコードする核酸
を含む外因性核酸配列を意味し、その外因性核酸はトランスジェニック生物によ
りコードされる。 ２種のポリヌクレオチドを“機能し得る形で連結された”と記載することは、
一本鎖又は二本鎖核酸部分が、２種のポリヌクレオチドのうちの少なくとも一種
がそれが他種により特徴とされる生理学的効果を与えることができるような様式
で核酸部分内に配置された２種のポリヌクレオチドを含むことを意味する。例と
して、遺伝子のコーディング領域に機能し得る形で連結されたプロモーターはコ
ーディング領域の転写を促進することができる。 本明細書に使用される“プロモーター／調節配列”という用語はプロモーター
／調節配列に機能し得る形で連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配
列を意味する。或る場合には、この配列はコアープロモーター配列であってもよ
く、また別の場合には、この配列はエンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必
要とされるその他の調節要素を含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例え
ば、遺伝子産物を組織特異性様式で発現するものであってもよい。
【００５３】 当業者は、本明細書に示された開示に基づいて、根の如き或る組織中のPCシン
ターゼの発現が植物の収穫可能な組織（例えば、葉及び果実）中に存在する重金
属のレベルを最小にし得ることを認めるであろう。更に、汚染された地下水の生
物改善の目的のために、気中組織中のPCシンターゼの発現はこれらの組織中の重
金属の蓄積を増大するであろう。更に、植物根中のPCシンターゼの選択的発現は
植物が“リゾフィルトレーション(rhizofiltration)”と称されるプロセスで毒
性重金属を汚染された地下水から除去する能力を増進するであろう。次いで重金
属を含む植物がこのような水から容易に収穫され、それにより重金属汚染物質を
地下水から除去し得る。 本明細書に使用される“地下水”という用語は天然又は人工のあらゆる水源を
意味する。
【００５４】 本発明のこの方法における使用に適している植物の型として、栽培活動が既に
完了された高歩留り作物種、又は改善すべき領域で繁茂する操作された固有種が
挙げられるが、これらに限定されない。 或る状況では、土壌又は地下水からの生体内異物毒素及び重金属の如き物質の
除去を防止することが必要であるかもしれない。このような状況では、AtPCS1、
AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、又はCePCS配列、又は配列番号１、配列番号３、配列番
号５、配列番号７、及び配列番号９の少なくとも一種、もしくはその断片と少な
くとも15％の相同性を有する配列（これは転写に関してアンチセンス配向である
）を含むトランスジーンを含むトランスジェニック植物が発生される。それ故、
このようなトランスジーンは植物中で発現されたAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、SpPC
S、又はCePCSの機能を抑制し、それにより土壌及び／又は地下水からの重金属の
除去を防止するのに利用できる。
【００５５】 当業者は細胞中のPCSタンパク質のレベルを減少する一つの方法がこのような
タンパク質をコードするPCS核酸の発現を抑制することであることを認めるであ
ろう。PCシンターゼタンパク質の発現は、例えば、アンチセンス分子、リボザイ
ム、ウイルス誘導遺伝子抑制、及び同時抑制を使用して抑制し得る。 アンチセンス分子及び遺伝子発現を抑制するためのそれらの使用は当業界で公
知である（例えば、Cohen, 1989, Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhi
bitors of Gene Expression, CRC Pressを参照のこと）。アンチセンス核酸は、
その用語が本明細書のいずれかに定義されるように、特定のmRNA分子の少なくと
も一部に相補性であるDNA分子又はRNA分子である（Weintraub, 1990, Scientifi
c American 262:40）。細胞中で、アンチセンス核酸は相当するmRNAにハイブリ
ダイズして、二本鎖分子を生成し、それにより遺伝子の翻訳を抑制する。
【００５６】 遺伝子の翻訳を抑制するためのアンチセンス方法の使用は当業界で知られてお
り、例えば、Marcus-Sakura, 1988, Anal. Biochem. 172:289に記載されている
。このようなアンチセンス分子はInoueの1993年の米国特許第5,190,931号（本明
細書に参考としてそのまま含まれる）により教示されたようなアンチセンス分子
をコードするDNAを使用する遺伝子発現により細胞に与えられてもよい。 又、本発明のアンチセンス分子は合成によりつくられて、細胞に与えられても
よい。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。何とならば、そ
れらが容易に合成され、標的PCシンターゼ生成細胞に導入されるからである。本
発明により意図される合成アンチセンス分子として、未修飾オリゴヌクレオチド
と較べて改良された生物学的活性を有する当業界で知られているオリゴヌクレオ
チド誘導体が挙げられる（Cohenの上記文献; Tullisの1991年の米国特許第5,023
,243号（本明細書に参考としてそのまま含まれる）を参照のこと）。
【００５７】 リボザイム及び遺伝子発現を抑制するためのそれらの使用は又当業界で公知で
ある（例えば、Cechら, 1992, J. Biol. Chem. 267:17479-17482; Hampelら, 19
89, Biochemistry 28:4929-4933; Ecksteinらの国際公開WO 92/07065; Altmanら
の米国特許第5,168,053号（本明細書に参考としてそのまま含まれる）を参照の
こと）。リボザイムはDNA制限エンドヌクレアーゼと同様の様式でその他の一本
鎖RNAを特異的に開裂する能力を有するRNA分子である。これらのRNAをコードす
るヌクレオチド配列の修飾により、分子がRNA分子中の特定のヌクレオチド配列
を認識し、それを開裂するように操作し得る（Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn
. 260:3030）。このアプローチの重要な利点は、それらが配列特異性であるので
、特別な配列を有するmRNAのみが不活性化されることである。
【００５８】 リボザイムの二つの基本的な型、即ち、テトラヒメナ型（Hasselhoff, 1988,
Nature 334:585）及びハンマーヘッド型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長
さ４塩基である配列を認識し、一方、ハンマーヘッド型リボザイムは長さ11-18
塩基の塩基配列を認識する。配列が長い程、その配列が専ら標的mRNA種中で生じ
る可能性が大きい。従って、ハンマーヘッド型リボザイムは特定のmRNA種を不活
性化するのにテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、また18塩基認識配列が
種々の無関係mRNA分子内でランダムに生じる更に短い認識配列よりも好ましい。 フィトケラチンシンターゼの発現を抑制するのに有益なリボザイムは、AtPCS1
、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、又はCePCSによりコードされ、又は配列番号１、配列
番号３、配列番号５、配列番号７、もしくは配列番号９に少なくとも約15％の相
同性を有するフィトケラチンシンターゼのmRNA配列に相補性である標的配列を基
本的なリボザイム構造にとり込むことにより設計し得る。フィトケラチンシンタ
ーゼを標的とするリボザイムは市販の試薬（Applied Biosystems, Inc., Foster
City, CA）を使用して合成されてもよく、又はそれらはそれらをコードするDNA
から遺伝子発現されてもよい。
【００５９】 関係するPCシンターゼの発現を抑制するための別のアプローチはBaulcombe（1
999, Curr. Opinion Plant Biol. 2:109-113）により記載されたようなウイルス
誘導遺伝子サイレンシング(VIGS)を使用して行なわれてもよい。即ち、エキソン
の一つ以上の部分が適当なウイルスベクターにクローン化され、これは植物組織
中で発現された時にクローン化エキソンに相同の核酸の減少された発現を生じる
。更に、遺伝子発現は同時抑制方法（Kralら, 1990, Plant Cell 2:279-289; Na
poliら, 1990, Plant Cell 2:291-299）を使用して植物中で抑制し得る。当業者
は、本明細書に示された開示に基づいて、関係するPCSの発現を抑制するのに使
用される特別な方法が組織及び／又は植物及び／又は特別なPCS遺伝子（その発
現が調節の標的である）に応じて変化し得ることを認めるであろう。
【００６０】 AtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、及びCePCSアンチセンス配列及び／又はこれ
らのPCS配列に相同のリボザイム、及び／又はこれらの配列に相同の配列を使用
するVIGSは、作物種による重金属蓄積の植物／食物減少の操作に用途を有する。
例えば、低重金属作物の動物又はヒトによる摂取はおそらく動物及びヒトの総合
の健康の改良に寄与するであろう。 それ故、本発明は転写に関してアンチセンス配向であるPCS配列もしくはリボ
ザイム又はVIGS構築物及び／又は同時抑制構築物を含むトランスジーンを有する
トランスジェニック植物を発生し、植物又は植物の種子を土壌に植えることを特
徴とする土壌からの重金属の除去の防止方法を含み、土壌からの重金属の除去は
土壌中の植物の成長中に防止される。 アンチセンス、リボザイム、VIGS、又は同時抑制PCS配列を有するトランスジ
ェニック植物の発生に有益であるアンチセンス、リボザイム、VIGS、及び／又は
同時抑制配列は植物中の滞留PCS遺伝子の発現を抑制する配列である。
【００６１】 アンチセンス、リボザイム、VIGS又は同時抑制配列を使用する本発明の方法に
おける使用に適している植物の型として、減少された重金属蓄積が望ましい作物
が挙げられるが、これらに限定されない。 更に、本発明はリポーター核酸に共有結合されたフィトケラチンシンターゼを
コードする単離された核酸を含む。フィトケラチンシンターゼ及びリポーターを
コードする単離された核酸の発生に関する操作はフィトケラチンシンターゼをコ
ードする核酸の配列が一旦知られると当業界で公知であり、このような技術は、
例えば、Sambrookらの上記文献に記載されている。好適なベクターとして、酵母
-E. coliシャトルベクター、武装解除されたアグロバクテリウム腫瘍誘発(Ti)プ
ラスミド（例えば、pBIN19）（Lagriminiら, 1990, Plant Cell 2:7-18; Bevan,
1984, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721）が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【００６２】 本明細書に使用される“リポーター核酸”は、細胞中で転写又は翻訳された時
に、細胞中で検出可能な産物の生成をもたらすものである。典型的には、細胞中
の産物の発現のレベルはリポーター核酸及びリポーター核酸に結合された植物フ
ィトケラチンシンターゼをコードする核酸の発現を誘導するプロモーター配列の
活性に比例する。それ故、リポーター核酸の発現は植物フィトケラチンシンター
ゼの発現のレベルを示し、又フィトケラチンシンターゼ核酸及び／又はそれから
発現され、リポーター配列に結合されたポリペプチドの細胞位置を測定するのに
使用し得る。 ２種の核酸配列を本明細書に使用されるように“共有結合された”と記載する
ことは、一本鎖又は二本鎖核酸部分が２種の核酸配列の夫々を含み、かつ二つの
配列が転写かつ／又は翻訳されてキメラ核酸及び／又はポリペプチドを生成する
ような様式で二つの配列が核酸部分内に配置されることを意味する。
【００６３】 好適なリポーター核酸は、例えば、ヒトインフルエンザウイルス血球凝集素(H
A)エピトープ、オクタペプチドFLAGエピトープ、β−グルクロニダーゼ(GUS)及
び緑色蛍光タンパク質(GFP)、又はルシフェラーゼ(LUC)をコードするが、既知又
は従来未知である植物細胞中で発現かつ検出することができるあらゆるリポータ
ー核酸が本発明の植物フィトケラチンシンターゼ核酸に結合されてもよい。 更に、本発明はAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、又はCePCSを含むフィトケラ
チンシンターゼを含む単離された核酸、又はリポーター核酸に結合された配列番
号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、及び／又は配列番号９と少なくと
も15％の相同性を共有する核酸を含むトランスジェニック植物を含む。
【００６４】 リポーター遺伝子分析の基本的な原理はGUS方法により示されるが、これに限
定されない。簡単に言えば、植物細胞（その細胞が植物内に含まれるか、又は植
物から分離されるかを問わない）中のPCS発現を評価するために、PCSプロモータ
ー配列、又は組織特異性プロモーター配列に融合されたGUSリポーター遺伝子を
含むプラスミドが生成し得る。例えば、適当な制限断片がGUS発現ベクターpBI10
1.3（Jeffersonら, 1987, EMBO J., 6:3901-3907）にサブクローン化される。正
確な読み取り枠を配列決定により確認した後、アグロバクテリウム又はあらゆる
その他の好適なベクターが、発現構築物で形質転換され、次いで植物、又はその
細胞を形質転換するのに使用される（Valvekensら, 1988, Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 85:5536-5540）。 GUSの発現は5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-グルクロニド（X-Gluc; Je
ffersonらの上記文献）で染色することにより組織化学的に局在化し得る。切片
が植物から得られ、それらがX-Gluc中でインキュベートされ、エタノール中で沸
騰させることにより浄化され、顕微鏡で調べられる。細胞間のGUS反応生成物の
移入から生じる複雑さを排除又は列挙するために、GUS発現の分布がその後に免
疫学的かつ生化学的の両方で更に調べられる。β−グルクロニダーゼタンパク質
が通常のドット−ブロッティング技術及び免疫局在化技術（Harlowら, 1988, An
tibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY）を使用
してウサギ抗−β−グルクロニダーゼ血清（ClonTech, Inc., Palo Alto, CA）
を使用して評価される。GUS活性の直接の推定が外植体の切開及び抽出後に基質
として4-メチル-ウンベリフェリルグルクロニド（Jeffersonらの上記文献）を使
用して蛍光光度法により行なわれる。
【００６５】 又、本発明はフィトケラチンの生合成方法を含む。その方法はグルタチオン又
はその他のチオールペプチドからのフィトケラチンの生合成を可能にする条件下
で単離されたフィトケラチンシンターゼを充分な量のグルタチオン、又はグルタ
チオン関連チオールペプチドと接触させることを含む。 本明細書に使用される“充分な量”という用語は、検出可能な量のPC生合成が
このような生合成を典型的に可能にする条件下で生じることを可能にするグルタ
チオン、又はグルタチオン関連チオールペプチドの量を意味する。 グルタチオン又はその他の関連チオールペプチドからのフィトケラチンの生合
成を可能にする条件はペプチド間のγ−グルタミルシステイン単位の転移に必要
とされる化学的パラメーター及び物理的パラメーターである。このようなパラメ
ーターが、例えば、Grillら（1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6838-6
842）に示されており、それらはCdCl2の不在下又は存在下の約3.3 mM GSH、10 m
M 2-ME、及び200 mM トリス-HCl緩衝液(pH 8.0)の存在を含むが、これらに限定
されない。しかしながら、本発明はこれらの条件又はPC生合成に関するあらゆる
その他の特別な条件に限定されると見なされるべきではない。むしろ、本発明は
基質から別の分子へのγ−グルタミルシステイン単位の酵素的移入の検出可能な
レベルがあらゆる必要とされるイオン、基質及び／又はコファクターの存在下で
起こり得るあらゆる条件を含むと見なされるべきである。
【００６６】 本明細書に使用される“グルタチオン関連チオールペプチド”という用語は、
γ−グルタミルシステイン単位をそのペプチドから別の部分に、又はフィトケラ
チンシンターゼがγ−グルタミルシステイン単位を別の源から移入し得るものに
、移入するのにフィトケラチンシンターゼにより使用し得るあらゆるペプチドを
意味する。このようなGSH関連チオールペプチドとして、ホモグルタチオン、PC2 、PC3、及びPC4が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】 本明細書に使用される“生合成”という用語は、化合物を生成するために酵素
