JPH07143886A - ヒト−インシュリン様成長因子をコードする遺伝子系 - Google Patents
ヒト−インシュリン様成長因子をコードする遺伝子系Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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-
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-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒト−インシュリン様成長因子をコードする
新規な遺伝子系の提供。 【構成】 ヒト−インシュリン様成長因子をコードして
おり、且つ適切なリーディングフレーム内に酵母α−フ
ァクター分泌リーダー及びプロセシングシグナルと連結
されているＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物。 【効果】 この遺伝子系により、ヒト−インシュリン様
成長因子を宿主である酵母細胞の細胞外に分泌させるこ
とができる。
新規な遺伝子系の提供。 【構成】 ヒト−インシュリン様成長因子をコードして
おり、且つ適切なリーディングフレーム内に酵母α−フ
ァクター分泌リーダー及びプロセシングシグナルと連結
されているＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物。 【効果】 この遺伝子系により、ヒト−インシュリン様
成長因子を宿主である酵母細胞の細胞外に分泌させるこ
とができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】成長ホルモンの生体内適用に続い
て生ずる肉体的成長が、有系分裂性インシュリン様ペプ
チドの群により介在され、このペプチドの血清内濃度が
成長ホルモンに依存することが予想される。これらのペ
プチドには、ソマトメジン−Ｃ、ソマトメジン−Ａ、並
びにインシュリン様成長因子Ｉ及びII（ＩＧＦＩ及びＩ
ＧＦII）が含まれる。
て生ずる肉体的成長が、有系分裂性インシュリン様ペプ
チドの群により介在され、このペプチドの血清内濃度が
成長ホルモンに依存することが予想される。これらのペ
プチドには、ソマトメジン−Ｃ、ソマトメジン−Ａ、並
びにインシュリン様成長因子Ｉ及びII（ＩＧＦＩ及びＩ
ＧＦII）が含まれる。
【０００２】ＩＧＦＩ及びIIはヒト−血清から分離する
ことができ、そしてインシュリンのアミノ酸配列に広範
囲に相同なアミノ酸配列を有する。現在、これらの成長
因子の限定された量のみがヒト−血清からの分離により
得られる。従って、組換ＤＮＡ技法によって比較的大量
の成長因子が製造できることは、科学的、及び臨床的に
非常に有利である。
ことができ、そしてインシュリンのアミノ酸配列に広範
囲に相同なアミノ酸配列を有する。現在、これらの成長
因子の限定された量のみがヒト−血清からの分離により
得られる。従って、組換ＤＮＡ技法によって比較的大量
の成長因子が製造できることは、科学的、及び臨床的に
非常に有利である。
【０００３】
【従来の技術】ヒト−インシュリン様成長因子Ｉ及びII
（ＩＧＦＩ及びII）のアミン酸配列はまず、それぞれ、
Rinderknecht及びHumbel(1978)J.Biol.Chem.253:2769-2
776;及びRinderknecht及びHumbel(1978)FEBS Letters 8
9:283-286 、により決定された。ＩＧＦ受容体の性質が
Massague及びCzech(1982)J.Biol.Chem.257:5038-5045に
おいて検討されている。
（ＩＧＦＩ及びII）のアミン酸配列はまず、それぞれ、
Rinderknecht及びHumbel(1978)J.Biol.Chem.253:2769-2
776;及びRinderknecht及びHumbel(1978)FEBS Letters 8
9:283-286 、により決定された。ＩＧＦ受容体の性質が
Massague及びCzech(1982)J.Biol.Chem.257:5038-5045に
おいて検討されている。
【０００４】Kurjan及びHerskowitz, Cell(1982)30:933
-934は、成熟α−ファクターの４個のタンデムコピーを
含有する推定上のα−ファクター前駆体を記載すると共
に、その配列を記載しそしてプロセシング機構を仮定し
ている。Kurjan及びHerskowitzは、1981年のCold Sprin
g Harbor Meeting on The Molecular Biology of Yeast
の要約書第242 頁において、「A Putative Alpha-Facto
r Precursor Containing Four Tandem Repeats of Matu
re Alpha-Factor 」と題して、α−ファクターについて
コードする配列及びこれらの２個の配列間のスペーサー
について記載している。
-934は、成熟α−ファクターの４個のタンデムコピーを
含有する推定上のα−ファクター前駆体を記載すると共
に、その配列を記載しそしてプロセシング機構を仮定し
ている。Kurjan及びHerskowitzは、1981年のCold Sprin
g Harbor Meeting on The Molecular Biology of Yeast
の要約書第242 頁において、「A Putative Alpha-Facto
r Precursor Containing Four Tandem Repeats of Matu
re Alpha-Factor 」と題して、α−ファクターについて
コードする配列及びこれらの２個の配列間のスペーサー
について記載している。
【０００５】
【発明の要約】成熟ヒト−インシュリン様成長因子（Ｉ
ＧＦ）を効率的に製造するための方法及び構成物が提供
される。特に、酵母宿主中での「プレ」−ＩＧＦＩ及び
「プレ」−ＩＧＦIIの発現が培地へのポリペプチドの分
泌を促進する。異る分離源に由来するＤＮＡ配列を連結
することによりＤＮＡ構成物を生じさせる。この分離源
には天然源及び合成源の両者が含まれる。得られたＤＮ
Ａ構成物は酵母中で安定に複製し、そしてプロセシング
された「プレ」−ポリペプチドの効率的で高レベルの生
産をもたらし、このポリペプチドは培地から高収量で分
離することができる。
ＧＦ）を効率的に製造するための方法及び構成物が提供
される。特に、酵母宿主中での「プレ」−ＩＧＦＩ及び
「プレ」−ＩＧＦIIの発現が培地へのポリペプチドの分
泌を促進する。異る分離源に由来するＤＮＡ配列を連結
することによりＤＮＡ構成物を生じさせる。この分離源
には天然源及び合成源の両者が含まれる。得られたＤＮ
Ａ構成物は酵母中で安定に複製し、そしてプロセシング
された「プレ」−ポリペプチドの効率的で高レベルの生
産をもたらし、このポリペプチドは培地から高収量で分
