JP2512416B2 - インスリンの発現方法 - Google Patents
インスリンの発現方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 （発明の分野） ハイブリドDNA技法は、遺伝子の転写及び翻訳による
所望のポリペプチド生成物の製造を可能にする。ほとん
どの場合、注目するポリペプチド生成物は哺乳動物遺伝
子に関連するが、宿主細胞の選択はまず原核生物及び下
等真核生物、例えば菌類、特に酵母に向けられてきた。
これな増殖及び遺伝的操作が簡単なためである。所望の
ポリペプチドの効果的な産生を供するDNA構成を形成す
るするための方法の開発においては、要求される通りに
DNA断片を挿入しそして切り出すことが可能な方法を開
発しなければならない。しばしば、種種の制御シグナ
ル、複製系、マーカー、及び注目する１又は複数の構造
遺伝子が異る分離源に由来する。従って、該当する配列
中でエンドヌクレアーゼ切断、挿入及び切出しを可能に
し、複数のDNA断片を正しい方向に且つ適切な空間的関
係において配列せしめる方法を開発しなければならな
い。さらに、目的とする構造遺伝子の効果的な転写、翻
訳又は増加を妨害するか又は妨害する可能性がある配列
の存在を回避しなければならず、又はこれらの配列が不
利益な効果を有しない場合にのみその存在が許される。
所望のポリペプチド生成物の製造を可能にする。ほとん
どの場合、注目するポリペプチド生成物は哺乳動物遺伝
子に関連するが、宿主細胞の選択はまず原核生物及び下
等真核生物、例えば菌類、特に酵母に向けられてきた。
これな増殖及び遺伝的操作が簡単なためである。所望の
ポリペプチドの効果的な産生を供するDNA構成を形成す
るするための方法の開発においては、要求される通りに
DNA断片を挿入しそして切り出すことが可能な方法を開
発しなければならない。しばしば、種種の制御シグナ
ル、複製系、マーカー、及び注目する１又は複数の構造
遺伝子が異る分離源に由来する。従って、該当する配列
中でエンドヌクレアーゼ切断、挿入及び切出しを可能に
し、複数のDNA断片を正しい方向に且つ適切な空間的関
係において配列せしめる方法を開発しなければならな
い。さらに、目的とする構造遺伝子の効果的な転写、翻
訳又は増加を妨害するか又は妨害する可能性がある配列
の存在を回避しなければならず、又はこれらの配列が不
利益な効果を有しない場合にのみその存在が許される。
DNA構成の調製に関する方法のほかに、制御シグナル
及び発現生成物についてコードする配列の選択、これら
の個々の相互作用、宿主に対するこれらの影響、宿主の
エネルギーが目的ポリペプチドの産生に用いられる効
率、及びポリペプチド生成物の分離の容易さも考慮に入
れられる。従って、特定のポリペプチドの製造のための
方法の個々の開発は、実験計画、手順の組織化及び研究
における知的な実践となる。
及び発現生成物についてコードする配列の選択、これら
の個々の相互作用、宿主に対するこれらの影響、宿主の
エネルギーが目的ポリペプチドの産生に用いられる効
率、及びポリペプチド生成物の分離の容易さも考慮に入
れられる。従って、特定のポリペプチドの製造のための
方法の個々の開発は、実験計画、手順の組織化及び研究
における知的な実践となる。
（従来技術の記載） ヒト−インスリンのヒト−DNA配列は、Bell等、Natur
e（1979）282:525−527に見出される。ラットの「プ
レ」−プロインスリンポリペプチド断片の細菌中での産
生が米国特許第4,338,397号に記載されている。Kurjan
及びHerskowitz,Cell（1982）30:933−943は、成熟α−
ファクターの４個のタンデムコピーを含有するα−ファ
クター前駆体を予想し、配列を記載しそしてプロセシン
グ機構を仮定している。Kurjan及びHerskowitz,1981年
におけるCold Spring Harbor Meeting on The Molecula
r Biology of Yeastの「A Putative Alpha−Factor Pre
cursor Containing Four Tandem Repeats of Mature Al
pha−Factor」と題する要約紙は、α−ファクターにつ
いてコードする配列、及びこれらの２個の配列の間のス
ペーサーを記載している。米国特許第4,338,397号の第
３及び第４欄は有用な定義を与えており、この定義を引
用によりこの明細書に組み入れる。
e（1979）282:525−527に見出される。ラットの「プ
レ」−プロインスリンポリペプチド断片の細菌中での産
生が米国特許第4,338,397号に記載されている。Kurjan
及びHerskowitz,Cell（1982）30:933−943は、成熟α−
ファクターの４個のタンデムコピーを含有するα−ファ
クター前駆体を予想し、配列を記載しそしてプロセシン
グ機構を仮定している。Kurjan及びHerskowitz,1981年
におけるCold Spring Harbor Meeting on The Molecula
r Biology of Yeastの「A Putative Alpha−Factor Pre
cursor Containing Four Tandem Repeats of Mature Al
pha−Factor」と題する要約紙は、α−ファクターにつ
いてコードする配列、及びこれらの２個の配列の間のス
ペーサーを記載している。米国特許第4,338,397号の第
３及び第４欄は有用な定義を与えており、この定義を引
用によりこの明細書に組み入れる。
発明の要約 酵母宿主中で「プレ」−プロインスリンを産生せし
め、そしてプロセシングされた「プレ」−プロインスリ
ンを培地中に分泌せしめるための方法及び構成が提供さ
れる。このDNA構成は種々の分離源に由来するDNA配列を
連結することによって形成され、この構成は酵母宿主中
で安定に複製されそしてプロセシングされた「プレ」−
プロインスリンの栄養培地中への効率的な高レベル産生
をもたらす。他方、この生成物は高収率で分離され得
る。
め、そしてプロセシングされた「プレ」−プロインスリ
ンを培地中に分泌せしめるための方法及び構成が提供さ
れる。このDNA構成は種々の分離源に由来するDNA配列を
連結することによって形成され、この構成は酵母宿主中
で安定に複製されそしてプロセシングされた「プレ」−
プロインスリンの栄養培地中への効率的な高レベル産生
をもたらす。他方、この生成物は高収率で分離され得
る。
特定の態様の記載 酵母宿主中で哺乳動物の「プレ」−プロインスリンを
効果的に産成し、そして「プレ」−プロインスリンをプ
ロセシングする新規なDNA構成が提供される。この構成
は、哺乳動物「プレ」−プロインスリンの転写及び翻
訳、並びにこのポリペプチド生成物のプロセシング及び
培地への分泌をもたらす。従ってこの構成は、酵母宿主
中で安定な保持を可能にする複製系；効果的なプロモー
ター；プロインスリンについてのコード領域に連結され
たリーダー及びプロセシングシグナルを含有する構造遺
伝子（このプロインスリンについてのコード領域は分泌