により媒介されるあらゆる真正の触媒反応を意味する。一実施態様において、生
合成は単離されたフィトケラチンシンターゼがGHSから別の関連チオールペプチ
ドへのγ−グルタミルシステイン単位の移入によりフィトケラチンを生成する酵
素反応である。しかしながら、本発明はin vitroで適当な緩衝系中で精製PCシン
ターゼ、GSH、又はγ−グルタミルシステイン単位のあらゆるその他の関連チオ
ールペプチド源、及び本明細書のいずれかに開示されたPCシンターゼ媒介PC生合
成を活性化するのに充分な濃度の重金属イオンの存在下で行なわれるPC生合成を
含む。精製PCシンターゼは約0.1μgから約0.1mg/mlまでの範囲の濃度で使用され
てもよく、GSH{又は、例えば、γ−グルタミルシステイン、PC2、PC3、もしくは
PC4、或いはホモ-GSH、ヒドロキシメチル-GSH（γ-Glu-Cys-Ser）、又はγ−グ
ルタミルシステイニルグルタミン酸（Zenkらの上記文献）}は約0.1μMから約50
mMまでの範囲の濃度で使用されてもよく、又重金属（例えば、Cd2+、Hg2+、Pb2+ 、As3+、Cu2+、Ni2+、又はZn2+）は約0.1μMから約500μMまでの範囲の濃度で使
用されてもよい。こうして、PC生合成は少なくともPCシンターゼ（例えば、AtPC
S1、AtPCS2、TaPCS1、SpPCS、又はCePCS）、GSH（γ−グルタミルシステインド
ナー又はアクセプターとして）、及び重金属活性剤を必要とする。本発明はいず
れかの特別なフィトケラチンの生合成又はγ−グルタミルシステイン単位がGSH
から誘導される反応に限定されると見なされるべきではない。むしろ、本発明は
PCシンターゼ分子により媒介されるあらゆる（γ-Glu-Cys）nポリマーの合成を
含むと見なされるべきである。
【００６８】 更に、本発明は生物学的抽出物からのPCシンターゼを使用するin vitroのPCの
生合成だけでなくin vivoで行なわれる生合成を含むことが意図されている。一
実施態様において、生合成は酵母細胞中でA.タリアーナPCシンターゼの異種発現
により行なわれる。別の実施態様において、生合成はS.セレビジエ酵母細胞中で
小麦PCシンターゼ（TaPCS1）又は酵母PCシンターゼ（SpPCS）の異種発現により
行なわれる。更に別の実施態様において、生合成は精製組換えSpPCSタンパク質
を使用してin vitroで行なわれる。本発明は適当な緩衝系中で精製PCシンターゼ
、GSH、又はγ−グルタミルシステイン単位のあらゆるその他の関連チオールペ
プチド源、及び本明細書に開示されたPCのPCシンターゼ触媒生合成を誘発するの
に充分な量のCdCl2の存在下でin vitroで行なわれるPC生合成を含む。
【００６９】 一実施態様において、単離されたフィトケラチンシンターゼタンパク質はAtPC
S1である。しかしながら、本発明はAtPCS1のみに限定されると見なされるべきで
はない。むしろ、本発明はPCシンターゼがAtPCS2（配列番号３及び配列番号４）
、TaPCS1（配列番号５及び配列番号６）、SpPCS（配列番号７及び配列番号８）
、及びCePCS（配列番号９及び配列番号10）を含むが、これらに限定されない、A
tPCS1（即ち、夫々配列番号１又は配列番号２）と核酸配列レベル又はアミノ酸
配列レベルで少なくとも約15％の配列相同性を共有するその他のフィトケラチン
シンターゼを含むと見なされるべきである。 又、本発明は一つのチオールペプチドから別のチオールペプチドにγ−グルタ
ミルシステイン単位を移入する方法を含み、前記方法は一つのチオールペプチド
から別のチオールペプチドへの前記γ−グルタミン単位の移入を可能にする条件
下で単離されたフィトケラチンシンターゼをグルタチオン、又は関連チオールペ
プチドと接触させ、それによりγ−グルタミルシステイン単位を一つのチオール
ペプチドから別のチオールペプチドに移入することを特徴とする。
【００７０】 本発明は植物の収穫可能な部分中の重金属のレベルの低減方法を含む。その方
法はフィトケラチンシンターゼをコードする核酸を植物の収穫できない部分中で
発現することを特徴とする。本明細書のいずれかに既に説明されたように、PCS
をコードする核酸の組織特異性発現はPCSをコードする核酸に共有結合された組
織特異性プロモーター配列を使用して行ない得る。このような組織特異性プロモ
ーターは当業界で公知である。 植物の収穫できない部分中のフィトケラチンシンターゼの発現は重金属をその
中に蓄積させ、それにより植物の収穫可能な部分中の重金属の量を低減する。植
物の収穫できない部分中のフィトケラチンシンターゼの発現はPCSをコードする
核酸を構成的プロモーター又は組織特異性プロモーターのいずれかのプロモータ
ーに機能し得る形で連結し、こうして機能し得る形で連結された核酸を植物の収
穫できない部分に導入することにより行ない得る。本明細書のいずれかに既に記
載されたように、適当なプロモーターの制御下にフィトケラチンシンターゼをコ
ードする核酸を含むトランスジェニック植物が生産され、それによりPCシンター
ゼをトランスジェニック植物の収穫できない部分中で選択的に発現させ得る。
【００７１】 こうして、当業者は、本明細書に示された開示に基づいて、植物の収穫できな
い部分中のPCSの発現が植物のその部分中の重金属の過剰蓄積をもたらし、それ
により植物の収穫可能な部分中の重金属のレベルの減少を含む植物中のほかの場
所の重金属のレベルを減少することを認めるであろう。 一局面において、植物の収穫可能な部分中の重金属のレベルはあらゆる内在性
フィトケラチンシンターゼの発現を植物の収穫可能な部分中で抑制することによ
り更に低減されるであろう。本明細書のいずれかに既に説明されたように、PCS
の発現を植物中で選択的に抑制するための方法は当業界で公知であり、アンチセ
ンス分子、リボザイム、VIGS、及び同時抑制技術の使用が挙げられるが、これら
に限定されない。これらの方法は植物の収穫可能な部分中のPCSの組織特異性抑
制を可能にする。こうして、フィトケラチンシンターゼをコードする核酸の発現
のレベルが植物の収穫できない部分中で増大され、このような部分中の重金属の
過剰蓄積を生じると同時に、同植物の収穫可能な部分中のフィトケラチンシンタ
ーゼの発現が抑制されて、植物の収穫可能な部分中に存在する重金属のレベルの
更なる低減を生じる。
【００７２】 又、本発明は地下水からの重金属の除去方法を含む。その方法は地下水中でフ
ィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を含むトランスジェニック
植物を生育することを特徴とする。それ故、植物が地下水から得られた重金属を
蓄積し、その結果、植物が地下水から収穫される時に、重金属が植物とともに除
去され、それにより重金属を地下水から除去する。 本発明が以下の実施例を参考にして更に詳しく記載される。これらの実施例は
説明のみの目的のために示され、特に明記しない限り、限定であることを目的と
しない。こうして、本発明は以下の実施例に限定されると何ら見なされるべきで
はないが、むしろ、本明細書に示された教示の結果として明らかになるありとあ
らゆる変化を含むと見なされるべきである。
【００７３】 （実施例）実施例１：アラビドプシスからのフィトケラチンシンターゼ この実施例に示される実験が以下のように要約し得る。 後翻訳合成されたタンパク質のクラスであるフィトケラチンは、植物及び菌類
中の重金属、主としてCd2+トレランスに重要な役割を果たす。PCは重金属をキレ
ート化し、それによりサンプル中のそれらの遊離濃度を低下する。γ−グルタミ
ルシステインジペプチジルトランスペプチダーゼ（即ち、フィトケラチンシンタ
ーゼ；EC 2.3.2.15）の作用によりグルタチオン及び関連チオールから誘導され
た、フィトケラチンはγ−グルタミルシステインの反復単位、続いてＣ末端Gly
、Ser又はβ-Ala{ポリ-(γ-Glu-Cys)n-Xaa}からなる。本明細書に開示されたデ
ータは、最初に、サッカロミセス・セレビジエ中で発現された時に重金属トレラ
ンスを増進し、Cd2+誘発フィトケラチン蓄積を促進する55 kDa可溶性タンパク質
をコードするアラビドプシス・タリアーナからの新規なcDNA（AtPCS1）の抑制ク
ローニングを実証する。これらの性質に基づいて、本明細書に開示されたデータ
はAtPCS1が酵素フィトケラチンシンターゼをコードすることを実証する。加えて
、本明細書に開示されたデータはin vitroのグルタチオンからの高速のCd2+活性
化フィトケラチン合成に関してイムノアフィニティー精製エピトープ標識AtPCS1
ポリペプチドの充分なことを実証し、更にAtPCS1が酵素フィトケラチンシンター
ゼをコードすることを支持した。 この実施例に示される実験に使用した物質及び方法が今記載される。
【００７４】 酵母株及び植物物質 ここに開示される実験に使用した酵母株は以下のとおりであった：yapIΔ変異
体SM12（MATαleu2-3,-112ura3-52his3-Δ200trpI-Δ901 lys2-801 suc2-ΔMel- yap1-Δ1::HIS3; Wemmieら, 1994, J. Biol. Chem. 269:14690-14697）; ycf1
Δ変異体DTY167 (MATαura3-52 leu2-3,-112 his-Δ200 trp1-Δ901 hys2-801 s
uc2-Δ9ycf1::hisG; Liら, 1996, J. Biol. Chem. 271:6509-6517)及びDTY168 (
MATαura3-52 leu2-3,-112 his6 ycf1::hisG; Szczypkaら, 1994, J. Biol. Che
m. 269:22853-22857); pep5Δ変異体DTY214 (MATαura3-52 leu2-3,-112 his3-
Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 suc-Δ9 pep5::LEU2); 及びcup1Δ変異体DTY4 (MAT
αura3-52 leu2-3,-112 trp1-1 gal1 his-cup1Δ::URA3; Hamerら, 1985, Scien
ce 228:685-690)。A.タリアーナ、品種コロンビアはMinetら（1992, Plant J. 2
:417-422）により記載されたpFL61 cDNAライブラリーの構築及びノーザンブロッ
ト分析に使用されたRNA、並びにサザンブロット分析に使用されたゲノムDNAの源
であった。
【００７５】 AtPCS1の単離 Cd2+過敏性を抑制することができる植物遺伝子を同定するために、S.セレビジ
エyap1Δ株SM12を酵母−エシェリキア・コリシャトルベクターpFL61（Minetら,
1992, Plant J. 2:417-422）中で構築されたアラビドプシスcDNAライブラリーで
形質転換した。安定なCd2+寛容性のUra+形質転換体を最初にSM12形質転換体を10
0μM CdCl2を含む合成の完全Ura培地に塗布することにより選択し、続いて200μ
M CdCl2を含む培地で複製した。この工程で同定された全ての105のCd2+寛容性SM
12形質転換体からのpFL61プラスミドを動員し（Strathern及びHiggins, 1991, M
ethods Enzymol. 194:319-329）、使用してS.セレビジエycf1Δ株DTY168を形質
転換し、Cd2+寛容性形質転換体を200μM CdCl2を含むAHC培地（Kimら, 1994, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:6128-6131）に塗布することにより選択した。
株SM12及びDTY168のCd2+過敏性を抑制することがわかった104のpFL61クローンの
うちのわずかに２種（それらの1.7 kbインサートが同じであることが測定された
）が、Cd2+トレランスの特に高いレベルを与えた。pFL61-AtPCS1と称される、こ
れらのうちの一種を機能分析した。
【００７６】 FLAG標識AtPCS1の異種発現 S.セレビジエ中で免疫反応性タンパク質を構成的に発現するために、最初にpF
L61-AtPCS1のAtPCS1 cDNAインサートをpYES2 (Invitrogen, Carlsbad, CA)の誘
導体であるpYES3ベクターにサブクローン化し、この場合、ガラクトース誘導酵
母GAL1遺伝子プロモーターを構成的3-ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)プロモ
ーター（GTTACATGCGTACACGCGTCTG;配列番号11；Luら, 1997, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 94:8243-8247）により置換し、製造業者（International Biotech
nologies, Inc., New Haven, CT）の指示により記載されたようにしてＣ末端FLA
G（DYKDDDDK; 配列番号12）エピトープ標識に融合されたAtPCS1をコードするよ
うに操作し、これは安定な翻訳産物を生じた。更に詳しくは、構築物をFLAGエピ
トープをコードする24 bp DNA配列及び方向性クローニングのためのSmaI制限部
位を含むように操作した（即ち、AAACAGCTGCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCCCGGGATA
GGCAGGAGC；FLAGコーディング配列が下線を施されている；配列番号13）。製造
業者（International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT）の指示により記
載されたようにして、抗FLAG抗体、例えば、モノクローナル抗体M2又はM5の使用
を伴う既知の免疫組織化学的方法を使用してAtPCS1-FLAG融合タンパク質のFLAG
オクタペプチド配列を検出した。
【００７７】 得られる構築物、pYES3-AtPCS1::FLAGの忠実度を配列決定により確認した後、
Giest及びSchiestl(1991, Yeast 7:253-263)により記載されたLiOAc/PEG方法を
使用して、S.セレビジエycf1Δ株DTY167をこの構築物又はAtPCS1::FLAGインサー
トを欠いているエンプティベクターで形質転換し、形質転換体をトリプトファン
を補給し、又は補給しないアンモニア／加水分解カゼイン(AHC)培地（0.17％(w/
v)のアミノ酸を含まない酵母窒素ベース、0.5％(w/v)の硫酸アンモニウム、１％
(w/v)の酸加水分解カゼイン、0.02％(w/v)のアデニンヘミスルフェート及び２％
(w/v)のグルコース；50 mM Mes-トリスを使用してpH 5.5に緩衝された）（Kimら
, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6128-6132）に塗布することによりウ
ラシルプロトトロフィーについて選択した。
【００７８】 細胞分別 AtPCS1-FLAGの局在化を調べるために、DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG又は対照DT
Y167/pYES3細胞を細胞壁消化、分断及び分画遠心分離による分別にかけた。200m
l容積の固定相培養液をトリプトファンを含む１リットルのAHC培地で希釈し、細
胞を16-18時間にわたって30℃で約1.0のA600nmまで増殖させた。細胞を遠心分離
により回収し、Luら（1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:8243-8247）に
より記載されたようにしてスフェロプラストに変換した。ドウンスホモジナイザ
ー中の１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド及び夫々１μg/mlのロイペプチ
ン、ペプスタチン及びアプロチニンを含む均一化媒体（10 mMトリス-HCl, pH 7.
6）中の均一化によるスフェロプラストの分断後に、粗細胞分解産物を4,000xgで
10分間の遠心分離により透明にした。100,000xgで１時間にわたる２回の最終遠
心分離後に、上澄み（可溶性フラクション）を凍結し、凍結乾燥により容積を減
少し、ペレット（膜フラクション）をプロテアーゼインヒビターを含む均一化緩
衝液1-2ml中で再懸濁させ、その後に液体窒素中で凍結し、-85℃で貯蔵した。PC
内容物及び可溶性フラクションのPC合成能力の研究及びAtPCS1-FLAGの精製のた
めに、均一化媒体がプロテアーゼインヒビターに加えて10 mM 2-ME、10％(v/v)
のグリセロール、及び50 mMトリス-HCl, pH 8.0を含んだ以外は、同じ様式で細
胞を分別した。
【００７９】 AtPCS1-FLAGの精製 AtPCS1-FLAGを、洗浄緩衝液（食塩加トリス緩衝液、TBS、150 mM NaCl、50 mM
トリス-HCl, pH 7.4）及び溶離緩衝液（0.1Mグリセリン-HCl, pH 3.5）の両方が
10％(v/v)グリセロールを含んでいた以外は、製造業者の推奨に従って抗FLAG M2
モノクローナル抗体アフィニティーゲルカラム（シグマ・ケミカル社、セントル
イス、MO）でDTY167/pYES3-AtPCS1-FLAG細胞の可溶性フラクションから精製した
。 AtPCS1-FLAGの平衡透析 Cd2+の結合を12時間にわたって４℃で2mlのミニ−コロジオン膜管（25,000の
分子量カットオフ；シュライヒェル・アンド・シュエル社、キーン、NH）中で0.