離することができる。
【０００６】
【具体的な態様の記載】ヒト−インシュリン様成長因子
（ＩＧＦＩ及びII）を発現することができるＤＮＡ配列
が提供される。これらのＤＮＡ配列はベクターに導入す
ることができ、そして得られたプラスミドを使用して感
受性宿主を形質転換する。組換プラスミドを用いる感受
性宿主の形質転換により、インシュリン様成長因子の発
現及びポリペプチド生成物の製造がもたらされる。
（ＩＧＦＩ及びII）を発現することができるＤＮＡ配列
が提供される。これらのＤＮＡ配列はベクターに導入す
ることができ、そして得られたプラスミドを使用して感
受性宿主を形質転換する。組換プラスミドを用いる感受
性宿主の形質転換により、インシュリン様成長因子の発
現及びポリペプチド生成物の製造がもたらされる。
【０００７】特に、前駆体ポリペプチドをプロセシング
しそして成熟ポリペプチドを培地中に生産することがで
きる酵母宿主中で前駆体ポリペプチド（「プレ」−ＩＧ
ＦＩ、及び「プレ」−ＩＧＦII）を産生せしめるための
新規なＤＮＡ構成物が提供される。このＤＮＡ構成物
は、酵母宿主中で安定に維持され得る複製系、効果的な
プロモーター、前記構造遺伝子とリーディングフレーム
が一致するリーダー及びプロセシングシグナルを含む構
造遺伝子、及びこの構造遺伝子から下流にある転写終結
配列を含有する。
しそして成熟ポリペプチドを培地中に生産することがで
きる酵母宿主中で前駆体ポリペプチド（「プレ」−ＩＧ
ＦＩ、及び「プレ」−ＩＧＦII）を産生せしめるための
新規なＤＮＡ構成物が提供される。このＤＮＡ構成物
は、酵母宿主中で安定に維持され得る複製系、効果的な
プロモーター、前記構造遺伝子とリーディングフレーム
が一致するリーダー及びプロセシングシグナルを含む構
造遺伝子、及びこの構造遺伝子から下流にある転写終結
配列を含有する。
【０００８】場合によっては、転写制御、遺伝子の増
幅、転写の外部的制御、及びこれらに類することのため
の他の配列を備えることができる。「プレ」−ＩＧＦＩ
及び「プレ」−ＩＧＦIIは、成熟ポリペプチドについて
コードするＤＮＡ配列が酵母により効果的に認識される
プロセシングシグナルを含むリーダー配列と連結されて
おり、そしてリーディングフレームが一致していること
を意味する。そして、「プレ」は酵母宿主と関連する分
泌及びプロセシングシグナルを示し、そして目的のポリ
ペプチドをコードする遺伝子と関連するプロセシングシ
グナルを示すものではない。
幅、転写の外部的制御、及びこれらに類することのため
の他の配列を備えることができる。「プレ」−ＩＧＦＩ
及び「プレ」−ＩＧＦIIは、成熟ポリペプチドについて
コードするＤＮＡ配列が酵母により効果的に認識される
プロセシングシグナルを含むリーダー配列と連結されて
おり、そしてリーディングフレームが一致していること
を意味する。そして、「プレ」は酵母宿主と関連する分
泌及びプロセシングシグナルを示し、そして目的のポリ
ペプチドをコードする遺伝子と関連するプロセシングシ
グナルを示すものではない。
【０００９】ＤＮＡ構成物の調製においては、複製系、
プロモーター、リーダー及びプロセシングシグナルを含
む構造遺伝子、並びにターミネーターを体現する個々の
配列を、得られたプラスミド中でこれらが適切に機能す
ることができることを保証するように所定の順序に一緒
にすることが必要である。後記のごとく、配列の適切な
方向と順序を保証するためにアダプターを使用すること
ができる。
プロモーター、リーダー及びプロセシングシグナルを含
む構造遺伝子、並びにターミネーターを体現する個々の
配列を、得られたプラスミド中でこれらが適切に機能す
ることができることを保証するように所定の順序に一緒
にすることが必要である。後記のごとく、配列の適切な
方向と順序を保証するためにアダプターを使用すること
ができる。
【００１０】使用するＩＧＦＩ及びＩＧＦII遺伝子は染
色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組合
わせであってよい。リーダー及びプロセシングシグナル
は通常、ポリペプチドの分泌をもたらす酵母中の天然Ｄ
ＮＡ配列から誘導される。酵母により自然に分泌される
これらのポリペプチドにはα−ファクター、ａ−ファク
ター、酸性ホスファターゼ、及びこれらに類するものが
含まれる。複製系、プロモーター、及びターミネーター
を含む構成物を構成する他の配列はよく知られており、
そして文献に記載されている。
色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組合
わせであってよい。リーダー及びプロセシングシグナル
は通常、ポリペプチドの分泌をもたらす酵母中の天然Ｄ
ＮＡ配列から誘導される。酵母により自然に分泌される
これらのポリペプチドにはα−ファクター、ａ−ファク
ター、酸性ホスファターゼ、及びこれらに類するものが
含まれる。複製系、プロモーター、及びターミネーター
を含む構成物を構成する他の配列はよく知られており、
そして文献に記載されている。
【００１１】この発明のＤＮＡ構成物を形成するために
連結される種々のＤＮＡ配列は種々の分離源から誘導さ
れるであろうから、これらの配列をコネクター分子又は
アダプター分子により連結するのが好ましい。特に、リ
ーダー及びプロセシングシグナル配列のコード鎖の３′
末端をＩＧＦコード鎖の５′末端にこれらのそれぞれの
相補的ＤＮＡ鎖と共に連結するために、アダプターを有
利に使用することができる。リーダー及びプロセシング
シグナル配列は、コード領域の所定の数の塩基対が欠失
するように、３′末端の近くで内部的に制限されてもよ
い。
連結される種々のＤＮＡ配列は種々の分離源から誘導さ
れるであろうから、これらの配列をコネクター分子又は
アダプター分子により連結するのが好ましい。特に、リ
ーダー及びプロセシングシグナル配列のコード鎖の３′
末端をＩＧＦコード鎖の５′末端にこれらのそれぞれの
相補的ＤＮＡ鎖と共に連結するために、アダプターを有
利に使用することができる。リーダー及びプロセシング
シグナル配列は、コード領域の所定の数の塩基対が欠失
するように、３′末端の近くで内部的に制限されてもよ
い。
【００１２】そして、リーダー及びプロセシング配列が
ＩＧＦコード鎖と連結された際に欠失した塩基対が与え
られそしてＩＧＦコード鎖がリーダー配列に対して適切
なリーディングフレーム内にあるように、アダプターを
構成することができる。ポリペプチドのＣ末端が天然の
Ｃ末端と同一であることを保証するため、合成ＩＧＦコ
ード領域及び／又はアダプターはその３′末端に翻訳終
結コドンを有するであろう。
ＩＧＦコード鎖と連結された際に欠失した塩基対が与え
られそしてＩＧＦコード鎖がリーダー配列に対して適切
なリーディングフレーム内にあるように、アダプターを
構成することができる。ポリペプチドのＣ末端が天然の
Ｃ末端と同一であることを保証するため、合成ＩＧＦコ
ード領域及び／又はアダプターはその３′末端に翻訳終
結コドンを有するであろう。