リーダー及びプロセシングコード配列とリーディングフ
レームが一致している）；及びこの構造遺伝子から下流
に位置するターミネーター配列を含む。場合によって
は、写転制御、遺伝子の増幅、転写の外的制御等のため
の他の配列を有することができる。
効果的に産成し、そして「プレ」−プロインスリンをプ
ロセシングする新規なDNA構成が提供される。この構成
は、哺乳動物「プレ」−プロインスリンの転写及び翻
訳、並びにこのポリペプチド生成物のプロセシング及び
培地への分泌をもたらす。従ってこの構成は、酵母宿主
中で安定な保持を可能にする複製系；効果的なプロモー
ター；プロインスリンについてのコード領域に連結され
たリーダー及びプロセシングシグナルを含有する構造遺
伝子（このプロインスリンについてのコード領域は分泌
リーダー及びプロセシングコード配列とリーディングフ
レームが一致している）；及びこの構造遺伝子から下流
に位置するターミネーター配列を含む。場合によって
は、写転制御、遺伝子の増幅、転写の外的制御等のため
の他の配列を有することができる。
「プレ」−プロインスリン遺伝子とは、ヒト−プロイ
ンスリンについてコードし、酵母宿主により効率的に認
識されるリーダ配列及びプロセシングシグナルとリーデ
ィングフレームが一致している遺伝子を意味する。すな
わち「プレ」とは、酵母宿主と関連する分泌及びプロセ
シングシグナルを意味し、プロインスリン遺伝子と共に
天然に存在し天然のプレプロペプチドをプロインスリン
にプロセシングするためのヒトの配列と区別される。
ンスリンについてコードし、酵母宿主により効率的に認
識されるリーダ配列及びプロセシングシグナルとリーデ
ィングフレームが一致している遺伝子を意味する。すな
わち「プレ」とは、酵母宿主と関連する分泌及びプロセ
シングシグナルを意味し、プロインスリン遺伝子と共に
天然に存在し天然のプレプロペプチドをプロインスリン
にプロセシングするためのヒトの配列と区別される。
この構成の調製においては、個々の配列をあらかじめ
定められた順序で一緒にすることにより、存在する複数
の配列が各段階において妨害されそれらの機能が不都合
な影響を受けることがないこと、及び導入される各配列
が他の配列との関係において適切に位置し、これらの個
々の機能が満たされ得ることを保証することが必要であ
る。さらに、構成を有利に調製するためにアダプター分
子を使用することができる。
定められた順序で一緒にすることにより、存在する複数
の配列が各段階において妨害されそれらの機能が不都合
な影響を受けることがないこと、及び導入される各配列
が他の配列との関係において適切に位置し、これらの個
々の機能が満たされ得ることを保証することが必要であ
る。さらに、構成を有利に調製するためにアダプター分
子を使用することができる。
使用されるプロインスリン遺伝子は染色体DNA、cDN
A、合成DNA、又はこれらを組合わせたものであってもよ
い。プロインスリン遺伝子は哺乳動物遺伝子であり、そ
して制御シグナル、リーダー及びプロセシングシグナ
ル、並びに転写ターミネーターシグナルは宿主に由来し
そして宿主によって認識される配列であるであろうか
ら、幾つかの配列をコネクター配列又はアダプター配列
により連結するのが有用であろう。すなわち、制御部位
を適切に選択することにより、コード鎖の内側であり
５′−末端近くの制限酵素部位において切断し幾つかの
塩基対が欠失したプロインスリン遺伝子を得ることがで
きる。同様にして、リーダー及びプロセシングシグナル
配列を、コード鎖の内側であって３′−末端の近くの制
限酵素部位で切断して多数の塩基対を欠失せしめること
ができる。（特にことわらないかぎり、５′−及び３′
−の標示はコード鎖について用いる。）アダプターがプ
ロインスリン遺伝子の適切なリーディングフレームをも
たらすように制御部位が選択される。
A、合成DNA、又はこれらを組合わせたものであってもよ
い。プロインスリン遺伝子は哺乳動物遺伝子であり、そ
して制御シグナル、リーダー及びプロセシングシグナ
ル、並びに転写ターミネーターシグナルは宿主に由来し
そして宿主によって認識される配列であるであろうか
ら、幾つかの配列をコネクター配列又はアダプター配列
により連結するのが有用であろう。すなわち、制御部位
を適切に選択することにより、コード鎖の内側であり
５′−末端近くの制限酵素部位において切断し幾つかの
塩基対が欠失したプロインスリン遺伝子を得ることがで
きる。同様にして、リーダー及びプロセシングシグナル
配列を、コード鎖の内側であって３′−末端の近くの制
限酵素部位で切断して多数の塩基対を欠失せしめること
ができる。（特にことわらないかぎり、５′−及び３′
−の標示はコード鎖について用いる。）アダプターがプ
ロインスリン遺伝子の適切なリーディングフレームをも
たらすように制御部位が選択される。
アダプターは合成的に調製することができるので、ア
ダプターのコドンは、天然に存在する哺乳動物のコドン
ではなく、酵母宿主により選択的に用いられるコドン、
例えば解糖系酵素の遺伝子中に存在するコドンであるこ
とが好ましい。アダプターはコード配列中に約20〜40、
さらに一般的には約25〜30の塩基を有し、そして接着末
端又は平滑末端、好ましくは接着末端を有する。好まし
くは、アダプターの末端は異なる接着末端を有し、該ア
ダプターの正しい方向付けを保証する。従って、連結さ
れるべき２つの末端も又異なる末端を有するであろう。
ダプターのコドンは、天然に存在する哺乳動物のコドン
ではなく、酵母宿主により選択的に用いられるコドン、
例えば解糖系酵素の遺伝子中に存在するコドンであるこ
とが好ましい。アダプターはコード配列中に約20〜40、
さらに一般的には約25〜30の塩基を有し、そして接着末
端又は平滑末端、好ましくは接着末端を有する。好まし
くは、アダプターの末端は異なる接着末端を有し、該ア
ダプターの正しい方向付けを保証する。従って、連結さ
れるべき２つの末端も又異なる末端を有するであろう。
リーダー及びプロセシングシグナルのために、酵母由
来の天然のDNA配列を使用することができる。酵母によ
り分泌されるポリペプチドにはα−ファクター、ａ−フ
ァクター等が含まれる。
来の天然のDNA配列を使用することができる。酵母によ
り分泌されるポリペプチドにはα−ファクター、ａ−フ
ァクター等が含まれる。
この発明を、酵母α−ファクターの制御シグナル、リ
ーダー及びプロセシングシグナル、並びに転下ターメネ
ーターと共に、プロインスリンのcDNAを用いて説明す
る。
ーダー及びプロセシングシグナル、並びに転下ターメネ
ーターと共に、プロインスリンのcDNAを用いて説明す
る。
酵母α−ファクターはHind III及びSal Iにより切り
出すことができる。Hind IIIは、α−ファクターのプロ
セシングシグナル中gluコドンのコード鎖の第２塩基に
おいて切断し、他方認識配列はgluコドンを満たしそし
てalaをコードする。Sal I部位はα−ファクター転写タ
ーミネーターに先行する。
出すことができる。Hind IIIは、α−ファクターのプロ
セシングシグナル中gluコドンのコード鎖の第２塩基に
おいて切断し、他方認識配列はgluコドンを満たしそし