05〜20μMの109CdCl2（比活性22Ci/モル、アメルシャム・ファーマシア・バイオ
テク、ピスカタウェイ、NJ）を含む80ml容積の10 mMトリス-HCl緩衝液、pH 7.8
に対する精製AtPCS1-FLAGの400-800μl（160μg）の平衡透析により測定した。
透析管の外部のバルク培地の放射能及び透析管内の溶液の放射能を測定し、AtPC
S1-FLAGについて必然の109Cd放射能の増加を測定することにより、タンパク質結
合109Cdを推定した。結合定数及び結合の化学量論値を、バイオソフト（ファー
ガソン、MO）からのウルトラフィット非線形曲線フィッティングパッケージを使
用する非線形最小自乗分析（Marquardt, 1963, J. Soc. Ind. Appl. Math. 11:4
31-441）により推定した。
【００８０】 可溶性フラクション及び精製AtPCS1-FLAGのゲル濾過FPLC 109CdCl2を含む培地中の増殖後にDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG及びDTY167/pYES
3細胞から抽出された可溶性フラクション中の109Cdの分布の分析はスペローズTM 6HR10/30カラム（ファーマシアLKBバイオテクノロジー社、ピスカタウェイ、NJ
）による抽出物のFPLCによるものであった。グルコース及びトリプトファンを補
給したAHC培地で増殖された固定相培養物のアリコート100mlを、50μMの109CdCl 2 （比活性2.3Ci/モル）を含む新しい培地500ml容積で希釈し、細胞を30℃で更に
18時間増殖させた。可溶性フラクションのサンプル（1ml、1.2-1.8mgのタンパク
質）を本明細書のいずれかに既に記載されたようにして調製し、サンプルを氷の
上で10 mMジチオスレイトール(DTT)とともに30分間インキュベートし、次いでサ
ンプルをスペローズ-6カラムに適用した。カラムを0.3ml/分の流量で50 mMトリ
ス-HCl, pH 7.8で展開した。0.5mlのフラクションを回収し、カラムフラクショ
ン中に存在する109CdのレベルをBCS液体シンチレーションカクテル（アメルシャ
ム、アーリントンハイツ、IL）中の夫々のフラクションのアリコート（60μl）
をカウントすることにより測定した。AtPCS1-FLAGの分布を測定するために、カ
ラムフラクションのアリコートを本明細書のいずれかに記載されたようにしてSD
S-PAGE及びウェスタンブロット分析により分析した。５μMの109CdCl2（比活性2
.3Ci/モル）に対する平衡透析の前後のイムノアフィニティー精製AtPCS1-FLAG（
1ml、140-180μgのタンパク質）を同じ条件下でクロマトグラフィーにかけた。
【００８１】 PC及びPCシンターゼ活性の測定 細胞PC含量を、50μMのCdCl2を含み、又は欠いている液体培地中で増殖された
後のDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG又はDTY167/pYES3細胞から調製された可溶性フ
ラクションの逆相FPLCにより推定した。逆相FPLCについて、1-2mlの容積の抽出
物（2.3-4.6mgのタンパク質）を5-スルホサリチル酸で５％(w/v)にし、サンプル
を遠心分離し、その後に上澄みのアリコート（500μl）をPepRPC HR5/5 HPLCカ
ラム（ファーマシアLKBバイオテクノロジー社、ピスカタウェイ、NJ）に装填し
た。カラムを0.4ml/分の流量で水/0.1％(v/v)リン酸（溶媒Ａ）-アセトニトリル
/0.1％(v/v)リン酸（溶媒Ｂ）勾配で展開した。プログラムパラメーターは0-2分
、0-2％溶媒Ｂ；2-5分、２％溶媒Ｂ；5-33分、2-30％溶媒Ｂであった。カラムフ
ラクションのアリコート（100μl）をEllman（1959, Arch. Biochem. Biophys.
82:70-72）に記載されたように50 mMリン酸塩緩衝液、pH 7.6(DTNB)に溶解され
た0.4 mM 5,5'-ジチオ-ビス（2-ニトロ安息香酸）（900μl）と反応させること
により、チオールを412nmで分光分析で推定した。PC標準物質をOrtizら（1995,
J. Biol. Chem. 270:4721-4728）により記載されたようにCd2+増殖S.ポンベ（AT
CC38390）から抽出した。 PCシンターゼ活性をGrillら（1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6838
-6842）に従って粗可溶性フラクション（50μgのタンパク質）、精製AtPCS1-FLA
G（0.5μg）又は無タンパク質、3.3 mM GSH、10 mM 2-メルカプトエタノール及
び200 mM トリス-HCl緩衝液（pH 8.0）＋又は−200μMのCdCl2を含む反応媒体中
で37℃で40分間にわたってアッセイした。反応を５％(w/v) 5-スルホサリチル酸
で停止した後、PCを上澄み中で逆相FPLC及びDTNBとの反応により推定した。
【００８２】 アミノ酸分析 in vitroでAtPCS1-FLAGによりGSHから合成されたPCの鎖長を、逆相FPLCからの
適当なフラクションの酸加水分解後にそれらのGlu/Gly比（比＝ｎ＝Gly当りのGl
u-Cysリピートの数）を推定することにより測定した。フラクションのアリコー
トを熱分解法ガラス管中で乾燥させ、気相6N HCl中で110℃で20時間にわたって
加水分解し、その後にイオン交換クロマトグラフィー、O-フタルアルデヒドによ
る後カラム誘導体化及び蛍光検出（Udenfriendら, 1972, Science 178:871-874
）にかけた。
【００８３】 ノーザンブロット分析及びサザンブロット分析 アラビドプシス幼植物をガムボルグのB-5培地中で21日間にわたって生育し、
全RNA及びゲノムDNAをTRIzol R試薬（ギブコBRLライフ・テクノロジーズ、ガイ
ザースブルグ、MD）中で製造業者の推奨に従って根及び茎から抽出した。RNAサ
ンプル及び制限DNAサンプルを電気泳動し、ブロッティングし、通常の操作（Lu
ら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:8243-8247）によりAtPCS1のコー
ディング配列に相当する32P標識された、ランダムプライミングされた1.5 kb No
tI/SmaI制限断片とハイブリダイズした。 SDS-PAGE分析及びウェスタンブロット分析 タンパク質サンプルを変性緩衝液に溶解し、バイオ−ラド・ミニ−ゲル装置（
Kimら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:6128-6132）中で10％(w/v)
スラブゲルによる一次元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。直接タ
ンパク質検出のために、ゲルを銀染色プラス（バイオ−ラド・ラボラトリィズ、
リッチモンド、CA）で染色した。AtPCS1-FLAGの免疫検出のために、分離された
サンプルを電気移送し、通常の操作により抗FLAG M2抗体（シグマ・ケミカル社
、セントルイス、MO）で探査した。免疫反応性バンドをECLキット（アメーシャ
ム社、アーリントン・ハイツ、IL）で製造業者の指示に従って増進ケミルミネセ
ンス(ECL)検出により視覚化した。
【００８４】 タンパク質推定 タンパク質を色素結合方法（Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248-254）
により推定した。 薬品 一般試薬の全てをフィッシャー・サイエンティフィック（ピッツバーグ、PA）
、リサーチ・オーガニクス社（クリーブランド、OH）、又はシグマ・ケミカル社
（セントルイス、MO）から入手した。 この実施例に示された実験の結果が今記載される。
【００８５】 抑制クローニング PCシンターゼをコードする植物cDNAの単離はアラビドプシス酵母活性化タンパ
ク質１(YAP1)のような転写因子に関する酵母抑制スクリーンに基づいていた。簡
単に言えば、酵母（S.セレビジエ）カドミウム（耐性）因子遺伝子YCF1（ScYCF1
）（これはCd.GSH錯体としてのCd2+の液胞イオン封鎖を担うATP結合カセット(AB
C)トランスポーターをコードする）（Liら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S
.A. 94:42-47）はbZIP DNA結合タンパク質YAP1（Wemmieら, 1994, J. Biol. Che
m. 269:14690-14697）により転写活性化されるので、本明細書のいずれか（物質
及び方法を参照のこと）に既に記載された２工程スクリーニング操作を行なって
AtPCS1を単離した。即ち、最初に、S.セレビジエyap1Δ分断株SM12を酵母−エシ
ェリキア・コリシャトルベクターpFL61（Minetら, 1992, Plant J. 2:417-422）
中で構築されたアラビドプシスcDNAライブラリーで形質転換し、200μMのCdCl2
を含むYPD培地で増殖することができる形質転換体を選択した。次いで、Cd2+耐
性形質転換体からのpFL6プラスミドの動員を行ない、プラスミドを使用してS.セ
レビジエycflΔ分断株DTY168を形質転換した。200μMのCdCl2を含むAHC培地で増
殖することができるUra+形質転換体を選択した。
【００８６】 YAP1のような因子をコードするpFL61所有アラビドプシスcDNAはycflΔ変異体
ではなくyap1Δ変異体を抑制し、一方、YAP1の経路とは異なる経路により作用す
るCd2+耐性因子をコードするcDNAはyap1Δを抑制するだけでなく、ycflΔ変異体
を抑制することが推論された。 yap1Δを抑制した同定された合計105のCd2+耐性SM12形質転換体のうち、一種
のみがYAP1均等物の最小要件を満足するpFL61所有cDNAを宿し、即ち、cDNAは株D
TY168のCd2+過敏性を抑制しなかった。残りの104のSM12形質転換体の全てがpFL6
1プラスミドを宿し、第二工程で株DTY168のCd2+過敏性を抑制することができた
。これらのうち、二つの同じクローンを単離し、その他のクローンのいずれか一
つで形質転換されたDTY168細胞により寛容された濃度を良く越えるCd2+濃度に対
するトレランスを与えるそれらの能力のために更に特性決定した。 これらのクローンのcDNAインサートがそれらの末端を配列決定することにより
同じであることを測定した後に、一種のpF61-AtPCS1を更に調べた。
【００８７】 AtPCS1の配列特性 配列分析はpFL61-AtPCS1の1.7 kb cDNAインサート（配列番号１）のオープン
リーディングフレームがシゾサッカロミセス・ポンベ（受理番号Q10075）からの
GenBankデータベース中の仮定遺伝子産物に対し約33％の同一性（約48％の類似
性）及びセノルハブジチス・エレガンス（GenBank受理番号Z66513）からの仮定
遺伝子産物に対し約32％の同一性（約45％の類似性）を共有する55 kDaポリペプ
チド（配列番号２）をコードすることを証明した。AtPCS1は夫々379アミノ酸残
基及び366アミノ酸残基のオーバーラップでS.ポンベ及びC.エレガンスからのGen
Bank配列と相同性のこれらの領域を共有する（図１及び図９）。ポリペプチドの
どの対が比較されようとも、配列保存は予想アミノ酸配列のＣ末端ハーフよりも
Ｎ末端ハーフ中で大きかった。AtPCS1はAtPCS1残基1-241により含まれる配列中
で夫々46.7 kDa S.ポンベ遺伝子産物及び40.8 kDa C.エレガンス遺伝子産物に対
し44％及び45％同一（62％及び63％類似）であったが、AtPCS1残基266-241によ
り含まれる配列中でわずかに20％及び12％同一（40％及び37％類似）であった。
理論により縛られたくないが、AtPCS1は73-74アミノ酸残基Ｃ末端延長の所有に
よりその他の２種のポリペプチドとは区別できたが、AtPCS1はファミリー特異性
である位置49-68、70-91、152-165及び176-190に相当する配列を保存した。何と
ならば、これらの配列を使用するGenBankデータベースのBLAST検索がこれらの３
種の遺伝子産物を同定したが、その他の遺伝子産物を同定しなかったからである
。
【００８８】 アラビドプシスゲノムデータベースの検索はこの生物が少なくとも二つのAtPC
S遺伝子：P1クローンMRH10内に位置され、かつ染色体５のマーカーmi83に隣接し
てマップするAtPCS1（配列番号１）、及び染色体１にマップし、かつAtPCS1と約
70％より大きい配列同一性（約85％の類似性）を共有する演繹ポリペプチド（配
列番号４）をコードするBACクローンF21M11内に配置された別の遺伝子、公称AtP
CS2（配列番号３；GenBank受理番号AC003027、図17）を含むことを示した。制限
アラビドプシスゲノムDNAのサザンブロット分析はAtPCS1のコーディング配列で
探査された時に二つの、それより多くない、AtPCS様遺伝子を必要とするハイブ
リダイゼーションパターンを生じたので、AtPCS1及びAtPCS2はアラビドプシス中
のこの遺伝子ファミリーの唯一の代表であると推論される。 更に、高ストリンジェンシーノーザンブロット分析は生後21日のアラビドプシ
ス幼植物の根及び茎から抽出された全RNAとのランダムプライミングされた32P標
識AtPCS1 cDNAのハイブリダイゼーション後に単一の1.7 kbバンドを検出し（図
２）、pFL61-AtPCS1のcDNAインサートが完全長であり、かつcDNAライブラリーの
非植物汚染物質に由来するのではなくアラビドプシスに由来することを示した。
【００８９】 重金属トレランス AtPCS1の機能性能力を探査し、その翻訳産物を免疫検出可能にするために、At
PCS1::FLAG融合を酵母-E. coliシャトルベクターpYES3中で操作した。BLAST検索
はS.セレビジエ中でAtPCS1様配列を開示しなかったので、この生物は内在性オー
ソログからの干渉なしにAtPCS1の作用の様式を調べるのに適していると考えられ
た。 得られるpYES3-AtPCS1::FLAG構築物（及びそのＣ末端FLAGエピトープ標識翻訳
産物）がS.セレビジエycf1Δ分断株DTY167のCd2+過敏性を抑制するのにpFL61-At
PCS1及びpYES-AtPCS1と同じ効力があることを証明した後、更に広い範囲の金属
又はそれらの酸化物に対する感受性のpYES3-AtPCS1::FLAG依存性抑制をこの株及
びメタロチオネイン欠損Cu2+過敏性cup1Δ株DTY4中でスクリーニングした。 本明細書に開示されたデータはAtPCS1-FLAGが多特異性重金属耐性因子である
ことを実証する。即ち、プラスミド所有AtPCS1-FLAGはCd2+に対する強い耐性を
与えただけでなく、金属がpYES3エンプティベクター対照と較べて培養液中の増
殖の50％抑制を与える濃度の倍増を基準として、Cd2+（24倍）>>Cu2+（2.4）>As
O4 3-（1.8）>AsO2-（1.6）＝Hg2+（1.6）の総合ランク順序でAsO4 3-、AsO3 -、Cu 2+ 及びHg2+に対する適度の耐性を与えた（図３）。こうして、AtPCS1-FLAG（及
びAtPCS1）は未形質転換ycflΔDTY167又はcup1ΔDTY4株により寛容される濃度を
良く越えるカドミウムだけでなく、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、水銀、及び銅の濃度に対
する耐性を与える。
【００９０】 AtPCS1の細胞局在化 異種発現されたAtPCS1-FLAGは原形質膜又は液胞膜との会合によりサイトゾル
からの重金属の排除又は押出しを促進することによりトレランスを与えないこと
が明らかであった。AtPCS1-FLAGを発現する細胞は増進された、減少されなかっ
た重金属含量を示した。更に、液胞欠損pep5Δ株DTY214（これは金属イオン封鎖
のためのかなり大きな液胞区画の不在のためにCd2+過敏性である）（Liら, 1997
, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:42-47）は株DTY167とほぼ同じくpYES3AtP
CS1::FLAGによる抑制を受けやすかった。AtPCS1-FLAGは殆ど専らDTY167/pYES3-A
tPCS1::FLAG形質転換体の可溶性フラクションに局在化した。 機械分断されたDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAGスフェロプラストの分画遠心分離
は全抽出物を可溶性（上澄み）フラクション及び膜濃縮（ペレット化可能な）フ
ラクションに分割した。二つのフラクションのうちの、上澄みフラクションのみ
がSDS-PAGE及びウェスタンブロット分析後に認められるMr58,000の抗FLAG抗体反
応性ポリペプチドを生じた（図４）。回収された唯一の抗FLAG抗体反応性ポリペ
プチドの移動特性は正確にはAtPCS1::FLAGのコーディング配列から予想されたも
のであり、同じ様式のDTY167/pYES3陰性対照細胞の分別は可溶性フラクション又
は膜フラクション中に免疫反応性タンパク質を生じなかった（図４）。それ故、
DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞からの可溶性フラクション中のFLAGを有するバ
ンドはpYES3-AtPCS1::FLAGのcDNAインサートのみに由来すると推定された。
【００９１】 in vivo Cd2+結合 S.セレビジエ中で異種発現されたAtPCS1-FLAGが可溶性タンパク質であること
を測定したので、結合された重金属の量及び分布に関するAtPCS1の効果（存在す
る場合）を、DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞からの可溶性抽出物のクロマトグ
ラフィープロフィールを109CdCl2を含む液体培地中の増殖後にDTY167/pYES3対照
細胞からの可溶性抽出物のプロフィールと比較することにより評価した。これら
の分析の結果はAtPCS1-FLAGそれ自体が109Cd2+を結合するという最初の指示を与
えただけでなく、AtPCS1-FLAGが別の重金属結合因子に対して109Cd2+の結合の量