【００１３】アダプターはコード配列中に約５〜４０塩
基、さらに一般には約８〜３５塩基を有し、そして接着
末端又は平滑末端のいずれかを有することができ、そし
て接着末端が好ましい。アダプターが適当な相補的接着
末端を有する２種類の異るＤＮＡ配列と選択的に連結す
るように、アダプターの各末端は異る制限酵素に関連す
る接着末端を有することが好ましい。
基、さらに一般には約８〜３５塩基を有し、そして接着
末端又は平滑末端のいずれかを有することができ、そし
て接着末端が好ましい。アダプターが適当な相補的接着
末端を有する２種類の異るＤＮＡ配列と選択的に連結す
るように、アダプターの各末端は異る制限酵素に関連す
る接着末端を有することが好ましい。
【００１４】この発明を、酵母α−ファクターのリーダ
ー及びプロセシングシグナルに連結された、ＩＧＦＩ及
びＩＧＦIIについてコードする合成断片に関して説明す
る。酵母α−ファクターをＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩに
より制限する。ＨｉｎｄIIIはα−ファクター前駆体の
プロセシングシグナル中ｇｌｕコドンのコード鎖中の第
２塩基の３′を開裂せしめ、他方、ＨｉｎｄIII 認識配
列はｇｌｕコドンを終え、ａｌａについてコードし、そ
して成熟α−ファクターのアミノ末端ｔｒｐコドンの第
１の５′塩基を与える。ＳａｌＩ部位は、α−ファクタ
ー遺伝子の転写の方向に関して転写ターミネーターの上
流に位置する。
ー及びプロセシングシグナルに連結された、ＩＧＦＩ及
びＩＧＦIIについてコードする合成断片に関して説明す
る。酵母α−ファクターをＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩに
より制限する。ＨｉｎｄIIIはα−ファクター前駆体の
プロセシングシグナル中ｇｌｕコドンのコード鎖中の第
２塩基の３′を開裂せしめ、他方、ＨｉｎｄIII 認識配
列はｇｌｕコドンを終え、ａｌａについてコードし、そ
して成熟α−ファクターのアミノ末端ｔｒｐコドンの第
１の５′塩基を与える。ＳａｌＩ部位は、α−ファクタ
ー遺伝子の転写の方向に関して転写ターミネーターの上
流に位置する。
【００１５】ＩＧＦについてコードする合成遺伝子は、
ＩＧＦＩ及びＩＧＦIIポリペプチドの公知のアミノ酸配
列に基礎を置くヌクレオチド配列を有するであろう。好
ましくは、この合成配列は、例えば酵母の解糖系酵素に
ついてコードする遺伝子において見出されるコドンの頻
度に基いて、酵母宿主により優先的に使用されるコドン
を用いるであろう。
ＩＧＦＩ及びＩＧＦIIポリペプチドの公知のアミノ酸配
列に基礎を置くヌクレオチド配列を有するであろう。好
ましくは、この合成配列は、例えば酵母の解糖系酵素に
ついてコードする遺伝子において見出されるコドンの頻
度に基いて、酵母宿主により優先的に使用されるコドン
を用いるであろう。
【００１６】便利には、合成配列は、クローニングベク
ター中の制限部位に挿入するために平滑末端ではなくむ
しろ接着末端を含有するであろう。さらに、ＩＧＦＩ／
ＩＧＦII雑種ペプチド分子を産生せしめることができる
配列にアニールされる断片を生成せしめるために、サイ
レント変異を用いて合成配列中に制限部位を予定するこ
とができよう。
ター中の制限部位に挿入するために平滑末端ではなくむ
しろ接着末端を含有するであろう。さらに、ＩＧＦＩ／
ＩＧＦII雑種ペプチド分子を産生せしめることができる
配列にアニールされる断片を生成せしめるために、サイ
レント変異を用いて合成配列中に制限部位を予定するこ
とができよう。
【００１７】例においては、合成断片にＥｃｏＲＩ用の
接着末端を設け、そしてｐＢＲ３２８中のＥｃｏＲＩ部
位に挿入する。通常、合成配列はポリペプチドコード領
域の各端の内側に追加の制限部位を有するであろう。こ
れらの内部制限部位は、クローニングベクターからコー
ド領域を正確に切り出しそしてアダプターと連結し、こ
れによってリーダー及びプロセシングシグナル並びにコ
ード領域を含有する最終ＤＮＡ構成物が転写ターミネー
ターに対して適切なリーディングフレームを有しそして
適切に並置されるように選択される。
接着末端を設け、そしてｐＢＲ３２８中のＥｃｏＲＩ部
位に挿入する。通常、合成配列はポリペプチドコード領
域の各端の内側に追加の制限部位を有するであろう。こ
れらの内部制限部位は、クローニングベクターからコー
ド領域を正確に切り出しそしてアダプターと連結し、こ
れによってリーダー及びプロセシングシグナル並びにコ
ード領域を含有する最終ＤＮＡ構成物が転写ターミネー
ターに対して適切なリーディングフレームを有しそして
適切に並置されるように選択される。
【００１８】好ましくは、制限部位は開裂部位から離れ
て認識部位を有し、開裂はコード領域の内側に向けら
れ、そして認識部位が失われる。これにより、ヌクレオ
チド配列にかかわりなくコード領域の各端における正確
な開裂が可能となる。例においてはＨｇａＩを用いる。
て認識部位を有し、開裂はコード領域の内側に向けら
れ、そして認識部位が失われる。これにより、ヌクレオ
チド配列にかかわりなくコード領域の各端における正確
な開裂が可能となる。例においてはＨｇａＩを用いる。
【００１９】合成遺伝子の調製においては、オーバーラ
ップする単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）断片を常法に従って
調製する。このｓｓＤＮＡ断片は通常約１０〜４０塩基
の長さを有する。さらに相当長い断片を使用することも
できるが、この場合には合成収量が低下し、そして適切
な配列が不注意に分解されておらず又は変化していない
ことを保証するのが困難となる。
ップする単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）断片を常法に従って
調製する。このｓｓＤＮＡ断片は通常約１０〜４０塩基
の長さを有する。さらに相当長い断片を使用することも
できるが、この場合には合成収量が低下し、そして適切
な配列が不注意に分解されておらず又は変化していない
ことを保証するのが困難となる。
【００２０】ｓｓＤＮＡ断片を合成した後、これらをア
ニーリング条件下で、適切な順序を確保しながら相補的
塩基対と連結（Ｊｏｉｎｉｎｇ）する。次に断片の端を
結合（ｌｉｇａｔｅ）せしめ、そして得られた合成ＤＮ
Ａ断片を、通常は細菌宿主、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）中でクローニングし、そして増幅せしめる。前記
のごとく、合成構造遺伝子には、目的のクローニングベ
クター中の適当な制限部位に相補的な接着末端、及びコ
ード領域の正確な切り出しを可能にする内部認識部位を
設ける。合成配列をクローニングしそして増幅せしめた
後、通常の量のこの配列を、通常はＩＧＦコード領域の
いずれかの末端の内部制限部位において切り出す。
ニーリング条件下で、適切な順序を確保しながら相補的