てalaをコードする。Sal I部位はα−ファクター転写タ
ーミネーターに先行する。
ヒト−プロインスリンcDNAは、EcoR Iにより切り出さ
れて、プロインスリンの完全コード配列及びフランク配
列を有する断片（EcoR I−EcoR I）をもたらす。EcoR I
−EcoR I断片をEcoR IIにより部分消化してコード配列
の内部を切断することにより、５′−末端においてコー
ド配列の一部分が欠落した不完全断片（truncated frag
ment）が得られる。この塩基対はアダプターにより与え
られ、このアダプターはEcoR II−EcoR I断片とリーデ
ィングフレームが適切に一致するようにリーダー及びプ
ロセシングシグナル断片（Hind III部位）に結合する。
アダプターは単一断片として調製することができ、又は
２以上の単一鎖を連結することによって調製することが
できる。アダプターが、プロセシングシグナル及び発現
されるべき遺伝子の必要なコドンを再構成する。
れて、プロインスリンの完全コード配列及びフランク配
列を有する断片（EcoR I−EcoR I）をもたらす。EcoR I
−EcoR I断片をEcoR IIにより部分消化してコード配列
の内部を切断することにより、５′−末端においてコー
ド配列の一部分が欠落した不完全断片（truncated frag
ment）が得られる。この塩基対はアダプターにより与え
られ、このアダプターはEcoR II−EcoR I断片とリーデ
ィングフレームが適切に一致するようにリーダー及びプ
ロセシングシグナル断片（Hind III部位）に結合する。
アダプターは単一断片として調製することができ、又は
２以上の単一鎖を連結することによって調製することが
できる。アダプターが、プロセシングシグナル及び発現
されるべき遺伝子の必要なコドンを再構成する。
プロインスリンのcDNA遺伝子を含有する断片の他端に
はEcoR I認識部位が存在する。α−ファクター遺伝子は
ｆ−metコドンの第１塩基から533番目の塩基にSal I制
限部位を有する。小型のEcoR I−Sal Iアダプターがこ
の３′−非コード領域において２個の末端を連結するた
めに機能し、そしてそれ由に構成にα−ファクター転写
ターミネーターを復原するために機能する。
はEcoR I認識部位が存在する。α−ファクター遺伝子は
ｆ−metコドンの第１塩基から533番目の塩基にSal I制
限部位を有する。小型のEcoR I−Sal Iアダプターがこ
の３′−非コード領域において２個の末端を連結するた
めに機能し、そしてそれ由に構成にα−ファクター転写
ターミネーターを復原するために機能する。
便利には、プロモーターとして、リーダー配列と関連
するプロモーターを使用することができる。この場合、
プロモーター及びリーダー配列の両者を効果的な転写の
ために適切である空間的関係において含有する５′−ポ
ータブル要素を得ることができる。さらに、転写ターミ
ネーターを含めることにより、プロモーター／リーダー
／外来性遺伝子／ターミネーターから成る「カセット」
を形成することもできる。このことは、酵母由来の無傷
の遺伝子、並びにこの遺伝子の上流及び下流の転写制御
配列を含有するDNA断片（この遺伝子は酵母宿主によっ
て分泌されるポリペプチドを発現する）を分離すること
によって達成される。このことは、α−ファクターを用
いてすでに例示した。
するプロモーターを使用することができる。この場合、
プロモーター及びリーダー配列の両者を効果的な転写の
ために適切である空間的関係において含有する５′−ポ
ータブル要素を得ることができる。さらに、転写ターミ
ネーターを含めることにより、プロモーター／リーダー
／外来性遺伝子／ターミネーターから成る「カセット」
を形成することもできる。このことは、酵母由来の無傷
の遺伝子、並びにこの遺伝子の上流及び下流の転写制御
配列を含有するDNA断片（この遺伝子は酵母宿主によっ
て分泌されるポリペプチドを発現する）を分離すること
によって達成される。このことは、α−ファクターを用
いてすでに例示した。
プロインスリンcDNAはそれ自体の終結コドンを有し、
ポリペプチドのＣ−末端が天然のＣ−末端と同一である
ことを保証するであろう。
ポリペプチドのＣ−末端が天然のＣ−末端と同一である
ことを保証するであろう。
上記の方法に代えて、天然のプロモーターの代りに転
写制御を可能にする他のプロモーターを使用することが
できる。このためには、異なるプロモーターを導入する
ためにリーダー配列から上流の領域の配列を決定しそし
て／又は制限地図を作成することが必要であろう。ある
場合には、天然のプロモーターを残留せしめ、この天然
のプロモーターの上流又は下流のいずれかに第２のプロ
モーターを与えることが望ましいであろう。
写制御を可能にする他のプロモーターを使用することが
できる。このためには、異なるプロモーターを導入する
ためにリーダー配列から上流の領域の配列を決定しそし
て／又は制限地図を作成することが必要であろう。ある
場合には、天然のプロモーターを残留せしめ、この天然
のプロモーターの上流又は下流のいずれかに第２のプロ
モーターを与えることが望ましいであろう。
広範囲の種類のプロモーターを使用することができ、
又は酵母遺伝子から得ることができる。特に好ましいプ
ロモーターには、解糖経路における酵素と関連するプロ
モーター例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ピル
ベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラー
ゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナー
ゼ等のためのプロモーターが含まれる。これらのプロモ
ーターを制御配列、例えばオペレーター、レプレッサー
及びデレプレッサーと共に使用することにより、そして
無傷の制御系を有する宿主を使用することにより、プロ
セシングされた「プレ」−プロインスリンの発現を制御
することができる。すなわち、目的ポリペプチドの産生
の制御のために種々の小有機分子、例えばグルコースを
用いることができる。
又は酵母遺伝子から得ることができる。特に好ましいプ
ロモーターには、解糖経路における酵素と関連するプロ
モーター例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ピル
ベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラー
ゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナー
ゼ等のためのプロモーターが含まれる。これらのプロモ
ーターを制御配列、例えばオペレーター、レプレッサー
及びデレプレッサーと共に使用することにより、そして
無傷の制御系を有する宿主を使用することにより、プロ
セシングされた「プレ」−プロインスリンの発現を制御
することができる。すなわち、目的ポリペプチドの産生
の制御のために種々の小有機分子、例えばグルコースを
用いることができる。