を増大し、かつ／又はその結合の程度を増大することを示した。
【００９２】 スペローズ-6 HR 10/30カラムによる109CdCl2増殖DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG
細胞からの可溶性フラクションのFPLCは109Cdの放射能の二つの主要ピーク及び
一つの小ピークを分割し、最高はフラクション34（ピーク１）、39（ピーク２）
及び43（ピーク３）に相当した（図５、主グラフ）。均等な109Cd放射能プロフ
ィールが109CdCl2増殖DTY167/pYES3-AtPCS1細胞からの可溶性フラクションにつ
いて得られ、FLAGエピトープ標識が109Cd2+結合に寄与しないことを実証した。
対照的に、同じ条件下で増殖されたDTY167/pYES3細胞からの可溶性フラクション
はピーク１の下で109Cd放射能の殆どを欠いていたが、ピーク２及び３は同じプ
ロフィールを有し、DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG抽出物中の相当するピークと同
じ位置で溶離した（図５）。DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG抽出物に特異なピーク
（ピーク１）はAtPCS1-FLAGへの109Cdの直接結合により完全に説明し得るという
概念と表面上は合致するが、精製AtPCS1-FLAGに関するカラムフラクション及び
実験の一層緊密な精査はこれがその場合ではないことを実証した。AtPCS1-FLAG
は高アフィニティー及び高能力でCd2+を結合したが、これは、単独では、DTY167
/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞抽出物のピークプロフィールを説明しなかった。
【００９３】 AtPCS1-FLAGのイムノアフィニティー精製 クロマトグラフィー特性及び金属結合特性を直接特定するために（最終的には
、酵素活性についてアッセイするために）、AtPCS1-FLAGを抗FLAG M2アフィニテ
ィーカラムによるイムノアフィニティークロマトグラフィーによりDTY167/pYES3
-AtPCS1::FLAG細胞の可溶性フラクションから精製した。クロマトグラフィーの
前後の可溶性フラクションのSDS-PAGE（タンパク質）分析及びウェスタンブロッ
ト(FLAG)分析はこの免疫精製操作が出発物質中のポリペプチドの電気泳動特性及
び免疫学的性質を保持する単一の抗FLAG抗体反応性のMr58,000タンパク質種を生
じることを実証した（図６）。
【００９４】 内因性結合及び外因性結合 109CdCl2濃度の範囲に対するイムノアフィニティー精製タンパク質の平衡透析
はAtPCS1-FLAGが高アフィニティー（0.54±0.20μMのKd）で高能力（7.09±0.94
の化学量論比）で109Cd2+を結合することを確かめた。しかしながら、総合の109 Cd2+放射能プロフィールへのAtPCS1-FLAGによる寄与と合致したが、AtPCS1-FLAG
（全抽出物中又は精製状態中を問わない）の内因性Cd2+結合活性はDTY167/pYES3
-AtPCS1::FLAG細胞抽出物中のピーク１の109Cd放射能プロフィールを充分に説明
するには不十分であった。DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞抽出物のクロマトグ
ラフィーからのフラクションのSDS-PAGE及びウェスタン分析は109Cd放射能に関
する最大（フラクション33-35）からのAtPCS1-FLAGポリペプチドに関する最大（
フラクション29-32）の一致した置換を実証したが、これは純粋な109Cd錯生成At
PCS1-FLAGでは模擬し得なかった。109CdCl2に対する平衡透析後の精製AtPCS1-FL
AGのクロマトグラフィーは最大（フラクション29-32）がDTY167/pYES3-AtPCS1::
FLAG抽出物中のAtPCS1-FLAGの最大と一致したAtPCS1-FLAGポリペプチド及び109C
d放射能の両方について厳密に重ねられるプロフィールを生じた（図５、挿入グ
ラフ）。これに基づいて、AtPCS1-FLAGはCd2+それ自体を結合するだけでなく、
低分子量の一種以上の金属結合因子の生成又は活性化を誘発すると結論された。
この解釈は二つの因子により強化された。第一に、Cd2+錯生成AtPCS1-FLAG及び
遊離AtPCS1-FLAGはスペローズ-6クロマトグラフィー中に同時溶離し、こうして
ピークプロフィールに寄与する因子としてのCd2+結合の結果としてのAtPCS1-FLA
Gの溶離特性の変化を排除した。第二に、AtPCS1-FLAG及び109Cd放射能最大のク
ロマトグラフィー置換がAtPCS1-FLAGからの結合された109Cdの部分解離及びDTY1
67/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞とDTY167/pYES3細胞の両方に共通の更に小さい既存
の因子へのその移入の結果であるスキームの非適用可能性を実証する実験による
。
【００９５】 PC生合成 Cd2+を結合し、低重量の金属リガンドの生成を刺激するAtPCS1の能力は、この
ような酵素が同じ性質、即ち、Cd2+により活性化された時にPCシンターゼを触媒
作用する容易さを顕著に有する点でPCシンターゼを示した。AtPCS1がPCシンター
ゼであるか、又は少なくともPC合成に寄与するかの研究を促進したAtPCS1とPCシ
ンターゼの間のその他の類似性は、以下のとおりであった。AtPCS1は55 kDaの計
算質量（図１）及び植物からの部分精製PCシンターゼ製剤（Grillら, 1989, Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6838-6842）の活性について50,000の見掛サブ
ユニットサイズと同等である58,000の電気泳動移動度（図４及び６）を有する。
更に、AtPCS1及びその同族体（図１）はPCシンターゼと同様に植物及びS.ポンベ
の両方中に見られる（Rauser, 1990, Annu. Rev. Biochem. 59:61-86; Zenk, 19
96, Gene 179:21-30）。加えて、AtPCS1は、PCシンターゼ活性の産物のように、
Cd2+に対する最大のトレランスを与えることができるが、又Cu2+の如きその他の
重金属に対するトレランスを与える（Rauserの上記文献；Zenkの上記文献）。更
に、pYES3-AtPCS1::FLAGによるGSH欠損S.セレビジエgsh2Δ変異体（その中で、G
SHシンターゼに関するコーディング配列が分断される）（Inoueら, 1998, Bioch
em. Biophys. Acta 1395:315-320）の形質転換はCd2+トレランスを与えず、AtPC
S1がPCシンターゼのようにGSHが利用できない限り有効ではないことを示唆する
。
【００９６】 PC生合成におけるAtPCS1の関与を三つのレベルで調べた。第一に、CdCl2増殖D
TY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞がCdCl2増殖DTY167/pYES3細胞と較べた場合に上
昇したPCレベルを含むか否か、含む場合には、PC蓄積がCd2+を含む培地中の増殖
を必要とするか否かを測定した。第二に、DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞から
の可溶性フラクションがDTY167/pYES3細胞からの可溶性フラクションと較べた場
合にin vitroのCd2+依存性PC合成について増大された能力を有するか否かを測定
した。第三に、精製AtPCS1-FLAGがGSHからのCd2+依存性PC合成を触媒作用するか
否かを測定した。研究した全てのレベルで、AtPCS1はPCシンターゼの特性の全て
を示した。 DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞はCd2+依存性様式でPCを蓄積した。CdCl2を含
む培地中の増殖後のDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞からの可溶性フラクション
中の非タンパク質チオール化合物の逆相FPLC分析はGSH/2-ME注入ピーク後に溶離
する多数のピークを明らかにし、その合計チオール含量は51ナノモル／mg抽出タ
ンパク質に相当した（図7A）。これらのピークのうちの二つの最も顕著なピーク
１及び２は４ナノモル／mgタンパク質に寄与し、S.ポンベから調製されたPC2及
びPC3標準物質と同じ位置で溶離した（図7A）。CdCl2増殖DTY167/pYES3細胞及び
Cd2+を欠いている培地中の増殖後のDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞からの相当
するフラクションは、GSH/2-メルカプトエタノール注入ピークと関連したもの以
外は、非タンパク質チオールを含んでいなかった。
【００９７】 プラスミド所有AtPCS1::FLAGの発現は抽出可能なPCシンターゼ活性の発生に必
要であったが、細胞内PC蓄積と違って、抽出の前にCd2+への細胞の暴露を必要と
しなかった。PCへのGSHのとり込みに関するCd2+の存在下及び不在下に増殖され
たDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞からの可溶性フラクションの能力のin vitro
アッセイは3.3 mM GSH及び200μM CdCl2を含む培地中でアッセイした場合に0.50
及び0.34ナノモル/mg/分の凝集物速度でPC2及びPC3の専らの合成を示した。DTY1
67/pYES3細胞からの相当するフラクションは、細胞がCd2+の存在下又は不在下で
増殖されたのかにかかわらず検出の限界（<0.01ナノモル/mg/分）より下の速度
を生じた。いずれの場合にも、Cd2+がアッセイ培地から省かれた場合にはPCシン
ターゼ活性が検出できず、PC合成のための重金属イオンに必要な要件を示した。
【００９８】 AtPCS1-FLAGはin vitroのGSHからのPCのCd2+依存性合成に充分であった。DTY1
67/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞からの可溶性フラクションのイムノアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製された単一のMr58,000ポリペプチド種（図６）は
夫々Cd2+の存在下及び不在下で30-35μモル/mg/分及び<0.01ナノモル/mg/分の凝
集物速度でPC2及びPC3へのGSHのとり込みを触媒作用した（図7B）。AtPCS1-FLAG
を欠いている対照反応混合物はPCを生じなかった。AtPCS1-FLAGが反応媒体中の
唯一のタンパク質種であること、またGSH、PC2及びPC3とのそれの反応の生成物
が定量アミノ酸分析により測定されて夫々2.1±0.1及び2.9±0.2のGlu/Gly比を
有することを考えると、AtPCS1がPC2を生成するために一つのGSH分子から別の分
子への、又はPC3を生成するために一つのGSH分子からPC2へのγ−グルタミルシ
ステイン単位の移入を触媒作用することができることが明らかであった。真正の
酵素触媒反応について予想されるように、PC2及びPC3の量は時間とともに線形に
増大して合成の速度と反応媒体に添加されたAtPCS1-FLAGの量の間の厳密な比例
関係を生じた。
【００９９】 本明細書に開示されたデータはアラビドプシスからの新規なcDNAであるAtPCS1
、及び、以下に更に充分に示されるような、T.エスチバム、S.ポンベ及びC.エレ
ガンスからのその同族体、並びにAtPCS2がPCシンターゼ：GSHからの高速のCd2+
活性化PC合成を可能にするCd2+結合酵素をコードすることを証明する。このよう
なものとして、AtPCS1のクローニング及びin vitro再構成がかなり重要である。
酵素学的には、AtPCS1-FLAGがpYES3-AtPCS1::FLAG形質転換酵母から単一工程で
明らかに均一になるまで精製できて植物からの従来の製剤（Grillら, 1989, Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6838-6842）の触媒活性を103倍以上越える触媒
活性を有するPCシンターゼ製剤を生じる容易さは、この酵素の詳細なメカニズム
研究及び結晶学的研究並びにミリグラムからグラム規模のin vitroのPCの容易な
生成を可能にするであろう。分子上は、AtPCS1が酵母中で活性状態で発現され、
選択可能な表現型を与えやすいということは、部位誘導アプローチ及びランダム
突然変異誘発アプローチの両方の適用によりAtPCS1触媒PC合成の構造要件を探査
するための基礎を与える。進化的には、S.ポンベ中のPCシンターゼの存在はその
生物におけるPCをベースとする金属トレランスを広範に研究する従来技術（Raus
erの上記文献, 1990; Zenkの上記文献, 1996）により示唆された。それにもかか
わらず、本発明の前に、S.ポンベからPCシンターゼを同定し、単離しようとする
全ての従来の試みは失敗していた。更に、C.エレガンスのゲノム中のAtPCS1同族
体の発見はそれが少なくとも或る動物の金属ホメオスタシスにおけるGSH及びMT
だけでなくPCの役割を誘発する点で全く驚くべきことであった。遺伝的には、PC
シンターゼをコードする単離された遺伝子の現在容易な利用可能性及びコアー触
媒作用の再生に関する単一遺伝子産物の実証された充分なことは、植物及びその
他の生物が重金属を解毒するメカニズムについての研究を促進するであろう。
【０１００】 加えて、本明細書のいずれかに既に記述されたように、生物改善（即ち、環境
浄化のための生体内異物の抽出及び／又は分解のための、生物、通常植物又は微
生物の使用）は通常の物理的方法及び化学的方法（Cunninghamら, 1995, Trends
Biotechnol. 13:393-397）との比較によりその潜在的に低いコスト及び支障の
ない性質のためにかなりの関心を引きつけていた。生物改善の異なる選択肢のう
ち、植物改善は植物が従来の技術を使用して収穫し得る容易さのために生分解し
得ない重金属の如き汚染物質について特に魅力的である。それ故、米国スーパー
ファンド部位に関する上位20の有害物質についてのASTDR/EPA優先リストの１番
目、３番目及び７番目にランクされた物質、即ち、ヒ素、水銀及びカドミウムの
夫々に対する耐性を与える異種発現されたAtPCS1の能力は特に顕著である（URL
http://www.atsdr.cdc.gov:8080/97list.html, 1997 CERCLA Priority List of
Hazardous Substances, n=275, 1999年３月25日にアクセスした）。これらの有
害物質に対する耐性を与えるAtPCS1の能力及び多くのCd2+寛容性植物細胞系中で
、この金属の少なくとも90％がCd.PC錯体として蓄積されるという事実（Rauser,
1990, Annu. Rev. Biochem. 59:61-86; Zenk, 1996, Gene 179:21-30）は、AtP
CS1及び同様の遺伝子が重金属過剰蓄積に関する植物の能力の遺伝子操作により
植物改善技術の開発に用途があり得ることを示す。
【０１０１】実施例２：小麦及び酵母からのフィトケラチンシンターゼ この実施例に示された実験は以下のように要約し得る。 フィトケラチンは植物及び菌類における金属解毒に重要な役割を果たす。しか
しながら、本発明の前に、フィトケラチンシンターゼをコードする遺伝子は同定
されていなかった。金属トレランスを媒介する植物遺伝子についてスクリーニン
グすることにより、小麦（トリチカム・エスチバム）cDNA、TaPCS1（サッカロミ
セス・セレビジエ（S.セレビジエ）中のその発現がカドミウムトレランスの著し
い増大をもたらす）を同定した。TaPCS1は既知の機能のタンパク質との類似性を
有しない約55 kDaのタンパク質（配列番号６；図９）をコードする。この新規な
遺伝子ファミリーの同族体をアラビドプシス・タリアーナ（A.タリアーナ）、シ
ゾサッカロミセス・ポンベ（S.ポンベ）、そしてまた重要なことには線虫セノル
ハブジチス・エレガンス（C.エレガンス）から同定した。又、アラビドプシス遺
伝子及びS.ポンベ遺伝子が酵母における金属トレランスの実質的な増大を与える
ことを実証した。PCS発現酵母細胞は対照細胞よりもCd2+を蓄積する。更に、PCS
発現は液胞酸性化に不十分であり、又は液胞生合成が損なわれている酵母変異体
でさえもCd2+トレランスを媒介する。PCS誘導金属耐性はフィトケラチン生成に
必要なプロセスである、グルタチオン生合成のインヒビターへの暴露後に失われ
る。PCS遺伝子中で分断されたS.ポンベ細胞はCd2+及びCuに対する過敏性を示し
、HPLC分析により測定してCd2+暴露後にフィトケラチンを合成することができな
い。PCSを発現するS.セレビジエ細胞はフィトケラチンを生成する。更に、組換
え体精製S.ポンベPCSタンパク質はフィトケラチンシンターゼ活性を示す。これ
らのデータはPCS遺伝子がフィトケラチンシンターゼをコードし、真核生物中で
金属解毒を媒介することを実証する。 この実施例に示される実験に使用した物質及び方法が今記載される。
【０１０２】 酵母培養物、形質転換及び増殖アッセイ S.セレビジエ株CY162（MATαura3-52 trk1Δhis3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK
64; Andersonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3736-3740）、INVS
c1（MATαhis3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-62）、SEY6210（MATαleu2-3, 112 Ura3
-52 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9）、Δvps-18（Robinsonら, 199
1, Mol. Cell. Biol. 11:5813-5824）及びΔvma4（Hoら, 1993, J. Biol. Chem.