塩基対と連結（Ｊｏｉｎｉｎｇ）する。次に断片の端を
結合（ｌｉｇａｔｅ）せしめ、そして得られた合成ＤＮ
Ａ断片を、通常は細菌宿主、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）中でクローニングし、そして増幅せしめる。前記
のごとく、合成構造遺伝子には、目的のクローニングベ
クター中の適当な制限部位に相補的な接着末端、及びコ
ード領域の正確な切り出しを可能にする内部認識部位を
設ける。合成配列をクローニングしそして増幅せしめた
後、通常の量のこの配列を、通常はＩＧＦコード領域の
いずれかの末端の内部制限部位において切り出す。
【００２１】便利には、使用するプロモーターは、リー
ダー及びプロセシング配列に関連するプロモーターであ
る。このようにして、効率的な転写のために適切な空間
的関係においてプロモーター及びリーダー配列を含有す
る５′−ポータブル要素が得られる。さらに転写ターミ
ネーターを含有せしめることにより「プロモーター／リ
ーダー−制限部位−ターミネーター」から成る「カセッ
ト」が得られ、ＩＧＦコード領域がアダプターを用いて
挿入される。通常、このようなカセットは、宿主により
分泌されるポリペプチドを発現する酵母宿主由来の無傷
の遺伝子及びこの遺伝子の上流及び下流の転写制御配列
を含むＤＮＡ断片を分離することにより得られる。
ダー及びプロセシング配列に関連するプロモーターであ
る。このようにして、効率的な転写のために適切な空間
的関係においてプロモーター及びリーダー配列を含有す
る５′−ポータブル要素が得られる。さらに転写ターミ
ネーターを含有せしめることにより「プロモーター／リ
ーダー−制限部位−ターミネーター」から成る「カセッ
ト」が得られ、ＩＧＦコード領域がアダプターを用いて
挿入される。通常、このようなカセットは、宿主により
分泌されるポリペプチドを発現する酵母宿主由来の無傷
の遺伝子及びこの遺伝子の上流及び下流の転写制御配列
を含むＤＮＡ断片を分離することにより得られる。
【００２２】前記の方法に代えて、天然の酵母プロモー
ターの代りに転写制御を可能にする他のプロモーターを
使用することができる。この方法においては、異るプロ
モーターを挿入するために、リーダー配列から上流の配
列決定及び／又は制限地図の作成が必要であろう。ある
場合には、天然の酵母プロモーターを保持し、そしてこ
の天然の酵母プロモーターから上流又は下流にタンデム
に第２のプロモーターを設けるのが好ましいであろう。
ターの代りに転写制御を可能にする他のプロモーターを
使用することができる。この方法においては、異るプロ
モーターを挿入するために、リーダー配列から上流の配
列決定及び／又は制限地図の作成が必要であろう。ある
場合には、天然の酵母プロモーターを保持し、そしてこ
の天然の酵母プロモーターから上流又は下流にタンデム
に第２のプロモーターを設けるのが好ましいであろう。
【００２３】広範囲の種類のプロモーターを入手するこ
とができ、又は酵母遺伝子から得ることができる。特に
有利なプロモーターには、解糖系における酵素に関する
プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリホースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ等に関するプロモーターが含まれる。
とができ、又は酵母遺伝子から得ることができる。特に
有利なプロモーターには、解糖系における酵素に関する
プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリホースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ等に関するプロモーターが含まれる。
【００２４】これらのプロモーターを制御配列、例えば
エンハンサー、オペレーター等と共に使用することによ
り、そして無傷の制御系を有する宿主を使用することに
より、プロセシングされた「プレ」−ＩＧＦの発現を制
御することができる。すなわち、種々の小有機分子、例
えばグルコースを用いて目的ポリペプチドの産生の制御
を行うことができる。
エンハンサー、オペレーター等と共に使用することによ
り、そして無傷の制御系を有する宿主を使用することに
より、プロセシングされた「プレ」−ＩＧＦの発現を制
御することができる。すなわち、種々の小有機分子、例
えばグルコースを用いて目的ポリペプチドの産生の制御
を行うことができる。
【００２５】さらに、温度の変化による転写の調節を可
能にする温度感受性制御変異様を使用することもでき
る。すなわち、非許容（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖ
ｅ）温度で細胞を増殖せしめることにより細胞を高濃度
に増殖せしめることができ、その後ＩＧＦＩ及びＩＧＦ
IIの「プレ」−ポリペプチドの発現をもたらすために温
度を変えることができる。
能にする温度感受性制御変異様を使用することもでき
る。すなわち、非許容（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖ
ｅ）温度で細胞を増殖せしめることにより細胞を高濃度
に増殖せしめることができ、その後ＩＧＦＩ及びＩＧＦ
IIの「プレ」−ポリペプチドの発現をもたらすために温
度を変えることができる。
【００２６】構成物中に他の能力を導入することもでき
る。例えば、宿主へのストレスに際しそのストレスに応
答する遺伝子のみならずフランク領域も増幅される場合
には、増幅のために幾つかの遺伝子を用いることができ
る。このような遺伝子を、プロモーター、コード領域、
及び「プレ」−ポリペプチドの転写制御をもたらす他の
制御シグナルから上流に配置し、そして酵母宿主をスト
レスすることにより、「プレ」−ポリペプチド遺伝子を
その制御配列と共に含有する多数の反復配列を有するプ
ラスミドが得られるであろう。代表的な遺伝子にはメタ
ロチオネイン及びジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝
子が含まれる。
る。例えば、宿主へのストレスに際しそのストレスに応
答する遺伝子のみならずフランク領域も増幅される場合
には、増幅のために幾つかの遺伝子を用いることができ
る。このような遺伝子を、プロモーター、コード領域、
及び「プレ」−ポリペプチドの転写制御をもたらす他の
制御シグナルから上流に配置し、そして酵母宿主をスト
レスすることにより、「プレ」−ポリペプチド遺伝子を
その制御配列と共に含有する多数の反復配列を有するプ
ラスミドが得られるであろう。代表的な遺伝子にはメタ
ロチオネイン及びジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝
子が含まれる。
【００２７】構成物は、リーダー配列断片に加えて、宿
主ゲノムと相同の他のＤＮＡを含有することができる。
ＩＧＦ遺伝子を染色体へ組み込むことが好ましい場合に