また、温度を変えることによって転写を調節すること
を可能にする温度感受性変異株を使用することもでき
る。すなわち、非許容的温度（nonepermissive tempera
ture）において細胞を増殖せしめることにより細胞を高
濃度に増殖せしめ、この後温度を変えることによりプロ
セシングされた「プレ」−プロインスリンを発現せしめ
る。
を可能にする温度感受性変異株を使用することもでき
る。すなわち、非許容的温度（nonepermissive tempera
ture）において細胞を増殖せしめることにより細胞を高
濃度に増殖せしめ、この後温度を変えることによりプロ
セシングされた「プレ」−プロインスリンを発現せしめ
る。
その他の能力を構成中に導入することもできる。例え
ば、宿主に対するストレスの際に、増幅されたストレス
に対して遺伝子のみならずフランク領域も応答する場
合、遺伝子は増幅をもたらす。このような遺伝子を、プ
ロモーター及び「プレ」−プロインスリンの転写制御を
もたらす他の制御遺伝子より上流に導入し、そして酵母
宿主をストレスすることにより、「プレ」−プロインス
リン遺伝子をその制御配列と共に含有する数の反復配列
を有するプラスミドが得られる。
ば、宿主に対するストレスの際に、増幅されたストレス
に対して遺伝子のみならずフランク領域も応答する場
合、遺伝子は増幅をもたらす。このような遺伝子を、プ
ロモーター及び「プレ」−プロインスリンの転写制御を
もたらす他の制御遺伝子より上流に導入し、そして酵母
宿主をストレスすることにより、「プレ」−プロインス
リン遺伝子をその制御配列と共に含有する数の反復配列
を有するプラスミドが得られる。
代表的な遺伝子にはメタロチオネイン遺伝子及びジヒ
ドロフォレートレダクターゼ遺伝子が含まれる。
ドロフォレートレダクターゼ遺伝子が含まれる。
構成はリーダー配列断片のほかに宿主染色体に相同の
他のDNAを含有することができる。プロインスリン遺伝
子を染色体に組み込むことが望ましい場合には、プロイ
ンスリン遺伝子構成の周縁に位置し宿主染色体DNAと相
同の配列を用いて組込みを強化することができる。
他のDNAを含有することができる。プロインスリン遺伝
子を染色体に組み込むことが望ましい場合には、プロイ
ンスリン遺伝子構成の周縁に位置し宿主染色体DNAと相
同の配列を用いて組込みを強化することができる。
酵母宿主により認識される複製系を用いる。従って、
複製系が酵母宿主にとって本来的なものであることが好
ましい。多数の酵母ベクターがBotstein等、Gene（197
9）８:17−24により報告されている。２μｍプラスミド
複製系を含有するYEpプラスミドが特に好ましい。これ
らのプラスミドは多コピー数において容易に保持され
る。以上の方法に代えて、又はこれに加えて、ARS1及び
CEN4の組合わせを用いて安定な保持を得ることができ
る。
複製系が酵母宿主にとって本来的なものであることが好
ましい。多数の酵母ベクターがBotstein等、Gene（197
9）８:17−24により報告されている。２μｍプラスミド
複製系を含有するYEpプラスミドが特に好ましい。これ
らのプラスミドは多コピー数において容易に保持され
る。以上の方法に代えて、又はこれに加えて、ARS1及び
CEN4の組合わせを用いて安定な保持を得ることができ
る。
各操作の後、適当であれば構成をクローニングして、
目的とする構成を純粋な形でそしてさらに操作するのに
十分な量において得る。好ましくは、原核生物、特に
Ｅ．コリ中でクローニングができるように、シャトルベ
クター（すなわち酵母及び細菌の複製開始点を含有する
ベクター）を用いる。
目的とする構成を純粋な形でそしてさらに操作するのに
十分な量において得る。好ましくは、原核生物、特に
Ｅ．コリ中でクローニングができるように、シャトルベ
クター（すなわち酵母及び細菌の複製開始点を含有する
ベクター）を用いる。
プラスミドは、酵母細胞又はスフェロプラストを用い
そして形質転換のためのカルシウム沈澱DNAを用いる任
意の便利な手段により、又はその他の常用技法により、
酵母に導入することができる。変性された宿主は、発現
プラスミドを構成するためのベクターに通常備なえられ
ている遺伝的マーカーに従って選択することができる。
栄養要求宿主を用い、プラスミドはこの宿主を補完（co
mplement）しそして原栄養性を付与する遺伝子を有す
る。この方法に代えて、適当な殺生物剤、例えば抗生物
質、重金属、毒素又はこれらに類するものに対する耐性
を、マーカーとしてプラスミドに導入することができ
る。次に、親細胞をストレスしプラスミドを含有する細
胞を選択する栄養培地を用いることにより選択を行う。
次にプラスミド含有細胞を適当な栄養培地中に増殖せし
め、そして分泌された目的ポリペプチドを常法に従って
分離する。このポリペプチドをクロマトグラフィー、抽
出等により精製する。ポリペプチドは培地中に成熟型と
して存在するであろうから、目的ポリペプチドを連続的
に取り出しながら栄養培地を循環することができる。
そして形質転換のためのカルシウム沈澱DNAを用いる任
意の便利な手段により、又はその他の常用技法により、
酵母に導入することができる。変性された宿主は、発現
プラスミドを構成するためのベクターに通常備なえられ
ている遺伝的マーカーに従って選択することができる。
栄養要求宿主を用い、プラスミドはこの宿主を補完（co
mplement）しそして原栄養性を付与する遺伝子を有す
る。この方法に代えて、適当な殺生物剤、例えば抗生物
質、重金属、毒素又はこれらに類するものに対する耐性
を、マーカーとしてプラスミドに導入することができ
る。次に、親細胞をストレスしプラスミドを含有する細
胞を選択する栄養培地を用いることにより選択を行う。
次にプラスミド含有細胞を適当な栄養培地中に増殖せし
め、そして分泌された目的ポリペプチドを常法に従って
分離する。このポリペプチドをクロマトグラフィー、抽
出等により精製する。ポリペプチドは培地中に成熟型と
して存在するであろうから、目的ポリペプチドを連続的
に取り出しながら栄養培地を循環することができる。
次に、この発明を具体的に説明するために例を記載す
るがこれによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。
るがこれによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。
実験 1. phins1−19のEcoR I消化 約700μｇのphins1−19（pBR328のEcoR I部位におい
てクローニングされた、完全なヒト−プロインスリン遺
伝子を含有する517bpのcDNA）を、約1600ユニットのEco
R I（ニューイングランドビオラブス）と共に、1ml中
で、37℃にて約4.5時間（完了まで）製造者により指定
された緩衝条件下でインキュベートした。（phins1−19
は、Bell等、前記、により記載されたプラスミドから、
Pst I開裂、Bal31切断、EcoR Iリンカーの付加、及びbB
R328への挿入により誘導される。） ヒト−プロインスリン遺伝子を含有するphins1−19のEc