268:221-227）、並びにS.ポンベ株FY254（h-ade6-M210 leu1-32 ura4-Δ18 can
1-1）及びFY261（h+ ade6-M216 leu1-32 ura4-Δ18 can1-1）を使用した。S.セ
レビジエ細胞を適当なアミノ酸で補給された酵母窒素ベース(YNB)又はアルギニ
ン-リン酸塩培地（Rodrigues-Navarro及びRamos, 1984, J. Bacteriol. 159:940
-945）中で増殖した。S.ポンベ細胞を適当に補給された酵母エキス培地(YE)又は
エジンバーフ最小培地（EMM; Mitchison, 1970, Methods in Cell Physiology,
4巻, 131頁, Prescott編集, Academic Press, New York; Nurse, 1975, Nature
256:457-451）中で増殖させた。S.セレビジエを使用する増殖アッセイを既に記
載されたように行なった（Clemensら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 9
5:12043-12048）。異なるCd2+濃度の存在下のS.ポンベの増殖をEMMプレートの上
及びEMM液体培地中でアッセイした。
【０１０３】 ライブラリースクリーニング CY162細胞（Andersonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3736-374
0）を、Gietz及びSchiestl（1995, Meth. Mol. Cell. Biol. 5:255-269）により
記載された酢酸リチウム方法に従って小麦幼植物の根先端からのmRNAを使用して
構築された酵母発現ライブラリー（Schachtman及びSchroeder, 1994, Nature 37
0:655-658）のサイズ選択された（約1.5 kbより大きい）フラクションで形質転
換した。形質転換体を最初にYNB-uraでウラシルプロトトロフィーについて選択
し、次いで細胞を20又は50μMのCdCl2を含むアルギニン-リン酸塩液体培地に移
した。2-4日後に、DNAを飽和培養液から抽出し、E. coli細胞を形質転換した。
制限消化及び核酸配列決定を使用して、フラスコ当り数個のコロニーを更に分析
した。
【０１０４】 DNA操作 E. coli 株DH5αを全てのDNA操作に使用した。誘導発現ベクターpYES2（イン
ビトロゲン、ラ・ジョラ、CA）又は構成的発現ベクターpYX132（Ｒ＆Ｄシステム
ズ、アビンドン、UK）を使用して、核酸をS.セレビジエ中で発現した。 ABI370自動シーケンサーで、又はシーケナーゼ（米国バイオケミカル社、クリ
ーブランド、OH）を使用して、DNA配列決定を行なった。 PCR及びサザン分析を確立された操作（Ausubelら, 1997, Current Protocols
in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New
York）に従って行なった。BLAST（Altschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-
410）を使用してGenBankデータベース内で検索することにより、相同配列を同定
した。 アミノ酸配列を推定トランスメンブランスパンの存在についてTMPred（Hofman
n及びStoffel, 1993, Biol. Chem. 347:166）で分析した。CLUSTAL W多重配列ア
ライメントプログラム（Thompsonら, 1994, Nuc. Acids Res. 22:4673-4680）を
使用して、アライメントを行なった。
【０１０５】 発現分析 Cd2+の存在下及び不在下で増殖された小麦及びアラビドプシス植物細胞からの
RNAのノーザン分析を確立された操作（Ausubelら, 1987, Current protocols in
molecular biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New Y
ork）に従って行なった。RT-PCRについて、RNAを未処理又は100μMのCd2+で６時
間処理された生後４日の小麦植物から単離した。RNAを根及び茎から別々に単離
した。cDNAサイクルキット（インビトロゲン、ラ・ジョラ、CA）を使用して、第
一ストランドcDNAをこれらのRNAサンプルから合成した。cDNA 10ngをPCR反応当
り使用した。競合PCRについて、RT-PCRアッセイと同じプライマー対を使用して
、小麦ゲノムDNAから増幅されたPCR断片をクローン化した。イントロンの存在の
ために、この断片はcDNAから増幅された断片より約100bp長く、この長い断片をP
CR反応における競合物質として使用した。競合物質DNAを0.1〜5fgの間の種々の
量でPCR反応に添加した。94℃で30秒、55℃で２分間、そして72℃で１分間の32
サイクルを使用して、PCR反応を行った。アガロースゲル電気泳動を使用して、P
CR産物を分析した。
【０１０６】 Cd2+蓄積 S.セレビジエ細胞を、0.5μCiの109Cd2+を含むCdCl2の種々の量の存在下で24
時間にわたってアルギニン-リン酸塩培地中で増殖した。細胞を回収し、洗浄し
た。放射能を既に記載されたようにして測定した（Clemensら, 1998, Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 95:12043-12048）。 S.ポンベノックアウト SpPCSの内部XbaI/HindIII断片をpYES2にサブクローン化した。部位誘導突然変
異誘発を使用して、BamHI部位及びSacI部位をこの構築物に導入した。pTZura中
のura4マーカーのBamHI/SacI断片を突然変異したSpPCS構築物にクローン化した
。LiAc操作（Okazakiら, 1990, Nucleic Acids Res. 25:6485-6489）を使用して
、S.ポンベ株FY254を線状にされたノックアウト構築物0.5μgで形質転換した。
形質転換体を、uraを省いた必要とされる全ての補給物を含むEMMで選択した。25
種の形質転換体を選択し、SpPCSの分断についてサザンブロッティングにより分
析した。SpPCS遺伝子の分断を含む形質転換体をura4遺伝子中のEcoRV部位による
第二バンドの出現により同定した。ノックアウト構築物の非相同挿入はSpPCSプ
ローブとハイブリダイズする第三バンドをもたらした。
【０１０７】 フィトケラチンアッセイ フィトケラチンを実質的に記載されたようにしてアッセイした（Fahey及びNew
ton, 1987, Meth. Enzymol. 143:85-97）。簡単に言えば、S.ポンベ及びS.セレ
ビジエ細胞を中間対数期（夫々、EMM-ura、YNB-ura中）まで増殖し、100μMのCd 2+ で処理した。Cd2+添加６時間後に、細胞を回収し、それらを凍結乾燥した。凍
結乾燥された物質1-5mgを0.1％のTFAで抽出し、サンプルを遠心分離し、上澄み
を45℃で暗所でモノブロモビマンで誘導体化した。アセトニトリル勾配を使用し
て、抽出物をC18カラム（３μM、150mm）によるHPLCにより分離した。SHを含む
化合物を蛍光測定により検出した。フィトケラチンの同定のために、N-α-Fmoc-
L-グルタミン酸α-ブチルエステル（ノババイオケム、ラウフェルフィンゲン、
スイス）を使用して、（γ-EC）2G（＝PC2）、（γ-EC）3G（＝PC3）及び（γ-E
C）4（＝PC4）標準物質をアビメド（ランゲンフェルド、ドイツ）エコノミー・
ペプチド合成装置EPS211で合成した。
【０１０８】 S.ポンベからのタンパク質抽出 タンパク質を実質的に記載されたようにしてEMM中で中間対数期まで増殖され
たS.ポンベ培養物から抽出した（Hayashiら, 1991, Biochem. Cell Biol. 69:11
5-121）。簡単に言えば、細胞を遠心分離により回収した。細胞ペレットを液体N 2 中で凍結し、３倍容積の石英砂を使用して冷却乳鉢中で粉砕した。50 mM トリ
ス-Cl, pH 8.0、10％のグリセロール、150 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM PMSF、10
μMのロイペプチンによる抽出及び10,000 x gで15分間の遠心分離後に、硫酸ア
ンモニウムを75％飽和まで上澄みに添加した。30分後に、沈殿を18,000 x gで15
分間の遠心分離により回収し、25 mM トリス-Cl (pH 8.0)、10％のグリセロール
、及び1 mM DTTに溶解した。 フィトケラチンシンターゼアッセイ 粗抽出物又はカラムフラクションのアリコートを200 mM トリス-Cl (pH 8.0)
、1 mM DTT、1 mM GSH（全容積100μl）中でインキュベートした。そのアッセイ
混合物を氷の上に５分間保った。CdCl2を0.1 mMの最終濃度まで添加し、サンプ
ルを35℃で30-120分間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に
、アリコート50μlを採取し、TFAを５％の濃度まで添加した。氷の上で10分間の
インキュベーション及び13,000 x gで10分間の遠心分離後に、上澄みのアリコー
トを上記のようにモノブロモビマンで誘導体化し、HPLCにより分析した。
【０１０９】 HA標識SpPCSの精製 ノックアウト株を使用して、SpPCSをpSGP73にサブクローン化してＮ末端HA標
識を有するSpPCSタンパク質を発現した。ロイシン及びウラシルを含まないEMM中
で中間対数期まで増殖されたSpPCS-HA発現細胞の培養液200mlからの粗抽出物をH
A-モノクローナル抗体アフィニティーマトリックススラリー（BAbCo、バークレ
イ、CA）600μlとともに４℃で軽度の振とう下でインキュベートした。３時間後
、混合物をカラムに移し、マトリックスを沈降させた。続いて、カラムを20mlの
50 mM トリス-Cl, pH 8.0、10％のグリセロール、150 mM NaCl、1 mM DTTで洗浄
した。HA標識タンパク質を30℃で溶離し、HAペプチド5mgを洗浄緩衝液5mlに溶解
した。確立された操作（Ausubelらの上記文献, 1997）を使用して、タンパク質
フラクションをSDS-PAGE続いて銀染色及びウェスタンブロッティングにより分析
した。 この実施例に示された実験の結果が今記載される。
【０１１０】 TaPCS1のクローニング スクリーニングアッセイを使用して細胞Cd2+トレランスを与える植物遺伝子を
同定した。酵母細胞をサイズ選択された（約1.5 kbより大きい）小麦根ライブラ
リー（Schachman及びSchroeder, 1994, Nature 370:655-658）で形質転換し、約
1 x 106の独立の形質転換体に相当する2 x 107の細胞を20又は50μMのCd2+を含
むアルギニン-リン酸塩液体培地50mlに添加した。これらのCd2+濃度はアルギニ
ン-リン酸塩培地中では酵母細胞に増殖抑制性である。しかしながら、液体培養
物を2-4日以内に増殖飽和させた。飽和後に、生存している酵母細胞アリコート
を採取し、DNAをこれらの生存物から抽出し、E. coli形質転換後に、生存物のpY
ES2インサートを分析した。 同培養物からの全てのインサートが同じ制限パターンを示し、液体培養物が同
小麦cDNAを含む酵母細胞の一つ又は少数から出発して飽和まで増殖することを示
した。このスクリーンの６種の液体培養物（新たに形質転換された細胞による２
回の繰り返しを含んでいた）では、5'未翻訳領域（UTR）の長さのみを異にする
単一cDNAをクローン化した。そのcDNAを最初にCdR（Cd2+耐性のため）と称した
が、更なる特性決定後に、その核酸をトリチカム・エスチバムフィトケラチン合
成（Triticum aestivum phytochelatin synthesis）におけるその機能のためにT
aPCS1と称した。
【０１１１】 TaPCS1発現はS.セレビジエを更にCd2+寛容性にする TaPCS1発現はS.セレビジエ細胞のCd2+トレランスの著しい増大を媒介した。Ta
PCS1発現細胞はエンプティpYESプラスミドを宿している対照細胞の増殖を完全に
抑制するCd2+濃度の存在下で飽和まで増殖した（図8A）。用量−応答分析はTaPC
S1発現細胞が対照細胞よりも15倍高いCd2+濃度を寛容することを実証した（図8B
）{K0.5（TaPCS1）＝90μMのCd2+；K0.5（対照）＝６μMのCd2+}。誘発物質ガラ
クトースの不在下で増殖されたTaPCS1発現細胞は又Cd2+トレランスの強い程度を
示し、低レベルのTaPCS1がCd2+耐性に充分であることを示唆し、TaPCS1への金属
の直接結合によるトレランスではなく、Cd2+トレランスを媒介するTaPCS1の触媒
の役割を示した（図8C）。炭素源としてグルコース（これはGAL1プロモーターを
抑制する）を用いたとしても、増殖のわずかな増進がTaPCS1を含む細胞中で見ら
れ、TaPCS1の触媒活性を更に示唆した。
【０１１２】 配列分析及びTaPCS1同族体 TaPCS1オープンリーディングフレーム（ORF；GenBank受理番号AF093752）は55
kDaの予想質量のポリペプチドをコードする（図9A）。その演繹アミノ酸配列（
配列番号６；図9A）は既知の機能のいずれのタンパク質にも相同性を示さない。
しかしながら、相同性がアラビドプシス・タリアーナEST G11G3T7（GenBank W43
439）、シゾサッカロミセス・ポンベ仮定46.7 kDaタンパク質C3H1.10（GenBank
Z68144）、及びセノルハブジチス・エレガンスORF F54D5.1（GenBank Z66513）
について見られた。これらの配列は夫々アミノ酸レベルで55％、28％、及び32％
同じである（図9A）。こうして、TaPCS1及びその同族体は新しい遺伝子ファミリ
ーを構成する。又、アラビドプシス（AtPCS1）及びS.ポンベ（SpPCS）からの同
族体はS.セレビジエ中で発現された時に強いCd2+トレランスを与える（図9B）。
アラビドプシスにおける低ストリンジェンシーDNAゲルブロット分析は一種より
多いAtPCS同族体の存在を示唆する（上記実施例１を参照のこと）。しばらくし
て、PCS遺伝子に相同性を有する第二アラビドプシス遺伝子（AtPCS2、GenBank A
C003027、実施例１を参照のこと）及び第二C.エレガンス遺伝子（GenBank AL023
633）がゲノム配列決定努力により同定された。
【０１１３】 TaPCS1がCd2+蓄積の増大を媒介する Cd2+トレランスの基礎となる一つの可能なメカニズムは多くの細菌で観察され
るようなCd2+イオンの外向きフラックスである（Silver及びPhung, 1996, Annu.
Rev. Microbiol. 50:753-789）。対照細胞の増殖でさえも有意に影響しないCd2 + 濃度で増殖された対照細胞及びTaPCS1発現細胞によるCd2+の蓄積を測定するこ
とにより、この可能性を調べた。図10に示されるように、TaPCS1発現は24時間の
培養期間中に約30-50％のCd2+蓄積の増大をもたらした(n=3)。同様の結果がアラ
ビドプシス同族体について観察された(n=2)。これらのデータはPCS依存性Cd2+キ
レート化又は金属イオン封鎖の支持の証拠である。
【０１１４】 TaPCS1は液胞変異体にもCd2+トレランスを与える 液胞へのCd2+及びその他の重金属イオンの封鎖は解毒の良く特性決定されたメ
カニズムである（Reaら, 1998, Plant Mol. Biol. 49:727-760）。液胞へのCd-
フィトケラチン錯体の輸送に平行して機能する植物に関する一つの仮定された経
路はCd2+/H+交換体である（Salt及びWagner, 1993, J. Biol. Chem. 268:12297-
12302）。TaPCS1がこのプロセスに関係するか否かを測定するために、TaPCS1を
Δvma4株（これは機能性液胞ATPaseを欠いており、それ故、Cd2+/H+交換体によ
るCd2+吸収に必要とされるpH勾配を確立することができない（Hoら, 1993, J. B
iol. Chem. 268:221-227））中で発現させた。Δvma4及び親株による増殖アッセ
イはTaPCS1が依然としてCd2+トレランスを与えることを示した(n=3)。更に、TaP
CS1を酵母株Δvps18（これは正常な液胞に形態上似ている構造を形成することが
できない（Robinsonら, 1991, Mol. Cell. Biol. 11:5813-5824））中で発現さ
せた。この株は親株よりも有意にCd2+に感受性である（図11、○）。重要なこと
に、TaPCS1発現はCd2+トレランスの強い増大を再度もたらした（図11、●）。
【０１１５】 SpPCS欠失が金属感受性をもたらす PCS遺伝子の生理学的役割を更に直接に調べるために、SpPCSの欠失変異体、Δ
SpPCSをS.ポンベ中で生成した。最初に、S.ポンベゲノムDNAのサザン分析を行な
って付加的なPCS同族体について検索した。低ストリンジェンシー条件下で、SpP
CSに相同の配列の指示を検出することができず（図12A）、SpPCSがこの生物にお
ける単一コピー遺伝子であることを実証した。続いて、SpPCS遺伝子をura4マー
カーを使用する１工程遺伝子分断により欠失した。SpPCS遺伝子の分断を含むS.