は、ＩＧＦ遺伝子構成の周縁に宿主の染色体ＤＮＡと相
同の配列を設けることにより組込みを促進することがで
きる。
主ゲノムと相同の他のＤＮＡを含有することができる。
ＩＧＦ遺伝子を染色体へ組み込むことが好ましい場合に
は、ＩＧＦ遺伝子構成の周縁に宿主の染色体ＤＮＡと相
同の配列を設けることにより組込みを促進することがで
きる。
【００２８】使用する複製系は酵母宿主により認識され
るであろう。従って、複製系は酵母宿主にとって本来的
（ｎａｔｉｖｅ）であることが好ましい。多数の酵母ベ
クターがＢｏｔｓｔｅｉｎ等、Ｇｅｎｅ（１９７９）
８：１７−２４により報告されている。特に有利なもの
は２μｍプラスミド複製系を含有するＹＥｐプラスミド
である。これらのプラスミドは、多コピー数において安
定に維持される。これに代えて又はこれに加えて、安定
な維持を得るためにＡＲＳ１とＣＥＮ４との組合わせを
用いることができる。
るであろう。従って、複製系は酵母宿主にとって本来的
（ｎａｔｉｖｅ）であることが好ましい。多数の酵母ベ
クターがＢｏｔｓｔｅｉｎ等、Ｇｅｎｅ（１９７９）
８：１７−２４により報告されている。特に有利なもの
は２μｍプラスミド複製系を含有するＹＥｐプラスミド
である。これらのプラスミドは、多コピー数において安
定に維持される。これに代えて又はこれに加えて、安定
な維持を得るためにＡＲＳ１とＣＥＮ４との組合わせを
用いることができる。
【００２９】各操作の後、ふさわしい場合には、構成物
をクローニングし、純粋にそしてさらに操作するのに十
分な量において所望の構成物を得る。クローニングを原
核性生物、特にＥ． コリ中で行うことができるよう
に、シャトルベクター（すなわち、酵母及び細菌の複製
開始点の両者を含有するベクター）を使用することが好
ましい。
をクローニングし、純粋にそしてさらに操作するのに十
分な量において所望の構成物を得る。クローニングを原
核性生物、特にＥ． コリ中で行うことができるよう
に、シャトルベクター（すなわち、酵母及び細菌の複製
開始点の両者を含有するベクター）を使用することが好
ましい。
【００３０】プラスミドは、酵母宿主細胞又はスフェロ
プラストを用い、そして形質転換のためのカルシウム沈
澱ＤＮＡもしくはリポゾーム、又は他の常用技法を用い
ながら、任意の便利な手段により酵母宿主に導入するこ
とができる。変性された宿主は、発現プラスミドを構成
するために使用されるベクター中に通常設けられている
遺伝的マーカーに従って選択することができる。プラス
ミドが、宿主を補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）しそして
これに原栄養性を付与する遺伝子を有する場合、栄養要
求性宿主を用いることができる。
プラストを用い、そして形質転換のためのカルシウム沈
澱ＤＮＡもしくはリポゾーム、又は他の常用技法を用い
ながら、任意の便利な手段により酵母宿主に導入するこ
とができる。変性された宿主は、発現プラスミドを構成
するために使用されるベクター中に通常設けられている
遺伝的マーカーに従って選択することができる。プラス
ミドが、宿主を補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）しそして
これに原栄養性を付与する遺伝子を有する場合、栄養要
求性宿主を用いることができる。
【００３１】他の方法として、適当な殺生物剤、例えば
抗生物質、重金属、毒素、又はこれらに類するものをマ
ーカーとしてプラスミドに導入することができる。次
に、親細胞をストレスすることによってプラスミド含有
細胞を選択することができる栄養培地を用いることによ
り選択を行うことができる。次に、プラスミド含有細胞
を適当な栄養培地に増殖せしめ、そして目的とする分泌
されたポリペプチドを常法に従って分離する。ポリペプ
チドはクロマトグラフィー、濾過、抽出等により精製す
ることができる。ポリペプチドは培地中に成熟形として
存在するであろうから、目的のポリペプチドを取り出し
ながら培地を連続的に循環することができる。次に例に
よりこの発明をさらに具体的に説明する。但しこれによ
りこの発明の範囲を限定するものではない。
抗生物質、重金属、毒素、又はこれらに類するものをマ
ーカーとしてプラスミドに導入することができる。次
に、親細胞をストレスすることによってプラスミド含有
細胞を選択することができる栄養培地を用いることによ
り選択を行うことができる。次に、プラスミド含有細胞
を適当な栄養培地に増殖せしめ、そして目的とする分泌
されたポリペプチドを常法に従って分離する。ポリペプ
チドはクロマトグラフィー、濾過、抽出等により精製す
ることができる。ポリペプチドは培地中に成熟形として
存在するであろうから、目的のポリペプチドを取り出し
ながら培地を連続的に循環することができる。次に例に
よりこの発明をさらに具体的に説明する。但しこれによ
りこの発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】＜実験＞好ましい酵母コドンを有するヒト
−インシュリン様成長因子Ｉ及びII（ＩＧＦＩ及びＩＧ
ＦII）のヌクレオチド配列を、それぞれ、Rinderknecht
及びHumbel(1978)J.Biol.Chem.253:2769-2776;及びRind
erknecht及びHumbel(1978)FEBS Letters 89:283-286 に
おいて報告されたアミノ酸配列に基いて案出した。配列
（コード鎖を５′−３′で示す）を次に示す。
−インシュリン様成長因子Ｉ及びII（ＩＧＦＩ及びＩＧ
ＦII）のヌクレオチド配列を、それぞれ、Rinderknecht
及びHumbel(1978)J.Biol.Chem.253:2769-2776;及びRind
erknecht及びHumbel(1978)FEBS Letters 89:283-286 に
おいて報告されたアミノ酸配列に基いて案出した。配列
（コード鎖を５′−３′で示す）を次に示す。
【００３３】
【化３】
【００３４】
【化４】
【００３５】この配列は両端にＥｃｏＲＩ接着末端を有
する。ＩＧＦＩのコードはコード鎖の１６塩基から始ま
り２２５塩基で終わる。ＨｇａＩ制限部位がＩＧＦＩコ
ード領域の両端に位置する。ＨｇａＩ認識部位（５′−
ＧＡＣＧＣ−３′）はＩＧＦＩコード領域の外側、すな
わち合成配列の末端とＨｇａＩ開裂部位の間に存在す
る。１６塩基から始まり２１９塩基で終わるコード鎖を
有するＩＧＦII合成配列も合同様に構成される。
する。ＩＧＦＩのコードはコード鎖の１６塩基から始ま
り２２５塩基で終わる。ＨｇａＩ制限部位がＩＧＦＩコ
ード領域の両端に位置する。ＨｇａＩ認識部位（５′−
ＧＡＣＧＣ−３′）はＩＧＦＩコード領域の外側、すな
わち合成配列の末端とＨｇａＩ開裂部位の間に存在す
る。１６塩基から始まり２１９塩基で終わるコード鎖を
有するＩＧＦII合成配列も合同様に構成される。
【００３６】ＩＧＦＩについてすぐ前に記載した配列を
有するＩＧＦＩのための合成ＤＮＡ断片を、燐アミディ