oR I−EcoR I断片の分離 EcoR I−EcoR I断片を５％非変性条件下のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分離した。ゲルを１μg/ml
のエチジゥムブロミド溶液中で約10分間染色し、そして
長波長UV光のもとで可視化した。517bp断片に対応する
バンドを切り取り、そして電気溶出〔Smith,Methods in
Enz.（1980）65:371−380〕によりゲルから分離した。
DNAを濃縮し、そしてこれを指定された条件下でエルチ
ップ（Elutip）−ｄカラム（Schleicher and Schuell
社）に通すことにより精製した。
てクローニングされた、完全なヒト−プロインスリン遺
伝子を含有する517bpのcDNA）を、約1600ユニットのEco
R I（ニューイングランドビオラブス）と共に、1ml中
で、37℃にて約4.5時間（完了まで）製造者により指定
された緩衝条件下でインキュベートした。（phins1−19
は、Bell等、前記、により記載されたプラスミドから、
Pst I開裂、Bal31切断、EcoR Iリンカーの付加、及びbB
R328への挿入により誘導される。） ヒト−プロインスリン遺伝子を含有するphins1−19のEc
oR I−EcoR I断片の分離 EcoR I−EcoR I断片を５％非変性条件下のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分離した。ゲルを１μg/ml
のエチジゥムブロミド溶液中で約10分間染色し、そして
長波長UV光のもとで可視化した。517bp断片に対応する
バンドを切り取り、そして電気溶出〔Smith,Methods in
Enz.（1980）65:371−380〕によりゲルから分離した。
DNAを濃縮し、そしてこれを指定された条件下でエルチ
ップ（Elutip）−ｄカラム（Schleicher and Schuell
社）に通すことにより精製した。
2. EcoR IIを用いるEcoR I−EcoR I片の部分消化 EcoR I−EcoR I断片（約17μｇ）を、約３ユニットの
EcoR II（ベセスダリザーチラブス）と共に、170μの
容積において、37℃にて指定された緩衝条件下でインキ
ュベートした。同量のアリコートを18、21、及び25分間
目に採取した。
EcoR II（ベセスダリザーチラブス）と共に、170μの
容積において、37℃にて指定された緩衝条件下でインキ
ュベートした。同量のアリコートを18、21、及び25分間
目に採取した。
EcoR II−EcoR I（長断片）の分離 392bpのEcoR II−EcoR I断片を、前記のごとく、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出、及びエルチッ
プ−ｄクロマトグラフィーにより分離した。
アクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出、及びエルチッ
プ−ｄクロマトグラフィーにより分離した。
3. EcoR II−EcoR I断片と合成断片との連結 インスリンコード領域のほとんどを含有するEcoR II
−EcoR I部分消化断片を、シリコン加工した1.5mlのエ
ッペンドルフ管中で水を蒸発せしめることにより乾燥し
た（80μg,0.35ピコモル）。このペレットに、10ピコモ
ルの５′−燐酸化合成断片３及び４、並びに25ピコモル
の断片２及び５を加え、容積を14μとした。断片２〜
５は次のDNA配列（５′→３′で示す）を有する。
−EcoR I部分消化断片を、シリコン加工した1.5mlのエ
ッペンドルフ管中で水を蒸発せしめることにより乾燥し
た（80μg,0.35ピコモル）。このペレットに、10ピコモ
ルの５′−燐酸化合成断片３及び４、並びに25ピコモル
の断片２及び５を加え、容積を14μとした。断片２〜
５は次のDNA配列（５′→３′で示す）を有する。
2. ACAAAAGCTTC 3. TTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACA 4. CCAGGTGTGAGCCGCACAGGTGTTGGTTC 5. AATTTGATAAG これに、５μｇのポリ−Ａ（５μ）、250mMのEDTA
（１μ）、2M酢酸ナトリウム（20μ）を加えた。こ
の溶液を60℃に５分間加熱することにより残存キナーゼ
を失活せしめ、そして次に25ピコモルの５′−ヒドロキ
シン合成断片１及び６を加えた。断片１及び６は次のDN
A配列を有する。
（１μ）、2M酢酸ナトリウム（20μ）を加えた。こ
の溶液を60℃に５分間加熱することにより残存キナーゼ
を失活せしめ、そして次に25ピコモルの５′−ヒドロキ
シン合成断片１及び６を加えた。断片１及び６は次のDN
A配列を有する。
1. AGCTGAAGCTT 6. TCGACTTATCA この方法によりコンカテマー（concatemer）の形成が
回避される。これらの断片は、酵母α−ファクタープロ
セシングシグナルからプロインスリン遺伝子中のEcoR I
I制限部位までのコドンを、his及びleuのコドンにおい
て架橋し、そしてさらにプロインスリン遺伝子を含有す
る断片のEcoR I制限部位と酵母α−ファクターを含有す
る断片のsal I制限部位（EcoR I部位及びSal I部位はい
ずれもこれらそれぞれのコード領域より下流にある）と
を架橋するアダプターとなる。
回避される。これらの断片は、酵母α−ファクタープロ
セシングシグナルからプロインスリン遺伝子中のEcoR I
I制限部位までのコドンを、his及びleuのコドンにおい
て架橋し、そしてさらにプロインスリン遺伝子を含有す
る断片のEcoR I制限部位と酵母α−ファクターを含有す
る断片のsal I制限部位（EcoR I部位及びSal I部位はい
ずれもこれらそれぞれのコード領域より下流にある）と
を架橋するアダプターとなる。
この混合物を撹拌し、200μの95％エタノールを加
え、そしてチューブを−80℃にて20分間保持することに
よりDNAを沈澱せしめる。12,800Gにて10分間遠心分離し
た後、溶液をデカントし、冷エタノールで洗浄し、そし
て蒸発乾燥した。断片のアニーリングを、18μの水を
加え、渦流撹拌し、90℃に加熱しそして１時間かけて14
℃に冷却することにより達成した。全容積27μに50mM
のTris−HCl（pH7.8）、10mMのMgCl2、1mg/mlのスパー
ミジン、10mMジチオスレイトール、1mMのATP（リゼーシ
ョン緩衝液）を含有するように溶液を調整した。
え、そしてチューブを−80℃にて20分間保持することに
よりDNAを沈澱せしめる。12,800Gにて10分間遠心分離し
た後、溶液をデカントし、冷エタノールで洗浄し、そし
て蒸発乾燥した。断片のアニーリングを、18μの水を
加え、渦流撹拌し、90℃に加熱しそして１時間かけて14
℃に冷却することにより達成した。全容積27μに50mM
のTris−HCl（pH7.8）、10mMのMgCl2、1mg/mlのスパー