ポンベ（ΔSpPCS）のCd2+感受性を種々のCd2+濃度を含む培地中で試験した。対
照について、エンプティプラスミドpTZura4で形質転換された株及びノックアウ
ト構築物(Sp3)の非相同組込みによる形質転換体を分析した。Cd2+の不在下では
、ノックアウト株は正常に増殖した（図12B）。ノックアウト株の増殖は区別で
きなかった２種の異なる対照株の増殖よりもCd2+により強く抑制された（図12B
）。又、ノックアウト株の増殖は銅に対し対照株よりも感受性であり（図12C）
、Cu2+に対する耐性におけるSpPCSの役割を実証した。
【０１１６】 PCS遺伝子はフィトケラチン合成に関係する Cd2+イオン封鎖におけるPCS遺伝子の触媒の役割を示す知見（図8C）はフィト
ケラチン合成におけるPCS遺伝子ファミリーに可能な役割を示唆した。グルタチ
オンはフィトケラチン合成に必要とされる前駆体である（Grillら, 1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:6838-6842）。グルタチオン生合成インヒビターBSO
（L-ブチオニン-スルホキシム）によるTaPCS1発現S.セレビジエの前処理は用量
依存様式でTaPCS1媒介Cd2+トレランスを低下した（図13A；●）。対照では、ア
ラビドプシスメタロチオネインの発現はメタロチオネイン依存性Cd2+トレランス
に関するBSOの効果を示さなかった（図13A、■）。TaPCS1発現細胞はわずかに60
μMのCd2+におけるメタロチオネイン発現細胞の増殖速度よりも有意に高い200μ
MのCd2+における増殖速度を示した（図13A）。 野生型S.ポンベ細胞（対照）及びΔSpPCS株を蛍光HPLCによりCd2+暴露後のフ
ィトケラチン合成について分析した。合成されたフィトケラチン標準物質、PC2
及びPC3と同じ保持時間を示すピークを野生型細胞からの抽出物で検出したが（
図13B、上部パネル、ピーク１及び２）、ΔSpPCS細胞からの抽出物には不在であ
った（図13B、下部パネル）。こうして、S.ポンベノックアウトの増大されたCd2 + 感受性はフィトケラチン合成の欠失と相関関係がある。更に、TaPCS1発現S.セ
レビジエ細胞はCd2+処理後に化合物を合成し（図13C、上部パネル）、これは野
生型細胞中で生成されなかった（図13C、下部パネル）。これらの化合物はS.セ
レビジエ対照では観察されなかったPC2及びPC3と同じ保持時間を示し、TaPCS1発
現が通常PCを生成しないと提案された生物（Rauser, 1995, Plant Physiol. 109
:1141-1149）中でPCの合成を誘発するのに充分であることを実証した。又、TaPC
S1発現細胞中のPC合成はCu2+又はZn2+による処理により誘発し得る。
【０１１７】 PCSタンパク質はフィトケラチン合成を触媒作用する S.ポンベマーカー形質転換細胞及びΔSpPCS細胞からの粗抽出物を用いるPCS酵
素アッセイはノックアウト株がPCS活性を欠くことを実証した（図14A、下部パネ
ル）。対照細胞からの抽出物では、グルタチオンからのPC2生成が、精製酵素製
剤を使用する先の論文（Grillら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6838-
6842; Hayashiら, 1991, Biochem. Cell Biol. 69:115-121）と同様に明らかに
検出できた（図14A、上部パネル）。こうして、PCSタンパク質がフィトケラチン
合成を触媒作用することを直接実証するために、ΔSpPCS株は標識SpPCSタンパク
質の発現に適したバックグラウンドを与えた。Ｎ末端血球凝集素(HA)標識を含む
SpPCS（SpPCS-HA）をノックアウト株中で発現させ、この構築物は金属トレラン
ス、PCS酵素活性、並びにPC2及びPC3を生成する能力を回復する。HA標識SpPCSタ
ンパク質を発現する細胞からの抽出物のウェスタンブロットはSpPCSの予想分子
量に相当する、約46 kDaでバンドを示し、これはモノクローナル抗HA抗体（BAbC
o、バークレイ、CA；図14B、左レーン）により認識される。シグナルがエンプテ
ィpSGP73プラスミドを含む対照細胞からの抽出物中で検出されなかった（図14B
、右レーン）。
【０１１８】 セファロースに結合されたモノクローナルHA抗体（BAbCo、バークレイ、CA）
を使用して、SpPCS-HAを精製した。合成されたHAペプチド（YPYDVPDYA）ととも
に溶離されたフラクションをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し
た。ゲルの銀染色は二つのバンド、約46 kDaにある一つのバンド（SpPCS-HA発現
細胞の抽出物から検出された抗HA免疫反応性バンドについて見られたものと同じ
）、及び約30 kDaの低分子量バンドを示した（図14C、左パネル）。溶離液フラ
クションのウェスタンブロット分析は抗HA抗体に対する両方のポリペプチドの交
差反応性を示した（図14C、右パネル）。このバンドがSpPCS-HA発現細胞及び対
照細胞の分解産物から検出されなかったという事実（図14B）と組み合わされて
、抗HA抗体による30 kDaタンパク質の認識は、理論により束縛されたくないが、
そのポリペプチドが精製中に生じたかもしれない46 kDaのタンパク質のタンパク
質分解産物に相当することを示唆する。 ペプチド溶離物のアリコートをPCS酵素活性について更に分析した。図14Dに示
されるように、モノブロモビマン誘導体化反応生成物のHPLC分析はグルタチオン
及びCd2+からのPC2に相当するピークの形成を示し、それによりSpPCS-HAを含む
フラクション中のPCS酵素活性を示す。
【０１１９】 TaPCS1は構成的であり、Cd2+により増進される TaPCS1 mRNAは小麦根mRNAのRNAブロット分析により検出し得なかった。TaPCS1
遺伝子が小麦幼植物中で転写されるか否かを測定するために、TaPCS1特異性プラ
イマーを使用してRT-PCR分析を行なった。予想サイズの断片が根（図15、上部パ
ネル）及び茎サンプルの両方について検出できた。又、アラビドプシス中のAtPC
S1の発現をRT-PCRにより分析した。アラビドプシスにおける結果はTaPCS1につい
て見られた結果と同じであり、TaPCS1及びAtPCS1の両方がin vivoで転写される
ことを実証した。Cd2+処理への暴露が小麦中のTaPCS1発現に影響するか否かを測
定するために、小麦cDNAをPCR反応に異なる量の競合物質DNAと一緒に使用した。
バンド強さの比較は100μMのCd2+で処理された小麦根中のTaPCS1メッセージの5-
10倍高い濃度を示した（図15）。
【０１２０】 ここに開示されたデータはS.セレビジエ中で発現された時にCd2+トレランスの
著しい増大を媒介する数種の異なる生物の遺伝子の新規なファミリーの単離及び
機能特性決定を実証する。カドミウム蓄積実験、根中のTaPCS1誘導、グルタチオ
ンインヒビター研究、及び数種の酵母変異体バックグラウンドにおける分析は、
S.ポンベ中のSpPCS分断変異体のCd2+及びCu2+感受性と一緒になって、金属トレ
ランスに関するPCS遺伝子ファミリーの重要な生理学的役割を実証する。S.ポン
ベノックアウト株のPC欠損、Cd2+暴露後にTaPCS1発現S.セレビジエ細胞中で観察
されたPC合成及び精製された組換えSpPCSのフィトケラチンシンターゼ活性はこ
れらの遺伝子がPC合成を媒介することを示唆する。
【０１２１】 増殖培地中でCd2+に対し高いトレランスを媒介するクローンについて検索する
ことにより、TaPCS1をS.セレビジエ中の発現クローニング戦略により同定した。
TaPCS1発現は酵母細胞が対照細胞よりも15倍以上高いCd2+濃度で増殖することを
可能にした。このアプローチを使用するTaPCS1の同定はそのスクリーニングがcD
NAライブラリーのcDNAサイズフラクション（約1.5 kbより大きい）に制限される
という事実（Schachtman及びSchroeder, 1994, Nature 370:655-658）により大
いに増進され、これがメタロチオネインの如き小さくかつ多量の重金属結合ペプ
チドをコードするcDNAのクローニングを排除することを助けた。極めて相同のス
クリーニング条件を得るとともに、スクリーニングが異なるレベルの選択圧力の
もとに平行に行なわれることを可能にするために、Cd2+に対する上昇されたトレ
ランスを示す形質転換体の選択を液体培地中で行なった。又、そのスクリーニン
グ方法はCd2+トレランスを与えるのに最も有効なこれらのcDNAの単離を可能にし
た。このアプローチの効力は、多くの独立の実験で、TaPCS1が単離された唯一の
cDNAであったという事実により実証される。
【０１２２】 金属トレランスにおける役割 幾つかの知見が金属解毒におけるPCS遺伝子産物の触媒の役割を示唆する。S.
セレビジエ中のTaPCS1発現後に観察されたCd2+蓄積の増大（図10）は、トレラン
ス表現型が細菌中の金属解毒の支配的なメカニズムである毒性金属の排除（Silv
er及びPhung, 1996, Annu. Rev. Microbiol. 50:753-789）に基づくものではな
いことを実証した。逆に、Cd2+蓄積のTaPCS1依存性増大はTaPCS1がCd2+イオン封
鎖に関係しているという仮説に一致し、例えば、ABC型トランスポーターhmt1を
過剰発現するS.ポンベ細胞が更に多くのCd2+を蓄積する（Ortizら, 1992, EMBO
J. 11:3491-3499）。更に、TaPCS1は非誘導条件下で低レベルで発現された時で
さえも強いCd2+トレランスを与えることができる（図8C）。 植物細胞内の殆どの毒性物質は液胞中でイオン封鎖されるので、酵母液胞変異
体を使用してCd2+感受性アッセイを行なった。機能性V-ATPase を欠いている酵
母株(Hoら, 1993, J. Biol. Chem. 268:221-227)又は形態上典型的な識別できる
液胞を欠いている酵母（Robinsonら, 1991, Mol. Cell. Biol. 11:5813-5824;図
11）中で依然として観察されたCd2+トレランスのTaPCS1媒介増大は、Cd2+イオン
の液胞輸送におけるTaPCS1の直接の役割がありそうにないようであるが、間接的
な関与又は液胞吸収に先行する早期の反応が除外し得ないという結論を導いた。
【０１２３】 PCS遺伝子はフィトケラチン合成を媒介する 金属暴露後のグルタチオンからのフィトケラチンの合成は植物金属トレランス
に直接関係していることが示されていた（Zenk, 1996, Gene 179:21-30）。フィ
トケラチンシンターゼは液胞中のCd-フィトケラチン錯体としてのCd2+のイオン
封鎖における最初の工程を触媒作用すると提案された。フィトケラチンシンター
ゼをコードするcDNAが単離されなかったので、また本明細書に開示されたデータ
がCd2+のPCS媒介イオン封鎖を示唆したので、PC合成におけるPCS遺伝子の関与を
調べた。 植物における上記観察と一致して、低下されたフィトケラチンレベルを示すS.
ポンベのCd2+過敏性変異体が単離されていた（Mutoh及びHayashi, 1988, Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 151:32-39）。こうして、ΔSpPCS株の観察されたCd2 + 過敏性（図13B）は、PCS遺伝子がフィトケラチン合成を直接媒介するという仮
説についての更なる指示を与えた。又、銅感受性はPC欠損と合致する。何となら
ば、フィトケラチンが幾つかの毒性金属、同様に銅イオンと錯体を形成するから
である（Rauser, 1995, Plant Physiol. 109:1141-1149）。
【０１２４】 PCS遺伝子がフィトケラチン合成を媒介するという仮説を更に直接に試験する
ために、TaPCS1媒介Cd2+トレランスに関する強力な特定のインヒビターグルタチ
オン生合成であるBSOの効果を測定した。BSOは植物細胞培養液中でPCの合成及び
PC関連Cd2+トレランスを低下すると既に示されていた（Steffens, 1990, Plant
Mol. Biol. 41:553-575）。TaPCS1発現S.セレビジエ細胞のCd2+トレランスのBSO
依存性低下（図13A）はTaPCS1媒介Cd2+耐性に関するグルタチオン生合成の役割
を実証した。対照的に、メタロチオネインを過剰発現する対照細胞はBSO感受性
を示さず、小さいCd2+耐性を示した（図13A）。
【０１２５】 続いて、Cd2+処理された野生型S.ポンベからのモノブロモビマン標識抽出物の
HPLC分析は分裂酵母の優性フィトケラチンであるPC2及びPC3について予想された
ピークを示した（Kondoら, 1985, Agric. Biol. Chem. 49:71-83；図6B、上部、
ピーク１及び２）。PC2及びPC3はCd2+処理されたΔSpPCS細胞の抽出物中に検出
できなかった（図13B、下部）。対応して、PCS酵素活性がノックアウト株のタン
パク質抽出物中に検出できず（図14A、下部）、それによりフィトケラチン合成
におけるSpPCSの役割を証明した。更に、S.セレビジエ対照細胞の抽出物は本研
究でPCピークの形成を示さなかった（図13C、下部）。注目すべきは、S.セレビ
ジエゲノムはPCS同族体を含まない（Mewesら, 1997, Nature 387:65）。対照的
に、TaPCS1発現S.セレビジエ細胞はCd2+暴露後にPC2及びPC3を生成した（図13C
、上部）。こうして、TaPCS1発現はゲノムがPCS同族体（Mewesら, 1997, Nature
387:7-65）を含まない生物中でグルタチオンからのフィトケラチン合成に充分
であると結論される。S.セレビジエはごく制限された量のPC2を専ら発現すると
報告されており（Kneerら, 1992, Arch. Microbiol. 157:305-310）、その活性
はTaPCS1発現細胞（これはPC2及びPC3合成を媒介する）で観察された活性とは明
らかに異なる。PCSタンパク質によるフィトケラチン合成の直接の触媒作用を実
証するために、ΔSpPCS株をSpPCSの標識バージョンの発現及び精製のヌルバック
グラウンドとして使用した。グルタチオンからのフィトケラチン合成はHA標識Sp
PCS以外の検出できるタンパク質を含まず、明らかな分解産物を含むHA抗体アフ
ィニティーマトリックスから溶離されたフラクション中で検出することができた
（図14）。これらのデータはPCSタンパク質によるフィトケラチン合成の直接の
触媒作用を実証する。これらの結果に基いて、本明細書に開示されたデータはPC
S遺伝子がフィトケラチンシンターゼをコードすることを実証する。
【０１２６】 フィトケラチンシンターゼは95 kDaテトラマーであると既に報告された（Gril
lら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6838-6842）。ここに記載されたPC
Sタンパク質の予想分子量は46-55 kDaの範囲にある。理論により束縛されたくな
いが、本明細書に開示されたPCS遺伝子は多量体PCシンターゼの触媒サブユニッ
トをコードすることは除外し得ない。
【０１２７】 フィトケラチンはin vivoの金属トレランスに関係している ΔSpPCS株の金属感受性に関する本明細書に開示されたデータはフィトケラチ
ンが植物及びS.ポンベ中の金属解毒に重要な役割を果たす分子上の証拠を与える
。更に、本明細書に開示されたデータはPC合成の欠如が又Cu過敏性をもたらすこ
とを実証する。これは、先に示唆され（Rauser, 1990, Annu. Rev. Biochem. 59
:61-86）、またPC-金属錯体がin vitroの金属枯渇アポ酵素を活性化し得るとい
う知見（Thumannら, 1991, FEBS Lett. 284:66-69）により示されたように、金
属ホメオスタシスにおけるフィトケラチンの更に一般的な役割の証拠を与える。 根及び幹（Chenら, 1997, Physiol. Plant. 101:165-172）中のフィトケラチ
ンシンターゼの報告された構成的活性（Grillら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 86:6838-6842）及び生物が金属トレランス遺伝子を構成的に発現するため
の示唆された要件（Zenk, 1996, Gene 179:21-30）と一致して、TaPCS1及びAtPC
S1メッセージが夫々金属ストレスのない小麦及びアラビドプシス植物の根及び茎
中で検出された。更に、Cd2+処理された小麦根及びTaPCS1を使用する競合PCR実
験はPCSmRNAレベルの金属誘発アップレギュレーションを示す（図15）。PCS活性
のCd2+誘導増大がトマト細胞系についてChenら（1997, Physiol. Plant. 101:16
5-172）により既に報告されていた。
【０１２８】 PCS遺伝子の異種発現は金属トレランスを増進するのに充分である フィトケラチン媒介Cd2+錯生成について提案されたモデル（Ortizら, 1995, J
. Biol. Chem. 170:4721-4728; Rauser, 1995, Plant Physiol. 109:1141-1149
）では、PCが低分子量錯体（これはその後にS.ポンベ中でABC型トランスポータ
ーHMT1の如きトランスポーターにより液胞に輸送される）を生成することにより
サイトゾルキレート剤及びCd2+イオンのキャリヤーとして機能する（Ortizら, 1
992, EMBO J. 11:349-3499）。液胞内で、更に多いCd2+及びスルフィドが錯体に
添加されてCd2+のイオン封鎖形態に相当すると考えられる高分子量錯体を生成す
る。 TaPCS1、AtPCS1及びSpPCSを発現するS.セレビジエ細胞を用いるTaPCS1のクロ
ーニング及び増殖アッセイはフィトケラチン合成単独が細胞のCd2+トレランスを
有意に増大し得ることを実証した（図８及び10）。Δvps18変異体を用いる実験
から得られた液胞非依存性TaPCS1媒介Cd2+トレランスに関して本明細書のいずれ
かに開示された証拠（図11）と一緒にされて、これはPCが金属イオンの重要なサ
イトゾル緩衝剤に相当することを示唆する。これらのデータ及びセノルハブジチ
ス・エレガンスゲノム中の２種のPCS同族体の予期しない知見は、PCシンターゼ
過剰発現が多様な生物の金属トレランスを増大するのに成功裏に使用し得るとい
う可能性を生じる。更に、トランスジェニックPCS発現は生物改善のために植物
及びその他の生物による毒性金属の除去を増進するのに有益であり得る。
【０１２９】 こうして、本明細書に開示されたデータは、ΔSpPCS株中で実証されたグルタ
チオン依存性及びPC合成欠損、TaPCS1を発現するS.セレビジエ細胞中のフィトケ
ラチン合成並びに精製された組換えSpPCSのフィトケラチンシンターゼ活性によ
り実証されるように、フィトケラチンシンターゼをコードする多種の生物からの
金属トレランス遺伝子の新規なファミリーの単離を実証する。本明細書に開示さ
れたデータはPCが金属トレランスに重要な役割を果たすモデル（Grillら, 1985,
Science 230:674-676; Zenk, 1996, Gene 179:21-30; Howdenら, 1995, Plant
Physiol. 107:1059-1066）に関する分子上の証拠を与える。Cd2+トレランスに関
するS.セレビジエ中のTaPCS1発現の効果はPCS遺伝子の異種発現が金属トレラン
スを著しく増進し得ることを実証する。トランスジェニック植物及びその他の生
物における更なる研究は毒性金属イオン封鎖、金属解毒、及び生物改善に関する
PCS遺伝子の潜在性の試験を可能にするであろう。 本明細書に引用された特許、特許出願、及び刊行物の夫々の開示は参考として
本明細書にそのまま含まれる。 本発明が特別な実施態様を参考にして開示されたが、本発明のその他の実施態
様及び変化が本発明の真の精神及び範囲を逸脱しないで当業者により推考し得る
ことは明らかである。特許請求の範囲は全てのこのような実施態様及び均等の変
化を含むものと見なされることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 AtPCS1並びにS.ポンベ（GenBank受理番号Q10075）及びC.エレガンス（GenBank
受理番号Z66513）の夫々からのその46.7 kDa及び40.8 kDa同族体によりコードさ
れたポリペプチドの演繹アミノ酸配列のアライメントを示すダイアグラムである
。配列をCLUSTAL W方法（Higgins及びSharp, 1988, Gene 73:237-240）により配
列した。同じ残基が白色又は黒色のバックグラウンド中に示される。類似残基が