ト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ法）（１９８３年
１月１２日に出願された係属中の出願No．４５７，４１
２を参照のこと）を用いて２０種類のオーバーラップｓ
ｓＤＮＡ断片を合成することにより調製した。ｓｓＤＮ
Ａを次に示す。
有するＩＧＦＩのための合成ＤＮＡ断片を、燐アミディ
ト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ法）（１９８３年
１月１２日に出願された係属中の出願No．４５７，４１
２を参照のこと）を用いて２０種類のオーバーラップｓ
ｓＤＮＡ断片を合成することにより調製した。ｓｓＤＮ
Ａを次に示す。
【００３７】
【化５】
【００３８】ｓｓＤＮＡを次のようにして連結する。Ａ
及びＩ−１６以外の各セグメント５０ｐモルずつをＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′−燐酸化した。
５０ｐモルずつのすべての断片を、１８μｌのプールと
して１段階で、１．５時間にわたって９５℃から２５℃
に冷却することによりアニーリングした。１mMのＡＴ
Ｐ、１０mMのＤＴＴ、１００mMのトリス−ＨＣｌ、pH
７．８、１０mMのＭｇＣｌ 2 、１μｇ／mlのスペルミジ
ン及びＴ４リガーゼを含有する３０μｌの反応容積中で
連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。次の方式１に示す
断片の順序及び対形成（ｐａｉｒｉｎｇ）から得られる
適切な２重鎖断片を、７％ネイティブポリアクリルアミ
ド電気泳動ゲル上で精製した。
及びＩ−１６以外の各セグメント５０ｐモルずつをＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′−燐酸化した。
５０ｐモルずつのすべての断片を、１８μｌのプールと
して１段階で、１．５時間にわたって９５℃から２５℃
に冷却することによりアニーリングした。１mMのＡＴ
Ｐ、１０mMのＤＴＴ、１００mMのトリス−ＨＣｌ、pH
７．８、１０mMのＭｇＣｌ 2 、１μｇ／mlのスペルミジ
ン及びＴ４リガーゼを含有する３０μｌの反応容積中で
連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。次の方式１に示す
断片の順序及び対形成（ｐａｉｒｉｎｇ）から得られる
適切な２重鎖断片を、７％ネイティブポリアクリルアミ
ド電気泳動ゲル上で精製した。
【００３９】
【化６】
【００４０】ＩＧＦIIのＤＮＡ配列を同様にして合成し
た。次の追加のｓｓＤＮＡ断片を調製した。
た。次の追加のｓｓＤＮＡ断片を調製した。
【００４１】
【化７】
【００４２】これらのｓｓＤＮＡ断片の２００ｐモル及
び断片Ａ，Ｄ及びＬを上記の方法と同様にして連結し
た。この場合、Ａ及びII−１５を燐酸化せず、次のよう
なセグメントの順序及び対を生成せしめた。
び断片Ａ，Ｄ及びＬを上記の方法と同様にして連結し
た。この場合、Ａ及びII−１５を燐酸化せず、次のよう
なセグメントの順序及び対を生成せしめた。
【００４３】
【化８】
【００４４】合成ＤＮＡ配列をｐＢＲ３２８のＥｃｏＲ
Ｉ部位に挿入してプラスミドｐ３２８ＩＧＦＩ及びｐ３
２８ＩＧＦIIを調製した。クローニングした後、ＩＧＦ
コード鎖を、ＨｇａＩを用いて切り出した。次に合成オ
リゴヌクレオチドアダプターを、ＨｇａＩ制限断片に連
結した。ＩＧＦＩのためのアダプターは次の配列を有す
る。
Ｉ部位に挿入してプラスミドｐ３２８ＩＧＦＩ及びｐ３
２８ＩＧＦIIを調製した。クローニングした後、ＩＧＦ
コード鎖を、ＨｇａＩを用いて切り出した。次に合成オ
リゴヌクレオチドアダプターを、ＨｇａＩ制限断片に連
結した。ＩＧＦＩのためのアダプターは次の配列を有す
る。
【００４５】
【化９】
【００４６】コード鎖の方向に関して、第１アダプター
（ａ）の３′末端はＩＧＦＩ合成配列上のＨｇａＩ開裂
部位と相補的であり、他方第１アダプターの５′末端は
ＨｉｎｄIII 接着末端を供する。第２アダプター（ｂ）
はその５′末端において、ＩＧＦＩ配列の３′末端のＨ
ｇａＩ開裂部位に相補的であり、他方アダプターの３′
末端はＳａｌＩ接着末端を供する。ＩＧＦIIについて、
アダプターは次の配列を有する。
（ａ）の３′末端はＩＧＦＩ合成配列上のＨｇａＩ開裂
部位と相補的であり、他方第１アダプターの５′末端は
ＨｉｎｄIII 接着末端を供する。第２アダプター（ｂ）
はその５′末端において、ＩＧＦＩ配列の３′末端のＨ
ｇａＩ開裂部位に相補的であり、他方アダプターの３′
末端はＳａｌＩ接着末端を供する。ＩＧＦIIについて、
アダプターは次の配列を有する。
【００４７】
【化１０】
【００４８】第１アダプターに関して上記した方向に関
して、（ｃ）はその３′末端においてＩＧＦII合成配列
中の５′−ＨｇａＩ開裂部位に相補的であり、他方５′
末端はＨｉｎｄIII 接着末端を供する。第２アダプター
（ｄ）はその５′末端においてＩＧＦII合成配列中の第
２ＨｇａＩ開裂部位に相補的であり、そしてその３末端
においてＳａｌＩ接着末端を供する。
して、（ｃ）はその３′末端においてＩＧＦII合成配列
中の５′−ＨｇａＩ開裂部位に相補的であり、他方５′
末端はＨｉｎｄIII 接着末端を供する。第２アダプター
（ｄ）はその５′末端においてＩＧＦII合成配列中の第
２ＨｇａＩ開裂部位に相補的であり、そしてその３末端
においてＳａｌＩ接着末端を供する。
【００４９】合成断片及びそれに連結したアダプターを
調製用ゲル電気泳動により精製し、そしてエンドヌクレ
アーゼＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩにより前もって完全消
化しておいた１００ngのｐＡＢ１１３に連結した。ｐＡ
Ｂ１１３はｐＡＢ１１２から、３個の６３bpＨｉｎｄII
I 断片を除去することにより誘導した。ｐＡＢ１１２
は、ＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩ部位が除去されているｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位中でクローニングされた酵
母α−ファクター遺伝子を有する１．８kbＥｃｏＲＩ断
片を含有するプラスミドである。
調製用ゲル電気泳動により精製し、そしてエンドヌクレ
アーゼＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩにより前もって完全消
化しておいた１００ngのｐＡＢ１１３に連結した。ｐＡ
Ｂ１１３はｐＡＢ１１２から、３個の６３bpＨｉｎｄII
I 断片を除去することにより誘導した。ｐＡＢ１１２
は、ＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩ部位が除去されているｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位中でクローニングされた酵