ミジン、10mMジチオスレイトール、1mMのATP（リゼーシ
ョン緩衝液）を含有するように溶液を調整した。
６ワイス（Weiss）ユニットのT4DNAリガーゼ（３μ
）を加えることにより連結反応（ligation）を開始し
た。14℃にて２時間置いた後、予想される443bpのHind
III−Sal I断片を、非変性条件下の７％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分離した。エチジウムブロミド
（0.5μg/ml）で染色することによりバンドを可視化
し、切り取り、そして電気溶出した。バッグの内容物を
取り出し、５μｇのポリ−Ａを加え、DNAをエタノール
沈澱し、そして乾燥した。断片をT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（３ユニット）を用い、37℃にて１時間合計20μ
のリゼーション緩衝液中で、５′−燐酸化した。
）を加えることにより連結反応（ligation）を開始し
た。14℃にて２時間置いた後、予想される443bpのHind
III−Sal I断片を、非変性条件下の７％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分離した。エチジウムブロミド
（0.5μg/ml）で染色することによりバンドを可視化
し、切り取り、そして電気溶出した。バッグの内容物を
取り出し、５μｇのポリ−Ａを加え、DNAをエタノール
沈澱し、そして乾燥した。断片をT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（３ユニット）を用い、37℃にて１時間合計20μ
のリゼーション緩衝液中で、５′−燐酸化した。
4. Hind III−Sal Iα−ファクター−プロインスリン
融合断片のpAB113への連結 pAB113は、Hind III及びSal I部位が除去されているp
BR322のEcoR I部位においてクローニングされた酵母α
−ファクター遺伝子を含有する1.8kbEcoR I断片を含ん
で成るプラスミドである。pAB133はプラスミドpAB101か
ら誘導され、このものは、プラスミドYEp24のBamH I部
位においてクローニングされた部位Sau3A断片としてα
−ファクター遺伝子を含有する。pAB101は、YEp24中に
クローニングされた酵母遺伝子ライブラリーを、公表さ
れているα−ファクターコード領域（Kurjan及びHersko
witz,Abstracts1981Cold Spring Harbor Meeting on th
e Molecular Biology of Yeast,242頁）と相同の合成オ
リゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングする
ことにより得られる。pAB113をエンドヌクレアーゼHind
III及びSal Iにより完全消化した。
融合断片のpAB113への連結 pAB113は、Hind III及びSal I部位が除去されているp
BR322のEcoR I部位においてクローニングされた酵母α
−ファクター遺伝子を含有する1.8kbEcoR I断片を含ん
で成るプラスミドである。pAB133はプラスミドpAB101か
ら誘導され、このものは、プラスミドYEp24のBamH I部
位においてクローニングされた部位Sau3A断片としてα
−ファクター遺伝子を含有する。pAB101は、YEp24中に
クローニングされた酵母遺伝子ライブラリーを、公表さ
れているα−ファクターコード領域（Kurjan及びHersko
witz,Abstracts1981Cold Spring Harbor Meeting on th
e Molecular Biology of Yeast,242頁）と相同の合成オ
リゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングする
ことにより得られる。pAB113をエンドヌクレアーゼHind
III及びSal Iにより完全消化した。
前記のようにして調製した連結生成物を含有するサン
プルを60℃に加熱し、そして100ngの消化されたpAB113
を加えた。この溶液を、15分間かけて14℃に冷却し、２
ワイスユニットのT4リガーゼを加え、そして14℃にて２
時間連結を行った。
プルを60℃に加熱し、そして100ngの消化されたpAB113
を加えた。この溶液を、15分間かけて14℃に冷却し、２
ワイスユニットのT4リガーゼを加え、そして14℃にて２
時間連結を行った。
挿入部を含有するpAB113によるE.コリHB101の形質転
換、及びけ形質転換体の試験 エタノール沈澱の後、ペレットを75mMのCaCl2に入
れ、そしてこれを用いてコンピテントトＥ．コリHB101
細胞を形質転換した。
換、及びけ形質転換体の試験 エタノール沈澱の後、ペレットを75mMのCaCl2に入
れ、そしてこれを用いてコンピテントトＥ．コリHB101
細胞を形質転換した。
８個の形質転換体を得、これらの各々からプラスミド
DNAを抽出した〔Birboim及びDoly,J.Nuc.Acids Res（19
79）７:1513〕。組換プラスミドをPst I及びSal Iによ
り消化し、そしてα−ファクター−プロインスリン挿入
部に特異的な319、207、79、48、31及び27bpの予想され
る断片の収得を電気泳動的に試験した。８個の形質転換
体の内に、pyins−１、−２、−３、−４、−５と標示
する５個の形質転換体がα−ファクター−プロインスリ
ン挿入部を含有していた。陽性形質転換体の各々につい
て１の培養物からプラスミドDNAを調製した。
DNAを抽出した〔Birboim及びDoly,J.Nuc.Acids Res（19
79）７:1513〕。組換プラスミドをPst I及びSal Iによ
り消化し、そしてα−ファクター−プロインスリン挿入
部に特異的な319、207、79、48、31及び27bpの予想され
る断片の収得を電気泳動的に試験した。８個の形質転換
体の内に、pyins−１、−２、−３、−４、−５と標示
する５個の形質転換体がα−ファクター−プロインスリ
ン挿入部を含有していた。陽性形質転換体の各々につい
て１の培養物からプラスミドDNAを調製した。
5. pyins−１、−２、−３、−４、−５のEcoR I消化 各形質転換体からのプラスミドDNA（100μｇ）を、24
0ユニットのEcoR I（BRL）と共に４時間200μの容積
において指定された緩衝条件のもとでインキュベートし
た。
0ユニットのEcoR I（BRL）と共に４時間200μの容積
において指定された緩衝条件のもとでインキュベートし
た。
EcoR I−EcoR I断片の分離 2056bpEcoR I−EcoR I断片を５％ポリアクリルアミド
電気泳動により分離した（この方法に代えてアガロース
を使用することもできる）。ゲルをエチジゥムブロミド
で染色し、そして予想されるUV−可視化バンドを切り出
した。DNAを、前記のごとく、電気溶出により分離し、
そしてクロマトグラフィーにより精製した。
電気泳動により分離した（この方法に代えてアガロース