灰色のバックグラウンドで黒色で示される。アライメントを最大にするために導
入されたギャップがハイフンにより表される。アミノ酸残基に関する略号はＡ、
Ala；Ｃ、Cys；Ｄ、Asp；Ｅ、Glu；Ｆ、Phe；Ｇ、Gly；Ｈ、His；Ｉ、Ile；Ｋ、
Lys；Ｌ、Leu；Ｍ、Met；Ｎ、Asn；Ｐ、Pro；Ｑ、Gln；Ｒ、Arg；Ｓ、Ser；Ｔ、
Thr；Ｖ、Val；Ｗ、Trp；及びＹ、Tyrである。
【図２】 アラビドプシスの根及び茎中のAtPCS1転写産物の発現を示すノーザンブロット
の像である。全RNAが生後21日のアラビドプシス幼植物から抽出され、RNAが32P
標識されたランダムプライミングされたAtPCS1 cDNAとハイブリダイズされた。1
0μgのRNAが夫々のゲルレーンに装填された。示された1.7 kbバンドはブロット
をAtPCS1で探査した後に検出された唯一の32P標識バンドであった。又、同ブロ
ットを18S rRNA (2.0 kb)に対し誘導されたプローブとハイブリダイズして同様
の量のRNAが夫々のゲルレーンに装填されたことを確かめた結果が示される。
【図３】 プラスミド所有AtPCS1によるS.セレビジエycf1Δ変異体株DTY167のCd2+過敏性
の抑制を示すグラフである。酵母ycf1Δ株DTY167がpYES3-AtPCS1::FLAG（○）（
機能性FLAG標識AtPCS1をコードする）又はAtPCS1::FLAGインサートを欠いている
エンプティベクターpYES（●）で形質転換された。形質転換された酵母細胞がグ
ルコース及びトリプトファンで補給されたAHC培地中で約1.8のOD600nmまで30℃
で増殖され、その後に異なる濃度の重金属塩を含む同培地2ml容積中でアリコー
トがインキュベートされた。OD600nmが36時間にわたる増殖後に測定された。AsO 4 3- 、AsO2 -、Cu2+又はHg2+を含む液体培地中の同様の増殖アッセイは、プラスミ
ド所有AtPCS1::FLAGが夫々300、200、250、及び４μMから550、325、600、及び6
.3μMへの細胞密度の50％減衰に必要とされるこれらの重金属イオン又はそれら
の酸化物の濃度を増大することを実証した。
【図４】 DTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG（FLAG）及びDTY167/pYES3（対照）細胞から抽出
された全細胞抽出物からの合計の可溶性フラクション及び膜フラクション中のAt
PCS1-FLAGのSDS-PAGE及びウェスタン分析を示す像である。膜フラクションは10,
000 x gにおける全細胞抽出物からの上澄みの4,000 x g遠心分離により沈降され
た物質を含む。可溶性フラクションは4,000 x g及び10,000 x gにおける連続の
遠心分離後の全細胞抽出物からの上澄み中に保持された物質を含む。タンパク質
（25μg）が10％のゲルでSDS-PAGEにかけられ、次いでニトロセルロース膜フィ
ルターに電気移送され、抗FLAG M2モノクローナル抗体で探査されて融合タンパ
ク質を検出した。ECLキット（アメルシャム・ファーマシア・ライフ・サイエン
シズ、セントピーターズブルグ、FL）を用いて、製造業者の指示に従って増進ケ
ミルミネセンス(ECL)検出を使用して、免疫反応性バンドが視覚化された。
【図５】 109CdCl2を含む培地中の増殖後のDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG（○）細胞及びD
TY167/pYES3細胞（●）から抽出された可溶性フラクションのゲル濾過クロマト
グラフィーを示す像（インサートを含む）である（主グラフ）。データは５μM
の109CdCl2に対する平衡透析後にイムノアフィニティー精製されたAtPCS1-FLAG
のスペローズ-6クロマトグラフィー後に得られた109Cd放射能プロフィール（フ
ラクション25-38を示すインサートのヒストグラムのピーク１）とのDTY167/pYES
3-AtPCS1::FLAG（○）細胞から抽出された可溶性フラクションからのピーク１の 109 Cd放射能プロフィールの直接比較を示す。AtPCS1-FLAGはヒストグラムインサ
ートの下に示されたようなDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞抽出物のクロマトグ
ラフィーから溜められたフラクションの対（即ち、27-28、29-30、31-32、33-34
、35-36）の20μlのアリコートのSDS-PAGE及びウェスタンブロット分析により検
出された。
【図６】 抗FLAG M2イムノアフィニティーカラムによるDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞
からの可溶性フラクションのイムノアフィニティークロマトグラフィーによるAt
PCS1-FLAGの精製を示すゲルの像（二つのパネルを含む）である。左パネル（タ
ンパク質）：AtPCS1-FLAGの精製の前（前）及び後（１μgのタンパク質）（後）
に可溶性フラクション（５μgのタンパク質）のタンパク質を視覚化する銀染色
されたSDSゲル。右パネル（FLAG）：AtPCS1-FLAGの精製の前（25μgの全可溶性
フラクションタンパク質）（前）及び後（１μgのタンパク質）（後）のFLAGエ
ピトープのウェスタンブロット分析。分子量マーカー（Mr x 103）の位置が示さ
れる。
【図７Ａ】 in vivo及びin vitroのAtPCS1-FLAG依存性PC合成を示すグラフである。ここに
開示されたデータはCdCl2（50μM）を含む液体培地中の増殖後にDTY167/pYES3-A
tPCS1::FLAG細胞から抽出された可溶性フラクション中に存在する非タンパク質
チオールの逆相FPLC分析を示す。ピーク１及び２は夫々S.ポンベから精製された
PC2及びPC3標準物質と同時移動することがわかった。CdCl2を欠いている培地中
の増殖後にDTY167/pYES3-AtPCS1::FLAG細胞から、又CdCl2（50μM）を含む培地
中の増殖後にDTY167/pYES3細胞から抽出された均等フラクションはPCのような非
タンパク質チオールを含んでいなかった。
【図７Ｂ】 Cd2+（200μM）の存在下のイムノアフィニティー精製AtPCS1-FLAGと一緒のGSH
（3.3 mM）のインキュベーション後に生成された非タンパク質チオールの逆相FP
LC分析を示すグラフである。“PC2”及び“PC3”と称されるピークがそれらのGl
u/Gly比（夫々、2.1±0.1及び2.9±0.2）及びS.ポンベPC標準物質とのそれらの
同時移動に基づいて同定された。サンプル注入の4-10分後に溶離する主要チオー
ルピークは夫々PCシンターゼアッセイ培地中に存在する細胞のGSH、及びGSHと2-
メルカプトエタノール（2-ME）である。GSH及び2-MEに相当するピーク以外のピ
ークはAtPCS1-FLAG又はCd2+がインキュベーション培地から省かれた場合に検出
されなかった。
【図８】 TaPCS1発現が酵母細胞を更にCd2+寛容性にすることを示すグラフである。エン
プティpYES2プラスミドを有する対照INVSc1細胞（インビトロゲン、カールスバ
ッド、CA）（四角）及びTaPCS1を発現する細胞（丸）がCd2+を含まない（白の記
号）か、又は200μMのCd2+を含む（黒の記号）YNB（１％の蔗糖／１％のガラク
トース）中で増殖された。
【図８Ｂ】 異なるCd2+濃度における対照細胞（○）及びTaPCS1発現細胞（●）のYNB（１
％の蔗糖／１％のガラクトース）中の酵母細胞の増殖を示すグラフである。24時
間の増殖後に600nmにおける培養物の光学密度（OD600nm）として測定された細胞
増殖が示される。
【図８Ｃ】 異なるCd2+濃度における対照細胞（○）及びTaPCS1発現細胞（●）のYNB（２
％のラフィノース）中の増殖を示すグラフである。40時間後の培養物のOD600nm
が示される。
【図９Ａ】 小麦（TaPCS1；配列番号６）、アラビドプシス・タリアーナ（AtPCS1；配列番
号２）、S.ポンベ（SpPCS；配列番号８）、及びC.エレガンス（CePCS；配列番号
10）のアミノ酸配列のCLUSTAL Wアライメント（Thompsonら, 1994, Nucleic Aci
ds Res. 22:4673-4680）を示すダイアグラムである。同じであるアミノ酸が黒い
ボックス中に示され、類似のアミノ酸残基が明灰色のボックス内に示される。
【図９Ｂ】 100μMのCd2+を含まない（左）、またそれを含む（中央）YNB培地における対
照細胞（エンプティpYESプラスミドを有する）及びTaPCS1、AtPCS1又はSpPCSを
発現する細胞の増殖を示す写真の像である。図面の離れた右にある図は夫々の酵
母形質転換体が線状に塗られた夫々のプレートの位置を示す。
【図１０】 対照細胞によるCd2+蓄積と比較されたTaPCS1を発現する細胞によるCd2+の更に
大きい蓄積を示すグラフである。エンプティpYES2プラスミドを有する酵母細胞
（白いバー）及びTaPCS1発現細胞（黒いバー）が異なる非抑制Cd2+濃度を含むア
ルギニン−リン酸塩培地中で増殖された。24時間後に、細胞が回収され、洗浄さ
れ、109Cd2+を使用して細胞内に蓄積されたCd2+の量が測定された（誤差バー＝S
.E.、n=3）。
【図１１】 形態上目視できる液胞を欠いているS.セレビジエ株であるΔvps18（Robinson
ら, 1991, Mol. Cell. Biol. 11:5813-5824）中のTaPCS1の発現が、依然としてC
d2+トレランス表現型を与えることを示すグラフである。エンプティpYES2プラス
ミドを有する細胞（○）及びTaPCS1を発現する細胞（●）が異なるCd2+濃度の存
在下でYNB培地中で増殖された。
【図１２Ａ】 SpPCSの分断を有するS.ポンベ株が増大された金属感受性を示すことを実証す
るサザンブロットを示す像である。S.ポンベゲノムDNAの低ストリンジェンシー
サザンブロットがSpPCSで探査された。レーンがBamHI（レーン１）、HindIII（
レーン２）、及びEcoRI（レーン３）で消化されたDNAで装填された。
【図１２Ｂ】 SpPCSノックアウト株（ΔSpPCS）並びに、対照としての、エンプティプラスミ
ドpTZura4で形質転換された株及びノックアウト構築物（Sp3）の非相同組込みに
よる形質転換体の増殖を示す写真の像である。形質転換体が０又は10μMのCd2+
を含むEMM-uraで増殖された。
【図１２Ｃ】 マーカー形質転換された対照株（○）及びΔSpPCS株（●）の増殖を示すグラ
フである。株が異なるCu2+濃度の存在下で液体EMM-ura中で増殖され、ODが増殖
の24時間後に測定された。
【図１３Ａ】 PCSを発現する細胞中のフィトケラチン合成を示すグラフである。異なる濃度
のBSO（L-ブチオニン-スルホキシム）、グルタチオン合成インヒビターを使用す
る６時間のプレインキュベーション後のCd2+（TaPCS1について200μMまたメタロ
チオネインについて60μM）の存在下のTaPCS1（丸）又はアラビドプシスメタロ
チオネイン（四角）を発現するS.セレビジエ細胞の増殖。
【図１３Ｂ】 モノブロモビマンで標識され、逆相カラム及び蛍光検出を使用するHPLCにより
分析されたCd2+処理S.ポンベ野生型細胞（対照、上部パネル）及びS.ポンベノッ
クアウト細胞（ΔSpPCS、下部パネル）の抽出物のHPLC分析を示すグラフ（二つ
のパネルを含む）である。１及び２と標識されたピークは同時注入実験に基づく
図13Cに示されたピークと同じである。これらのピークはアビメドペプチド合成
装置（本明細書のいずれかに記載された）で合成された標準物質との保持時間の
比較により実証されたPC2及びPC3に相当する。
【図１３Ｃ】 モノブロモビマンで標識され、逆相カラム及び蛍光検出を使用するHPLCにより
分析されたCd2+処理されたTaPCS1を発現するS.セレビジエ細胞（上部パネル）及
びS.セレビジエ野生型（下部パネル）の抽出物のHPLC分析を示すグラフ（二つの
パネルを含む）である。１及び２と標識されたピークは同時注入実験に基づく上
記の図13Bに１及び２と標識されたピークと同じである。それらはアビメドペプ
チド合成装置（本明細書のいずれかに記載された）で合成された標準物質との保
持時間の比較により示されたPC2及びPC3に相当する。
【図１４Ａ】 PCSがフィトケラチン合成を媒介することを示すダイアグラム（二つのパネル
を含む）である。S.ポンベ対照野生型細胞（上部パネル）又はS.ポンベΔSpPCS
細胞（下部パネル）の粗抽出物が200 mM トリス-Cl (pH 8.0)、1 mM ジチオスレ
イトール(DTT)、1 mM GSH及び0.1 mM CdCl2中で30℃で30-120分間インキュベー
トされ、反応生成物がモノブロモビマン標識され、HPLCにより分析された。ピー
ク１は遊離GSHに相当し、ピーク２はPC2に相当する。
【図１４Ｂ】 抗HAモノクローナル抗体（BAbCo、バークレイ、CA）を使用するSpPCS-HA（左
レーン）又はエンプティベクター（右レーン）を宿しているΔSpPCS細胞からの
抽出物のウェスタンブロット分析を示す像である。サンプルレーンと平行に走る
分子量標準物質のサイズが図の左側に沿って示される。
【図１４Ｃ】 SpPCS-HAが抗HA抗体アフィニティーカラムを使用してSpPCS-HAを発現する細胞
の粗抽出物から精製されたことを示すウェスタンブロットの像である。タンパク
質がHAペプチド（YPYDVPDYA）5mgを使用してアフィニティーカラムから溶離され
、溶離されたフラクションがSDS-PAGE（左レーン）及びウェスタンブロッティン
グ（右レーン）により分析された。おそらく46 kDa SpPCS-HAのタンパク質分解
断片である第二バンドが約30 kDaで検出された。
【図１４Ｄ】 精製SpPCS-HAによるPC合成を示すグラフである。アフィニティー精製されたSp
PCS-HAがPCシンターゼ活性についてアッセイされ、得られる生成物が標識され、
本明細書のいずれかに既に記載されたようにHPLCにより分析された。ピーク１及
び２は夫々遊離GSH及びPC2に相当する。
【図１５】 根中のTaPCS1発現が競合PCRを使用して実証されるようにCd2+により誘発され
ることを示すゲルの像（三つのパネルを含む）である。RNAが未処理又は100μM
のCd2+で６時間処理された生後４日の小麦根から単離された。第一ストランドcD
NAが合成され、10ngがPCR反応で鋳型として使用された。この研究に使用された
競合物質DNAはイントロンの存在のためにcDNA増幅断片よりも約100bp長いゲノム
DNAから増幅されたPCR断片であった。示された量の競合物質DNAが添加された。
アリコートがアガロースゲル電気泳動により分析された。実験が同様の結果で２
回繰り返された。
【図１６】 図16A及び16Bを含み、AtPCS1をコードするDNAのヌクレオチド配列（配列番号
１）をリストする。
【図１７】 図17A、17B、及び17Cを含み、AtPCS2をコードする遺伝子のヌクレオチド配列
（図17A及び17B；配列番号３）及びAtPCS2のアミノ酸配列（図17C；配列番号４
）をリストする。
【図１８】 図18A、18B、及び18Cを含み、TaPCS1をコードする遺伝子のヌクレオチド配列
（図18A及び18B；配列番号５）及びTaPCS1のアミノ酸配列（図18C；配列番号６
）をリストする。
【図１９】 図19A及び19Bを含み、SpPCSをコードする遺伝子のヌクレオチド配列（図19A；
配列番号７）及びSpPCSのアミノ酸配列（図19C；配列番号８）をリストする。
【図２０】 図20A及び20Bを含み、CePCSをコードする遺伝子のヌクレオチド配列（図20A；
配列番号９）及びCePCSのアミノ酸配列（図20C；配列番号10）をリストする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/10 ４Ｄ０４０ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ｃ 9/10 Ｂ０９Ｂ 3/00 ＺＡＢＥ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 ヴァタマニウク オレナ ケイ アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19104 フィラデルフィア サウス フォ ーティーンス ストリート 409 アパー トメント ２アール (72)発明者 マリ ステファン アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19046 ジェンキンタウン ワシントン レーン 155 アパートメント エイチ− ４ (72)発明者 ル ユ−ピン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91377 オーク パーク サルティノ ウ ェイ 4774 (72)発明者 シュレーダー ジュリアン アイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ タフト アヴェニュ ー 5651 (72)発明者 キム ユージーン ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92101 サン ディエゴ アイヴィー ス トリート 132 (72)発明者 クレメンス ステファン ドイツ連邦共和国 デー−06120 ハーレ （ジアレ） エルネスト−シュネラー シ ュトラッセ ８ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CB03 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 AA17 BA10 CA04 DA01 DA12 EA04 GA11 HA01 HA04 HA20 4B050 CC03 DD13 FF09E LL01 4B065 AA79X AA80X AA89X AA89Y AB01 BA02 CA29 CA44 CA53 CA56 4D004 AA41 AB03 AC07 CA17 CA20 CC07 CC20 4D040 CC05 CC09

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸。
  2. 【請求項２】 前記核酸がAtPCS1（配列番号１）、AtPCS2（配列番号３）、
    TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列番号７）、及びCePCS（配列番号９）の少な
    くとも一種と少なくとも約15％の相同性を共有する請求の範囲第１項記載の単離
    された核酸。
  3. 【請求項３】 前記核酸が配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号
    ７、配列番号９からなる群から選ばれる請求の範囲第２項記載の単離された核酸
    。
  4. 【請求項４】 フィトケラチンシンターゼがAtPCS1（配列番号２）、AtPCS2
    （配列番号４）、TaPCS1（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS（配
    列番号10）の少なくとも一種と少なくとも約15％の相同性を共有することを特徴
    とする植物フィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸。
  5. 【請求項５】 フィトケラチンシンターゼを含むことを特徴とする単離され
    たポリペプチド。
  6. 【請求項６】 前記フィトケラチンシンターゼが配列番号２、配列番号４、
    配列番号６、配列番号８、及び配列番号10の少なくとも一種と少なくとも約15％
    の相同性を共有する請求の範囲第５項記載の単離されたポリペプチド。
  7. 【請求項７】 前記フィトケラチンシンターゼが配列番号２、配列番号４、
    配列番号６、配列番号８、及び配列番号10の少なくとも一つである請求の範囲第
    ６項記載の単離されたポリペプチド。
  8. 【請求項８】 前記核酸がそれに共有結合されたリポーター核酸を更に含む
    請求の範囲第１項記載の単離された核酸。
  9. 【請求項９】 前記リポーター核酸がFLAGオクタペプチド、ヒトインフルエ
    ンザウイルス血球凝集素エピトープ、β−グルクロニダーゼエピトープ、緑色蛍
    光タンパク質エピトープ、及びルシフェラーゼエピトープからなる群から選ばれ
    たリポーターポリペプチドをコードする請求の範囲第８項記載の単離された核酸
    。
  10. 【請求項１０】 請求の範囲第２項記載の単離された核酸を含むことを特徴
    とする組換え細胞。