母α−ファクター遺伝子を有する１．８kbＥｃｏＲＩ断
片を含有するプラスミドである。
【００５０】プラスミド１１２は、プラスミドＹＥｐ２
４のＢａｍＨＩ部位中でクローニングされた部分Ｓａｕ
３Ａ断片として酵母α−ファクター遺伝子を含有するプ
ラスミドｐＡＢ１０１から誘導した。ｐＡＢ１０１は、
公表されているα−ファクターコード領域(Kurjan 及び
Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor meet
ing on th Molecular Biology of Yeasts, 242頁）と相
同の酵素的にＰ34放射性ラベルした合成オリゴヌクレオ
チドを用いてＹＥｐ２４中でクローニングされた酵母ゲ
ノムライブラリをスクリーニングすることにより得た。
４のＢａｍＨＩ部位中でクローニングされた部分Ｓａｕ
３Ａ断片として酵母α−ファクター遺伝子を含有するプ
ラスミドｐＡＢ１０１から誘導した。ｐＡＢ１０１は、
公表されているα−ファクターコード領域(Kurjan 及び
Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor meet
ing on th Molecular Biology of Yeasts, 242頁）と相
同の酵素的にＰ34放射性ラベルした合成オリゴヌクレオ
チドを用いてＹＥｐ２４中でクローニングされた酵母ゲ
ノムライブラリをスクリーニングすることにより得た。
【００５１】得られた混合物を用いてＥ． コリＨＢ１
０１の細胞を形質転換し、そしてＩＧＦＩ及びＩＧＦII
についてそれぞれプラスミドｐＡＢ１１３−ＩＧＦ−Ｉ
及びｐＡＢ１１３−ＩＧＦ−IIを得た。それぞれＩＧＦ
Ｉ及びＩＧＦII構造遺伝子を有するプラスミドｐＡＢ１
１３−ＩＧＦ−Ｉ及びｐＡＢ１１３−ＩＧＦ−II（各５
μｇずつ）をＥｃｏＲＩにより完全消化し、そして得ら
れた断片を過剰のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩアダプターに
連結し、そしてＢａｍＨＩで消化した。得られた１．８
kbＢａｍＨＩ断片を調製用ゲル電気泳動により分離し、
そして約１００ngの各断片を、あらかじめＢａｍＨＩで
完全消化しそしてアルカリホスファターゼで処理した１
００ngのｐＣ１／１に連結した。
０１の細胞を形質転換し、そしてＩＧＦＩ及びＩＧＦII
についてそれぞれプラスミドｐＡＢ１１３−ＩＧＦ−Ｉ
及びｐＡＢ１１３−ＩＧＦ−IIを得た。それぞれＩＧＦ
Ｉ及びＩＧＦII構造遺伝子を有するプラスミドｐＡＢ１
１３−ＩＧＦ−Ｉ及びｐＡＢ１１３−ＩＧＦ−II（各５
μｇずつ）をＥｃｏＲＩにより完全消化し、そして得ら
れた断片を過剰のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩアダプターに
連結し、そしてＢａｍＨＩで消化した。得られた１．８
kbＢａｍＨＩ断片を調製用ゲル電気泳動により分離し、
そして約１００ngの各断片を、あらかじめＢａｍＨＩで
完全消化しそしてアルカリホスファターゼで処理した１
００ngのｐＣ１／１に連結した。
【００５２】プラスミドｐＣ１／１はpJDB219, Beggs,
Nature(1978)275:105 、の誘導体であり、この場合ｐＪ
ＤＢ２１９における細菌プラスミドｐＭＢ９に対応する
領域はｐＣ１／１においてはｐＢＲ３２２により置き換
えられている。各連結混合物を用いてＥ． コリＨＢ１
０１細胞を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐
性により選択し、そしてそのプラスミドを制限エンドヌ
クレアーゼ消化により分析した。
Nature(1978)275:105 、の誘導体であり、この場合ｐＪ
ＤＢ２１９における細菌プラスミドｐＭＢ９に対応する
領域はｐＣ１／１においてはｐＢＲ３２２により置き換
えられている。各連結混合物を用いてＥ． コリＨＢ１
０１細胞を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐
性により選択し、そしてそのプラスミドを制限エンドヌ
クレアーゼ消化により分析した。
【００５３】各構造遺伝子ＩＧＦＩ又はＩＧＦIIについ
て選択したそれぞれのクローンからのＤＮＡ，（ｐＹＩ
ＧＦ−Ｉ−１０／１）又は（ｐＹＩＧＦ−II−１０／
１）を調製し、そしてこれを用いて酵母ＡＢ１０３細胞
を形質転換した。形質転換体をそのＬｅｕ+ 表現型によ
り選択した。
て選択したそれぞれのクローンからのＤＮＡ，（ｐＹＩ
ＧＦ−Ｉ−１０／１）又は（ｐＹＩＧＦ−II−１０／
１）を調製し、そしてこれを用いて酵母ＡＢ１０３細胞
を形質転換した。形質転換体をそのＬｅｕ+ 表現型によ
り選択した。
【００５４】プラスミド（ｐＹＩＧＦ−Ｉ−１０／１）
により形質転換された酵母株ＡＢ１０３（α，ｐｅｐ
４−３，Ｌｅｕ ２−１１２，ｕｒａ ３−５２，ｈｉ
ｓ４−５８０）の培養物（５ｌ及び９ｌ）をロイシン不
含培地中で３０℃にて飽和（光学濃度６５０nmにおいて
５）まで増殖せしめ、そしてさらに１２時間３０℃にて
振とうを継続した。細胞上澄液を遠心分離により各培養
物から集め、そしてＩＧＦＩをイオン交換樹脂（Bio-Ra
d Laboratories社、リッチモンド、カリホルニア製Ｂｉ
ｏｒｅｘ−７０）への吸着により濃縮した。
により形質転換された酵母株ＡＢ１０３（α，ｐｅｐ
４−３，Ｌｅｕ ２−１１２，ｕｒａ ３−５２，ｈｉ
ｓ４−５８０）の培養物（５ｌ及び９ｌ）をロイシン不
含培地中で３０℃にて飽和（光学濃度６５０nmにおいて
５）まで増殖せしめ、そしてさらに１２時間３０℃にて
振とうを継続した。細胞上澄液を遠心分離により各培養
物から集め、そしてＩＧＦＩをイオン交換樹脂（Bio-Ra
d Laboratories社、リッチモンド、カリホルニア製Ｂｉ
ｏｒｅｘ−７０）への吸着により濃縮した。
【００５５】８０％エタノール中１０mMＨＣｌにより溶
出した後、ＩＧＦ分画（それぞれ０．４ml及び３ml）を
全蛋白質濃度及びＩＧＦＩ濃度について測定した。蛋白
質は、Bio-Rad Laboratories社、リッチモンド、カリホ
ルニア製、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂ
ｌｕｅ）により測定した。ＩＧＦＩ測定は、放射性ラベ
ルしたＩＧＦＩを用いる常用の競争ラジオイムノアッセ
イにより行った。この結果を次に示す。
出した後、ＩＧＦ分画（それぞれ０．４ml及び３ml）を
全蛋白質濃度及びＩＧＦＩ濃度について測定した。蛋白
質は、Bio-Rad Laboratories社、リッチモンド、カリホ
ルニア製、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂ
ｌｕｅ）により測定した。ＩＧＦＩ測定は、放射性ラベ
ルしたＩＧＦＩを用いる常用の競争ラジオイムノアッセ