を使用することもできる）。ゲルをエチジゥムブロミド
で染色し、そして予想されるUV−可視化バンドを切り出
した。DNAを、前記のごとく、電気溶出により分離し、
そしてクロマトグラフィーにより精製した。
6. EcoR I−EcoR I断片へのEcoR I−BamH Iアダプター
の連結 各「pyin」クローン（約４μｇ）を、次のDNA配列を
有する５′−燐酸化EcoR I−BamH Iアダプター1.0μｇ
と共に、2000ユニットのT4DNAリガーゼ（ニューイング
ランドビオラブス）の存在下でインキュベートした。
の連結 各「pyin」クローン（約４μｇ）を、次のDNA配列を
有する５′−燐酸化EcoR I−BamH Iアダプター1.0μｇ
と共に、2000ユニットのT4DNAリガーゼ（ニューイング
ランドビオラブス）の存在下でインキュベートした。
５′−GATCCCTCTAGG−３′；及び、 ５′−AATTCCTAGAGG−３′ 反応は、900μの指定された緩衝液中で18℃にて2.5時
間行った。サンプルを65℃に10分間加熱し、フェノール
抽出し、そして250μの指定された緩衝液中で37℃に
て４時間、100ユニットのBamH I（BRL）を用いて消化し
た。
間行った。サンプルを65℃に10分間加熱し、フェノール
抽出し、そして250μの指定された緩衝液中で37℃に
て４時間、100ユニットのBamH I（BRL）を用いて消化し
た。
BamH I−BamH Iα−ファクター−プロインスリン断片
を、上記のようにして、１％アガロースゲル電気泳動、
電気溶出及びこれに続くカラムクロマトグラフィーによ
り精製した。
を、上記のようにして、１％アガロースゲル電気泳動、
電気溶出及びこれに続くカラムクロマトグラフィーによ
り精製した。
7. pCl/1のBamH I部位へのBamH I−BamH I断片の連結 pyins−１のBamH I−BamH I断片0.7μｇ及び他のpyin
sからの同様の断片0.4μｇを、一定量のBamH I消化pCl/
1と連結し、この場合のモル比を断片10:ベクター１とし
た。〔プラスミドpCl/1はpJDB219（Beggs,Nature,1978,
275:104）の誘導体であり、pJBB219中の細菌プラスミド
pMB9に対応する領域はpCl/1中でpBR322により置換され
ている。pCl/1は完全な２μｍ複製因子、酵母LEU2遺伝
子及び完全なpBR322を含有している。〕すべての連結反
応は、５μg/mlのDNA濃度及び800ユニットのT4リガーゼ
（ニューイングランドビオラブス）を用いて21℃にて2.
5時間行った。
sからの同様の断片0.4μｇを、一定量のBamH I消化pCl/
1と連結し、この場合のモル比を断片10:ベクター１とし
た。〔プラスミドpCl/1はpJDB219（Beggs,Nature,1978,
275:104）の誘導体であり、pJBB219中の細菌プラスミド
pMB9に対応する領域はpCl/1中でpBR322により置換され
ている。pCl/1は完全な２μｍ複製因子、酵母LEU2遺伝
子及び完全なpBR322を含有している。〕すべての連結反
応は、５μg/mlのDNA濃度及び800ユニットのT4リガーゼ
（ニューイングランドビオラブス）を用いて21℃にて2.
5時間行った。
エタノール沈澱の後、DNAを75mMのCaCl2100μに再
懸濁し、そしてこれを用いてＥ．コリHB101細胞を形質
転換した。
懸濁し、そしてこれを用いてＥ．コリHB101細胞を形質
転換した。
α−ファクター−プロインスリン挿入部の存在について
の形質転換体の試験 各「pyins」のクローンについて数百個ずつの形質転
換体を得た。５種類の「pyins」クローンのそれぞれに
由来する４個ずつの形質転換体を、プラスミドDNAを抽
出し、これをPst I（ニューイングランドビオラブス）
により消化することにより試験した。このPst Iは、挿
入部の存在下で、207、48、及び27bpの特異的な断片を
生じさせるものと予想される。試験した20個の形質転換
体の内の14個がα−ファクター−プロインスリン挿入部
を含有していることが見出された。これらの形質転換体
はもとの「pyins」クローンの各々を代表している。も
との「pyins」クローンの各々に由来する形質転換体か
らプラスミド標品を調製した。
の形質転換体の試験 各「pyins」のクローンについて数百個ずつの形質転
換体を得た。５種類の「pyins」クローンのそれぞれに
由来する４個ずつの形質転換体を、プラスミドDNAを抽
出し、これをPst I（ニューイングランドビオラブス）
により消化することにより試験した。このPst Iは、挿
入部の存在下で、207、48、及び27bpの特異的な断片を
生じさせるものと予想される。試験した20個の形質転換
体の内の14個がα−ファクター−プロインスリン挿入部
を含有していることが見出された。これらの形質転換体
はもとの「pyins」クローンの各々を代表している。も
との「pyins」クローンの各々に由来する形質転換体か
らプラスミド標品を調製した。
このプラスミドを用いて酵母AB103細胞（α，pep ４
−３，leu ２−３，leu ２−112，ura ３−52，his
４−580）を形質転換し、そしてLeu+形質転換体を選
択した。
−３，leu ２−３，leu ２−112，ura ３−52，his
４−580）を形質転換し、そしてLeu+形質転換体を選
択した。
細胞培地のインスリンのラジオイムノアッセイ 酵母形質転換体AB103（pYins1又はpYins5）を、ロイ
シンを含有しない最少プレート上に「斑点」として増殖
せしめた。殺菌したプラスチック製植菌耳を用いて各斑
の幾らかを、ロイシンを含有しない最少培地2mlに植付
けた。この培養物及びAB103（pCl/1）の対照培養物を飽
和状態まで増殖せしめた。ベックマンJ6B遠心分離機中
で2,500rpmで10分間遠心分離することにより細胞をペレ
ットにした。上清清を取り出し、アマーシヤム製のキッ
トを用いてRIAアッセイした。１、10、及び100μの上
清液を測定した。実験 クローン インスリン濃度（ng/ml） １ pCl/1 0 pYins5−2B 16 pYins5−3A 13 pYins5−3B 33 ２ pCl/1 0 pYins1−4A 60 pYins5−2B 32 pYins5−3B 22 pYins7−1A 15 pYins7−2A 46 pYins8−４ 48 脂肪形成バイオアッセイ（lipogenesis bioassay）
〔Moody等、Horm.Metab.Res.（1974）６:12−16〕にお
いて、１μｇのサンプルは27％のインスリン活性を示し
た。サンプルはプラスミドpYins1−4Aから次のようにし
て得た。この特徴付けのために酵母培養物を遠心分離し
て細胞を除去し、そして上清液を酢酸によりpH3に酸性
化した。この材料をビオレックス（Biorex）−70に吸着
し、カラムを0.1N酢酸及び50％エタノールで洗浄し、そ
して80％エタノール中10mMHClで溶出することにより精
製した。溶出物をロータリーエバポレーターにより乾燥