  11. 【請求項１１】 前記細胞が原核生物細胞及び真核生物細胞からなる群から
    選ばれる請求の範囲第１０項記載の細胞。
  12. 【請求項１２】 請求の範囲第２項記載の単離された核酸を含むことを特徴
    とするベクター。
  13. 【請求項１３】 細胞、種子及び子孫がフィトケラチンシンターゼをコード
    する単離された核酸を含むトランスジェニック植物であって、前記核酸がAtPCS1
    （配列番号１）、AtPCS2（配列番号３）、TaPCS1（配列番号５）、SpPCS（配列
    番号７）及びCePCS（配列番号９）の少なくとも一種、又はその断片を含み、か
    つ前記核酸が配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、及び配列番号
    ９の少なくとも一種と少なくとも約15％の相同性を共有することを特徴とするト
    ランスジェニック植物。
  14. 【請求項１４】 細胞、種子及び子孫がフィトケラチンシンターゼをコード
    する単離された核酸、又はその断片を含むトランスジェニック植物であって、前
    記フィトケラチンシンターゼがAtPCS1（配列番号２）、AtPCS2（配列番号４）、
    TaPCS1（配列番号６）、SpPCS（配列番号８）、及びCePCS（配列番号10）の少な
    くとも一種と少なくとも約15％の相同性を共有することを特徴とするトランスジ
    ェニック植物。
  15. 【請求項１５】 土壌からの重金属の除去の防止方法であって、前記方法が
    前記土壌中でアンチセンス配向でフィトケラチンシンターゼをコードする単離さ
    れた核酸を含むトランスジェニック植物を生育し、前記植物を前記土壌から収穫
    し、それにより前記土壌からの前記重金属の除去を防止することを特徴とする重
    金属の除去の防止方法。
  16. 【請求項１６】 土壌からの重金属の除去方法であって、前記方法がフィト
    ケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を含むトランスジェニック植物
    を前記土壌中で生育し、前記植物を前記土壌から収穫し、それにより前記重金属
    を前記土壌から除去することを特徴とする重金属の除去方法。
  17. 【請求項１７】 前記重金属がカドミウム、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、水銀、鉛、
    亜鉛、ニッケル、ビスマス、セレン、銀、金、及び銅からなる群から選ばれる請
    求の範囲第１６項記載の方法。
  18. 【請求項１８】 植物の細胞にフィトケラチンシンターゼをコードする単離
    された核酸を導入し、それによりトランスジェニック重金属耐性植物を発生する
    ことを特徴とするトランスジェニック重金属耐性植物の発生方法。
  19. 【請求項１９】 フィトケラチンの生合成方法であって、前記方法が単離さ
    れたフィトケラチンシンターゼを充分な量のグルタチオン、又はグルタチオン関
    連チオールペプチドと、前記グルタチオン又は関連チオールペプチドからのフィ
    トケラチン生合成を可能にする条件下で接触させ、それによりフィトケラチンを
    生合成することを特徴とする生合成方法。
  20. 【請求項２０】 前記生合成がin vitroで行なわれる生合成、及びin vivo
    で行なわれる生合成からなる群から選ばれた生合成である請求の範囲第１９項記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記グルタチオン関連チオールペプチドがホモグルタチオ
    ン、PC2、PC3、PC4、ホモグルタチオン、ヒドロキシメチル−グルタチオン、及
    びγ−グルタミルシステイニルグルタミン酸からなる群から選ばれる請求の範囲
    第１９項記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記フィトケラチンがPC2、PC3、PC4、ホモ−PC2、ヒドロ
    キシメチル−PC2、イソ−PC2(Glu)、及びdesGly-PC2からなる群から選ばれる請
    求の範囲第１９項記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記フィトケラチンシンターゼがAtPCS1、AtPCS2、TaPCS1
    、SpPCS、及びCePCSからなる群から選ばれる請求の範囲第１９項記載の方法。
  24. 【請求項２４】 一種のチオールペプチドからのγ−グルタミルシステイン
    単位を別のチオールペプチドに移入する方法であって、前記方法が単離されたフ
    ィトケラチンシンターゼをグルタチオン、又は関連チオールペプチドと、一種の
    チオールペプチドから別のチオールペプチドへの前記γ−グルタミルシステイン
    単位の移入を可能にする条件下で接触させ、それによりγ−グルタミルシステイ
    ン単位を一種のチオールペプチドから別のチオールペプチドに移入することを特
    徴とする移入方法。
  25. 【請求項２５】 植物の収穫可能な部分中の重金属のレベルの減少方法であ
    って、前記方法が植物の非収穫可能な部分中でフィトケラチンシンターゼをコー
    ドする核酸を発現し、それにより前記植物の前記収穫可能な部分中の重金属のレ
    ベルを減少することを特徴とする重金属のレベルの減少方法。
  26. 【請求項２６】 前記方法が前記植物の前記収穫可能な部分中のフィトケラ
    チンシンターゼの発現を抑制することを更に含む請求の範囲第２５項記載の方法
    。
  27. 【請求項２７】 地下水からの重金属の除去方法であって、前記方法が前記
    地下水中でフィトケラチンシンターゼをコードする単離された核酸を含むトラン
    スジェニック植物を生育し、前記植物を前記地下水から収穫し、それにより前記
    重金属を前記地下水から除去することを特徴とする重金属の除去方法。
JP2000620073A 1999-05-20 2000-05-19 新規なフィトケラチンシンターゼ及びその使用 Pending JP2003504010A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31544999A 1999-05-20 1999-05-20
US09/315,449 1999-05-20
US09/354,123 1999-07-15
US09/354,123 US6489537B1 (en) 1998-08-07 1999-07-15 Phytochelatin synthases and uses therefor
PCT/US2000/014008 WO2000071695A1 (en) 1999-05-20 2000-05-19 Novel phytochelatin synthases and uses therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003504010A true JP2003504010A (ja) 2003-02-04

Family

ID=26979902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000620073A Pending JP2003504010A (ja) 1999-05-20 2000-05-19 新規なフィトケラチンシンターゼ及びその使用

Country Status (9)

Country Link
US (1) US6489537B1 (ja)
EP (1) EP1179055A1 (ja)
JP (1) JP2003504010A (ja)
AU (1) AU5036500A (ja)
BR (1) BR0010730A (ja)
CA (1) CA2373372A1 (ja)
IL (1) IL146364A0 (ja)
MX (1) MXPA01011857A (ja)
WO (1) WO2000071695A1 (ja)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100538952B1 (ko) 2000-12-13 2005-12-26 유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 내금속성 식물 및 환경오염의 식물에 의한 개선
ES2176117B1 (es) * 2001-03-14 2004-02-16 Consejo Superior Investigacion Planta resistente a medios con metales pesados.
AU2002323048A1 (en) * 2001-08-07 2003-02-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Phytochelatin synthase
WO2003100068A1 (en) * 2002-05-29 2003-12-04 Aresa Biodetection Aps Reporter system for plants
ES2376805B1 (es) 2003-04-02 2013-05-10 Juan Pedro Navarro Aviño Selección y modificación genética de plantas para fitorremediación de suelos y medios acuosos.
US7501832B2 (en) * 2005-02-28 2009-03-10 Ridgetop Group, Inc. Method and circuit for the detection of solder-joint failures in a digital electronic package
KR100755746B1 (ko) * 2006-05-22 2007-09-06 한국과학기술원 중금속 흡착 단백질을 이용한 양자점의 제조방법 및 이를 위한 양자점 생성능을 가지는 재조합 미생물
CN100404437C (zh) * 2006-07-22 2008-07-23 东北电力大学 利用啤酒废酵母处理含镉工业废水的方法
US20080144243A1 (en) * 2006-12-19 2008-06-19 Ridgetop Group, Inc. Method and circuit for low-power detection of solder-joint network failures in digital electronic packages
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
ES2336173B2 (es) 2007-10-24 2011-01-24 Universidad Politecnica De Valencia Metodo para mejorar la tolerancia a la salinidad.
CN101978066A (zh) 2007-11-27 2011-02-16 麦迪卡格公司 表达血凝素之转基因植物中生产的重组流感病毒样颗粒(vlp)
WO2009138449A2 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 Romeral Cabeza, Angel Recombinant cell transformed by an arabidopsis thaliana atpase athma1 sequence that is useful to remove heavy metals from aqueous solutions; the use of said cell; a process to decontaminate a liquid medium from the presence of heavy metals
PT2294202E (pt) * 2008-07-08 2015-10-09 Medicago Inc Antigénios gripais recombinantes solúveis
ES2593277T3 (es) * 2008-07-18 2016-12-07 Medicago Inc. Nuevo epítopo de inmunización contra el virus de la influenza
CN102448629A (zh) * 2009-03-30 2012-05-09 胡安佩德罗·纳瓦罗阿维尼奥 利用遗传修饰的植物物种恢复退化土地的方法
NZ597401A (en) 2009-06-24 2013-09-27 Medicago Inc Chimeric influenza virus-like particles comprising hemagglutinin
PL2480658T3 (pl) 2009-09-22 2017-12-29 Medicago Inc. Sposób otrzymywania VLP pochodzenia roślinnego
KR101286391B1 (ko) * 2010-10-28 2013-07-15 포항공과대학교 산학협력단 파이토킬라틴 수송용 조성물
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
CN102191259B (zh) * 2011-04-12 2012-10-17 南京农业大学 荷花植物络合素合酶基因NnPCS1及其植物表达载体和构建方法
US11441150B2 (en) 2014-01-10 2022-09-13 Medicago Inc. CPMV enhancer elements
US10370675B2 (en) * 2016-05-24 2019-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Transgenic plants exhibiting enhanced phytochelatin-based heavy metal tolerance and methods of use thereof
CN112850884A (zh) * 2021-01-07 2021-05-28 大唐环境产业集团股份有限公司 一种活性污泥的短纤维固定化载体及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5168053A (en) 1989-03-24 1992-12-01 Yale University Cleavage of targeted RNA by RNAase P
US5364451A (en) * 1993-06-04 1994-11-15 Phytotech, Inc. Phytoremediation of metals
US5965796A (en) * 1995-04-21 1999-10-12 University Of Georgia Research Foundation Inc. Metal resistance sequences and transgenic plants

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000071695A1 (en) 2000-11-30
CA2373372A1 (en) 2000-11-30
EP1179055A1 (en) 2002-02-13
AU5036500A (en) 2000-12-12
MXPA01011857A (es) 2003-09-04
BR0010730A (pt) 2002-04-16
IL146364A0 (en) 2002-07-25
US6489537B1 (en) 2002-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003504010A (ja) 新規なフィトケラチンシンターゼ及びその使用
Murata et al. A specific transporter for iron (III)–phytosiderophore in barley roots
Chow et al. Two different genes encode ferrochelatase in Arabidopsis: mapping, expression and subcellular targeting of the precursor proteins
Reverdatto et al. A multisubunit acetyl coenzyme A carboxylase from soybean
O'mahony et al. Characterization of a desiccation-responsive small GTP-binding protein (Rab2) from the desiccation-tolerant grass Sporobolus stapfianus
Shukla et al. Synthetic phytochelatins complement a phytochelatin-deficient Arabidopsis mutant and enhance the accumulation of heavy metal (loid) s
US10370675B2 (en) Transgenic plants exhibiting enhanced phytochelatin-based heavy metal tolerance and methods of use thereof
AU715382B2 (en) Process and DNA molecules for increasing the photosynthesis rate in plants
WO1997017447A2 (en) Plant vde genes and methods related thereto
WO1997017447A9 (en) Plant vde genes and methods related thereto
AU719624B2 (en) AATT promoter element and transcription factor
US7700827B2 (en) Metal resistant plants and phytoremediation of environmental contamination
CA2559093C (en) Proteins imparting boron-tolerance and genes thereof
US20020194644A1 (en) Method for increasing stress-resistance to a plant
WO1998004700A1 (en) Nucleic acids encoding metal uptake transporters and their uses
CN107446946B (zh) 禾本科植物抗病调控的酯酶基因
US6093810A (en) Nematode-induced genes in tomato
US7189891B2 (en) Isolated ferric reductase defective polypeptides and uses thereof
JP2003334084A (ja) ストレスに応答する根特異的遺伝子
AU727951B2 (en) Method of changing the composition of the phospholipid produced by the living body and recombinant vector therefor
US6841719B1 (en) Plant VDE genes and methods related thereto
Jeon et al. Molecular characterization of a cDNA encoding chloroplastic fructose-1, 6-bisphosphatase from soybean (Glycine max L.)
JP2007521838A (ja) ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチド、それを暗号化するポリヌクレオチド、及びそれらの用途
Dreff-Kerwin The HOTHEAD Protein: Assessing Enzymatic Activity using Computational and Recombinant Protein Expression Approaches
Pence Molecular physiology of zinc/cadmium hyperaccumulation in Thlaspi caerulescens