イにより行った。この結果を次に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】プロラクチンに対するハト−そのうの反応
を促進するペプチドの作動性効果に基くＩＧＦＩのバイ
オアッセイ〔Anderson等(1983)Somatomedins／Insulin-
LikeGrowth Factors, Spencer E.M. 編、バルター、デ
グルター、ベルリン〕により、これらの標品のＩＧＦＩ
はヒトの血清から分離された真正なＩＧＦＩと同等の活
性を有することが示された。
を促進するペプチドの作動性効果に基くＩＧＦＩのバイ
オアッセイ〔Anderson等(1983)Somatomedins／Insulin-
LikeGrowth Factors, Spencer E.M. 編、バルター、デ
グルター、ベルリン〕により、これらの標品のＩＧＦＩ
はヒトの血清から分離された真正なＩＧＦＩと同等の活
性を有することが示された。
【００５８】ＡＢ１０３（ｐＹＩＧＦ−II−１０／１）
を上記と同様に増殖せしめ、そしてＩＧＦIIについての
ヒト−胎盤膜ラジオリセプター測定〔Spencer 等、(197
9)Act.Endocrinal.91:36-48 〕により、３．９ユニット
／mlが示された。正常なヒト−血清は１ユニット／mlを
有する。
を上記と同様に増殖せしめ、そしてＩＧＦIIについての
ヒト−胎盤膜ラジオリセプター測定〔Spencer 等、(197
9)Act.Endocrinal.91:36-48 〕により、３．９ユニット
／mlが示された。正常なヒト−血清は１ユニット／mlを
有する。
【００５９】この発明に従えば、ヒト−インシュリン様
成長因子Ｉを発現し、プロセシングしそして分泌するた
めにベクターに挿入される新規な構成物が提供される。
こうして、天然のヒト−インシュリン様成長因子Ｉと同
じ配列を有するポリペプチドが得られる。分泌により、
細胞数に対して非常に増強された収量が得られ、そして
その後の調製操作及び精製が単純化される。
成長因子Ｉを発現し、プロセシングしそして分泌するた
めにベクターに挿入される新規な構成物が提供される。
こうして、天然のヒト−インシュリン様成長因子Ｉと同
じ配列を有するポリペプチドが得られる。分泌により、
細胞数に対して非常に増強された収量が得られ、そして
その後の調製操作及び精製が単純化される。
【００６０】以上説明及び例によりこの発明を幾分詳細
に記載したが、この発明の範囲内において幾つかの変化
及び変法が実施できることは言うまでもない。なお、酵
母菌株Ｓ． セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＡＢ１０３（ｐＹＩＧＦ−Ｉ−１０／１）及びＡＢ
１０３（ｐＹＩＧＦ−II−１０／１）は１９８３年４月
２３日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ン（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ）に寄託され、それぞれ番号No．２
０６７３及びNo．２０６７４が与えられた。
に記載したが、この発明の範囲内において幾つかの変化
及び変法が実施できることは言うまでもない。なお、酵
母菌株Ｓ． セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＡＢ１０３（ｐＹＩＧＦ−Ｉ−１０／１）及びＡＢ
１０３（ｐＹＩＧＦ−II−１０／１）は１９８３年４月
２３日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ン（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ）に寄託され、それぞれ番号No．２
０６７３及びNo．２０６７４が与えられた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｅ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ギィー ミュレンバッハ アメリカ合衆国，カリフォルニア，バーク レイ，グローブ ストリート 1324 (72)発明者 ミッキー エス．アルディー アメリカ合衆国，カリフォルニア，サンフ ランシスコ，アービング ストリート 209
Claims (11)
- 【請求項１】 ヒト−インシュリン様成長因子をコード
しており且つ適切なリーディングフレーム内に酵母α−
ファクター分泌リーダー及びプロセシングシグナルと連
結されているＤＮＡ配列であって、制御シグナルの転写
制御のもとにあるものを含んで成るＤＮＡ構成物。 - 【請求項２】 前記ヒト−インシュリン様成長因子コー
ド配列がヒト−インシュリン様成長因子Ｉについてコー
ドする請求項１に記載のＤＮＡ構成物。 - 【請求項３】 前記ヒト−インシュリン様成長因子コー
ド配列がヒト−インシュリン様成長因子IIについてコー
ドする請求項１に記載のＤＮＡ構成物。 - 【請求項４】 酵母により認識される複製系を含有する
請求項１に記載のＤＮＡ構成物。 - 【請求項５】 前記コード配列の少なくとも一部分が、
酵母により優先的に利用されそしてヒトのコドンとは異
るコドンを有する請求項１に記載のＤＮＡ構成物。 - 【請求項６】 前記構成物が細菌により利用される複製
系を含有する請求項１に記載のＤＮＡ構成物。 - 【請求項７】 前記酵母複製系が２μｍプラスミド又は
その部分を含んで成る請求項４に記載のＤＮＡ構成物。 - 【請求項８】 次の配列： 【化１】 を含有する請求項１に記載のＤＮＡ構成物。
- 【請求項９】 次の配列： 【化２】 を含有する請求項１に記載のＤＮＡ構成物。
- 【請求項１０】 培養中の細胞性宿主の発現のための、
転写及び翻訳制御配列に連結された、ヒト−インシュリ
ン様成長因子についてコードする配列を含んで成るＤＮ
Ａ構成物。 - 【請求項１１】 ヒト−インシュリン様成長因子をコー
ドしており且つ適切なリーディングフレーム内に酵母α
−ファクター分泌リーダー及びプロセシングシグナルと
連結されているＤＮＡ配列、並びに培養の際の酵母宿主
細胞での発現のための転写及び翻訳制御配列を含んで成
るＤＮＡ構成物を含有する酵母宿主細胞。
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| JP59082096A Expired - Lifetime JP2548105B2 (ja) | 1983-04-25 | 1984-04-25 | ヒト−インシユリン様成長因子の製造方法 |
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| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
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