し、そして少量の水に入れた。上記の結果はインスリン
活性ペプチドの存在を示す。
シンを含有しない最少プレート上に「斑点」として増殖
せしめた。殺菌したプラスチック製植菌耳を用いて各斑
の幾らかを、ロイシンを含有しない最少培地2mlに植付
けた。この培養物及びAB103（pCl/1）の対照培養物を飽
和状態まで増殖せしめた。ベックマンJ6B遠心分離機中
で2,500rpmで10分間遠心分離することにより細胞をペレ
ットにした。上清清を取り出し、アマーシヤム製のキッ
トを用いてRIAアッセイした。１、10、及び100μの上
清液を測定した。実験 クローン インスリン濃度（ng/ml） １ pCl/1 0 pYins5−2B 16 pYins5−3A 13 pYins5−3B 33 ２ pCl/1 0 pYins1−4A 60 pYins5−2B 32 pYins5−3B 22 pYins7−1A 15 pYins7−2A 46 pYins8−４ 48 脂肪形成バイオアッセイ（lipogenesis bioassay）
〔Moody等、Horm.Metab.Res.（1974）６:12−16〕にお
いて、１μｇのサンプルは27％のインスリン活性を示し
た。サンプルはプラスミドpYins1−4Aから次のようにし
て得た。この特徴付けのために酵母培養物を遠心分離し
て細胞を除去し、そして上清液を酢酸によりpH3に酸性
化した。この材料をビオレックス（Biorex）−70に吸着
し、カラムを0.1N酢酸及び50％エタノールで洗浄し、そ
して80％エタノール中10mMHClで溶出することにより精
製した。溶出物をロータリーエバポレーターにより乾燥
し、そして少量の水に入れた。上記の結果はインスリン
活性ペプチドの存在を示す。
この発明に従えば、新規な構成が提供され、この構成
はベクターに挿入され、「プレ」−プロインスリンの発
現、プロセシング及び分泌がもたらされる。こうして、
天然のヒト−インスリンと同一の配列を有するポリペプ
チドが得られる。分泌により細胞数に対する収量が非常
に増加し、その後の調製操作及び精製が非常に単純化さ
れる。
はベクターに挿入され、「プレ」−プロインスリンの発
現、プロセシング及び分泌がもたらされる。こうして、
天然のヒト−インスリンと同一の配列を有するポリペプ
チドが得られる。分泌により細胞数に対する収量が非常
に増加し、その後の調製操作及び精製が非常に単純化さ
れる。
以上、この発明を説明及び例によりいく分詳細に記載
したが、これは理解を明確にするためのものであり、こ
の発明の範囲内において幾つかの変更及び変法を行うこ
とができることは言うまでもない。
したが、これは理解を明確にするためのものであり、こ
の発明の範囲内において幾つかの変更及び変法を行うこ
とができることは言うまでもない。
なお、細胞系pYins1は、1983年４月６日、Accession
No.20670としてA.T.C.C.に寄託された。
No.20670としてA.T.C.C.に寄託された。
第１図は本発明において使用される酵母α−ファクター
リーダー配列をコードするDNA、プロインスリンをコー
ドするDNA及びこれらを連結するアダプター配列、並び
に制限酵素部位を示す。
リーダー配列をコードするDNA、プロインスリンをコー
ドするDNA及びこれらを連結するアダプター配列、並び
に制限酵素部位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） ） (72)発明者 ミッキー エス、アーディア アメリカ合衆国，カリフォルニア，サン フランシスコ，サーティサード アベニ ュ 1606 (72)発明者 パブロ ディー、ティー、バレンズエラ アメリカ合衆国，カリフォルニア，サン フランシスコ，アパー テラス 455
Claims (6)
- 【請求項１】成熟インスリンへのプロセシング及び分泌
をもたらす酵母での成熟インスリンの製造方法であっ
て、 ａ）同一のリーディングフレーム内に第一DNA配列及び
該第一DNA配列の３′末端に直接連結された第二DNA配列
を含んで成るDNA構成物により形質転換された酵母宿主
を用意し、ここで該第二DNA配列は成熟インスリンの生
産のためにはプロセシングを必要とする成熟インスリン
のための前駆体配列をコードしており、そして該第一DN
A配列は酵母α−ファクターシグナルペプチド配列をコ
ードする配列を含み；そして ｂ）前記形質転換された酵母宿主を栄養培地中で、成熟
インスリンが該培地中に分泌される条件下で増殖せしめ
る； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】前記第二DNA配列がヒトインスリンcDNA断
片を含んで成る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記DNA構成物が、プロモーター、第一DNA
配列、第二DNA配列、および転写ターミネーターを含む
発現カセットである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記発現カセットが、前記酵母宿主により
認識される複製系を含んで成るベクター中に存在する、
請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】前記発現カセットが、大腸菌により認識さ
れる複製系を含んで成るベクター中に存在する、請求項
３に記載の方法。 - 【請求項６】前記複製系が２ミクロンプラスミド配列を
含んで成る、請求項４に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP6185950A Division JP2511251B2 (ja) | 1983-04-07 | 1994-08-08 | 成熟インスリンの生産のための遺伝子系 |
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|---|---|
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Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
-
1984
- 1984-02-23 DK DK198400927A patent/DK172738B1/da not_active IP Right Cessation
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- 1984-03-23 JP JP59054554A patent/JP2512416B2/ja not_active Expired - Lifetime
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-
1994
- 1994-08-08 JP JP6185950A patent/JP2511251B2/ja not_active Expired - Lifetime
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